人高密度脂蛋白受体表达上调剂筛选模型

摘要

本发明涉及一种筛选人高密度脂蛋白受体表达上调剂的方法，其用于从组合化学库、微生物次级代谢产物库以及天然产物库中高通量筛选人高密度脂蛋白受体表达上调剂。

说明书

发明领域

本发明涉及一种筛选人高密度脂蛋白受体表达上调剂的方法，其用于从组合化学库、微生物次级代谢产物库以及天然产物库中高通量筛选人高密度脂蛋白受体表达上调剂。

发明背景

冠心病(coronary heart disease，CHD)等心血管疾病严重危害人类健康，而动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是其主要病理基础。流行病学和临床研究表明，血浆中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平与AS的发病率呈正相关，而高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平则与AS的发病率呈负相关。胆固醇摄取的LDL受体调节通路的发现及他汀类药物的广泛应用使得发达国家心血管疾病致死率下降了50％以上，尽管如此，心血管疾病仍是发达国家和大多数发展中国家的主要健康杀手。

为更有效地降低心血管疾病的危害，在利用现有药物降低血浆中LDL-C的同时，还必须从预防和/或逆转AS的新的治疗靶点出发，来寻找具有新作用机制的药物。

近年来的研究表明，HDL的抗AS作用主要基于HDL参与的胆固醇逆转运(reverse cholesterol transport，RCT)过程，并确定以前发现的清道夫受体SR-BI即为功能性的HDL受体[1]，在RCT过程中起着关键作用，被认为是发现新型心血管药物的有潜力的新靶标[2]。胆固醇逆转运的增强将有利于动脉粥样硬化病灶积蓄的胆固醇减少和病变的逆转，因此可以通过升高SR-BI表达来加速RCT过程，促进机体富余胆固醇酯的清除。

由上述可知，能升高SR-BI基因表达的化合物有望开发成为有效治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的新型药物[2，6，7，8]。

随着组合化学、天然产物化学和药物筛选技术的迅猛发展，药物的高通量筛选(high throughput screening，HTS)已成为新药早期发现的重要手段。构建新型的适于高通量筛选的药物筛选模型是新药发现的基础。基于检测报告基因的药物筛选方法近年来取得了较大的进展和广泛的应用[9]。利用基于检测报告基因的药物筛选方法已筛选到细胞因子、激素等的受体激动剂[10，11]以及人LDL受体表达上调剂[12，13，14]等。

本发明人以人高密度脂蛋白受体SR-BI为靶点，成功构建了新型抗动脉粥样硬化药物的高通量筛选模型，用于从大量微生物代谢产物和待测化合物中筛选人高密度脂蛋白受体SR-BI的上调剂，并利用所述模型获得了具有上调人高密度脂蛋白受体活性的代谢产物。

发明内容

在人和一些动物模型中，血浆中HDL胆固醇(通常被称为“好胆固醇”)与AS的发病率成反比。近年来对HDL功能受体SR-BI与AS关系的研究表明，SR-BI具有抗AS的作用。Trigatti等[4]发现在ApoE敲除小鼠中，如果SR-BI被敲除将更易发生AS。Arai等[5]发现在高脂饮食的LDL受体敲除的小鼠中过量表达SR-BI将明显减少AS损伤。动物实验的结果表明，以提高肝中SR-BI表达水平为目的的药物治疗或基因治疗有可能在动脉粥样硬化的防治中取得突破性进展[2，6，7，8]。

本发明在此基础上成功构建了适于高通量筛选人高密度脂蛋白受体SR-BI表达上调剂的模型，应用于从微生物代谢产物和组合化学库中寻找可以上调人SR-BI基因表达水平的活性物质。

人高密度脂蛋白受体SR-BI基因的转录调控是通过许多转录因子(如C/EBP，SF-1，SREBP-1(固醇调节元件结合蛋白-1，sterolregulatory element binding protein-1)与其上游调控序列相互作用来实现的。人高密度脂蛋白受体基因CLA-1的转录起点上游大约1kb为已知的启动子序列，含有与不同转录因子结合的顺式元件[3]。

