香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶基因及其克隆

摘要

本发明公开了一种香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶基因，本发明还公开了一种香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶基因克隆，根据已测的PGC1蛋白N末端编码序列设计引物，以香蕉枯萎病菌4号生理小种菌株总RNA为模板，采用RT－PCR方法，合成cDNA的第一条链，5’RACE和3’RACE的方法克隆PGC1 cDNA的全长序列，推测出PGC1的氨基酸序列。本发明获得的PGC1基因cDNA序列，可以作为区分FOC1号和4号小种的依据；将PGC1基因转化到真核微生物中，所表达的PGC1可以作为免疫蛋白抗原制作动物血清，作病原菌检测使用；真核微生物表达产物可以代替病原菌作靶标物，广泛筛选对PGC1有效的抗病基因，供香蕉抗枯萎病转基因育种使用。

说明书

                            技术领域

本发明属于植物保护和生物技术领域，特别涉及一种香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶基因及其克隆。

                            背景技术

香蕉镰刀菌枯萎病又称香蕉巴拿马病、黄叶病，是由镰刀菌侵染引起维管束坏死的土传性病害，病原菌为尖镰孢霉古巴专化型[Fusarium oxysporum f.sp.cubense(E.F.Smith)Snyder et Hansen](FOC).病原菌从受伤的根茎侵入，通过寄主维管束向茎上发展，并进一步向假叶部蔓延。当植株枯死后，病原菌随残体遗留在土壤中，随着水流或带菌的农具在蕉园内再进行自然传播，其厚垣孢子可在土壤中存活8～10年。由于该菌存活期长，传播迅速，尚未有防止该病的特效药物，因此一旦在香蕉产地发病，很可能大面积爆发将造成重大损失。

尖镰刀菌古巴专化型有4个生理小种，1号小种(racel)感染香蕉的栽培种“大蜜哈”[Grosmichel(AAA)]及龙牙蕉(MusaAAB)，矮蕉[Dwarfcavendish(AAA)]较抗病，该小种呈世界分布，在中国大陆已有记录；2号小种(race2)在中美洲，仅感染三倍体杂种梭香蕉[Bluggoe(AAB)]，不侵染“大蜜哈”；3号小种(race3)感染野生的羯尾蕉属(Heliconia)；4号小种(race4)能感染几乎所有的香蕉种类，如Cevendish、“大蜜哈”、矮香蕉、野蕉(BB)和梭指蕉，毁灭性最大，在全世界范围内尚末找到有效的抵抗4号小种的香蕉品种。

香蕉枯萎病侵染时间长，没有有效的农药和防治措施，品种抗病性成为一个重要的控病方法。但是，由于对病害的侵染过程缺乏深入的研究，目前未见有关香蕉枯萎病的致病性研究报道，对病菌的致病因子没有足够的认识，抗病品种的选取很难取得理想的进展。植物病原菌可产生一系列的果胶酶，许多研究发现内切多聚半乳糖醛酸酶与病原菌的毒力和致病性高度相关。

                              发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点，提供一种香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶PGC1基因及其克隆。从香蕉枯萎病菌的致病性内切半乳糖醛酸酶是作为病菌的检疫检测的新指标，以及用于筛选和培育新的香蕉抗病品种。

一种香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶基因，其核苷酸序列，PGC1cDNA的全长序列如下：

cttcaacaac tctttgcatc ctcttgtctt tgtctcacac gaatatcaca atg gtt          56

cga aac atc gct att gcg gct ttg ctg cca gct gcc ttt gct tca acg         104

ctg cct cga gat ccc tgc agc gtg act gac tac tcc ggc ctc gcc acc         152

gcc gtc tca tct tgc aca aac att gtg ctc aac ggt ttc caa gtc ccc         200

act ggc aag gct ctt gat cta tcc aag ctc aag gac ggc gca acc gtt         248

acc ttc aag ggc aag acc acg ttt gcc act act gcc gat aac gac ttt         296

gat cct atc gtc att agc gga aat ggc atc act ata act ggt gca tct         344

ggc cat gtc att gat ggt aac ggc ccg gcg tac tgg gat ggc gaa ggt         392

tct aac aac aag aaa aac cca aag ccc gac cat ttc atc gtt gtc aag         440

aag act acc ggc aac tca aag atc aca aac ctg aac atc cag aac tgg         488

ccc gtt cac tgc ttc gac atc aca ggc agt tca caa ttg acc atc tca         536

ggg ctc att ctt gat aac aga ctt ggc gac aag ccc aat gcc aag agc         584

ggt agc ttg ccc gct gcg cac aac agc gac ggt ttc gac atc ccg tcc         632

agt gac cac gtt act ctg gat aac att cat gtt tat aac cag gat gac         680

tgt gtt gct gtc act tcg ggt aca aac atc atc gtc tcc aac atg tac         728

tgc tcc ggt ggt cat ggt ctt agc att gga tct gtt ggc ggc aag agc         776

aac aat gtc gtc aat ggt gtt cag ttc ttg gat tcg cag att gtt aac         824

agt gag aat gga tgc cgc atc aag tcc aac tct ggc aca act ggc acg         872

att gag aac gcc acg tac caa aac att gcc ctt acc aac atc agc aaa         920

tat ggt gtc gat gtc cag cag gac tat ctc aac ggt ggc cct act gga         968

aag ccc acc aac gga gtc aag atc agc ggt atc aag ttc atc aag gtc         1016

act ggt aca gtg gct agc tct gct caa gat tgg tat att ctg tgt ggc         1064

gat ggt agc tgc tct gga ttc act ttc tct gga aac gcc atc act ggt         1112

ggt ggc aag act agc agc tgc aac tat cct acc aac act tgc cct agc         1160

aag gtc aaa gcg gga cga tca cca ctc cat gtt cac aaa gct aga acc         1208

cag tca aag agt ggt ctt acg gtt gtt gcg tgg aat tgc tgc ggc gga         1256

cag ttg tgagcttggg tctatagtag tatttgtccg atagtcacta ggcttatctt         1312

agcaatacac tttatttatc gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      1372

