减毒活寄生虫疫苗

摘要

本发明特别地涉及顶复门(Apicomplexa)和锥虫科(Trypanosomatidae)减毒活寄生虫，涉及在疫苗中和这种疫苗制备中这种减毒活寄生虫的用途。而且本发明涉及包含这种减毒活寄生虫的疫苗，和这种疫苗的产生方法。最后，本发明涉及特异性tet阻抑蛋白融合蛋白和涉及包含这种tet阻抑蛋白融合蛋白的本发明减毒活寄生虫。

说明书

技术领域

本发明涉及顶复门(Apicomplexa)和动基体目(Kinetoplastida)减毒活寄生虫，涉及在疫苗中和这种疫苗制备中这种减毒活寄生虫的用途，涉及包含这种减毒活寄生虫的疫苗，涉及这种疫苗的产生方法，涉及特异性tet-阻抑蛋白融合蛋白和涉及包含这种tet-阻抑蛋白融合蛋白的减毒活寄生虫。

背景技术

在原生动物界中，已知顶复门(Apicomplexa)和动基体目(Kinetoplastida)，更具体地锥虫科(Trypanosomatidae)包含几种出名地致病寄生虫。

锥虫科(Trypanosomatidae)包含属于利什曼原虫属(Leishmania)和锥虫属(Trypanosoma)的寄生虫。

利什曼病是利什曼原虫属(Leishmania)引起的各种疾病表现的术语。在狗和人类中最常常发生这种疾病。该寄生虫由白蛉传播到哺乳动物宿主，并且在世界上所有热带和亚热带地区流行。在宿主中，巨噬细胞摄取寄生虫，在巨噬细胞中寄生虫停留和繁殖，引起慢性发炎过程。临床上，狗中该疾病的特征是：体重减轻，贫血，发热和淋巴结病。常常观察到皮肤损伤。在人类中，多种利什曼原虫属(Leishmania)物种具有感染性，它们中最致病性的是婴儿利什曼原虫(L.infantum)，引起严重的内脏利什曼病(也称为黑热病)，感染脾脏、肝脏和骨髓，并且如果不治疗将是致命的。其它致病性利什曼原虫属(Leishmania)物种是即硕大利什曼原虫(L.major)和墨西哥利什曼原虫(L.mexicana)。

已知多种锥虫物种，其在人类和动物中引起各种不同的疾病。特别地，已知两种锥虫物种是致病性的：布氏锥虫(Trypanosoma brucei)和克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)。

布氏锥虫(T.brucei)物种存在于非洲国家，并且在人类中引起昏睡病和动物(牛、马、猪)中引起非洲锥虫病。布氏锥虫(T.brucei)由舌蝇传播，将锥鞭毛体形式递送到宿主中。

克氏锥虫(T.cruzi)物种主要存在于南美，该寄生虫具有广泛的宿主范围(包括家畜和野生动物)，但是以在人类中引起查加斯病而著名。该寄生虫是由锥鼻虫(象红猎蝽属(Rhodnius spp.)和锥蝽属(Triatomaspp.))传播的。后循环的锥鞭毛体期感染宿主，并且不同于布氏锥虫(T.brucei)，将在不同细胞类型的宿主胞质内部繁殖。宿主细胞破裂后，释放新的锥鞭毛体形式，锥鼻虫可以再次摄取它。

顶复门(Apicomplexa)包含艾美球虫科(Eimeriidae)寄生虫。许多不同的艾美球虫属(Eimeria)物种存在于广泛种类的哺乳动物和鸟类中。感染鸡胃肠道的7种主要物种是禽艾美球虫(Eimeria tenella)，尼氏艾美球虫(E.necatrix)，波氏艾美球虫(E.brunetti)，巨型艾美球虫(E.maxima)，堆形艾美球虫(E.acervulina)，塞前艾美球虫(E.praecox)和和缓艾美球虫(E.mitis.)。这些艾美球虫属(Eimeria)物种都参与家禽球虫病。这使得艾美球虫属(Eimeria)成为家禽中最重要的寄生性疾病的原因，给农民造成了巨大的经济损失。艾美球虫属(Eimeria)感染肠上皮细胞和粘膜下层，引起严重的出血性肠炎，这在年幼的鸟类中引起高死亡率。

这种疾病具有广泛的分布，并且是现代家禽产业中最常记载的影响家禽的疾病。

还已知肉孢子虫科(Sarcocystidae)，包括弓形体属(Toxoplasma)，肉孢子虫属(Sarcocystis)和新孢子虫属(Neospora)，有致病成员。

弓形体属(Toxoplasma)是广泛分布的寄生性感染，存在于几乎所有哺乳动物中，特别是山羊、绵羊和猪中，也存在于人类中。在人类种群中流行可以高达总种群的70％。常常由于食用寄生虫污染的煮得欠熟的肉类而发生这种感染，也可能由于摄入分布在最终宿主猫粪便中的卵囊而发生感染。当动物或人类在怀孕期间被感染时，它可以引起自发性流产或发育中胎儿的先天性弓形体病。这可以引起神经病学后遗症或眼睛障碍。在免疫受损患者中可以发生慢性和致命的感染(脑炎)。

新孢子虫属(Neospora)，特别是犬新孢子虫(N.caninum)是与弓形体属(Toxoplasma)非常相似的球虫寄生虫。然而，与弓形体属(Toxoplasma)相比，新孢子虫属(Neospora)有狗做为最终宿主。犬新孢子虫(N.caninum)诱导其中间宿主流产，并且可以在牛中引起严重的流产发作。怀疑另一种新孢子虫属(Neospora)物种，洪氏新孢子虫(N.hughesi)在马中引起马原虫脑脊髓炎。

许多肉孢子虫属(Sarcocystis)物种存在于牛、猪、绵羊、山羊和马中。经济地，认为Sarcocystis neurona是马中最常见的临床马原虫脑脊髓炎的原因。在美国，50％马对S.neurona是血清反应阳性的。

疟原虫属(Plasmodium)属于血孢子虫目(Haemosporida)，并且已知是疟疾的原因，其由蚊子传播。在人类中描述了4种疟原虫属(Plasmodium)物种，其中恶性疟原虫(P.falciparum)是最致病性和致命的。估测4亿人被感染，每年引起2百万人死亡。最初的临床症状是间歇发烧。最初感染后，疟原虫属(Plasmodium)寄生于红细胞，常常引起贫血。寄生的红细胞被隔离在内脏毛细管中，因此引起组织缺氧。这在大脑中特别严重，产生多发性点状出血，引起可能是致命的水肿和昏迷。尽管主要描述了人类中的疟原虫属(Plasmodium)物种，但是其它疟原虫属(Plasmodium)物种可以感染广泛种类的脊椎动物。

巴贝虫属(Babesia)和泰勒尔梨浆虫属(Theileria)都属于梨浆虫目，有寄生虫物种感染许多哺乳动物物种，并且引起各种不同的疾病。巴贝虫属(Babesia)物种由蜱传播，并且感染广泛的脊椎动物，引起称为巴贝虫病的疾病。该疾病以倦怠、贫血和寄生物血症为特征，在感染动物中引起多器官功能障碍。在晚期出现血红蛋白尿。牛中重要的巴贝虫属(Babesia)物种包括牛巴贝虫(B.bovis)，分歧巴贝虫(B.divergens)，大巴贝虫(B.major)和二联巴贝虫(B.bigemina)。在狗中，犬巴贝虫(B.canis)，罗西巴贝虫(B.rossi)，微小巴贝虫(B.microti)和吉氏巴贝虫(B.gibsoni)主要引起巴贝虫病，并且是常见的死亡原因。已经报道有些巴贝虫属(Babesia)物种，象分歧巴贝虫(B.divergens)和，微小巴贝虫(B.microti)也感染人类。

泰勒尔梨浆虫属(Theileria)是蜱传播的疾病，感染反刍动物，并且是牛中的主要问题。泰勒尔梨浆虫属(Theileria)在白细胞和红细胞中感染和发育。病理学主要是由于白细胞内的阶段。在牛中应该区分两种主要的泰勒尔梨浆虫属(Theileria)物种，小泰勒尔梨浆虫(T.parva)和环状泰勒尔梨浆虫(T.annulata)。小泰勒尔梨浆虫(T.parva)引起东海岸热，一种致死的牛疾病，是各个非洲国家的地方性流行病。东海岸热以高烧、淋巴结病、严重肺水肿和消瘦为特征。环状泰勒尔梨浆虫(T.annulata)感染牛和水牛，首先侵袭淋巴系统细胞，后来做为内部红细胞形式出现在外周血中。环状泰勒尔梨浆虫(T.annulata)的感染通常称为热带泰勒尔梨浆虫病。这种疾病开始于高烧和淋巴结肿大，接种倦怠、加速的脉搏、呼吸速率和厌食。在该疾病末期，观察到贫血，并且最后发生死亡。在马中，马巴贝虫(Babesia equi)(也被再命名为马泰勒尔梨浆虫(Theileria equi))也是主要的病原体。

清楚的是，这些年来已经研究了不同途径抗这些寄生虫的攻击。

与寄生性感染斗争的途径之一是药物学成分的应用，诸如抗球虫剂(anticoccidials)的广泛应用，今天抗球虫剂是家禽球虫病治疗中非常普通的治疗。另一种途径毫无怀疑地是接种。特别地，在存在日益增加抗议抗生素应用的不满情况下，需要新的和有效的疫苗，特别是提供广泛保护的疫苗。

目前，两种不同的方法被用在抗寄生性感染的接种中：用活的减毒疫苗接种和用灭活(杀死)疫苗接种。如下面所概述的，这两种方法都有它们的优点和缺点。

减毒疫苗的主要优点是它接近地模拟了天然感染：它们激活所有阶段的免疫系统，它们能诱导体液IgG和局部IgA，它们诱导了对许多保护性抗原的免疫应答，它们提供了更持久的免疫性和更多的交叉反应。而且，它们花费低，并且在大多数情况下，它们提供了快速免疫性。

减毒疫苗的缺点是发现正确水平减毒作用的困难和回复毒力的可能性(这些是主要缺点)，与受接种者接触的传播和免疫受损人和动物中的问题。

灭活疫苗的优点是如果提供加强，它们就提供了足够的体液免疫性，它们不显示突变和回复(大的优点)，它们可以使用于免疫缺陷患者，并且原则上它们是安全的。

灭活疫苗的缺点是：它们常常不诱导(细胞)免疫性，需要加强，它们不提供局部免疫性(重要的)，它们更昂贵，并且如果灭活低于100％，它们的应用是危险的。

然而，抗寄生虫疫苗的开发是复杂的，但愿是因为与其它微生物比较时，寄生虫的复杂性本身。接下来，即使在顶复门(Apicomplexa)中和锥虫科(Trypanosomatidae)中的各种寄生虫，尽管它们相关，但是它们在其基因组成方面没有足够的相似性以配给同样地应用于所有这些寄生虫的共同减毒位点或失活方法。而且，为了制备减毒活疫苗，必需定位每个寄生虫的适合的减毒靶。为了产生死菌疫苗，人们需要知道通过灭活方法必须保持每个寄生虫的哪种抗原不变。此外，迄今为止，已经证明许多灭活的寄生虫疫苗无效。最后，存在各种不同的感染途径，不同的宿主，宿主中不同的宿主细胞，和生活周期期间甚至经常的宿主改变，这种宿主改变是大多数寄生虫的特征，并且一种寄生虫的宿主改变不同于另一种寄生虫的宿主改变。这也复杂化了疫苗的开发。

因此，迄今为止，抗寄生性感染的疫苗开发是困难的，费时和不是非常成功的。

发明内容

本发明的目的是提供抗顶复门(Apicomplexa)和锥虫科(Trypanosomatidae)寄生虫引起感染的疫苗，该疫苗联合了死疫苗和活减毒疫苗的大多数优点，并且几乎完全没有这些疫苗的缺点。而且，产生这种疫苗的方法普遍地可以应用于顶复门(Apicomplexa)和锥虫科(Trypanosomatidae)寄生虫。

所有顶复门(Apicomplexa)和锥虫科(Trypanosomatidae)寄生虫的生活周期中，存在至少一个时刻，在该时刻中某阶段感染宿主细胞和开始分裂。现在惊奇地发现如果能在此感染时刻或在此感染时刻左右终止核糖体合成，寄生虫仍然进入宿主细胞，并且利用现有的核糖体库分裂几次，因此完美地模拟了天然感染。然而最后，几轮分裂后，后代寄生虫由于核糖体的缺乏而死亡。

其优点有：以最天然途径触发了感染后免疫应答的诱导，好象发生了强毒感染，但是与天然情况相反，该寄生虫将在一段时间后不可避免地灭绝。通过将核糖体蛋白质基因放置于诱导型启动子控制下达到了该目的。