为构建本发明所述的人高密度脂蛋白受体筛选模型，可以选择参与胆固醇逆转运过程的细胞作为测试细胞，包括但不限于肝细胞，例如肝癌BEL-7402细胞；外周细胞，例如巨噬细胞或血管壁细胞(血管内皮细胞和血管平滑肌细胞)。对于上述测试细胞而言，能够造成人SR-BI基因启动子活性状态增加的化合物，即为具有上调SR-BI基因表达的活性化合物。其中，可以选择适当的本领域知晓的报告基因替换目标基因SR-BI，从而能够以便于检测的方式反映出所述启动子的活性变化。具体地，可以将待测化合物加入测试细胞培养体系，与不加入所述化合物的对照测试细胞相比，如果其能够影响报告基因，例如荧光素酶的表达，则利用检测所述报告基因例如荧光素酶活性的方法，检测所述报告基因，例如荧光素酶基因表达的改变，从而确定所述化合物是否为人高密度脂蛋白SR-BI表达上调剂。

在本发明的一个实施方案中，本发明人利用PCR的方法，从人肝癌BEL-7402细胞总DNA中扩增出人SR-BI基因CLA-1(CD36 andLIMPII Analogous-1)的调控序列(SEQ ID NO：1)，克隆至荧光素酶报告基因上游。得到用于转染BEL-7402细胞的重组表达载体。将所得重组表达载体转染BEL-7402细胞后，用于检测人高密度脂蛋白受体表达上调剂。其中，荧光素酶基因的表达受人SR-BI基因上游调控序列的控制。

本发明所述模型中采用的以萤火虫荧光素酶基因为报告基因的体系具有不使用同位素，灵敏性好，线性范围宽，在哺乳动物细胞中内源性活性极小，相对廉价等优点。运用荧光素酶分析试剂盒，采用适用于96孔甚至384孔培养板的荧光光度计检测，又具有通量高、系统误差小、可自动化的特点。与传统的受体配基结合法相比，基于检测报告基因的药物筛选方法可以直接给出有关化合物的功能性信息，筛出的阳性化合物更易进入结构优化过程。

利用本发明人建立的人高密度脂蛋白表达上调剂筛选模型，针对小分子类药物的特点，能够在细胞水平上大规模筛选可以影响人高密度脂蛋白受体表达水平的小分子化合物，适于对天然产物、合成化合物、组合化合物库等进行高通量筛选。

附图说明

图1脱氧新羟曲霉酸(2101C)抑制巨噬细胞泡沫化的镜检结果(油红O染色法)。

实施例1重组表达质粒pGL3-CLAP的构建

菌株和细胞株

E.coli DH5α用于质粒DNA的遗传操作。肝癌BEL-7402细胞株(购自上海午立生物技术有限公司)用于人高密度脂蛋白受体表达上调剂筛选模型的构建。

质粒

pGEM-T(购自Promega公司)用于PCR产物的克隆。pGL3-Basic(购自Promega公司)为报告基因载体，含有无启动子的萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶编码基因，用于人高密度脂蛋白受体调控序列的克隆。

pGL3-control(购自Promega公司)含有SV40启动子和增强子序列，用于荧光素酶表达的阳性对照。pRL-TK(购自Promega公司)包含编码海肾(Renilla reniformis)荧光素酶的cDNA，与实验载体共转染哺乳动物细胞，用于双荧光素酶报告基因体系的内对照。

高密度脂蛋白受体基因调控序列的获得

根据文献[3]报道的CLA-1基因序列，利用软件Primer Premier5.0设计PCR引物P1(5’-CCTCGAG TGG AGC CAT TGT GTG CAAAG-3’)(SEQ ID NO：2)和P2(5’-CAAGCTT CGG CGA CAG AGACGA CAC AG-3’)(SEQ ID NO：3)，用于扩增人SR-BI基因上游1055bp 62bp(以SR-BI基因起始密码子ATG的A为+1)长度为996bp的片段，其中P1引入了XhoI酶切位点，P2引入了HindIII酶切位点。