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa            1426

推测的PGC1的氨基酸序列如下：

Met Val Arg Asn Ile Ala Ile Ala Ala Leu Leu Pro Ala Ala Phe Ala

1               5                   10                  15

Ser Thr Leu Pro ArgPro Cys Ser Val Thr Asp Tyr Ser Gly Leu

            20                    25                  30

Ala Thr Ala Val Ser Ser Cys Thr Asn Ile ValLeu Asn Gly Phe Gln

        35                  40                  45

Val Pro Thr Gly Lys Ala Leu Asp Leu Ser Lys Leu Lys Asp Gly Ala

    50                  55                  60

Thr Val Thr Phe Lys Gly Lys Thr Thr Phe Ala Thr Thr Ala Asp Asn

65                  70                  75                  80

Asp Phe Asp Pro Ile Val Ile Ser Gly Asn Gly Ile Thr Ile Thr Gly

                85                  90                  95

Ala Ser Gly His Val Ile Asp Gly Asn Gly Pro Ala Tyr Trp Asp Gly

            100                 105                 110

Glu Gly Ser Asn Asn Lys Lys Asn Pro Lys Pro Asp His Phe Ile Val

        115                 120                 125

Val Lys Lys Thr Thr Gly Asn Ser Lys Ile Thr Asn Leu Asn Ile Gln

    130                 135                 140

Asn Trp Pro Val His Cys Phe Asp Ile Thr Gly Ser Ser Gln Leu Thr

145                 150                 155                 160

Ile Ser Gly Leu Ile Leu Asp Asn Arg Leu Gly Asp Lys Pro Asn Ala

                165                 170                 175

Lys Ser Gly Ser Leu Pro Ala Ala His Asn Ser Asp Gly Phe Asp Ile

            180                 185                 190

Pro Ser Ser Asp His Val Thr Leu Asp Asn Ile His Val Tyr Asn Gln

        195                 200                 205

Asp Asp Cys Val Ala Val Thr Ser Gly Thr Asn Ile Ile Val Ser Asn

    210                 215                 220

Met Tyr Cys Ser Gly Gly His Gly Leu Ser Ile Gly Ser Val Gly Gly

225                 230                 235                 240

Lys Ser Asn Asn Val Val Asn Gly Val Gln Phe Leu Asp Ser Gln Ile

                245                 250                 255

Val Asn Ser Glu Asn Gly Cys Arg Ile Lys Ser Asn Ser Gly Thr Thr

            260                 265                 270

Gly Thr Ile Glu Asn Ala Thr Tyr Gln Asn Ile Ala Leu Thr Asn Ile

        275                 280                 285

Ser Lys Tyr Gly Val Asp Val Gln Gln Asp Tyr Leu Asn Gly Gly Pro

    290                 295                 300

Thr Gly Lys Pro Thr Asn Gly Val Lys Ile Ser Gly Ile Lys Phe Ile

305                 310                 315                 320

Lys Val Thr Gly Thr Val Ala Ser Ser Ala Gln Asp Trp Tyr lle Leu

                325                 330                 335

Cys Gly Asp Gly Ser Cys Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Asn Ala Ile

            340                 345                 350

Thr Gly Gly Gly Lys Thr Ser Ser Cys Asn Tyr Pro Thr Asn Thr Cys

        355                 360                 365

Pro Ser Lys Val Lys Ala Gly Arg Ser Pro Leu His Val His Lys Ala

    370                 375                 380

Arg Thr Gln Ser Lys Ser Gly Leu Thr Val Val Ala Trp Asn Cys Cys

385                 390                 395                 400

Gly Gly Gln Leu

其中Pro Cys Ser Val Thr Asp Tyr Ser Gly Leu Ala Thr Ala Val Ser Ser CysThr Asn Ile Val为已知PGC1蛋白N端测序部分，Asp为PGC1成熟蛋白N端编码氨基酸。

本发明的香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶基因克隆，根据已测的PGC1蛋白N末端编码序列设计引物，以香蕉枯萎病菌4号生理小种菌株总RNA为模板，采用RT-PCR方法，合成cDNA的第一条链，5’RACE和3’RACE的方法克隆PGC1 cDNA的全长序列，推测出PGC1的氨基酸序列。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：本发明纯化的多聚半乳糖醛酸酶PGC1是香蕉枯萎病菌4号生理小种的关键致病因子之一，获得的PGC1基因cDNA序列，可以作为区分FOC1号和4号小种的依据。将PGC1基因转化到真核微生物中，所表达的PGC1可以作为免疫蛋白抗原制作动物血清，作病原菌检测使用。同时，真核微生物表达产物可以代替病原菌作耙标物，广泛筛选对PGC1有效的抗病基因，供香蕉抗枯萎病转基因育种使用。

                                    附图说明

图1为Sephacryl S-100凝胶过滤柱层析图。

图2为Sephacryl S-100凝胶过滤柱层析收集各管的PG活性变化曲线。

图3为Sepharose SP XL 16/10强阳离子交换柱层析图。

图4为Sepharose SP XL 16/10强阳离子交换柱层析收集各管的PG活性变化曲线。

图5为Sepharose CM弱阳离子交换柱层析图。

图6为Sepharose CM弱阳离子交换柱层析收集各管的PG活性变化曲线。

图7为纯化PGC1的IEF-PAGE电泳图谱。

其中71为粗酶液PG同工酶染色；72为经Sepharose CM Hitrap收集的PGC1酶染色；73为经Sepharose CM Hitrap收集的PGCl酶蛋白银染；74为标准等电点(pI3.5-9.5)。

图8为各纯化PGC1步骤的SDS-PAGE电泳银染图谱。

其中81为Sepharose SP XL 16/10收集酶液；82为Sephacryl S-10016/10收集酶液；83为粗酶液；84为Sepharose CM Hitrap收集酶液；85为低分子量蛋白标准。