诱导型启动子是可以被有意地开关的启动子。下面将给出这种启动子的例子。因为原则上所有核糖体蛋白质都是稳定、完全功能的核糖体合成所需要的，所以原则上，每种核糖体蛋白质基因都可以用做靶。所有顶复门(Apicomplexa)和锥虫科(Trypanosomatidae)寄生虫都有胞质核糖体，并且它们大多数都有质体核糖体和/或线粒体核糖体。所有这些核糖体都是寄生虫正常发育所必需的。因此，通过将核糖体蛋白质基因放置于诱导型启动子控制下可以获得本发明的活减毒寄生虫，而不论是否该核糖体蛋白质基因编码将掺入到质体、线粒体或胞质核糖体中的核糖体蛋白质。

各种寄生虫之间的核糖体蛋白质序列是高度保守的。因此，下面提供的核糖体序列的DNA探针可以用于检测顶复门(Apicomplexa)和锥虫科(Trypanosomatidae)每个寄生虫中类似核糖体蛋白质。此外，在NCBI蛋白质数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)中可以发现许多不同寄生虫的许多核糖体蛋白质基因序列。

缺少一种核糖体蛋白质已经可以干扰稳定核糖体形成的事实已经在各种植物、动物和微生物中得到了证明。只是做为例子：在果蝇属(Drosophila)中，已经证明80种核糖体蛋白质中一些核糖体蛋白质的突变产生典型表型，例如，细和短的刚毛，延迟的发育，和杂合子中雌性半不育性及纯合致死性。在例如核糖体蛋白质S13和L9中已经观察到伴随着突变的这种表型，称为微小表型(Schmidt，A.，Hollmann，M.，Schfer，U.，Mol.Gen Genet.251：381-387(1996)，-Larssen& S.，Lambertsson，A.，Genetics 143：877-885(1996))。另一个例子是酵母的核糖体蛋白质基因YS3，其编码酵母核糖体蛋白质S3。它的破坏产生不能生存的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)单倍体孢子(Finken-Eigen，M.，Domdey，H.，Khrer，K.，Biochemical andBiophysical research communications 223，397-403(1996))。这些研究证明下调单一核糖体蛋白质就已经能影响核糖体复合物的形成和/或正确的功能。

将要用于在本发明寄生虫中控制核糖体蛋白质基因转录的启动子仅仅需要满足一个先决条件。在寄生虫繁殖期间，它们必需被打开。为了提供具有正常繁殖所必需天然数量核糖体的本发明寄生虫，当然这是必需的。然而，在接受寄生虫做为疫苗的受体宿主中必需关闭启动子。认为如果启动子起始它所控制基因的转录，启动子被认为打开。在本发明中，该基因将是核糖体蛋白质基因。如果启动子控制的基因转录低于在打开情况下基因转录的至少两倍，启动子被关闭。优选地，转录水平低至少3、更优选地4，仍旧更优选地5，6或者甚至7倍。要强调的是无论如何，不需要转录的完全抑制。在寄生虫灭绝前，低水平核糖体蛋白质转录最后将引起寄生虫延长的生命期间。因此它们将稍微更长期间地触发免疫系统。

原则上，存在两种不同的可能：如果不应用某些关闭启动子的条件，启动子就打开，或者如果不应用某些打开启动子的条件，启动子就关闭。

优选地，除非应用接受寄生虫做为疫苗的受体宿主中不存在的一些条件，启动子处于关闭状态。

如果必需，2或更多种核糖体蛋白质基因可以置放于诱导型启动子控制下。如果启动子中所用的诱导型启动子不能被充分地关闭，即，如果诱导型启动子是渗漏启动子，或者在例外的情况下，一种特异性核糖体蛋白质的缺乏不足以去稳定该核糖体，这将是优选的选择方案。

将通过下面的例子解释本发明。

鼠弓形体(Toxoplasma gondii)用猫做为终宿主，并且分别使用食草动物，杂食动物和食肉动物做为随后的中间宿主。在弓形体属(Toxoplasma)的情况下，是寄生虫的卵囊/组织孢囊阶段最终感染人类。人类和恒温动物是接种的靶哺乳动物，因此，弓形体属(Toxoplasma)速殖子是活减毒寄生虫所需要的寄生阶段。因此，速殖子是本发明的寄生阶段，在这个阶段，根据本发明核糖体蛋白质基因被置于诱导型启动子控制下。可以在打开启动子的条件下，用经典的方法繁殖由此制备的重组寄生虫，也称为减毒活寄生虫。在这些条件下，核糖体数量将相同于或接近于天然条件下的核糖体数量。如果为了疫苗目的培养了足够的寄生虫，收集该减毒寄生虫，并且做为疫苗施用。在待接种宿主中，不存在打开启动子的条件，因此启动子将保持在关闭状态。在接种时候，寄生虫和野生型寄生虫一样行动，因为核糖体库与天然状态相当。因此，优选地，感染过程和宿主细胞侵入过程将完美模拟天然感染过程。只要寄生虫在宿主细胞中开始分裂，它也分开其后代的核糖体库。因为，当在宿主细胞中时，(至少)一种核糖体蛋白质基因的启动子位于关闭位置，将存在减少的核糖体从头合成或者甚至不存在的核糖体从头合成。因此，后代将慢慢灭绝。然而，在感染过程的同时，免疫系统的触发已经如同在野生型寄生性感染中一样继续进行。因此，将建立最终的免疫性，好象曾经发生强毒野生型寄生虫的感染一样，而在一轮或几轮感染后，用于免疫性诱导的活减毒寄生虫已灭绝。下面的例子提供了进一步的细节。

除了新孢子虫属(Neospora)利用狗做为最终宿主，并且在例如牛、狗、绵羊和马中引起流产的事实外，犬新孢子虫(Neospora caninum)的生活周期与弓形体属(Toxoplasma)的生活周期相似。因此，新孢子虫属(Neospora)疫苗的方法紧密地相关于上述弓形体属(Toxoplasma)疫苗方法。关于弓形体属(Toxoplasma)，速殖子是根据本发明核糖体蛋白质基因被置于诱导型启动子控制下的寄生阶段。Howe，D.K.和Sibley，L.D.METHODS：13(2)：123-33(1997))描述了用于新孢子虫属(Neospora)的分子遗传学工具的进展。

为了产生活减毒艾美球虫属(Eimeria)寄生虫，裂殖子是根据本发明核糖体蛋白质基因被置于诱导型启动子控制下的寄生阶段。在这种情况下，尽管疫苗不包含裂殖子，但是包含芽胞化卵囊(sporulated oocysts)。这是由于芽胞化卵囊是寄生虫被小鸡正常摄取的形式的事实。为了复制根据本发明制备的最初重组裂殖子，将这些裂殖子引入到小鸡消化道中将足够了。然后小鸡将排出重组卵囊，并且可以分离重组卵囊和直接将其用做球虫病疫苗，例如施用到饮用水的口服疫苗中的活减毒寄生虫。从鸡粪分离卵囊是本领域熟知的标准方法。Kelleher，M.和Tomley，F.M.(Mol.Biochem.Parasitol.97(1-2)：21-31(1998))等描述了艾美球虫属(Eimeria)的基因工程。

例如，从疟原虫属(Plasmodium)寄生虫红血球阶段开始，可以制备本发明的活减毒疟疾疫苗。疟原虫属(Plasmodium)重组子孢子。子孢子是由雌性蚊子注射到(人类)血流中的寄生虫阶段。注射后2分钟内，子孢子感染肝脏，产生裂殖体和裂殖子。接着，裂殖子感染红细胞并且在其中复制。此时，核糖体库必须分配给大量后代寄生虫，并且此时是后代寄生虫逐渐灭绝的时候。此时已经充分地触发了整个免疫系统。这个例子再次示例了基于本发明重组寄生虫的疫苗的优点：它们共有活疫苗的所有优点和灭活疫苗的优点。优选地，用重组红细胞阶段的疟原虫属(Plasmodium)寄生虫或(不太好实践的)重组子孢子进行接种。Crabb，B.S.，等，(Mol.Biochem.Parasitol.90：131-144(1997))和Wu，Y.等，(Proc.Natl.Acad.Sci.，93：1130-1134(1996)和Proc.Natl.Acad.Sci.，92：973-977(1995))描述了用于疟原虫属(Plasmodium)的重组DNA技术。

而且，本发明的活减毒泰勒尔梨浆虫属(Theileria)疫苗可以基于重组裂殖子。可以在淋巴细胞中培养和维持这些裂殖子。正是在淋巴细胞中，裂殖子开始分裂，该分裂与淋巴细胞的分裂同步，而几个游离后代寄生虫将感染其它淋巴细胞，一起引起野生样免疫性的诱导，然而，如其它实例中所述，将产生由于核糖体慢慢增加的缺少而最后灭绝的后代。可以在原代淋巴细胞中繁殖和培养泰勒尔梨浆虫属(Theileria)。参见，例如Shkap V.等，Vet.Parasitol.65：11-20(1996)和Hulliger，L.J.Protozool.12：649-655(1965)。

利用用于重组的裂殖子和/或滋养体，可以制备活减毒巴贝虫属(Babesia)疫苗。可以在红细胞中培养它们。整个方法相似于上述用于泰勒尔梨浆虫属(Theileria)的方法。参见，I.a.Levy，M.G和Ristic，M.Science 207：1218-1220(1980)。

对于肉孢子虫属(Sarcocystis)物种，诸如猪人肉孢子虫(S.suihominis)和S.neurona，子孢子和裂殖子都是本发明重组的靶。而且，原理相同：重组子孢子提供重组裂殖子，并且在缺少从头核糖体蛋白质合成的情况下，这些裂殖子由于缺少核糖体慢慢地灭绝。重组裂殖子可以直接用在疫苗中。参见，例如Murphy，A.J.和Mansfield，L.S.J.Parasitol.85：979-981(1999)和Ellison，S.P.等，Vet.Parasitol.95：251-261(2001)。

就动基体目(Kinetoplastida)而言，已经描述了布氏锥虫(Trypanosoma brucei)(Wirtz，E.和Clayon，C.，Science 268：1179-1183(1995)和Biebinger，S.等，Mol.& Biochem.Parasitol.85：99-112(1997))，刚果锥虫(Trypanosoma congolense)(Inoue N.，等，Mol.& Biochem.Parasitol.120：309-313(2002))和杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)(Yan，S.，等，Mol.& Biochem.Parasitol.112：61-69(2001))的四环素调节的基因表达，并且如下所述，可以调整四环素调节的基因表达以调节核糖体蛋白质基因转录：简而言之，寄生虫的前循环型是转染的靶。四环素阻抑蛋白整合到核糖体RNA重复的非转录间隔区中，使得可以用依赖于四环素的方式调节异源基因(在该参考文献中不是核糖体基因)。为了构建动基体目(Kinetoplastida)的本发明活减毒寄生虫，首先，一起插入额外拷贝的核糖体蛋白质基因和含有一个或多个四环素操作基因元件的启动子。随后，从寄生虫基因组缺失内源基因拷贝。这可以容易地通过同源重组来完成，优选地在重组标记存在情况下进行。这与下述用于顶复门(Apicomplexa)的方法相似。内源核糖体蛋白质基因的直接靶向对于利什曼原虫属(Leishmania)和锥虫属(Trypanosoma)不可行，因为在利什曼原虫属(Leishmania)和锥体虫(Trypanosome)中大多数基因被组织为相同DNA链上邻近基因的大(＞100-500kb)多顺反子簇。因此，一种基因的抑制将引起位于下游所有基因的转录抑制(Myler，P.J.等，Med.Microbiol.Immunol.190：9-12(2001))。

上面给出的例子实际上只是示例。它们决没有限制本发明的范围。在Encyclopaedic Reference of Parasitology，Heinz Mehlhorn，SpringerVerlag(2001)(ISBN 3-540-66829-2)中可以发现各种各样顶复门(Apicomplexa)和锥虫科(Trypanosomatidae)寄生虫的例子和它们的生活周期。因此，对于顶复门(Apicomplexa)和锥虫科(Trypanosomatidae)的每种寄生虫，本领域技术人员利用上面给出的例子和EncyclopaedicReference of Parasitology能正确地确定哪个阶段将是做为制备本发明活减毒寄生虫起点的优选阶段。

属于上述科的许多寄生虫都有各种不同的宿主。只是做为例子：存在巴贝虫属(Babesia)物种，诸如感染狗的犬巴贝虫(B.canis)，感染马、骡和驴的马巴贝虫(B.caballi)，感染牛、野生反刍动物和人类的分歧巴贝虫(B.divergens)。然而，在所有情况下，寄生虫的生活周期相似。因此，上文指出例如抗巴贝虫属(Babesia)的本发明疫苗可以基于重组裂殖子，这适用于所有的巴贝虫属(Babesia)物种。在上述Encyclopaedic Reference of Parasitology，Heinz Mehlhorn，SpringerVerlag(2001)(ISBN 3-540-66829-2)中也可以发现关于一个科中各种物种生活周期的详细内容。