以人肝癌细胞BEL-7402总DNA为模板设立25μl PCR反应体系：1×PCR缓冲液，0.5μmol/L P1和P2，2.5μmol/L dNTPs，0.5U TaqDNA聚合酶。反应条件为94℃变性5min；94℃变性40s，54℃退火40s，72℃延伸1min 20s(30个循环)；72℃延伸10min。PCR扩增的目的片段用pGEM-T载体克隆后酶切鉴定并测定所得调控序列的序列，如SEQ ID NO：1所示。

依据分子克隆：实验室指南中所述的方法，将PCR产物与pGEM-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α受体菌，用蓝白斑法挑选转化子。对转化子进行快速质粒提取后进行酶切鉴定，用XhoI，HindIII双切后含目的片段的转化子为克隆有目的片段的重组子，命名为pGEM-CLAP。

重组质粒pGL3-CLAP的构建

用XhoI，HindIII双切重组质粒pGEM-CLAP得到目的片段后，将目的片段与经过相同双酶切的pGL3-basic质粒相连，从而将人SR-BI基因上游调控序列定向插入到pGL3-basic的荧光素酶基因上游，构建成重组质粒pGL3-CLAP。

实施例2人高密度脂蛋白受体SR-BI上调剂的筛选

细胞培养与转染

RPMI-1640 Medium(Hyclone)(含10％标准胎牛血清(Hyclone)，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)用于肝癌细胞BEL-7402的培养。转染用质粒DNA的提取采用Wizard^R PureFection Plasmid DNAPurification System试剂盒(Promega)。采用LipofectAMINE^TM2000Reagent(Invitrogen)转染试剂盒进行细胞转染。

荧光素酶表达活性的测定

细胞荧光素酶表达活性的测定采用荧光检测试剂盒LuciferaseAssay System和Dual-Luciferase Assay System(Promega)。用BMGPolarstar Galaxy紫外-可见-荧光台式培养板用分光光度计检测荧光素酶活性。

筛选样品

待筛化合物溶于DMSO。微生物发酵液用等体积丙酮或乙酸乙酯提取后干燥，溶于DMSO。

初筛条件的确定

以pGL3-basic为阴性对照质粒，pGL3-control为阳性对照质粒，与构建的质粒pGL3-CLAP同时分别瞬时转染肝癌BEL-7402细胞，对转染条件进行优化，确定用96孔培养板初步筛选化合物和微生物次级代谢产物的条件如下：每孔接种5×10⁴个细胞，200ng质粒DNA，0.5μl脂质体，转染时间为6小时，转染6小时后换为无血清无抗生素培养基。加入待筛选的样品后继续温育18小时后，测定肝癌BEL-7402细胞中荧光素酶活性，结果见表1。

实验结果表明不同孔的变异系数(CV)不超过10％，孔间一致性较好，而pGL3-CLAP与pGL3-basic组间差别显著。

表1  96孔培养板读数的孔间差异(x±s，n＝10)

    组别                相对荧光单位       CV/％    空白(非转染细胞)    1468.3±20.4       1.4    pGL3-basic          2041.1±89.2       4.0    pGL3-control        52330.3±4632.3    8.1    pGL3-CLAP           25597.4±1140.9    4.1

DMSO对筛选结果的影响

待筛样品采用DMSO溶解，因此测定了不同浓度DMSO荧光素酶活性的影响，结果表明，在DMSO浓度为0.1％-0.01％时对荧光素酶活性影响较小，筛选时采用此范围浓度并设置溶媒对照孔。