图9为3’端racePCR产物电泳。

91为第一轮RT-PCR产物；92为第二轮nest-PCR产物

图10为5’端racePCR产物电泳。

1为第一轮RT-PCR产物；2为第二轮nest-PCR产物

                               具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

根据PGC1酶蛋白的N-端的22个氨基酸设计简并引物PGA1，PGA2。以香蕉枯萎病菌4号生理小种菌株总RNA为模板，采用RT-PCR方法，退火温度47.9℃，与反向锚定引物Oligo(T)₂₀进行PCR扩增，RT-PCR扩增产物，用PGA2和Oligo(T)₂₀进行巢式PCR扩增，在54℃退火温度得到了特异性很强的1200bp单一条带RPGC1。将该片段送上海联合基因公司克隆、测序后，发现RPGC1全长1222bp，序列分析后发现包含PGC1蛋白质N-端的部分序列SGLAYAVSSCYNI。在PGC1片断中还包括一个终止密码子TGA。在终止密码子下游还包含一个长69bp的3’端非编码区，其中包括聚腺苷酸化的信号-TTTATTT-，以及一个含72个腺苷酸的poly(A)。由此证实得到的片段为PGC1基因的3’端的片段。

为了得到PGC1的全长DNA基因片段，根据RPGC1的序列设计引物，采用TaKaRa的5’Full RACE core set试剂盒进行5’片段的扩增。以PGB3为引物反转录总RNA，通过PGA3和PGLS1进行扩增得到一条800bp的条带，用PGLS2与PGA3进行巢式PCR扩增，在退火温度内得到了特异性很强的750bp单一条带LPGC1。目的片段克隆、测序后发现它全长758nt。序列分析后发现，除掉它与RPGC1重叠片段后，还包含120nt序列，LPGC1中包含N-端全部已测出的22个氨基酸序列和1个起始密码子AUG。起始密码子前有50nt的5’端非编码区。从序列分析结果可以证实，片段为PGC1基因的5’末端片段。

PGA1：5’TGCWSCGTSACTGACTACTCYGGC 3’

PGA2：5’CTCGCYACCGCYGTCTCATCYTG 3’

PGB2：5’CCAGAGTTGGACTTGATG 3’

PGA3：5’GTTACCTTCAAGGGCAAGACC 3’

PGLS1：5’ACAATGTITGTGCAAGATGAGAC 3’

PGLS2：5’GGCCGGAGTAGTCAGTCACTGAG 3’

可获全长cDNA序列并推测氨基酸序列。

本发明中液体培养基：NH4HNO31.0g、KCl0.2g、FeSO40.01g、KH 2PO40.2g、ZnSO40.01g、蒸馏水1000mL。Sigma公司产柑桔果胶5g，羧甲基纤维素钠5g，液体培养基pH值5.0后，于121℃、15磅下灭菌20min。

PG酶活性的测定：用pH5.0的0.05mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液配制0.5％的果胶酸溶液，取1mL果胶酸溶液与0.5mL稀释100倍的酶液混合，于45℃水浴锅中反应30min，立即加入DNS试剂0.5mL中止反应，再加入蒸馏水至5mL。在Bakeman分光光度计520nm波长处测定反应混合物的O.D值。测定后，取样品的O.D值平均值在标准曲线查出相应的糖量。对照除加入的PG酶液沸煮10min的失活酶液外，其余操作同上。多聚半乳糖醛酸酶的酶活单位为45℃下每mg酶每分钟催化低物释放1μmolD-半乳糖醛酸量(μmol/mg*min)。

酶蛋白浓度测定按Bradforf方法，用考马斯亮兰G250显色，在595nm下比色测定，用牛血蛋白清作标准曲线。

根据已测的PGC1蛋白N末端编码序列设计引物，克隆PGC1 cDNA的全长序列，推测出PGC1的氨基酸的序列。具体操作过程如下：

首先，提取纯化香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶，其工艺步骤是：

-20℃低温保藏的香蕉枯萎病菌4号生理小种菌株(由广东省农业科学院提供)活化，接种在加有香石竹叶片的PDA平板上，25℃培养7天，用0.7cm打孔器在菌落边缘打下菌片，每个250mL三角瓶盛诱导果胶酶液体培养基100mL，加4个菌片，25℃下，110rpm振荡培养10天。在4℃，16000g下离心20min，取上清液。然后用Millipore公司的Amicon 8400超滤浓缩系统，内含10kDa超滤膜，浓缩约200倍，测多聚半乳糖醛酸酶活性和蛋白含量，保存于-20℃冰箱中备用。

采用Amersham Biosciences的全自动蛋白层析系统AKTA purify HPLC，预先用内含0.15mol/L NaCl，pH4.5的0.02mol/L醋酸钠缓冲液，平衡120mL的Sephacry S-10016/10凝胶柱，上述粗酶液上样量为2mL，用凝胶柱平衡缓冲液洗脱1.5倍柱体积，流速2.5mL/min，收集4mL/管。检测洗脱液在OD₂₈₀的吸光值，可见两个蛋白峰A和B，如图1所示。测各管收集液的PG活性表明，15-48收集管中存在PG活性，如图2所示。合并每次层析收集的酶活性大于粗酶液活性25％洗脱液，用Millipore公司的10kDa超滤离心管浓缩脱盐，获得组分BI，测浓缩液酶活性及蛋白含量。

BI每次上样2mL于20mL的Sepharose SP XL 16/10强阳离子交换层析柱中，预先用pH4.5的0.02mol/L醋酸钠缓冲液平衡柱，用pH4.5的0.02mol/L醋酸钠缓冲液配置的0.75mol/L NaCl溶液进行线性梯度洗脱30倍体积，流速4mL/min，收集梯度洗脱部分，4mL/管。经过Sepharose SP XL 16/10强阳离子交换柱层析后，可见一明显的蛋白洗脱峰C，如图3所示。PG活性检测表明，从60-74收集管存在PG活性，如图4所示。合并每次层析收集的酶活性大于BI活性25％洗脱液，经10kDa超滤离心管浓缩脱盐，获得组分CI，测浓缩液酶活性及蛋白含量。