因此，本发明的一个实施方式涉及顶复门(Apicomplexa)和锥虫科(Trypanosomatidae)的减毒活寄生虫，并且它们的特征在于它们包含诱导型启动子控制下的核糖体蛋白质基因。

上面刚刚提到了诱导型启动子的概念。诱导型启动子是在外部因子作用下可以开或关的启动子。这种开关因子可以是生理因子，例如热；这是几十年以来本领域熟知的所有大量热激启动子的触发因素。这种因子也可以是化学性质的。而且，大量这种因子是本领域熟知的。存在了太多本领域已知的诱导型启动子，而不能全部提到它们。这里将提到几个例子。IPTG诱导的Lac启动子可能是最常用的诱导型启动子之一。可以替代的诱导型启动子系统是例如四环素控制的反式激活系统(Baron，U.等，OxfordUniversity Press 25：2723-2729(1995))和蜕皮激素诱导的表达系统(Invitrogen)(Yao，T.P.等，CELL 71：63-72(1992))。

原则上有两种诱导型启动子：在存在一定条件下打开的启动子，和在存在一定条件下关闭的启动子。该条件可以是化学物质的存在。

在本发明该实施方式优选的形式中，所用的启动子是在存在一定条件下被打开的启动子，所述一定条件在宿主中不天然存在。使用这种启动子的优点是一旦将它们施用给寄生虫的天然宿主，它们就自动地处于(或转换到)关闭的位置。这意味着优选地在“人工”条件即，天然宿主中不存在的条件下培养本发明的活减毒寄生虫以进行复制。

优选类型的诱导型启动子是基于操纵基因位点和阻抑蛋白的诱导型启动子类型，并且阻抑蛋白能可逆地结合所述操纵基因位点。然后，通过施用上述“条件”，即加热、化学试剂等存在或缺乏，可以调节阻抑蛋白的结合和分离。

可以非常有效地用在本发明减毒活寄生虫中的诱导型启动子的非常适合的例子，或者更精确地说启动子/操纵基因/阻抑蛋白复合物，是tet启动子/tet操纵基因复合物，进一步也称为tetR系统。

已经描述了这种tetR系统，并且证明它在许多不同原生动物寄生虫中，诸如布氏锥虫(T.brucei)(Wirtz等，Science 268：1179-1183(1995)，Biebinger等.(Mol.Biochem.Paras.85：99-112(1997))中和溶组织内阿米巴(Entamoeba hystolitica)(Hamann等，Mol.Biochem.Paras.84：83-91(1997))中起作用。tetR系统也成功地用在弓形体属(Toxoplasma)中以调节肌球蛋白A的表达(Meissner M，等，NucleicAcids Res.29(22)：E115(2001))。此外，在肠贾第鞭毛虫(Giardialamblia)和杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)中也证明了四环素调节的表达，表明它在寄生虫中的普遍适用性(Yan S，等，Mol BiochemParasitol.112(1)：61-9(2001)，Sun，C.H.和Tai，Mol.Biochem.Parasitol.105(1)：51-60(2000))。

这种复合物如下所述进行工作，并且实施例中更详尽地描述了这种复合物的操作。

原则上，必须进行两步以产生四环素调节的核糖体蛋白质表达：1.四环素阻抑蛋白(tetR)基因的整合和表达和2.在转录起始附近的核糖体蛋白质基因的启动子中一种或多种四环素操纵基因元件的整合。

tet阻抑蛋白基因是编码能结合tet操纵基因位点，因此能阻断邻近基因转录的蛋白质的基因。现在，将该基因置放于组成型启动子控制之下(即，重组寄生虫中组成型)，并且利用重组DNA技术将其引入到寄生虫中。因此，重组寄生虫将合成tet阻抑蛋白。优选地，将tet操纵基因引入到STS上游一个或多个核糖体蛋白质基因的转录起始位点附近，优选地内源启动子中。因此，tet阻抑蛋白将结合tet操纵基因，因此阻断下游核糖体蛋白质基因的转录。然而，在四环素存在的情况下，阻抑蛋白将与tet操纵基因位点分离，因此能使下游基因转录。因此，在四环素存在的情况下，如同在天然情况下一样，重组寄生虫能复制。如果能在体外培养重组寄生虫(对于许多寄生虫包括上述例子的大多数寄生虫都是这种情况)，可以容易地将四环素添加到生长培养基中。如果寄生虫生长需要在天然宿主中繁殖，例如对于艾美球虫属(Eimeria)寄生虫就是这种情况，可以容易地将四环素口服或注射地施用给宿主(这种情况下为小鸡)。应该注意下面事项：细胞外和细胞内寄生虫都摄取四环素。宿主细胞的细胞破裂对该药物对核糖体蛋白质表达调节产生作用是不必要的。

步骤1，可以如上述文献中所述，获得四环素阻抑蛋白基因(tetR)的整合和表达。表明稳定转化和四环素阻抑蛋白基因可能整合的适合和熟知的选择性标记是例如CAT基因(Kim，K.，等，Science 262(5135)：911-4(1993))。其它适合的稳定转染筛选标记也是本领域已知的，诸如DHFR-TS(Donald，R.G.和Roos，D.S.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(24)：11703-11707(1993)，Roos，D.S.等，METHODS 13：112-122(1997))和HXGPRT(Donald，R.G.等，J.Biol.Chem.271：14010-14019(1996)，Donald，R.G.和Roos，D.S.，Mol.Biochem.Parasitol.91(2)：295-305(1998))。

Cre-lox系统也提供了适合的筛选系统(参见，Hardy，S.等，Journ.Virol.71：1842-1849(1997))。

如果tetR系统用做诱导型启动子系统，核糖体蛋白质基因上游启动子可以是例如内源启动子，现在通过在转录起始位点附近克隆tet操纵基因使得它可诱导(参见下面tet操纵基因序列和优选的插入位点的详细内容)。不用说，能提供足够高核糖体蛋白质基因转录水平的任何其它启动子也是适合的。

如果使用另一种诱导型启动子系统，可容易地利用该诱导型启动子，并且缺失内源启动子。然而，如果使用另一种调节元件，其原理相似于tet操纵基因，启动子本身同样可以是内源启动子。而且不用说，能提供足够高下游所克隆的核糖体蛋白质基因转录水平的任何其它启动子也是适合的。

步骤2，用在STS附近含有一个或多个tetO位点(＝tet操纵基因位点)的核糖体蛋白质基因置换野生型核糖体蛋白质基因需要在选定的核糖体蛋白质基因启动子和该基因本身之间插入tet操纵基因位点。Yan S，等.(Mol.Biochem.Parasitol.112(1)：61-9(2001))，Wirtz，E和Clayon，C.(Science 268(5214)：1179-83(1995))和Meissner M，等.(Nucleic Acids Res.29(22)：E115(2001))描述了tet操纵基因。

单一tet操纵基因(tetO)位点的序列是：

5′-TCCCTATCAGTGATAGAGATC-3′。

原则上，选定的核糖体蛋白质基因前面单一tet操纵基因位点的插入足够了。然而，tetR系统和所有生物系统一样不是可以诱导精确地从0％到100％活性，反之亦然。因此，如果需要更强的调节水平，优选地插入2个或多个操纵基因位点。tet操纵基因干扰转录下游基因的RNA聚合酶的结合。因此，优选地，在相对于转录起始位点(这里称为STS)，从核苷酸-100延伸到+3的区域中的某处插入tet操纵基因。而且，在实施例中还描述了如何定位这种STS。

可以用Donald，R.G.和Roos，D.S.(Mol.Biochem.Parasitol.91(2)：295-305(1998))所述的打了就走(hit-and-run)策略进行用包含一个或多个tet操纵基因位点的重组基因置换野生型核糖体蛋白质基因的步骤。

本领域技术人员将能发现利用其它阳性和阴性选择性标记的联合的可替代的方法。例如，HSV胸苷激酶可以用做阴性选择性标记(LeBowitz，J.H.等，Mol.Biochem.Parasitol.51(2)：321-5(1992)，Fox，B.A.等，Mol.Biochem.Parasitol.116(1)：85-8(2001))。

用于本发明重组弓形体属(Toxoplasma)寄生虫构建的分子工具在新孢子虫属(Neospora)中同样可以很好地工作(Howe，D.K.和Sibley，L.D.METHODS 13(2)：123-133(1997))。

在艾美球虫属(Eimeria)中，相同的方法同样适用。只是做为例子：Kelleher，M.和Tomley，F.M.(Mol Bioehem Parasitol.97(1-2)：21-31(1998))证明β-半乳糖苷酶可以在禽艾美球虫(E.tenella)中瞬时表达。

对于泰勒尔梨浆虫属(Theileria)，Adamson，R.等.(Mol.Biochem.Parasitol.114(1)：53-61(2001))已经开发了瞬时转染感染性单核环形泰勒尔梨浆虫(Theileria annulata)子孢子的方法。

在疟原虫属(Plasmodium)中，被突变以赋予对乙胺嘧啶抗性的二氢叶酸还原酶-胸苷酸合酶(dhfr-ts)编码序列，或嘌呤霉素-N-乙酰基转移酶，或曲霉属(Aspergillus)杀稻瘟菌素S脱氨基酶(BSD)基因，或来源于转座子Tn5的新霉素磷酸转移酶II(NEO)基因已经被描述为选择性标记(Wu，Y.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93(3)：1130-4(1996)，Wang，P.，等，Mol.Biochem.Parasitol.123(1)：1-10(2002)，deKoning-Ward，T.F.，等.(Mol.Biochem.Parasitol.117(2)：155-60.(2001))。

相似的选择性标记在巴贝虫属(Babesia)中也起作用。

因此，本领域技术人员能将本发明应用于属于顶复门(Apicomplexa)和锥虫科(Trypanosomatidae)的全部范围的寄生虫。

该实施方式优选的形式涉及属于球虫亚纲(Coccidia)，梨浆虫目(Piroplasmida)或血孢子虫目(Haemosporida)的本发明减毒活寄生虫。

在该实施方式更优选的形式中，减毒活寄生虫属于艾美球虫科(Eimeridiidae)，隐孢子虫科(Cryptosporidiidae)或肉孢子虫科(Sarcocystidae)。

在该实施方式甚至更优选的形式中，减毒活寄生虫属于艾美球虫属(Eimeria)，隐孢子虫属(Cryptosporidium)，弓形体属(Toxoplasma)，肉孢子虫属(Sarcocystis)和新孢子虫属(Neospora)。

在该实施方式另一个更优选的形式中，减毒活寄生虫属于巴贝虫科(Babesiidae)或泰勒尔梨浆虫科(Theileriidae)。

在该实施方式甚至更优选的形式中，减毒活寄生虫属于巴贝虫属(Babesia)或泰勒尔梨浆虫属(Theileria)。

在该实施方式另一个更优选的形式中，减毒活寄生虫属于疟原虫属(Plasmodium)。

还是在该实施方式另一个更优选的形式中，减毒活寄生虫属于锥虫属(Trypanosoma)或利什曼原虫属(Leishmania)。

在甚至更优选的形式中，减毒寄生虫属于墨西哥利什曼原虫(Leishmania mexicana)，婴儿利什曼原虫(L.infantum)或硕大利什曼原虫(L.major)物种或布氏锥虫(Trypanosoma brucei)或克氏锥虫(T.cruzi)物种。

在该实施方式另一个优选的形式中，本发明活减毒寄生虫核糖体蛋白质基因受可被抗生素诱导的诱导型启动子控制。

更优选地，这些抗生素是四环素或无水四环素，或它们的衍生物。

在该实施方式另一个优选的形式中，选定的核糖体蛋白质基因是编码L9，S3，质体-S9或S13，优选地鼠弓形体(Toxoplasma gondii)L9，S3，质体-S9或S13的基因。