待测样品对荧光素酶表达活性改变率的计算

用如下方程计算待测样品对荧光素酶表达活性的改变率：

改变率(％)＝(A-B)/B×100

其中，A为加入待测样品后测定的荧光素酶表达活性(或相应的荧光单位)，B为加入阴性对照样品(空白)后测定的荧光素酶表达活性。

对于改变率在+20％以上的待测样品可初步认定为具有人高密度脂蛋白受体表达上调剂活性。

初筛结果

应用上述确定的筛选条件对124个化合物，800个微生物次级代谢产物进行了初步筛选，其中1个化合物2101C和4个菌株为阳性，初筛阳性率为5.4‰。

筛选结果

应用上述确定的筛选条件测定本发明所述脱氧新羟曲霉酸，结果见表2，其中本发明所述脱氧新羟曲霉酸使得荧光素酶活性改变率大于+60％，显示为强人高密度脂蛋白受体上调剂。

表2.脱氧新羟曲霉酸(2101C)上调高密度脂蛋白活性结果(荧光报告基因法，荧光强度)

样品  荧光素酶活性(均值) 增幅(％)空白  26335.3对照(0.1％DMSO)  17949.1 -7.60483812101C(5μg/ml)  40685.3 126.670422101C(2.5μg/ml)  38647.6 115.317762101C(1.25μg/ml)  29757.6 65.788814

复筛

对有阳性结果的化合物和发酵液采用双荧光素酶检测试剂盒进一步检测。用质粒pGL3-CLAP转染肝癌BEL-7402细胞的同时，转染另一种荧光素酶(Renilla reniformis，sea pansy)报告基因质粒pRL-TK，此质粒用量是前者的十分之一。Renilla荧光素酶报告基因上游含有SV40启动子，在不同类型的哺乳动物细胞中表达稳定，并且其表达活性对外界药物刺激不敏感，可以用来校正转染效率不同造成的误差。用Firefly荧光素酶活性对Renilla荧光素酶活性的相对值作为相对表达活性。

待测样品对双荧光素酶表达活性改变率的计算

用如下方程计算待测样品对双荧光素酶表达活性的改变率：

改变率(％)＝(A-B)/B×100

其中，A为加入待测样品后测定的荧光素酶相对表达活性，B为加入阴性对照样品(空白)后测定的荧光素酶相对表达活性。

对于改变率在+10％以上的待测样品可初步认定为具有人高密度脂蛋白受体表达上调剂活性。

复筛结果

1个化合物2101C和3个菌株复筛阳性。

2101C的活性结果：2μg/ml时荧光素酶相对表达活性上调23.01％。

实施例4脱氧新羟曲霉酸抑制巨噬细胞泡沫化活性的测定

A)氧化的低密度脂蛋白(OX-LDL)的制备

将低密度脂蛋白(LDL)溶于0.15mol/L，pH7.4的NaCl溶液中，然后放入透析袋中置于含10μmol/L CuSO4的PBS中，37℃透析12小时后，在含0.1％EDTA的PBS中透析24小时，0.2μm微孔滤膜过滤除菌，备用。用硫代巴比妥酸反应物含量来鉴定LDL氧化程度。以四乙氧基丙烷为标准品，按丙二醛(MDA)测定试剂盒说明书操作，测定此批氧化后每毫克LDL的丙二醛含量。

B)将人类单核细胞株U937，置于37℃含0.5％CO₂培养箱中，倍增时间为24～48小时，在含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液中悬浮生长，培养液中加青霉素和链霉素各1.0×10⁵IU/L。U937细胞实验前用100nmol/L的佛波酯(PMA)刺激72小时，使其由单核细胞分化为巨噬细胞。换无血清培养液并加到96孔培养板上，每孔150μl，细胞密度为1×10⁶个/毫升左右，此时将U937细胞分为对照组、泡沫细胞组和加样组。对照组只加无血清培养液，泡沫细胞组另加OX-LDL至每孔终浓度为80mg/L，加样组在泡沫组的基础上，再加入待测样品(5μl微生物发酵液)，培养48小时后，进行染色。