CI每次上样0.5mL于1mL的Sepharose FF CM弱阳离子交换层析柱，用pH4.5的0.02mol/L醋酸钠缓冲液配置的0.75mol/L NaCl溶液进行线性梯度洗脱30倍柱体积，流速1mL/min，收集0.5mL/管，OD₂₈₀检测为一对称的蛋白洗脱峰D，如图5所示，39-54收集管的有PG活性，如图6所示，收集梯度洗脱峰，合并数次层析的收集洗脱液，经10kDa超滤离心管浓缩脱盐，获得组分DI，进行IEF-PAGE同工酶电泳染色只检测到PGC1，如图7所示，SDS-PAGE电泳显示DI为一条蛋白带，如图8所示，即为达电泳纯的多聚半乳糖醛酸酶PGC1。

各纯化步骤组分析表明，纯化的PGC1酶活性为260.52Units mg^-1.min^-1，与培养液相比较纯化了51.59倍，见表1。

                                          表1PGC1纯化表

  纯化步骤  总蛋白  (mg)  总活性  (U)  回收率  (％)  比活性(Units  mg^-1.min^-1)  纯化倍  数  16000g离心上清  PM-10膜浓缩液  SephacrylS-10016/10(BI)  SepharoseSPXL16/10(CI)  Sepharose CM Hitrap(DI)  268.1  38.88  4.10  0.32  0.16  13539.05  297.04  98.81  49.34  41.68  100  0.022  0.0072  0.0036  0.0031  5.05  7.46  24.51  154.2  260.52  0  1.48  4.85  30.53  51.59

超薄层IEF-PAGE电泳后，以标准等电点电泳迁移率作标准曲线的，从曲线中查出PGC1的等电点约为7.85，如图7所示。

用SDS-PAGE电泳，以标准分子量对数为纵坐标，迁移率为横坐标作直线回归图，以回归方程y＝3.1554x²-38.239x+131.33(R＝0.997)计算出PGC1的相对分子量为42.3kDa，如图8所示。

由中国科学技术大学生命科学院协助测定的PGC1酶蛋白N-末端序列为Asp Pro Cys Ser Val Thr Asp Tyr Ser Gly Leu Ala Thr Ala Val Ser Ser Cys Thr ArgIle Val。

香蕉枯萎病菌4号生理小种菌株，低温保存菌株接种在加有香石竹叶片的PDA平板培养基上，25～28℃培养3～4天，过滤除去菌丝，提取病菌总RNA，于-70℃保存。

低温保藏的病菌菌株经活化在液体培养基：NH₄HNO₃ 1.0g、KCl 0.2g、FeSO₄ 0.01g、KH₂PO₄ 0.2g、ZnSO₄ 0.01g、蒸馏水1000mL。Sigma公司产柑桔果胶5g，羧甲基纤维素钠5g，培养4天，用2层普通滤纸以布氏漏斗滤出菌丝，经双蒸水(ddH₂O)充分洗涤，真空泵抽干水分。改进OMEGA公司的真菌RNA抽提纯化试剂盒E.Z.NA FungaL RNA Kit方法提取总RNA。其过程为：首先将抽滤收获的菌体放入研钵中，加液氮速冻后研磨成粉末，取约10-20mg粉末转移到用液氮预冷的1.5mL离心管中，向离心管中加入600cRNA裂解液RFL和12μLβ-巯基乙醇快速混匀，振荡10秒，使菌丝粉末完全溶解。然后加入140μL RNA抽提液SP，颠倒混合数秒钟，冰浴15分钟，室温离心10000g，10min，吸取上清，再加入140μL RNA抽提液SP，重复抽提一次，以完全除去除菌丝体中的蛋白质和多糖。接着吸取上清，加入等体积异丙醇，室温离心10000g，10min，弃上清，离心管倒置于干净滤纸上，流干其中的液体。加350μL 65℃预热RB缓冲液，350μL溶解RNA沉淀，加入350μL75％的无水乙醇，剧烈振荡混匀。再将混匀的样品移入HiBind RNAspin吸附柱中，放入2mL离心管中，室温离心10000g，30sec，取出吸附柱，倒掉离心管中的滤液。吸附柱中加入750μL洗脱缓冲液I，室温离心10000g，30sec，取出吸附柱，倒掉离心管中的滤液。吸附柱中加入500μL洗脱缓冲液II，室温离心10000g，30sec，取出吸附柱，倒掉离心管中的滤液，重复一次。最后加入30μL去离子甲酰胺溶液，放入新的1.5mL离心管中，室温离心10000g，1min，所获洗脱液即为提取的RNA。

测得的PGC1酶蛋白N-末端序列，在GenBank中查找同源序列，根据同源序列的氨基酸密码子的偏好性，同时也考虑香蕉枯萎病菌密码子本身的偏好性，利用Omiga 2.0软件设计两条上游简并引物PGA1和PGA2，进行3’RACE(RNA3’端快速扩增)。

PGA1：5’TGCWSCGTSACTGACTACTCYGGC 3’

PGA2：5’CTCGCYACCGCYGTCTCATCYTG 3’

首先合成cDNA的第一链，在200μLPCR管中配制下列反应液：1μL总RNA，4μL 5×反转录缓冲液，10mM的dNTPs(脱氧核苷三磷酸)2μL，40units/μL的RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)0.5μL，20μm的Oligo(dT)₂₀Primer2.5μL，5μ/μL的AMV反转达录酶2μL，加DEPC(焦碳酸二乙酯)处理ddH₂O至总体积20μL。混合均匀后在室温放置10min后移于42℃恒温槽中。42℃保温1h，在冰水中冷却2min。然后以PGA1和Oligo(dT)₂₀进行第一轮RT-PCR，在冰上准备下列反应物：1μL cDNA模板，5units/μL的Pfu Taq 0.25μL，含Mg²⁺的10×Pfu缓冲液2.5μL，25mM的dNTPs4μL，20μm的上游引物PGA10.5μL，20μm的下游引物Oligo(dT)₂₀0.5μL，加入灭菌ddH2O至总体积25μL。混匀后在Hybraid express梯度PCR仪上，进行扩增：94℃，3min预变性；94℃，45sec变性；47.9℃，40sec退火；72℃，1∶30min延伸；35个重复循环，最后72℃，延伸10min。反应结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