SEQ ID NO：1中描述了编码9号大亚基核糖体蛋白质(L9)的基因的核苷酸序列，及包含启动子区的上游序列。

区域        1       2296      启动子      启动子区

区域        2297    2461      e           外显子1

区域        2416    2418      atg         atg起始密码子

基因        2416    4831      cds         编码序列

区域        2462    3838      i           内含子1

区域        3839    4260      e           外显子2

区域        4261        4727       i       内含子2

区域        4728        4834       e       外显子3

区域        4829        4831       终止    TAA终止密码子

SEQ ID NO：2中描述了编码质体9号小亚基核糖体蛋白质(S9)的基因的核苷酸序列及包含启动子区的上游序列。

区域        1           3076       启动子  启动子区

区域        3077        3616       e       外显子1

区域        3156        3158       atg     ATG起始密码子

基因        3156        4325       cds     编码序列

区域        3617        3874       i       内含子1

区域        3875        4034       e       外显子2

区域        4035        4130       i       内含子2

区域        4131        4338       e       外显子3

区域        4323        4325       终止    TAA终止密码子

区域        4326        4338       3′utr  3′UTR

SEQ ID NO：3中描述了编码13号小亚基核糖体蛋白质(S13)的基因的核苷酸序列及包含启动子区的上游序列。

区域        1           1289       启动子  启动子区

区域        1290        1594       e       外显子1

区域        1448        1450       atg     ATG起始密码子

基因        1448        3639       cds     编码序列

区域        1595        2527       i       内含子1

区域        2528        2615       e       外显子2

区域        2616        3489       i       内含子2

区域        3490        3639       e       外显子3

SEQ ID NO：4中描述了编码3号小亚基核糖体蛋白质(S3)的基因的核苷酸序列及包含启动子区的上游序列。

区域    1       1177    启动子    启动子区

区域    1178    1308    e         外显子1

区域    1291    1293    atg       ATG起始密码子

基因    1291    2651    cds       编码序列

区域    1309    1752    i         内含子1

区域    1753    2137    e         外显子2

区域    2138    2249    i         内含子2

区域    2250    2389    e         外显子3

区域    2390    2486    i         内含子3

基因    2487    2748    e         外显子4

区域    2649    2651    终止      TAA终止密码子

区域    2652    2748    3′utr    3′UTR

本发明减毒活寄生虫非常适于用在疫苗中。如上所详尽阐述的，这是由于它们联合了活减毒疫苗和灭活疫苗的优点，而没有它们缺点的事实。因此，本发明的另一个实施方式涉及用在疫苗中的本发明减毒活寄生虫。

本发明另一个实施方式涉及抗寄生虫感染，并且包含本发明活减毒寄生虫和药物学可接受载体的疫苗。

药物学可接受的载体可以是例如无菌水或无菌生理盐水溶液。在更复杂的形式中，载体可以是例如本领域熟知的缓冲液诸如PBS。

在优选的形式中，本发明疫苗也可以含有免疫刺激物质，所谓的佐剂。佐剂一般包含以非特异性方式加强宿主中免疫应答的物质。大量不同的佐剂是本领域已知的。在母牛疫苗中常常使用的佐剂例子是胞壁酰二肽，脂多糖，几种葡聚糖和聚糖和Carbopol(均聚物)。

疫苗也可以包含所谓的“运载体(vehicle)”。运载体是蛋白质附着但不共价连接它的化合物。这种运载体是例如脂质载体，ISCOMs，dendromers，Niosomes，微粒，特别是基于脱乙酰壳多糖的微粒，多糖基质等，生物微囊，微藻酸盐，脂质体和macrosols，所有这些载体都是本领域已知的。特别用于口服接种中的微粒，更具体地是基于脱乙酰壳多糖的微粒非常适于用做疫苗运载体。

其中抗原部分包埋在运载体中的该运载体的一种特殊形式是所谓的ISCOM(EP 109.942，EP 180.564，EP 242.380)。

此外，疫苗可以包含一种或多种适合的表面活性化合物或乳化剂，例如Span或Tween。而且，疫苗可以包含一种或多种免疫刺激物诸如细胞因子，例如干扰素。

当与灭活寄生虫比较时，可以施用相对低量的基于上述活减毒重组寄生虫的疫苗，因为在感染期间它们会繁殖自身。因此，每个剂量中非常适合的量范围是10²到10⁷个寄生虫。每个剂量中低于10²个寄生虫的数量不能总是确保所有免疫动物中足够水平的保护。要是只从经济观点考虑，每个剂量中范围是10⁷到10⁸个寄生虫，尽管适合，但不是非常切实可行。

本发明另一个实施方式涉及本发明减毒活寄生虫用于对抗顶复门(Apicomplexa)或锥虫科(Trypanosomatidae)寄生虫所引起感染的疫苗制备的用途。

本发明另一个实施方式涉及本发明疫苗的生产方法，该方法包括本发明活减毒寄生虫和药物学可接受载体的混合。

例如可以皮内、皮下、肌内、腹膜内、静脉内或在粘膜表面诸如口服或鼻内施用本发明的疫苗。

tet阻抑蛋白基因是原核生物来源的基因。因此，该基因的密码子使用在真核生物体诸如本发明涉及的活减毒寄生虫中是次最佳的。因此，本领域技术人员能受到启发而修改tet阻抑蛋白基因的编码序列，使得它对应于真核生物细胞的密码子使用，因此获得合成的tet阻抑蛋白基因。这已经被Meissner M，等.(Nucleic Acids Res.29(22)：E115(2001))完成。当然，人们将预期因为这种合成的tet阻抑蛋白基因已经完全适于真核生物细胞，所以它不能被进一步优化了。而且，人们将预期这种“合成的”tet阻抑蛋白将是真核生物细胞中最适合的阻抑蛋白。原则上，这种蛋白质是与天然蛋白质相同的蛋白质，因此根据定义其最适合与tet操纵基因位点相互作用。

然而，现在惊奇地发现包含融合到天然即原核生物tet阻抑蛋白N末端部分的异源基因(一部分)的重组基因编码的融合蛋白，甚至比完全适应真核生物的“合成的”tet阻抑蛋白提供更显著优越的tet操纵基因调节。

因此，这种融合蛋白将是优选用在本发明活减毒寄生虫中的阻抑蛋白。这甚至是更出人意料的发现，因为tet阻抑蛋白3D结构研究预测N-末端融合将不利地干扰DNA结合。然而，在实践中惊奇地发现不是这种情况。

异源基因是编码除了tet阻抑蛋白外蛋白质的任何基因。异源蛋白质是除了tet阻抑蛋白外的任何蛋白质。重组基因是任何人工制备的基因，该基因包含融合到编码tet阻抑蛋白质N末端的tet阻抑蛋白基因一侧的异源基因(部分)。

融合蛋白必须能到达核以与tet操纵基因相互作用。因此，tet阻抑融合蛋白存在一些要满足的先决条件：单体tet阻抑蛋白融合蛋白的最终分子量必须是＜60kD，融合蛋白质的异源部分必须在tet阻抑蛋白N末端侧，并且融合蛋白必须无GPI锚(anchors)，分泌/外泌信号(Secretion/excretion signals)和跨膜区。原则上，满足这些先决条件和(因此)能靶向核的每个蛋白质或其部分都可以用于和tet阻抑蛋白进行N末端融合。

不需要利用全长异源蛋白质进行融合。利用这种异源蛋白的部分就足够了。认为该部分是做为异源融合蛋白的至少10个氨基酸，优选地至少20个氨基酸的片段。优选地，该部分来源于异源蛋白质N末端侧。例如，选定的异源蛋白质是绿色、红色和黄色荧光蛋白质和CAT蛋白质。

因此，本发明的另一个实施方式涉及编码tet阻抑蛋白融合蛋白的DNA片段，其特征在于：它包含tet阻抑蛋白和在tet阻抑蛋白N末端侧融合的异源蛋白或其部分，其中单体形式融合蛋白具有＜60kD的大小，并且融合蛋白质无GPI锚，分泌/外泌信号和跨膜区。

本发明另一个实施方式涉及这种tet阻抑蛋白融合蛋白，其特征在于：它包含tet阻抑蛋白和在tet阻抑蛋白N末端侧融合的异源蛋白或其部分，其中单体形式融合蛋白具有＜60kD的大小，并且融合蛋白质无GPI锚，分泌/外泌信号和跨膜区。

用语“跨膜区”提到的膜是位于细胞胞质和外界之间的这些膜。具体地，这些膜排除了核和胞质之间的膜。优选地，本发明tet阻抑融合蛋白的确有特异地将融合蛋白引导到核的一些信号。这点是清楚的，因为tet阻抑蛋白融合蛋白(如同天然tet阻抑蛋白基因所需要的)必须进入核以便能够调节它所控制基因的转录。

由于它的普遍性特征，tetR系统和tet阻抑蛋白融合蛋白的联合不仅可以用在本发明活减毒寄生虫中，当然也可以用在其它寄生虫中和其它真核生物细胞和生物体中。对于任何基因之表达的调节，这在真核细胞中是广泛适用的。

因此，当这种寄生虫包含与上述tet阻抑融合蛋白(编码遗传信息)联合的tet操纵基因时，本发明减毒活寄生虫更适于做为疫苗的基础。这能够更好地阻断和诱导核糖体基因的转录。

因此，在更优选形式的本发明减毒活寄生虫中，其中通过四环素，无水四环素或它们的衍生物调节基因诱导的减毒活寄生虫包含tet操纵基因和编码上述tet阻抑蛋白融合蛋白的遗传信息。

如实施例中将要说明的，如果串连地克隆一个或多个tet操纵基因位点，上述tet阻抑蛋白融合蛋白的意外特征更显著。用语“串连地”应该在以下意义上做广义地解释：可以直接相互邻近地克隆tet操纵基因位点，或者在两个或多个tet操纵基因位点之间中具有间隔区序列。如上所述，优选地，tet操纵基因位点被克隆在相对于STS的-100到+3之间的区域。

因此，在更优选的形式中，本发明的这种减毒活寄生虫不仅包含上述tetR系统和tet阻抑蛋白融合蛋白，也包含2个或多个，而不是1个tet操纵基因位点。

实施例

实施例1

试验过程期间所用的引物：

插入的限制位点被加有下划线。

SEQ ID NO   #     名称            序列5′→3′

5           1     SAG3-FW         CGATAAGCTTCGAATCTCTGAACGGATGTGT

6           2     TUB5-RV         CGAGATCTGGGAATTCAAGAAAAAATGCCAACG

7           3     TETAVR5-FW      CGATCCTAGGATGTCTAGATTAGATAAAAG

8           4     TETPST3-RV      CGTCTGCAGTTAAGACCCACTTTCACATTTAAG

9           5     T3              ATTAACCCTCACTAAAGGGAA

10          6     SAG1/1634-RV    CGATAAGCTTTCGGGGGGGCAAGAATTGTGT

11          7     REV 13A         GCGCCCCATGGTGACGGAGAAAAATCG

                  REV 13B(嵌套

12          8                     GGGAACCGCAAGGTGGGAGCGGAGAAC

                  引物)

13          9     S13PROMFUS FW   GCATAAGCTTCCTCGCAGAGATTGTCAGTG

14          10    S13PROMFUS RV   GCATTCTAGAGGCAGACATGCCCTTTCCAGG

15          11    LACZ-AVRII FW   CGATCCTAGGATGACCATGATTACGGATTCACT

16          12    LACZ-PSTI RV    CGATCTGCAGTTATTTTTGACACCAGACCAA

                                  GGTTCTCCCCTCAATCCCTATCAGTGATAGAGATCTC

17          13    S13INSTETO+3FW

                                  TCTTCCTTTCTCT

                                  AGAGAAAGGAAGAGAGATCTCTATCACTGATAGGGAT

18          14    S13INSTETO+3RV

                                  TGAGGGGAGAACC

                                  CTACGCGGCCGACGGTCCCTATCAGTGATAGAGATCT

19          15    S13SUBTETO-23FW

                                  TCCTCGACGGGTTC

                                  GAACCCGTCGAGGAAGATCTCTATCACTGATAGGGAC

20          16    S13SUBTETO-23RV

                                  CGTCGGCCGCGTAG

21                S13NOTI-FW      CGATGCGGCCGCGTCAGTGCATGACACAACCG

22                S13SACI-RV      GCTAGAGCTCCTGTAAGTCGCCAGAGAAGCAC

23                M13-REV         AACAGCTATGACCATGATTACGC

24                S13CL FW3       CGATAGTGTGCAATAACAGG

                  HRCHECKII5S13-

25

                  FW              GTCGAGTCCTGTAGGTTCATC

26                HRCHECKIIS13-RV CTCCGAAGGAGTCTCTCAGTG

27                T7              AATACGACTCACTATAG

28                HXGPRT/BGLII-FW CGATAGATCTAAAATGGCGTCCAAACCCATTG

29                HXGPRT/PSTI-RV  CGATCTGCAGTTACTTCTCGAACTTTTTGCG

TubYFP/TR-sagCAT(9332bp)的构建

如下所述，逐步改造质粒ptubYFP/TR-sagCAT。首先，利用引物SAG3FW(#1，SEQ ID NO：5)和TUB5RV(#2，SEQ ID NO：6)，通过从ptubYFP/YFP-sagCAT构建体(Llopis，J.等，PNAS 97(8)：4363-4368(2000))扩增鼠弓形体(Toxoplasma gondii)微管蛋白A(tub)启动子，制备构建体ptubCAT/GFP。用HindIII和BgIII消化PCR产物及质粒pdhfrCAT/GFP(Striepen，B.等，Molecular and BiochemicalParasitology 92：325-338(1998))。并且将它们互相连接。这产生了ptubCAT/GFP，其中已经用tub启动子置换了dhfr启动子。所得到的质粒是基于Bluescript pKS+(Stratagene，La Jolla，CA)，并且含有α-微管蛋白启动子，通过BaIII位点将氯霉素乙酰转移酶(CAT)编码序列和绿色荧光蛋白的融合物与该α-微管蛋白启动子分开。