C)U937细胞油红O染色

①油红O染色液的配制方法：油红0.3克溶于30毫升异丙醇，搅拌下60℃保温过夜，然后再加20毫升蒸馏水搅拌过夜，过滤。使用时必须用新鲜过滤好的滤液。

②U937细胞中性脂质的油红O染色法：按步骤2)提到的方法，将加好样的96孔培养板从二氧化碳孵箱中取出，10％戊二醛固定液固定(15μl/孔)，10分钟后弃去溶液，水洗两次，再加入60％异丙醇(150μl/孔)放置5分钟，弃去溶液，用油红O染色液(150μl/孔)染色1小时，弃去溶液用60％异丙醇(150μl/孔)洗孔，然后水(150μl/孔)洗两次，最后每孔加150μl水放到显微镜下观察。

D)镜检结果

经油红O染色后，镜下观察不加OX-LDL的对照组细胞内无明显红色油滴状颗粒，而泡沫细胞组的细胞可见到细胞浆内有较多的红色油滴颗粒，并且由于个别细胞吞噬的油滴过多使得这些细胞体积增大，样品组中若有对巨噬细胞泡沫化有抑制作用的样品，其细胞中几乎无红色油滴颗粒。由附图所示，本发明所述脱氧新羟曲霉酸的加入，使得能够有效抑制对巨噬细胞的泡沫化。

参考文献

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14 Murakami S，Nitanai I，Uchida S，et al.Up-regulation of lowdensity lipoprotein receptor by a novel isobenzofranone derivative，MD-700.Atherosclerosis，1999，146：281-290

序列表

<110>中国医学科学院医药生物技术研究所

<120>人高密度脂蛋白受体表达上调剂筛选模型

<130>IDC040025

<160>3

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1008

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>1

ctcgagtgga gccattgtgt gcaaagcact caggacaggg gccagcacct agaaggctcc     60

tcagtcattc attctagaat atttactgtg agcaggcatt ccctgccagg ccacgttcta    120

gagctcagga cgcgtggggg ggggggcccg cctcacgggt tggcatccca gttggagcac    180

atggtcagaa tgcaaggacg caaatgaacg tgaacctgcc agggggtgct cagtcatagg    240

gtgatggtgg caccagcgtt acgaaggata gggccaggcg gatacctggg agaacagaat    300

tgcctgtgca gggtgtatgg aggccctggg gctggagcct gcggggcttc ttccagggac    360

agtgaggctg gagatggact gcggagatga gggtctagaa ggtggtggcg gggcatgtgg    420

accgttgtaa gggctctggg gttcctgggt gggctggcga agtcctactc acagtgacca    480

accatgatga tggtcccgat agaggaggag agggaggagg agggaaaagg aagggtgagg    540

ggctcagagg ggagagctgg gaggagggga gacataggtg ggggaagggg taggagaaag    600

gggaagggag caagagggtg aggggcacca ggccccatag acgttttggc tcagcggcca    660

cgaggccacc tcagctcccg ccccaaaacg gaagcgaggc cgtgggggca gcggcagcat    720

ggcggggctt gtcttggcgg ccatggcccc gccccctgcc cgtccgatca gcgccccgcc    780

ccgtccccgc cccgaccccg ccccgggccc gctcaggccc cgcccctgcc gccggaatcc    840

tgaagcccaa ggctgcccgg gggcggtccg gcggcgccgg cgatggggca taaaaccact     900

ggccacctgc cgggctgctc ctgcgtgcgc tgccgtcccg gatccaccgt gcctctgcgg     960

cctgcgtgcc cggagtcccc gcctgtgtcg tctctgtcgc cgaagctt                 1008

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>primer

<400>2

cctcgagtgg agccattgtg tgcaaag                                          27

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>primer

<400>3

caagcttcgg cgacagagac gacacag                                          27