然后将第一轮PCR产物稀释100倍用于第二轮巢式PCR扩增。巢式PCR的反应体系为：1μL第一轮扩增DNA，5units/μL的Ex Taq 0.25μL，含Mg²⁺的10×Pfu缓冲液2.5μL，25mM的dNTPs4μL，20μm的上游引物PGA20.5μL，20μm的下游引物Oligo(dT)₂₀0.5μL，加入灭菌ddH₂O至总体积25μL。混匀后在Hybraid express梯度PCR仪上，进行扩增：94℃，3min预变性；94℃，45sec变性；54℃，45sec退火；72℃，1：30min延伸；35个重复循环，最后72℃，延伸10min。反应结束后在1％琼脂糖凝胶电泳检测到一条1200bp的特异DNA条带RPGC1(图9)，用上海申能博彩生物有限公司的凝胶回收试剂盒回收，送上海联合基因公司测序。将该片段克隆、测序后，发现RPGC1全长1222bp(表1)，序列分析后发现，包含PGC1蛋白质N-端的部分序列。在PGC1片断中还包括一个终止密码子TGA。在终止密码子下游还包含一个长69bp的3非编码区，其中包括聚腺苷酸化的信号-TTTATTT-，以及一个含72个腺苷酸的poly(A)。由此证实得到的片段为PGC1基因的3’端的片段。

PGB2以已知RPGC1序列设计5’端磷酸化引物PGB2起始cDNA链的合成，进行5’端RACE。将单链cDNA环化，设计两对序列特异性引物扩增环化的单链cDNA，PGA3和PGAL1为第一轮扩增引物，PGA3和PGLS2为第二轮扩增引物。首先配制反转录反应液：1μL总RNA，4μL 5×反转录缓冲液，10mM的dNTPs 2μL，40units/μL的RNase Inhibitor 0.5μL，20μm的PGB2Primer(引物)2.5μL，5μ/μL的AMV反转达录酶2μL，加DEPC处理ddH₂O至总体积45μL。混合均匀后在室温放置10min后移于42℃恒温槽中。42℃保温1h，在冰水中冷却2min。

然后将PGB2反转录的15μL的cDNA加入的5×Hybrid RNA Degeneration缓冲液(5倍RNA连接缓冲液)5μL，加水至75μL，再加入1μL RNase H，30℃反应1小时。反应结束后加入100μL的灭菌蒸馏水，500μL的100％乙醇均匀混合后在-20℃放置30分钟，进行乙醇沉淀。用的70％乙醇，清洗沉淀两次后将沉淀干燥处理。

在乙醇沉淀的单链cDNA中加入5×RNA Ligation buffe 8μL，40％PEG(聚乙二醇)#6000 20μL，T4 RNA Ligase 1μL，溶解乙醇沉淀的DNA，加灭菌ddH₂O至反应总体积45μL，16℃，过夜(反应15～18h)。取反应液为RT-PCR的模板进行反应，按如下准备反应混合液：

1μL cDNA模板，5units/μL的Pfu Taq 0.25μL，含Mg²⁺的10×Pfu缓冲液2.5μL，25mM的dNTPs4μL，20μm的上游引物PGLS1 0.5μL，20μm的下游引PGA3 0.5μL，加入灭菌ddH₂O至总体积25μL。混匀后在Hybraid express梯度PCR仪上，进行扩增：94℃，3min预变性；94℃，45sec变性；56℃，45sec退火；72℃，1min延伸；35个重复循环，最后72℃，延伸10min。反应结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测。取1μL第一轮扩增DNA，5units/μL的Ex Taq0.25μL，含Mg²⁺的10×Pfu缓冲液2.5μL，25mM的dNTPs4μL，20μm的上游引物PGLS2 0.5μL，20μm的下游引物PGA3 0.5μL，加入灭菌ddH₂O至总体积25μL。混匀后在Hybraid express梯度PCR仪上，进行扩增：94℃，3min预变性；94℃，45sec变性；56℃，45sec退火；72℃，1min延伸；35个重复循环，最后72℃，延伸10min。

PGB2：5’CCAGAGTTGGACTTGATG 3’

PGA3：5’GTTACCTTCAAGGGCAAGACC 3’

PGLS1：5’ACAATGTTTGTGCAAGATGAGAC 3’

PGLS2：5’GGCCGGAGTAGTCAGTCACTGAG 3’

通过PGA3和PGLS1进行扩增得到一条800bp的条带，用PGLS2与PGA3进行巢式PCR扩增，在退火温度内得到了特异性很强的750bp单一条带LPGC1(图10)。目的片段克隆、测序后发现它全长758nt。序列分析后发现，除掉它与RPGC1重叠片段后，还包含120nt序列(表1)，LPGC1中包含N-端全部已测出的22个氨基酸序列(表1下划线部分)和1个起始密码子AUG。起始密码子前有50nt的5’端非编码区。从序列分析结果可以证实，片段为PGC1基因的5’末端片段。将LPGC1和RPGC1从起始密码子到终止密码子的部分合并，得到PGC1cDNA序列。

利用将所获的PGC1cDNA片段推测的氨基酸的序列，PGC1 cDNA的全长序列为1215个核苷酸组成，编码产物N端21个氨基酸残基构成信号肽序列和383个氨基酸的PGC1的成熟蛋白，使用DNA Star软件推测PGC1成熟蛋白的分子量和等电点，推测的成熟蛋白分子量是39.8kDa，等电点7.74。与通过SDS-PAGE和等电聚焦测定的分子量和等电点相吻合。确定该cDNA序列是PGC1蛋白的编码基因。