为了获得ptubYFP/TR构建体，将CAT编码序列交换为黄色荧光蛋白(YFP)，GFP编码序列交换为tet阻抑蛋白编码序列(tetR)。通过BgIII和AvrII，从ptubYFP/YFP-sagCAT切下YFP基因，并且连接到ptubCAT/GFP构建体BgIII和AvrII位点之间，置换CAT编码序列。利用引物TETAVR5-FW(#3，SEQ ID NO：7)和TETPST3-RV(#4，SEQ ID NO：8)，通过PCR从大肠杆菌(E.coli)Tn10扩增tetR编码序列(Hillen，W.和Berens，C.，Annu.Rev.Microbiol.48：345-369(1994))，用AvrII和PstI消化，并且在构建体中通过将GFP编码序列交换为tetR编码序列进行连接。所得到的质粒命名为ptubYFP/TR。

最后，CAT筛选盒被插入到tub启动子上游，产生ptubYFP/TR-sagCAT质粒。这是通过利用引物T3(#5，SEQ ID NO：9)和SAG1/1634 RV(#6，SEQID NO：10)，从前述ptubYFP/YFP-sagCAT构建体扩增CAT盒，用HindIII消化，并且连接到ptubYFP/TR构建体唯一的HindIII位点来完成的。

图1中示出了TubYFP/TR-sagCAT的构建和它的全长序列。

实施例2

鼠弓形体(Toxoplasma gondii)核糖体蛋白质基因S13起始转录位点的测定

为了测定核糖体蛋白质基因S13转录的起始，从在Vero细胞中生长的鼠弓形体(Toxoplasma gondii)RHΔHXGPRT速殖子分离RNA。利用GeneRacer试剂盒(Invitrogen)，从总RNA获得基因特异性全长cDNA。利用该试剂盒，将寡RNA连接到全长mRNA末端，用寡dT发生逆转录后，用结合寡RNA的GeneRacer引物及基因特异性引物，通过PCR进行扩增产生产物。然后，可以测定转录起始(STS)。对于核糖体蛋白质基因S13，这可以利用下面引物：REV13A(#7，SEQ ID NO：11)和REV13B(#8，SEQID NO：12)来完成。引物#7与GeneRacer引物一起使用以获得产物，随后，引物#8用于嵌套式PCR。PCR产物显示出3条带；2条弱带和1条强带。分离了显示最大量产物的条带，并且测定STS，表明为位置0。在图3A和3B中，相对于起始密码子表示STS。

实施例3

S13/LZ构建体

为了检测tet阻抑蛋白的诱导表达，利用受S13启动子控制，有或无单一tetO位点存在的lacZ基因制备几种报道构建体。首先，制备质粒S13/lacZ(参见图2最终构建体的结构和序列)，随后如下所述，该质粒用于插入或置换tetO位点序列。

用引物S13PROMFUS FW(#9，SEQ ID NO：13)和S13PROMFUS RV(#10，SEQ ID NO：14)，用PCR从鼠弓形体(Toxoplasma gondii)RH/ΔHXGPRT株系的基因组DNA扩增S13启动子区。利用引物LACZ-AVRII FW(#11，SEQID NO：15)和LACZ-PSTI RV(#12，SEQ ID NO：16)，用PCR从BL21细菌的基因组DNA扩增lacZ编码序列。随后，用HindIII和XbaI消化S13PCR产物，而用AvrII和PstI消化lacZ PCR产物。质粒ptubYFP/YFP-sagCAT用于将ptubYFP部分及CAT筛选盒交换成S13启动子部分。剩余的YFP基因被交换为lacZ基因，产生S13/lacZ质粒。通过定点诱变，S13/lacZ质粒用于插入或置换单一tet操纵基因(tetO)位点序列(5′-TCCCTATCAGTGATAGAGATC-3′)。这是利用QuickChange定点诱变试剂盒(Stratagene)来完成的。在测定的STS附近插入或置换tetO。引物S131NSTETO+3 FW(#13，SEQ ID NO：17)和S131NSTETO+3 RV(#14，SEQ ID NO：18)用于在相对于STS的+3位置插入tetO位点，STS表示为0。引物S13SUBTETO-23 FW(#15，SEQ ID NO：19)和S13SUBTETO-23 RV(#16，SEQ ID NO：20)用于置换相对于STS-43到-23之间的序列为tetO序列。在不存在或存在tetR和(无水)四环素的情况下，用CPRG测定法(Seeber，F.等，Gene 169：39-45(1996))，在鼠弓形体(Toxoplasmagondii)株系RHΔHXGPRT，REP1/2(Meissner，M.等，Nucleic AcidsResearch 29(22)，E115(2001))和tubYFP/TR中检测了这两个构建体S13instetO+3/lacZ和S13subtetO-23/lacZ及S13/lacZ。

图2中示出了S13/lacZ构建体，并且图3A中示出了S13/lacZ构建体中tet操纵基因的置换或插入位点。

L9/LZ构建体

图3B中示出了tetO插入/置换到rp-L9启动子中。

实施例4

带有pTub-YFP-TR-sagCAT的稳定转染子弓形体属(Toxoplasma)寄生虫的筛选

如Roos，D.S.等.(″Methods in Microbial Pathogenesis″InMethods in Cell Biology(1994)，D.G.Russell，编者)所述进行弓形体属(Toxoplasma)寄生虫的电穿孔。

根据Kim，K.，等.(Science 262(5135)：911-4(1993))进行稳定转染子的筛选。

根据Roos，D.S.等.(1994，上文)，再一次进行S13/LZ，S13i+3/lacZ和S13s-23/lacZ的电穿孔。

实施例4的结果

测定电穿孔到tub-YFP-TR株系中、包含单一tet操纵基因的S13启动子驱动的lacZ表达

检测了下面的构建体

a)S13/LZ：这是tub-YFP-TR转染子弓形体属(Toxoplasma)株系，用S13核糖体蛋白质基因启动子控制下的LacZ基因瞬时转染。在该构建体中不存在tet操纵基因位点

b)S13i+3/lacZ：这是tub-YFP-TR转染子弓形体属(Toxoplasma)株系，用S13核糖体蛋白质基因启动子控制下的LacZ基因瞬时转染，该启动子其还带有在相对于STS的位点+3插入的tet操纵基因位点(参见图3A)。

c)S13s-23/lacZ：这是tub-YFP-TR转染子弓形体属(Toxoplasma)株系，用S13核糖体蛋白质基因启动子控制下的LacZ基因瞬时转染，该启动子还带有在相对于STS的位点-23被置换的tet操纵基因位点(参见图3A)。

图3B中示出了tetO插入/置换到rp-L9启动子中的相似构建体。

如图4中所观察到的，在无水四环素和四环素存在和不存在的情况下，如所期望的，tub-YFP-TR产生了相同水平的LacZ。

在不存在无水四环素和四环素的情况下，用构建体S13i+3/lacZ转染引起了一定数量LacZ的产生，该一定数量LacZ是在无水四环素和四环素存在情况下产生的LacZ量的一半。

这清楚地表明在该株系中LacZ转录的可诱导性。

在不存在无水四环素和四环素的情况下，用构建体S13s-23/lacZ转染引起了一定数量LacZ的产生，该一定数量LacZ是在无水四环素和四环素存在情况下产生的LacZ量的1/3。

这清楚地表明在该株系中LacZ转录的可诱导性。

而且，这些结果证明了tet操纵基因位点相对于STS所位于的位点不是非常至关重要的。它也证明了可以通过插入和置换引入tet操纵基因位点。

用构建体电穿孔的瞬时转染子CPRG测定，该构建体包含S13启动子驱动的LacZ基因，该S13启动子包含单一tet操纵基因或双tet操纵基因。

在该测定中，比较了下面构建体：

a)上述S13/LZ，

b)上述S13s-23/lacZ(I)(＝S13s-23/lacZ)，

c)除了另一个tet操纵基因位点已经被克隆到紧邻第一个tet操纵基因下游的事实外，等同于S13s-23/lacZ的S13s-23/lacZ(II)。利用与S13s-23/lacZ(I)相似的技术装配该构建体。

如图5中所示，在不存在四环素的情况下，上述合成的tet阻抑蛋白基因(Meissner)和本发明的融合tet阻抑蛋白基因(tub-YFP-TR)都能阻断LacZ转录。更惊人地，可以清楚地看出，当使用两个邻近tet操纵基因位点时，和单一tet操纵基因位点的使用相比，表达的阻断好3至4倍。

在包含上述合成的tet阻抑蛋白基因(Meissner)的株系中和包含本发明融合tet阻抑蛋白基因的株系中，CPRC测定瞬时转染子，比较lacZ表达。

意外地，从图5中可以看出，当与用上述合成的tet阻抑蛋白(Meissner)发现的阻断比较时，本发明融合tet阻抑蛋白产生了显著更好的LacZ转录阻断。而且，意外地，当与用上述合成的tet阻抑蛋白基因(Meissner)发现的诱导比较时，用本发明融合tet阻抑蛋白基因发现了好得多的LacZ转录诱导。

实施例5

利用同源重组，利用打了就走(hit-and-run)诱变方法，在核糖体蛋白质S13基因座中插入tet操纵基因元件

在核糖体蛋白质S13基因座(S13)的情况下，为了在基因组上特定基因座整合tet操纵基因位点，需要同源重组。为了进行同源重组，需要整合位点上游和下游大的序列部分(在这种情况下是～1200bp)以获得同源重组，而不是非同源重组。如Donald等.(Mol.Biochem.Paras.91：295-305(1998))所述，可以利用次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HXGPRT)基因做为选择性标记，分两步在特定基因座整合序列元件。

详细地，含有HXGPRT盒前面整合位点附近S13基因座一部分的转染质粒将与同源基因组DNA S13基因座同源重组一次，产生假二倍体型I和II(图6)。如所述(Donald等1998，上文)，用霉酚酸和黄嘌呤，在HXGPRT正选择下进行这步。随后，用抗HXGPRT的6-硫黄嘌呤筛选第二次同源重组，引起假二倍体型丧失和速殖子产生，该速殖子有或无整合在S13基因座的tet操纵基因位点(～1∶1比率)。这个方法称为打了就走(hit-and-run)诱变。

为了进行这个方法，首先制备含有DHFR启动子控制下HXGPRT筛选盒的质粒。从鼠弓形体(Toxoplasma gondii)RH速殖子分离RNA。利用SUPERSCRIPTTM II RnaseH-逆转录酶(Gibco BRL)和标准分子生物学方法(Sambrook & Russell：″Molecular cloning：a laboratory manual″(2001)，Cold Spring Harbor Laboratory Press；ISBN：0879695773)，用该RNA制备cDNA。利用引物HXGPRT/BGLII-FW(SEQ ID NO：28)和HXGPRT/PSTI-RV(SEQ ID NO：29)，从鼠弓形体(T.gondii)RH速殖子cDNA扩增HXGPRT编码序列，并且筛选剪接变异体I以进一步使用(Donald等，J.Biol.Chem.271：14010-14019(1996))。用BglII和PstI消化PCR产物和质粒pdhfrCAT/GFP(Striepen，B.等，Mol.Biochem.Paras.92：325-338(1998))，随后，CAT/GFP编码序列与HXGPRT编码序列交换，产生dhfrHXGPRT构建体，命名为pminiHXGPRT。

随后，利用引物S13NOTI-FW(SEQ ID NO：21)和S13SACI-RV(SEQID NO：22)，从鼠弓形体(T.gondii)RH速殖子基因组DNA PCR扩增含有tet操纵基因整合位点(相对于STS的-43/-23)上游(～1200bp)和下游(～1200bp)区域的DNA部分。用NotI和SacI消化该PCR产物和pminiHXGPRT，随后，PCR产物连接到HXGPRT盒下游。最后，如实施例3所述，利用定点诱变，用引物S13SUBTETO-23FW(SEQ ID NO：19)和引物S13SUBTETO-23RV(SEQ ID NO：20)，通过置换插入tet操纵基因，产生pS13s-23/pminiHXGPRT。

如前所述(实施例4)，将环形pS13s-23/pminiHXGPRT质粒电穿孔到RHΔHXGPRT速殖子中。如Donald等.(1998，上文)所述，感染到Vero细胞单层后，开始霉酚酸/黄嘌呤筛选。

