一个编码具有调控高羊茅抗寒性的转录因子的基因及其应用

摘要

本发明公开了一个编码具有调控高羊茅抗寒性的转录因子的基因及其应用，属于植物分子生物学领域。该基因具有序列表No.1所示的碱基序列，其编码的蛋白具有转录激活功能。本发明的优点是：FaDREB1转录激活因子能够激活植物体内的多种耐冷机制，因此FaDREB1为基因工程改良植物耐冷性提供了一种全新的技术途径，在园艺植物(如草坪草)耐逆性的综合改良过程中具有广泛的应用前景和极大的经济价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一个编码具有调控高羊茅抗寒性的转录因子的基因及其应用，更具体地说是具有调控禾本科植物草坪草高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)抗寒性的转录因子的编码核酸及其用于转基因育种的应用，属于植物分子生物学领域。

背景技术

目前已知转录因子在生物的生命活动中起着非常重要的作用，它不仅参与了生物体的生长、发育，同时也调控着生物体对外界逆境如干旱、高盐、低温、病原物侵染等的应答反应。植物中调控对外界干旱、高盐、低温等逆境的应答反应的转录因子DREB(drought-responsive element binding factor)自1998年(Liu等Plant Cell，1998，10(8)：1391-1406)从拟南芥中被分离出来以来，DREB已受到广泛的关注和得到深入的研究，如目前除拟南芥外，已从其它许多植物中分离到类似DREB的基因，这些基因也具有类似的功能。但是在草坪草领域，还鲜有这方面的报道。

随着分子生物学技术和转基因技术的发展，分离新的基因和将新的基因导入植物中来改良植物的遗传性状已成为可能。植物的抗寒应答涉及到许多基因的上调表达，在这些上调表达的基因中有许多受到转录因子DREB的调控。

在世界各国日益重视环境质量的今天，草坪和草坪草业发展非常迅速，各国均在进行大面积，大范围的引种。高羊茅作为一种耐热、抗旱、耐盐、抗病优良的草坪草，而得到广泛的引种。但是高羊茅引种在寒冷地带或寒冷的季节表现失绿、长势参差不齐(韩烈保，草业科学，1999)等，严重影响了草坪的观赏价值和经济价值。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一个编码具有调控高羊茅抗寒性的转录因子的基因。

本发明的第二个目的是提供这种编码这种转录因子的基因的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一个编码具有调控高羊茅抗寒性的转录因子的基因(FaDREB1)，其具有序列表No.1所示的碱基序列。

序列表No.1所示的碱基序列所编码的具有转录激活功能的调控高羊茅抗寒性的转录因子。

本申请发明人经过深入研究，分离并得到了草坪草高羊茅的DREB cDNA，并确定了其碱基序列。此外，还将该cDNA的编码区构建到特定的载体中，并使特定载体导入酵母细胞中激活特定报告基因的表达，从而鉴定出该cDNA编码的DREB转录因子具有转录激活功能。

编码具有调控高羊茅抗寒性的转录因子的基因用于转基因植物育种的应用。植物耐寒性属于复杂的数量性状，是多种耐逆机制共同作用的结果。FaDREB1转录激活因子是一个受低温特异诱导的反式作用因子，能与多种DNA调控元件特异结合，促进启动子中含有这一元件的多个冷诱导基因表达，从而激活植物体内的多种耐寒机制。

所述的转基因植物为草坪草，如高羊茅。FaDREB1激活因子超表达在提高植物耐逆性的同时，还会产生生长迟缓、植株矮化的负效应，但这种负效应对于抑止草坪草的生长反而有利。通常，为保持草坪草的美观，需要经常对其进行修剪，FaDREB1激活因子既能够增强转基因草坪草的耐逆性，又能减少修剪的次数，从而节省了养护费用。

本发明的优点是：FaDREB1转录激活因子能够激活植物体内的多种耐冷机制，因此FaDREB1为基因工程改良植物耐冷性提供了一种全新的技术途径，在园艺植物(如草坪草)耐逆性的综合改良过过程中具有广泛的应用前景和极大的经济价值。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照以下内容所作的任何本领域的等同替换均属于对本发明专利权的侵犯。

附图说明

图1为冷胁迫下FaDREB1基因的表达模式图，上方为Northern杂交结果，下方为总RNA提取结果。

图2为FaDREB1转录激活载体的构建方法图

图3为FaDREB1蛋白转录激活功能的检测结果图

具体实施方式

下述实施例中所使用的方法均为本领域常规操作，详见《分子克隆实验指南》(第三版)，本申请发明人克隆到了高羊茅的DREB1 cDNA，并确定了其碱基序列(命名为FaDREB1)。

实施例1、FaDREB1 cDNA的分离

1、cDNA文库的构建：

禾本科植物高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.来自丹麦DLF-Trifolium公司)种子用1％次氯酸钠溶液消毒20分钟后，无菌水洗三遍，播于含适量1/2MS固体培养基(pH5.8)的培养瓶中。25℃下，16∶8(光∶暗)小时培养14天后，取幼苗洗净，于4℃低温处理5小时，立即用液氮速冻，存于-80℃用于总RNA的提取。

用Trizol(GIBCO公司)方法分离高羊茅植株的总RNA，用PolyATtract mRNAIsolation Systems(Promega公司)分离mRNA，用ZAP Express cDNA Synthesis Kit andZAP Express cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit(Stratagene公司)合成cDNA，经加EcoRI和Xho I接头后，插入到λ-ZAP媒介物的相应部位，用Gigapack III Gold封装混合法(见试剂盒说明书)构建了高羊茅冷诱导cDNA文库。