表1PGC1蛋白的编码基因

cDNA                                                   1      CT      2

3    TCA ACA ACT CTT TGC ATC CTC TTG TCT TTG TCT CAC ACG AAT ATC      47

48   ACA ATG GTT CGA AAC ATC GCT ATT GCG GCT TTG CTG CCA GCT GCC      92

AAl      Met Val Arg Asn Ile Ala Ile Ala Ala Leu Leu Pro Ala Ala      14

93   TTT GCT TCA ACG CTG CCT CGA GAT CCC TGC AGC GTG ACT GAC TAC      137

15   Phe Ala Ser Thr Leu Pro ArgPro Cys Ser Val Thr Asp Tyr    29

138  TCC GGC CTC GCC ACC GCC GTC TCA TCT TGC ACA AAC ATT GTG CTC      182

30  Ser Gly Leu Ala Thr Ala Val Ser Ser Cys Thr Asn Ile Val Leu     44

183  AAC GGT TTC CAA GTC CCC ACT GGC AAG GCT CTT GAT CTA TCC AAG      227

45   Asn Gly Phe Gln Val Pro Thr Gly Lys Ala Leu Asp Leu Ser Lys      59

228  CTC AAG GAC GGC GCA ACC GTT ACC TTC AAG GGC AAG ACC ACG TTT      272

60   Leu Lys Asp Gly Ala Thr Val Thr Phe Lys Gly Lys Thr Thr Phe      74

273  GCC ACT ACT GCC GAT AAC GAC TTT GAT CCT ATC GTC ATT AGC GGA      317

75   Ala Thr Thr Ala Asp Asn Asp Phe Asp Pro Ile Val Ile Ser Gly      89

318  AAT GGC ATC ACT ATA ACT GGT GCA TCT GGC CAT GTC ATT GAT GGT      362

90   Asn Gly Ile Thr Ile Thr Gly Ala Ser Gly His Val Ile Asp Gly      104

363  AAC GGC CCG GCG TAC TGG GAT GGC GAA GGT TCT AAC AAC AAG AAA      407

105  Asn Gly Pro Ala Tyr Trp Asp Gly Glu Gly Ser Asn Asn Lys Lys      119

408  AAC CCA AAG CCC GAC CAT TTC ATC GTT GTC AAG AAG ACT ACC GGC      452

120  Asn Pro Lys Pro Asp His Phe Ile Val Val Lys Lys Thr Thr Gly      134

453  AAC TCA AAG ATC ACA AAC CTG AAC ATC CAG AAC TGG CCC GTT CAC      497

135  Asn Ser Lys Ile Thr Asn Leu Asn Ile Gln Asn Trp Pro Val His      149

498  TGC TTC GAC ATC ACA GGC AGT TCA CAA TTG ACC ATC TCA GGG CTC      542

150  Cys Phe Asp Ile Thr Gly Ser Ser Gln Leu Thr Ile Ser Gly Leu      164

543  ATT CTT GAT AAC AGA CTT GGC GAC AAG CCC AAT GCC AAG AGC GGT      587

165  Ile Leu Asp Asn Arg Leu Gly Asp Lys Pro Asn Ala Lys Ser Gly      179

588  AGC TTG CCC GCT GCG CAC AAC AGC GAC GGT TTC GAC ATC CCG TCC      632

180  Ser Leu Pro Ala Ala His Asn Ser Asp Gly Phe Asp Ile Pro Ser      194

633  AGT GAC CAC GTT ACT CTG GAT AAC ATT CAT GTT TAT AAC CAG GAT      677

195  Ser Asp His Val Thr Leu Asp Asn Ile His Val Tyr Asn Gln Asp      209

678  GAC TGT GTT GCT GTC ACT TCG GGT ACA AAC ATC ATC GTC TCC AAC      722

210  Asp Cys Val Ala Val Thr Ser Gly Thr Asn Ile Ile Val Ser Asn      224

723  ATG TAC TGC TCC GGT GGT CAT GGT CTT AGC ATT GGA TCT GTT GGC      767

225  Met Tyr Cys Ser Gly Gly His Gly Leu Ser Ile Gly Ser Val Gly      239

768  GGC AAG AGC AAC AAT GTC GTC AAT GGT GTT CAG TTC TTG GAT TCG      812

240  Gly Lys Ser Asn Asn Val Val Asn Gly Val Gln Phe Leu Asp Ser      254

813  CAG ATT GTT AAC AGT GAG AAT GGA TGC CGC ATC AAG TCC AAC TCT      857

255  Gln Ile Val Asn Ser Glu Asn Gly Cys Arg Ile Lys Ser Asn Ser      269

858  GGC ACA ACT GGC ACG ATT GAG AAC GCC ACG TAC CAA AAC ATT GCC      902

270  Gly Thr Thr Gly Thr Ile Glu Asn Ala Thr Tyr Gln Asn Ile Ala      284

903  CTT ACC AAC ATC AGC AAA TAT GGT GTC GAT GTC CAG CAG GAC TAT      947

285  Leu Thr Asn Ile Ser Lys Tyr Gly Val Asp Val Gln Gln Asp Tyr      299

948  CTC AAC GGT GGC CCT ACT GGA AAG CCC ACC AAC GGA GTC AAG ATC      992

300  Leu Asn Gly Gly Pro Thr Gly Lys Pro Thr Asn Gly Val Lys Ile      313

993  AGC GGT ATC AAG TTC ATC AAG GTC ACT GGT ACA GTG GCT AGC TCT      1037

315  Ser Gly Ile Lys Phe Ile Lys Val Thr Gly Thr Val Ala Ser Ser      329

1038 GCT CAA GAT TGG TAT ATT CTG TGT GGC GAT GGT AGC TGC TCT GGA      1082

330  Ala Gln Asp Trp Tyr Ile Leu Cys Gly Asp Gly Ser Cys Ser Gly      344

1083 TTC ACT TTC TCT GGA AAC GCC ATC ACT GGT GGT GGC AAG ACT AGC      1127

345  Phe Thr Phe Ser Gly Asn Ala Ile Thr Gly Gly Gly Lys Thr Ser      359

1128 AGC TGC AAC TAT CCT ACC AAC ACT TGC CCT AGC AAG GTC AAA GCG      1172

360  Ser Cys Asn Tyr Pro Thr Asn Thr Cys Pro Ser Lys Val Lys Ala      374

1173 GGA CGA TCA CCA CTC CAT GTT CAC AAA GCT AGA ACC CAG TCA AAG   1217

375  Gly Arg Ser Pro Leu His Val His Lys Ala Arg Thr Gln Ser Lys   389

1218 AGT GGT CTT ACG GTT GTT GCG TGG AAT TGC TGC GGC GGA CAG TTG   1262

390  Ser Gly Leu Thr Val Val Ala Trp Asn Cys Cys Gly Gly Gln Leu

1263 TGA GCT TGG GTC TAT AGT AGT ATT TGT CCG ATA GTC ACT AGG CTT   1307

      ★

1308 ATC TTA GCA ATA CAC TTT ATT TAT CGC AAA AAA AAA AAA AAA AAA    1352

1353 AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA    1397

1398 AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AA                         1426

注：斜体部分为推测的氨基酸序列，一为已知PGC1蛋白N端测序部分，

为PGC1成熟蛋白N端编码氨基酸。

香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶基因及其克隆.ST25

                         SEQUENCE LISTING

<110>华南农业大学

<120>香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶基因及其克隆

<130>1

<160>2

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1426

<212>DNA

<213>Fusarium oxysporum f.sp.cubense

<220>

<221>CDS

<222>(51)..(1262)