根据Kim，K.，等.(Science 262(5135)：911-4(1993))产生稳定转染子后，挑选几个克隆的寄生虫株系。从这些克隆的每个克隆分离基因组DNA。利用引物M13-REV(SEQ ID NO：23)，S13CL FW3(SEQ ID NO：24)，HRCHECK II 5 S13-FW(SEQ ID NO：25)，HRCHECK II S13-RV(SEQID NO：26)，和T7(SEQ ID NO：27)，对这些基因组DNA样品进行PCR分析以检查这些转染子中假二倍体形式的存在或不存在。详细地分析了4个克隆(c4，c5，c6和c9)，并且株系RHΔHXGPRT和Vero细胞的基因组DNA用做阴性对照。使用不同的引物组合(图6)以通过PCR扩增这些样品的基因组DNA，这些引物列为：23/24，25/26，23/26，和25/27，表示SEQ ID NO：23和24引物组合，等等。图7中示出了该结果。

引物组合23/24显示不同克隆中质粒的存在。引物M13-REV(SEQ IDNO：23)与非转染寄生虫(RHΔHXGPRT)缺少的载体部分退火。所有转染克隆都显示了正确大小的条带(2.8kb)，表明电穿孔后，所有稳定的转染子都摄取了质粒，并且在筛选期间保留了该质粒。随后，引物组合25/26显示是否假二倍体形式存在于克隆中。在基因组上，两种引物都位于载体中存在的S13部分的上游(引物HRCHECK II 5 S13-FW(SEQ ID NO：25))或下游(引物HRCHECK II S13-RV(SEQ ID NO：26))。如果假二倍体不存在，将PCR扩增“野生型”S13位置，这产生～2.6kb的产物，正如用克隆c4和野生型寄生虫RHΔHXGPRT可以观察到的。这表明克隆c4是没有假二倍体的稳定转染子，表明发生了非同源重组。克隆c5，c6和c9不存在2.6kb PCR产物，表明这些克隆的确含有假二倍体形式。此外，对于克隆c5和c9，可以观察到当假二倍体存在时所预期的约10kb产物。对于克隆c6没有检测到10kb产物。用引物组合23/26和引物组合25/27进行PCRs以证明p13s-23/pminiHXGPRT载体并置在S13基因座两侧。引物M13-REV(SEQ ID NO：23)位于载体序列中，引物HRCHECK II S13-RV(SEQID NO：26)位于该载体同源S13部分下游基因组上。引物T7(SEQ ID NO：27)位于载体序列中，引物HRCHECK II 5 S13-FW(SEQ ID NO：25)位于该载体同源S13部分上游基因组上。在野生型的情况中，引物组合23/27不与DNA退火，因此没有PCR产物被扩增。在假二倍体情况下，引物组合23/26产生4.6kb产物，并且组合25/27产生2.6kb PCR产物。图7中所示的数据证明实际上，阳性克隆显示了两种组合的正确条带，而阴性样品没有观察到产物。

因此，该PCR分析用于证实成功地进行了用打了就走(hit-and-run)诱变方法，同源重组到例如S13基因座中。

附图说明

图1：TubYFP/TR-sagCAT构建体的描述：

图1A：全部序列：相关区域标在序列下面；限制性酶识别位点标在序列上面。

图1B：TubYFP/TR-sagCAT构建体相关特征和区域的列表。

图1C：TubYFP/TR-sagCAT构建体的图谱。

图2：S13/lacZ构建体的描述：

图2A：全部序列：相关区域标在序列下面；限制性酶识别位点标在序列上面。

图2B：S13/lacZ构建体相关特征和区域的列表。

图2C：S13/lacZ构建体的图谱。

图3：

图3A：rp-S13启动子中tetO插入/置换：

核糖体蛋白质S13启动子部分序列，也标明了相对于STS的+3插入和-23置换位点。也标明了编码区域的最初3个氨基酸。

图3B：rp-L9启动子中tetO插入/置换。

图4：在1μg/ml无水四环素(Atc)存在或1μg/ml四环素(Tc)存在的情况下，没有抗生素，测定用构建体S13/LZ，S13i+3/lacZ和S13s-23/lacZ电穿孔的tubYFP/TR稳定转染子的LacZ表达水平。OD是LacZ表达的指标。横轴的标记表明使用了1.25×10⁶个速殖子(原始制备数量的50％)。

图5：测定用构建体S13/LZ，S13s-23/lacZ(I)和S13s-23/lacZ(II)电穿孔的不同株系(RH，REP，tubYFP/TR)中LacZ表达水平。

RH表示没有tet阻抑蛋白基因的株系。REP表示带有合成的tet阻抑蛋白基因(Meissner)的株系。TYT表示带有融合tet阻抑蛋白基因(tub-YFP-TR)的株系。在这些比较试验中使用相等数量的细胞。如图中所标明的，在四环素不存在或存在的情况下进行所述试验。

图6：第一步打了就走(hit-and-run)诱变后，类型I和II假二倍体形式的形成。

图7：不同克隆基因组DNA上的PCR以测定假二倍体形式的存在。

                         序列表

<110>AKZO Nobel N.V.

<120>减毒活寄生虫疫苗

<130>2002-017-EP

<150>EP 02078953

<151>2002-09-20

<160>29

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>4834

<212>DNA

<213>鼠弓形体

<400>1

cctagttgtg ttcgcaacag tacaccgtcc tgagtgagtc gagaacatca gagatgagca      60

cacgcaatag cggtccgcca agggtgcatt tgtccacatc gggatgcaca gagtggcacg     120

agtcgcacaa aagcagatac tagagacaag gagagagtgc ggcctaacca gaattcgact     180

cagtttcttg acccattcgt tagggtcggt ctcagcctcc ttcaggattt ccgtcaagac     240

atctttgcta gcttcccgct gcagacatga aaggcagtgt cacgcataaa gagccgattg     300

aaacgcagtc acagagatac gaagaaatca aagcccgtgg aaagcgaacg gctgggatgt     360

agctgagaaa gcaaattcac tggcggtgca aagagccaat gaaatcaggg tcgcgtagag     420

gaactataaa acgtgaaaaa cgtgccttcc gagtctcgca aaggtgcgca tcgatcccac     480

atttgagaga aggttgcgag gcagtaataa gggcagggga gaggataaaa tccgatagac     540

ccagttcttg gtctcccaga acggggacag gaccggacgc ctgcaagggt ggatcacaac     600

tccagaggca aagccgccac ggaggaacgg aatccatgac cgagtggaat tataacgaag     660

aggtgtttgt cgtcggaatg gtgccaagac acaaaaaaag aaatgtttag acgctcgact     720

gtgcactagc ggggggcggg gtgcaaaagg gacgagtgtg ctcagtggtt cggaggtaac     780

tgaaaaaacg gtgcaaaata tggagcctta cgtggagccg cagggggcag aacagatgtc     840

tcagaagaaa gtccgagaga acagaagaaa aacgagaaaa gtgatgggcg actcatgcag     900

agtggcgcga cgagtctgtc tctcagacga gcttaccagt gctgggcgga ggtaaaggaa     960

agaagtcaag acgcggacct tgaggggggt ggacagcatg atgaatcgct gatgtatgta    1020

ctttagaagc gcaggagtta agagtcgagc ggcatggcag gacgaccagt tgtcctttat    1080

gcttcgcaga taggcaatat atctgctgct gagggcctca tttctggaga gttgcgttgt    1140

ccctgtcgtc gcctcatcct ttatctccgt gtttgtctct tccagggcag ccttctgact    1200

accgcccaac gggcttcctt cttcggattc catttgagat agccgtagaa gcagaggaag    1260

agccgtcaga acgcttgccg cggcagaaaa acacttaaag ggcgtcacaa gattgatata    1320

ggcaagagga atggacgtca acaggctgat tcataagtga cgctcccagt aagtggcgga    1380

cagccatgaa aatgagcggc cgagtttgca gaaacagaga aagaggtctg catcctggcg    1440

aagagccgcc ggacaccctg cttctctttc acagttcgta ggtgccaaga ccaggaccaa    1500

attatcgccc ttcttagcaa accttgagcc gagttaccgg agaggttagc cgaaaaagaa    1560

tcgaaacgaa gacgccattt tttgtctcca ttgcacacgg acggaccgta gcttgtctct    1620

cagcatatct tacgacgttt tgcggctgtt atcgctaaca caccacaaag agaaatggtt    1680

tatcgaaaaa cttgttagcc ggatggtaaa gagatgcaga aggcagtccg cagtaattcg    1740

gttttcgtca gttgtggcgt gctggcacac tcacgttttt ccagcgtcac atgctgcctg    1800

attcacgcag aaactgcatg tgcgctgcgt gtctcgcctg cctcaggatg cccttgtcgg    1860

ccgatagtga ggaaggaaaa acggctccag caaaatgttg gttctattcg gcgagtgccg    1920

gtattccttc cacaaggtcg agacaccgtc gagtgttttc cttccggact gaaccccgga    1980

aaagtcactt tgcaccgtag attccacgtg ctccagcgcg gctgtcaatt ttcgacactg    2040

cgcgaacggc ttgccaacaa gaccaggctc gcgcgcccgg cttttcacat tcccgacggc    2100

ttatatacgg aaggctttgc caggcgtatt ctggccgcgt ggggtcgaaa gaaagtcgaa    2160

aaagagcatg cttgtcaagt gcatgcggcc atgtaggttg ctaggacccc tgttaaattt    2220

ccagggtgcg gggcaactaa gtggcctctc ttcgcgtcgt cttcggactg ttctctgggt    2280

tggcctcgct tcgccacaga cacttgtcga cgcgtctcag ggagtctgag cccgttgtat    2340

ttttttcgct gtctttttgg cggttcccgt ttcccctcga ctgccgactc tcccctctcc    2400

cgctccgtcg ccaccatgaa gtctgtttat gcctgtgaga ctatcaccat ccctgcggga    2460

ggtaagtttc tcgacctacg agagggtgaa ctgcggagaa gacgaatgaa acattgcccc    2520

gcttgatctt tgagggagag ttgccagatt ctgcggctcc acagccctcg ttttttttcc    2580

tcccgcatgt gttagatgtg tcccgacccc gagggaagcg atcgacacgc tgggaaggaa    2640

cgcccgatga gcggaaaagt tttggaattc aggccccgat gcgcaaagtg gcaagtgtct    2700

tggaccccac tgaggaagcc gaacagcagc attttacaga tcttcgccac tgaggagggg    2760

ggcggatctg ggaggtgaag aggcgcggaa ccgtgttcca cttggctttt ctccgcattc    2820

gctgtgtctg ctctgcgtca aaaatccgca tgctttgttg tcattcaaag aggtcatctg    2880

ggcgccttgt tctttgttct gccgcatcca caacagtctg acccgccaga gaatacggtc    2940

tgttctgtcc ggtgactggc gatggggaaa tgggggaaac tgtgtcgtca gcgagtgaag    3000

gcgtttttta gtggaatttc tacattgtgc aagcacacag aaggtgtccc gtgctaatat    3060

ctggaacagt agattatgat taggtagtgg aacagggaga gcgtctgttg tacatcactg    3120

tctgcactcg tttgtactac aacgaagttg ttgatgcgct gacttgggtg tcgattgcat    3180

agacatagcg tggaaaagta gaagacaggg ttgtatgcga ggctctgtgt gcacctgttt    3240

catgtggaca agaccaccgg gcatatgctg gctgttgctt caacacgctg ccgaaacatg    3300

tcacggcgtt gcgggggaaa ggagtcgttg tagaaaccat agagagagtt gaggtagctc    3360

ttgatgtctc gcaaaaatgg gactggcacc tgttgtctgt gtcttcgatt aacacgagcg    3420

ccgccactgc gtttgatgct cgctaactgg gcagcgtcgt gtacgtacag ctcgaatagc    3480

gtaattgtgt gtttttgtac tctttctgtt tgagtttcat caaagagggc cagccacaaa    3540

atgggagcag ggggatattg gagggcatat gataagtgcc gcctgtgtgc atacttctag    3600

aatagacagg aattcgagag cgaagctgtc tgaacagaga tctgcaggtt ctggtttgac    3660

tgtgtaggca ggtttctgta gcgacgggag tcgcaatgca gagtgccgct tggtattggt    3720

tgtttcaaga tgtttgcatc cctctgagag caatcgcttt ttgtcctgtt ttgcgtgtct    3780

ctcggctgtg tgccttctga aagaaaatgt tgcatccgtt tgcggttttc tgctgcagtc    3840

acggtggatg tgaagtcgcg ggtggtgact gtgaagggca agtaggcgaa atcacgcgtg    3900

cattccgcca cctccctgtc gacatccaga agaccaagtc tggaaaccga ctgaaggtcg    3960

agatgtggta tggaacctgc acagacctca gctgcatccg cacgctgtgc tctcacatca    4020

agaacatgtt cactggtgtg atgaagaagt tccagtacaa gatgcgcttc gtgtatgcac    4080

attttcccat caacgtgaac atcagcggca acggaactgt cgtcgaaatc cgcaacttct    4140

tgggcgagga gcgtgtgcgg atcgtcaaga tgcttccggg agttaagtgc gagaaggcca    4200

caaacgtcaa ggatgaaatc gcgctcactg gaactgacgt cgagctcgtc tctcgatcag    4260

gtagaggctc cgaggaactg aaaaggggcg tggtgtgccg gtatgcgcgc atctaatatg    4320

agttttggag gtgcggaggc agcaaggaag cgtatagatg tgggcattta tgaatgtgca    4380

tctatgttgg tgtaattctg tgtatgcctg attgcgacgt gcccacaacc acctccaggt    4440

tggaagaaga gagaaactga taacggtgga ccccgagagc gggattaccg ggaactctcg    4500

gacggtcgtt gtatactcat ctcacgtggg cgagggggag gtggtttgtc cttcgatgtt    4560

gccacagatt tggaggtgag gtgtcttcat atcctgcatg tgtgtctgca ccagcagata    4620

tgttaactgc caggtgagac acgttgtcga gccacaggta tttttgtgta tctgcattgc    4680

attaacatgg tttgtattct tctgttctgt atgcttctct tcttcagcgg ctctcatcca    4740

tcaatcgact ttggtcagga gaaaggatat ccgtaaattt ttggatggca tctacgtgtc    4800

agagaccagc actgtcgaac aggacgcgta aatg                                4834

<210>2

<211>4338

<212>DNA

<213>鼠弓形体

<220>

<221>misc_feature

<222>(565)..(566)