2、FaDREB1 AP2保守区序列的获得：

利用反转录PCR法得到FaDREB1的AP2保守区，所用合成引物的序列如下：

正向引物：5’GC(G)ACCAAGTTCCAGGAGG(A)CG3’

反向引物：5’GCGA(G)AGTCAGCGAAGTTG3’

3、反应体系及参数：

反应条件：

使用377 DNA Sequencer(Applied Biosystems公司)测定，AP2保守区的碱基序列如下：

GCACCAAGTTCCAGGAGGCGCGGCACCCGGTGTACCGCGGCGTTCGGCGCCGGGGGCGTGCCGGGCAGTGGGTGTGCGAGATGCGCATCCACGGGACGAAGGGGTCCAGGCTCTGGCTCGGCACCTTCGACACCGCTGAGATGGCTGCGCGCGCGCACGACGCCGCCGCGCTCGCGCTCTCCGGCGGCGACGCATGCCTCAACTTCGCTGACTCCGC

4、cDNA文库的筛选：

将上述FaDREB1的AP2保守区序列用作探针，通过常规方法来筛选上述cDNA文库，得到多个阳性克隆，用377 DNA Sequencer确定其碱基序列，得到了FaDREB1的cDNA序列，所确定的FaDREB1碱基序列如序列表No.1所示。

实施例2、冷胁迫下FaDREB1基因的表达模式

将上述方法(实施例1)培养的高羊茅幼苗洗净，置于4℃，分别按0、1、2、4、8、12、24、48小时的时间间隔取样，并立即用液氮速冻，置于-80℃冰箱中用于总RNA的分离。

用Trizol(GIBCO公司)方法分离高羊茅植株的总RNA，按常规方法进行Northern杂交(杂交液为6×SSC，5×Denhardt’s，50％甲酰胺，0.5％SDS，鲑鱼精DNA 100μg/ml)。结果表明，高羊茅FaDREB1基因受冷胁迫诱导表达，并持续较长时间的高水平表达(如图1所示)。

实施例3、FaDREB1转录激活载体的构建和FaDREB1蛋白转录激活功能的检测

用高保真Pfu DNA聚合酶(Promega公司)通过PCR法获得FaDREB1的编码区，所用引物如下

正向引物：5’AAAAGATGGACGCTGCCGTTG3’

反向引物：5’AAAACACTACAAGTAGCTCCATAGCG3’

反应体系及参数：

反应条件：

将其插入到pMD 18-T载体(TaKaRa公司)上，用限制性内切酶BamHI和Hind III从重组pMD18-T载体上切下FaDREB1的编码区，插入到YEpGAP112的相应位置，经检测无误后，转化入含双报道子的酵母菌株(4271，Clontech公司)中(如图2所示)。用含3-AT的SD-Agar三缺培养基(三缺SD固体培养基，His^-，Trp^-，Ura^-，Clontech公司)检测其生长情况，结果含FaDREB1和野生型DRE元件的酵母菌株在3-AT-SD-Agar三缺培养基上生长良好，而含FaDREB1和突变型DRE元件的酵母菌株在3-AT-SD-Agar三缺培养基上不能生长(如图3所示)。说明FaDREB1蛋白能特异结合DRE元件，激活下游目的基因的表达，具有调控草坪草高羊茅抗寒性应答的功能。

                        序列表

<110>北京扬华生物科技有限公司

<120>一个编码具有调控高羊茅抗寒性的转录因子的基因及其应用

<130>

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>881

<212>mRNA

<213>羊茅属禾本科(Schedonorus arundinaeus)

<400>1

gatggacgct gccgttgccg tctcgctgtc gctgcagtcg gaggagcaag agtacaggac  60

ggtatggtcg gagccgccga agccacgatc ggagcgcacc aagttccagg aggcgcggca  120

cccggtgtac cgcggcgttc ggcgccgggg gcgtgccggg cagtgggtgt gcgagatgcg  180

catccacggg acgaaggggt ccaggctctg gctcggcacc ttcgacaccg ctgagatggc  240

tgcgcgcgcg cacgacgccg ccgcgctcgc gctctccggc ggcgacgcat gcctcaactt  300

cgctgactcc gcctggcgga tgcagcccgt tctccctgcc ggtgccgagt cggtctgctt  360

cggcggagcg caggaggtca aggacgccgt cgccgccgcc gtcgaggcgt tccaggagga 420

ggagcaccac gttgcgtcca cggcggagac ggccaaggac aaggagagcg cgctgtccat 480

gtccagcgac ttgtcggagc acgacgacga gcgctggatt gacggcatgg acgccgggtc 540

gtactacgcg agcttggcgc agggcatgct cgtggagcca ccggacgccg gagcgtggcg 600

ggaggacggc gaacacggcg gtgtcgagac gtcgctatgg agctacttgt agtgtacgtg 660

gagttttacc aggaactact actagaacta gttctgttct cgcttccaaa tatgggaaga 720

cgcagaataa tcatcgaggg caatttttac cccatatgtg aaagcttccc gtttctattt 780

ctgggaagat cgtactagat tttcccttta gttaattgtt actaagagtc agtaaaggaa 840

tgcatagtac gaatccaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a  881