<400>1

cttcaacaac tctttgcatc ctcttgtctt tgtctcacac gaatatcaca atg gtt       56

                                                       Met Val

                                                       1

cga aac atc gct att gcg gct ttg ctg cca gct gcc ttt gct tca acg      104

Arg Asn Ile Ala Ile Ala Ala Leu Leu Pro Ala Ala Phe Ala Ser Thr

        5                   10                  15

ctg cct cga gat ccc tgc agc gtg act gac tac tcc ggc ctc gcc acc      152

Leu Pro Arg Asp Pro Cys Ser Val Thr Asp Tyr Ser Gly Leu Ala Thr

    20                  25                  30

gcc gtc tca tct tgc aca aac att gtg ctc aac ggt ttc caa gtc ccc      200

Ala Val Ser Ser Cys Thr Asn Ile Val Leu Asn Gly Phe Gln Val Pro

35                  40                  45                  50

act ggc aag gct ctt gat cta tcc aag ctc aag gac ggc gca acc gtt      248

Thr Gly Lys Ala Leu Asp Leu Ser Lys Leu Lys Asp Gly Ala Thr Val

                55                  60                  65

acc ttc aag ggc aag acc acg ttt gcc act act gcc gat aac gac ttt      296

Thr Phe Lys Gly Lys Thr Thr Phe Ala Thr Thr Ala Asp Asn Asp Phe

            70                  75                  80

gat cct atc gtc att agc gga aat ggc atc act ata act ggt gca tct      344

Asp Pro Ile Val Ile Ser Gly Asn Gly Ile Thr Ile Thr Gly Ala Ser

        85                  90                  95

ggc cat gtc att gat ggt aac ggc ccg gcg tac tgg gat ggc gaa ggt      392

Gly His Val Ile Asp Gly Asn Gly Pro Ala Tyr Trp Asp Gly Glu Gly

    100                 105                 110

tct aac aac aag aaa aac cca aag ccc gac cat ttc atc gtt gtc aag      440

Ser Asn Asn Lys Lys Asn Pro Lys Pro Asp His Phe Ile Val Val Lys

115                 120                 125                 130

aag act acc ggc aac tca aag atc aca aac ctg aac atc cag aac tgg      488

Lys Thr Thr Gly Asn Ser Lys Ile Thr Asn Leu Asn Ile Gln Asn Trp

                135                 140                 145

ccc gtt cac tgc ttc gac atc aca ggc agt tca caa ttg acc atc tca      536

Pro Val His Cys Phe Asp Ile Thr Gly Ser Ser Gln Leu Thr Ile Ser

            150                 155                 160

ggg ctc att ctt gat aac aga ctt ggc gac aag ccc aat gcc aag agc      584

Gly Leu Ile Leu Asp Asn Arg Leu Gly Asp Lys Pro Asn Ala Lys Ser

        165                 170                 175

ggt agc ttg ccc gct gcg cac aac agc gac ggt ttc gac atc ccg tcc      632

Gly Ser Leu Pro Ala Ala His Asn Ser Asp Gly Phe Asp Ile Pro Ser

    180                 185                 190

agt gac cac gtt act ctg gat aac att cat gtt tat aac cag gat gac      680

Ser Asp His Val Thr Leu Asp Asn Ile His Val Tyr Asn Gln Asp Asp

195                 200                 205                 210

tgt gtt gct gtc act tcg ggt aca aac atc atc gtc tcc aac atg tac      728

Cys Val Ala Val Thr Ser Gly Thr Asn Ile Ile Val Ser Asn Met Tyr

                215                 220                 225

tgc tcc ggt ggt cat ggt ctt agc att gga tct gtt ggc ggc aag agc      776

Cys Ser Gly Gly His Gly Leu Ser Ile Gly Ser Val Gly Gly Lys Ser

            230                 235                 240

aac aat gtc gtc aat ggt gtt cag ttc ttg gat tcg cag att gtt aac      824

Asn Asn Val Val Asn Gly Val Gln Phe Leu Asp Ser Gln Ile Val Asn

        245                 250                 255

agt gag aat gga tgc cgc atc aag tcc aac tct ggc aca act ggc acg      872

Ser Glu Asn Gly Cys Arg Ile Lys Ser Asn Ser Gly Thr Thr Gly Thr

    260                 265                 270

att gag aac gcc acg tac caa aac att gcc ctt acc aac atc agc aaa      920

Ile Glu Asn Ala Thr Tyr Gln Asn Ile Ala Leu Thr Asn Ile Ser Lys

275                 280                 285                 290

tat ggt gtc gat gtc cag cag gac tat ctc aac ggt ggc cct act gga      968

Tyr Gly Val Asp Val Gln Gln Asp Tyr Leu Asn Gly Gly Pro Thr Gly

                295                 300                 305

aag ccc acc aac gga gtc aag atc agc ggt atc aag ttc atc aag gtc     1016

Lys Pro Thr Asn Gly Val Lys Ile Ser Gly Ile Lys Phe Ile Lys Val

            310                 315                 320

act ggt aca gtg gct agc tct gct caa gat tgg tat att ctg tgt ggc     1064

Thr Gly Thr Val Ala Ser Ser Ala Gln Asp Trp Tyr Ile Leu Cys Gly