<223>n是a，c，g或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(625)..(626)

<223>n是a，c，g或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(639)..(640)

<223>n是a，c，g或t

<400>2

atcgcatgac ctgatcacgc acggaaagaa acgaatagtc gccatttgaa gtgagatccg      60

tgtgaacagg tcagatcacc gaatcggacg atatatgcac tgaaggcagc ggagccagct     120

gtaaacaaag aactggacag cagctaccgt agctgtagac ggacgcgact tcgagagcgt     180

ccacgtcaaa cctcaccgat ctcgccctca taaagaggca tgtgggctgg gagatacagg     240

ggtgaagaag gagagacaat ttgcgtaagg aggcgaagct ttcgatttcc aggtgcgatt     300

ggagtcgccg ccacaggaga cgcgaactcc tcaaaaacgg acacggagaa gccctgtgca     360

gagacaacgg aaagaatgtc ctgacgagag agttgcaaaa gaatgttgaa caattaaagc     420

aatgatgcag actcgaagat ctaacgcctc gcaggtctca acggttgctg tgatcgccca     480

tttacacagt ccttaagttg agtgcatgag aggctttgca gctcaaggca acgctgtaaa     540

cagcagtgtt atgaatcggt tgccnntatt gaggcgtctg cgtctggtcg gtccatcaag     600

ccaaaagacg cttgtaaaca ggatnntcca ttcgaatgnn gacagacagt ttggcaactg     660

tcatcacacg tgacgttaaa aggcaccgtt aagcgcatga caaggaaagg tcacccgcga     720

tttacacaca ccaggtgccg tagctgtcga tgaatgcgaa ttccagagtt tttctctccg     780

acactacata agctgtaaat gctcattctg tcattcgttg accgtgttta ctacggggaa     840

tcgagaaacg gaatatcaag aacacaggct gtcaaaagac accgcgaaac ctgcttgcgg     900

aatctaacgg ttgcctctgg ccatttatgt gtttctcgcc tgtgccttgt tcgctgcaga     960

cacagcctga gtccgcagcg aggtaaatac gaagaaaaac ctgacgagct ctgtcagatc    1020

tgtacaagcg acagaagcgg attgacagag gagagtgcgc gacggtgacg agagtgagag    1080

tcgactacga agttagagga caccagggtg gcgaatgtgc caatacgcag cttgaaaggg    1140

tcgagatcga caatcgaaac tcacttcact cgttaaacaa tcgagcgttt gctgcaggtt    1200

ttgtttgggg caccccgcct ttgccttccc acccatcgga ttcagcccgc agtactccac    1260

cagcaaaaca gcatcgaggc cgtatgcctc gaagaagtct ccaacctgca aaagaaaggc    1320

accacgtcag agcaaggaaa tcaagactca accaggtgta cagacaccgc ataccgtcgc    1380

caggaacccc ggtctaggac aactttgcta gtgctgctca aaaggtggaa cggagaaggc    1440

gagacagcag actggcggtg ccagttcaaa tcaccactgc ctgaagcgcg gggaccgaga    1500

cagtttgcga tgttggaatt cctgtgacgc acacactttg gaacttgcct gaataatcag    1560

aactttgtcg ggccgaagtc gtttttgttc tcgtacgaag acgaggagag gaggcatatg    1620

cagggagtca ggaaccatcg acggatggtc gaaggaaaga aaagagagct gccgccggga    1680

agcgggacgg gaaagaagcg gcagccttgc caagaacgtc gggtgtactg ccaccgaggg    1740

aggcgggcag ctttctgcag acgaacgcag aacggagcag ttttcttccg ctcttcgact    1800

cggcttcggt cccagcaggt tgtcgcgcgt cggcgcttcc ggacgcttct gcgtgtggaa    1860

gaagcggccg gacaggcggg atgcgtttga agggaaatga gtctgcctgt ctgaaatcgc    1920

gtgaggcaac tgaatggtcg gacgtgcgag gcgtcggtcc ggatggacaa caaaagcgac    1980

gcgtcgagaa gaggcaagaa agggcaagct ggcgcgacag ccacgcaact ggcctgctgc    2040

gtcccttgca gctgccgaaa agaagtccag cagctgatgc tgcccaagag tggcccaccc    2100

tccgcagctg ctgtcgcgtt tcgcgacctt ctgtaaaaaa ctcttggacg tgcggccgtg    2160

catcttgttc gcggaaagca aggcattgat cgaccagtac gcttgcggaa cggagcaggc    2220

taaaccctgc cggcaaccgc gctgtcgcgg aaacatttcc atcagcagtc tcgcgttgac    2280

ctccactgag atgcacacaa gtgaaaagag aatcgtctgc agtttccagc gatagcgcgc    2340

gaaagaagcg gagccgcgga gaggcgcccc cggacccgaa gcgggccgca gagcgcgaga    2400

ggcaatggag caaaaaaatt cctgcctaga ggagaatcgc cattcctggt cacggtcact    2460

gcatacagaa tcccctccca tcgtgggtct gatgaaaaag agaaaaggac accattgtgg    2520

tgtggagccg cggtgccgtc tcggctttcc cgttggtcaa tgcagaagcg cgtccccagt    2580

gactagagcc gaaccaccgg cgactccaat aaaggggcct tctactccat tcaggggtgt    2640

cgcatggtaa aactgagttc tctaatccat ggcacacctc ggaaaaacac tactcacagt    2700

cgtggaatat cttaaatagt cgagcgctcc agagtaccaa gctgcaatgc ccagctgcct    2760

ctcggacaac accggtggac taggcagcgc atcaaggaga caccccccag aggcggcctt    2820

actccagaac atgcgaagga tgtcactgtt gatgcaaaat cagggtactg accatcaagt    2880

gaacagtttc tagagtatcc acgtggctcc aaaaagtaaa gtatggcccc acatcaaacc    2940

gagacyagcc tgtcttcgtt agaaacgctc gtgccgatga cgtcagtgca tgcacgctgc    3000

agacacgacc caaagtagct gatacggtga ggaatgagca tgctgccgat tcaaaatcgt    3060

cagtcgcggc tacagcagtg ttttatgtac atcctcgttt tctttttatt caagaaaccc    3120

aggtaacatg tgcttgaagg gcggacttgg gtagaatggc cctcgaacgt tggtgccgag    3180

gggttcggtg cagccttcca tcctgggctg taatgtgtct tgcgtatttt ctctgcgggc    3240

ctgcagtcgg aactgccttc atagtccctc aacgcaacct gcatagcttt accaggaatt    3300

tccgtgtcct tcccttggtt gggaagcgat ggtttgcagg agatgcagct gtgcaacact    3360

gtaaaggctg gtttcagcaa acgggactct cccctcggtc actcccaggg agtgtcggcc    3420

aggtgacggc ctggtctgcg gtcacagaag gatgtccttt cgaagatgca gtccatgaaa    3480

cttcgcttcc tagtgactgg gtggagagga gtgaacccac agctctaggg acggatgcga    3540

cactctcaag cattccatcc gagctacctg agcctggaac gccgcggaac agcttctcat    3600

ggggcacccg gaaaaggtac tgacgagaga atgctttctc agaattgatc cttcgccttc    3660

tgtgagaaac actgtcacga ggactgcaat cttttcaggt gtatcttttc tgtacagctg    3720

tgcagcgttc acgcttttga ccggagagta cccgtgatgt gacttgcggg ttgggtagag    3780

cctagtccag ctgtctgtca tcttctgaac gggagttagg aagccgtaac aactaatatg    3840

tgcatcgcgg tttctccggt gtgcgcgtgg gcaggtctta tgcaagggtt cggcttcccc    3900

ctggttctgg aaagctgacg atcaacaaca gagacgcagc cgactatctt caagacaatc    3960

catggtggat tcataattgc atcgcgccac tcatggaact gcagctggag aatgaatttg    4020

atatcattgc ggaggtaagc cacgttagct agcttcgggt gacagtcgat atgtttcgca    4080

atgatttctt acagcgtctt tcctacgttt ttgcttgcct tcgacatcag gcccacgggg    4140

gaggcctcgg cgggcagtct ggagcaatca tgcttgctgt cgctcgggag attgtgcgac    4200

agcgaccgga actgcgaccc cctcttcggc gagcaggttt tctgaccgta gacgcaagga    4260

aggtcgagag gaagaaattt ggtcttcgga aggcgagaaa gaaggaacag tacagcaaac    4320

ggtagggtgc gtaggtca                                                  4338

<210>3

<211>3639

<212>DNA

<213>鼠弓形体

<400>3

cctcgcagag attgtcagtg catgacacaa ccgcgaaaag ccggcagccg cggtaatacg      60

gggacgagga aaacgactga gcgtcacaac agaagcagcc gagtaaacgg cgaaggaaat     120

ggaaaggacc caagtaaaat ttcttgaaga atttcagcgc aacaactctg cgggttcttg     180

cgaatagagg aatttcactt cctcatcgtc tgatttatgc tttcatcatc tgccgctcaa     240

cagccgaata aacggttctc ggtcgcttcc ttaaactcta cttcagtagt tgaaactctt     300

ttgcttcacg agccttcgtc tcagccctca ccgtcctgag ttctgtcttt gttgaggaaa     360

gctcccgctg aaaaaacagg actttgtttg cagattttca tgtgtactgg aaagtgagat     420

gtgacttggg gaagtccgct ttaaaatttc cattgttttc tcaaaatgaa aagtctaaaa     480

aatcgaagtg cgtgccccgc gaggaattcc cctctgcaga tttgttttgc atttatatgt     540

cgtttttacg gagaaaagtc ccaagctgct gctccttctc taactagatg ttgaacgcta     600

gcacatatgc accagatgct tctgaagtat acctaaacgc accttgggaa caactgtgct     660

cccattcata aaactcatac aagtcaccaa gcatgccata cccgtgagac ataacaacgg     720

aagctagact actcccccct gttattgcac actatcgaaa aggattccta ggtttctatc     780

ctctgccttt tcctggggca cactgcagag aaactaccgt gcgcgctacc tcccgacgtg     840

cgaggcgata gcaaaacgct tttgaaggaa aaagtcgaga aatcgacgac tgcgtctctt     900

gaatccgaga gagggatcca acccaccgag ttctctgcat gtgcagcatc tgcaagaacg     960

tgataatgca tgaactcgat catcgcctta tctgtgtgca tgcattttcg aaaaagaaag    1020

gcgttttctg cgcggagact cgcgcggagg caagacgaga ctttctcctc ttccaaactg    1080

cgagccacgg gggcgcatgc aatttgaaca tcacgcaaaa tcccaaaacg ggtggggtgg    1140

agccgcaaac ttttttggca tgcagcgttg agcctgagct gcggtggggg cttttgtcgc    1200

gagcgtgggg tgccgcgaga gagcaacgcg gcgctacgcg gccgacgggt cttctgggaa    1260

gcctcgcatt tcctcgacgg gttctcccct caattctctt cctttctctg cgtcttcctc    1320

aggtggcttc gtcaccggtt tttctcctcg cgttcgtgct ccgctgtgtg tccggagtgc    1380

cgcgacagat cgagggcgtt ctccgctccc accttgcggt tcccaatttc gatttttctc    1440

cgtcaccatg gggcgcatgt acggtcctgg aaagggcatg tctgccagcg ctctcccctg    1500

gcgcagaaag cccccgacat ggctgaaaat caagccgtcg gacgtcgaag agcacattgc    1560

caagcttgca aagaagggcc agaccccctc ccaggtactt tcggcgggaa gaagggagaa    1620

aaacgacgga gttgccgcgg ctgcggtctg gggaacaacg gggaagtgca caggaaaaat    1680

acgcgttctc caggtcatcg ggggaaaacg ctcgcgaatc ccagcccctc gactctccgc    1740

agttgttttt cgcagtcttt tcgccctcgg accgttcagc ggagatgggg acgagaatcc    1800

tctccctccc tctgctgagt tttcccgcct ctctcgtgtc tcaaaaaagg ctgcagaaat    1860

gctcgcttgc ctcacagccg gacctctctg ttgaccaaag cgcccagtcg ggatttcttg    1920

cgcggggatg ggctgaagca acgaaacggg atggacgttt gtcggtttcc ccgctgtcgt    1980

gtgacttgct cgaggaacca aagaacggga acgagcggga ggaagccggg ggaaaatttg    2040

cgttcctccc cgcaaaacct atccgcaaaa atgcctcgtt tcgcgaactg tggacggggg    2100

ggaacaacgc gttgtgttgt ttgtgcatac ctgactgaca cggtcctgcg cgtgggtggc    2160

tgggatccga gcggtccgaa gacagtctct cggaaattcg cgagcggacc tactgttgtt    2220

cactgaacgg ttcgcttctc ctgtgaaatc aacatggttt cttgtgcagt ttaccgaaag    2280

tgaggacgac atgttttttg tgaccgtggc gcggccgttc cgcgtcggcg gcaaaccgga    2340

cgatccaatg cggcgaaacc gggggagagt cattgcacac gatgaagtcg cgaacgacca    2400

aggcaatttt ttcggaggtc aaatcacatc tttcgagaag tatgaatgca tgtggaaggt    2460

cgtctgtttt tccattctcc acgttcttct tgcttttggc tgcttgtgct tctctggcga    2520

cttacagatc ggcgtcacac tgagagactc cttcggagtg ccgcaggtta aatccgtcac    2580