        325                 330                 335

gat ggt agc tgc tct gga ttc act ttc tct gga aac gcc atc act ggt     1112

Asp Gly Ser Cys Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Asn Ala Ile Thr Gly

    340                 345                 350

ggt ggc aag act agc agc tgc aac tat cct acc aac act tgc cct agc     1160

Gly Gly Lys Thr Ser Ser Cys Asn Tyr Pro Thr Asn Thr Cys Pro Ser

355                 360                 365                 370

aag gtc aaa gcg gga cga tca cca ctc cat gtt cac aaa gct aga acc     1208

Lys Val Lys Ala Gly Arg Ser Pro Leu His Val His Lys Ala Arg Thr

                375                 380                 385

cag tca aag agt ggt ctt acg gtt gtt gcg tgg aat tgc tgc ggc gga     1256

Gln Ser Lys Ser Gly Leu Thr Val Val Ala Trp Asn Cys Cys Gly Gly

            390                 395                 400

cag ttg tgagcttggg tctatagtag tatttgtccg atagtcacta ggcttatctt      1312

Gln Leu

agcaatacac tttatttatc gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa   1372

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa         1426

<210>2

<21l>404

<212>PRT

<213>Fusarium oxysporum f.sp.cubense

<400>2

Met Val Arg Asn Ile Ala Ile Ala Ala Leu Leu Pro Ala Ala Phe Ala

1               5                   10                  15

Ser Thr Leu Pro Arg Asp Pro Cys Ser Val Thr Asp Tyr Ser Gly Leu

            20                  25                  30

Ala Thr Ala Val Ser Ser Cys Thr Asn Ile Val Leu Asn Gly Phe Gln

        35                  40                  45

Val Pro Thr Gly Lys Ala Leu Asp Leu Ser Lys Leu Lys Asp Gly Ala

    50                  55                  60

Thr Val Thr Phe Lys Gly Lys Thr Thr Phe Ala Thr Thr Ala Asp Asn

65                  70                  75                  80

Asp Phe Asp Pro Ile Val Ile Ser Gly Asn Gly Ile Thr Ile Thr Gly

                85                  90                  95

Ala Ser Gly His Val Ile Asp Gly Asn Gly Pro Ala Tyr Trp Asp Gly

            100                 105                 110

Glu Gly Ser Asn Asn Lys Lys Asn Pro Lys Pro Asp His Phe Ile Val

        115                 120                 125

Val Lys Lys Thr Thr Gly Ash Ser Lys Ile Thr Asn Leu Asn Ile Gln

    130                 135                 140

Asn Trp Pro Val His Cys Phe Asp Ile Thr Gly Ser Ser Gln Leu Thr

145                 150                 155                 160

Ile Ser Gly Leu Ile Leu Asp Asn Arg Leu Gly Asp Lys Pro Asn Ala

                165                 170                 175

Lys Ser Gly Ser Leu Pro Ala Ala His Asn Ser Asp Gly Phe Asp Ile

            180                 185                 190

Pro Ser Ser Asp His Val Thr Leu Asp Asn Ile His Val Tyr Asn Gln

        195                 200                 205

Asp Asp Cys Val Ala Val Thr Ser Gly Thr Asn Ile Ile Val Ser Asn

    210                 215                 220

Met Tyr Cys Ser Gly Gly His Gly Leu Ser Ile Gly Ser Val Gly Gly

225                 230                 235                 240

Lys Ser Asn Ash Val Val Asn Gly Val Gln Phe Leu Asp Ser Gln Ile

                245                 250                 255

Val Asn Ser Glu Asn Gly Cys Arg Ile Lys Ser Asn Ser Gly Thr Thr

            260                 265                 270

Gly Thr Ile Glu Asn Ala Thr Tyr Gln Asn Ile Ala Leu Thr Asn Ile

        275                 280                 285

Ser Lys Tyr Gly Val Asp Val Gln Gln Asp Tyr Leu Asn Gly Gly Pro

    290                 295                 300

Thr Gly Lys Pro Thr Asn Gly Val Lys Ile Ser Gly Ile Lys Phe Ile

305                 310                 315                 320

Lys Val Thr Gly Thr Val Ala Ser Ser Ala Gln Asp Trp Tyr Ile Leu

                325                 330                 335

Cys Gly Asp Gly Ser Cys Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Asn Ala Ile

            340                 345                 350

Thr Gly Gly Gly Lys Thr Ser Ser Cys Asn Tyr Pro Thr Asn Thr Cys

        355                 360                 365

Pro Ser Lys Val Lys Ala Gly Arg Ser Pro Leu His Val His Lys Ala

    370                 375                 380

Arg Thr Gln Ser Lys Ser Gly Leu Thr Val Val Ala Trp Asn Cys Cys

385                 390                 395                 400

Gly Gly Gln Leu