tggcaacaag atcctccgta tcctcaagct ccaaggtagg tttacgcgtt aagggaaaca    2640

ctagtttcaa tcttctcgag aacactggag gggcggagat cggggcgcag ctccttccag    2700

gctcaagaag gtctgggagt gaaaaacgaa cgcaaatgca tggacgttgt atatatgtat    2760

gcctggatac ggtgtgaggg tagcgccttt ggcaggagca agtgtgaagt ttgcgtctgt    2820

ttggagaagg aatgacgccg cgtcgtcgcg agggcgttct ctgccttccc ggttctctgt    2880

tctttgagaa agaacgtttt tcgcgtttct ccgcagtgag aggttccctt cgaagaggca    2940

cctagatcag tcgactcgtt cttgaggagg ctggccttcg tcagtgtgtc tgctgcttct    3000

ctcactgcaa cactgtctcc cttgaagaga tttagcgcag atgctgattt tctggcgttc    3060

agctctctgc cgtcgccctc tccaacatgt caagaagcac gttgcttgtc tccctctttg    3120

tccagcaaag tggagttttt gtatgcgtgc aatctatgca atcgagagct tgctgaagcg    3180

acgttgctct cctctctccc aagtgtatgc tctccgcgtt tcttcgtctg gttaaaaaga    3240

aacggcgtcg ctgtcctttc cttcgtggcg aactcggtat tgtttctcaa atccgatcta    3300

ctgtcagccg tccaagtgcc tgtctgacct ctttcctcga ctcccgcatg cacatttaga    3360

gcgcgtggaa gcgactgttc aagtcctcct ctcatctgtt tctctaggtt ctgaagagcg    3420

ccaagtgcgt tttcgaggtc ctccagaccc ggcgccacca gtgttctccc gactgttctt    3480

ttttttcagg tcttgccccc gagctgcctg aggacttgta ctacttgatc aagaaagccg    3540

tgagcgtgcg aaagcacttg gagagaaaca ggaaggacaa ggacgccaag ttccgtctga    3600

ttcttgttga gtctcgaatt caccgtcttg ctcgctaca                           3639

<210>4

<211>2748

<212>DNA

<213>鼠弓形体

<400>4

ctgccgcttc cttaacctct ggaaggggtt gaagcttttt cgcactgaaa cgcgagagac      60

acgaatgagc tgaccacttt tcctgcattc gctggccctg taccggccgc attctctact     120

tcgtacacct tcactgtact cacacccgaa aacttcagaa gtcgggcttt gctgcaggcg     180

actcagggca gaggagaagg tgaacatgcc ttccccaatt ttgcccgcag tttgcctcgg     240

gttgctctct tccccaacct agatgaaatg aaaccactcg atcagccatg tatttcccgc     300

aaaaggttgg ctaccaagcc cacatttggt aagcactctg gaagatgcgg cgccacggaa     360

gcaaccctcg accgcaccgc tgtcgcgggg tctcgacgtc gtccgcgtta acatgatgtc     420

ccgccagagc ttccactgtt ctgacgagta catggatgca ataagcaagt cgtctccact     480

cgtacacgaa tgtccagcac cagcaagctg catcacttca atcgcttggt agcccaacgc     540

ttcttttgtc tgctttctgt ttttgctgcg agactgaccg agcacgaagc ttacacgaaa     600

cgcgaagctc taatcgccta catcccactc cttcttcaga aatggcaggg aagctacact     660

cttgttaacg tctctaggtt taaagggttt gtgcaccgag ccgatcacgt tacggacacg     720

ggctcggggt tcactacgtt acaaggaata aacaactaac gcacaatcct ggttacattc     780

gggcccacag catataaccc ctccggaggc ttgtattcca gctatcgaaa aaaaagcaat     840

tcgatgtaat tccctccaat agccccgagc gyatgtcatc tacaagtggc agccttggta     900

gggacccctc ttgggtatgc ccggacagat gcgccagtga gatctttaac ctccgcgtaa     960

agataggtgt ctgctgtagc ggtgcgcttt tttgtgttgc atgcatgcat caagctggcc    1020

gggacaaggc ggttgccccg atggatggat ggcaaaacca ctgtgctgca ggcagcagcc    1080

ctccctcgga ggctcctctt gtggggcacg gcgcatgccc cagcacaacg tagcggcctt    1140

gtccagcatg gacgaaaagc agtgggggag actcccagag gaaagcgttg ccatgcaaag    1200

gggaaacagg ggatttttgt cacgacgagc tgtttgtcca cttttgtgag gtggtaattt    1260

gacacagttc tcatccctgt tttgtccaag atggcgtcga ccggcaacgt aaggggattc    1320

tccgcactgc attgctctct tgagggagaa aaggccgccg tgaaaacatg ctgttctcca    1380

ccagttggca gattgaagca gtctacggga agatgcacgg tttaatcatt gttgaatttc    1440

gtctgcagtc tgactcttcc gtattggagc acgcgatgtc tcgttgcgtg tgaaatcgta    1500

ctgtctggat ctctttgagt gaagaacacg cggcaggccg cagttttttt gcagggcctt    1560

ggtaccaaat gcttgtttac atatttgcct tgtcgagttc ttttgcatgc ttttagatat    1620

gcgtggagac tgttaaatca acaaccgctc ggagatattg tgcgcggccc agcaatgctc    1680

tggttccact cccgtcgtga gcagggaacg catggtgggc ttttgtggct tctgtgtgta    1740

tgccgtctgc agacttgcaa aaagagaaag ttcgtcaagg atggtgtctt ccaggcggag    1800

ctcaatgagt tcctctcctg cacactgtcc gaggatgggt actcgggagt tgaagtccgt    1860

gtgactccca tccgcacaga gatcatcatc cgcgccacca ggactaggga agtgctcggc    1920

gacaagggaa ggcgtatccg cgaattgacg tcggtcgttc agaagcgatt cggcttcgcg    1980

cccgactcgg ttgagctctt cgccgagcgt gtggagaacc gtggtctgtg cgccatggca    2040

caggcagaat cgttgcggta caagcttcta aaggggcttg cagtcagacg cgcctgctat    2100

ggtgtcctcc gccacatcat ggagtccgga gctaaaggtg agtgctgaca aagtgccatg    2160

tattgtatga ggtaacttga atttagagtg tgaacaaaaa gcattagtcg actgtcacac    2220

gtatcttcgc cggacttttt tcttttcagg ttgcgaggtc gtcgtgtccg gtaaacttcg    2280

cgctcagcgt gccaagagca tgaagttcaa ggatggttac ctgatctcta ctggagagcc    2340

ctcgaagatg ttcgtcgacc aagcaatccg ctcggtgcaa cttcgacaag taagtttcaa    2400

attattaagc ctcagttacg tagtaaaggg caatttgtgt aggagctagt atgtacagag    2460

gcagtgtatg tgtgtttttt ttgcagggtg ttcttggtgt tagagtcaag atcatgctgc    2520

cgcatgaccc ggagggcaaa cgtggccccg cgaacccgct gccggatact attatcgtga    2580

tggatcccaa gccagagatc cccgttgtgc agcctgagga gatggacgag ggagtgctcg    2640

gtccaatgta atgagtgatt cgtgcgtgac tgttgattta tgggaggagg gtgtccacat    2700

gtgcgtgacc gtggagcagc cgcttaacga aattcgcatg ctccttcg                 2748

<210>5

<211>31

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物：SAG3-FW

<400>5

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<210>6

<211>33

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物：TUB5-RV

<400>6

cgagatctgg gaattcaaga aaaaatgcca acg                                   33

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物：TETAVR5-FW

<400>7

cgatcctagg atgtctagat tagataaaag                                       30

<210>8

<211>33

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物：TETPST3-RV

<400>8

cgtctgcagt taagacccac tttcacattt aag                                   33

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物：T3

<400>9

attaaccctc actaaaggga a                                                21

<210>10

<211>31

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物：SAG1/1634-RV

<400>10

cgataagctt tcgggggggc aagaattgtg t                                     31

<210>11

<211>27

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物：REV 13A

<400>11

gcgccccatg gtgacggaga aaaatcg                                          27

<210>12

<211>27

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物：REV 13B(嵌套引物)

<400>12

gggaaccgca aggtgggagc ggagaac                                          27

<210>13

<211>30

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物：S13PROMFUS FW

<400>13

gcataagctt cctcgcagag attgtcagtg                                       30

<210>14

<211>31

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物：S13PROMFUS RV

<400>14

gcattctaga ggcagacatg ccctttccag g                                     31

<210>15

<211>33

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物：LACZ-AVRII FW

<400>15

cgatcctagg atgaccatga ttacggattc act                                   33

<210>16

<211>31

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物：LACZ-PSTI RV

<400>16

cgatctgcag ttatttttga caccagacca a                                     31

<210>17

<211>50

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物：S13INSTETO+3FW

<400>17

ggttctcccc tcaatcccta tcagtgatag agatctctct tcctttctct                 50

<210>18

<211>50

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物：S13INSTETO+3RV

<400>18

agagaaagga agagagatct ctatcactga tagggattga ggggagaacc                 50

<210>19

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物：S13SUBTETO-23FW

<400>19

ctacgcggcc gacggtccct atcagtgata gagatcttcc  tcgacgggtt c              51

<210>20

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物：S13SUBTETO-23RV

<400>20

gaacccgtcg aggaagatct ctatcactga tagggaccgt cggccgcgta g               51

<210>21

<211>32

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物：S13NOTI-FW

<400>21

cgatgcggcc gcgtcagtgc atgacacaac cg                                    32

<210>22

<211>32

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物：S13SACI-RV

<400>22

gctagagctc ctgtaagtcg ccagagaagc ac                                    32

<210>23

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物：M13-REV

<400>23

aacagctatg accatgatta cgc                                              23

<210>24

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物：S13CL FW3    

<400>24

cgatagtgtg caataacagg                                                  20

<210>25

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物：HRCHECK II 5 S13-FW

<400>25

gtcgagtcct gtaggttcat c                                                21

<210>26

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物：HRCHECK II S13-RV

<400>26

ctccgaagga gtctctcagt g                                                21

<210>27

<211>17

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物：T7

<400>27

aatacgactc actatag                                                     17

<210>28

<211>32

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物：HXGPRT/BGLII-FW

<400>28

cgatagatct aaaatggcgt ccaaacccat tg                                    32

<210>29

<211>31

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物：HXGPRT/PSTI-RV

<400>29

cgatctgcag ttacttctcg aactttttgc g                                     31