来自节杆菌的Hsp70

摘要

已经分离并测序了来自节杆菌物种的hsp70基因。认为其所编码蛋白质为高免疫原性的，尤其在鱼类中，并且也已经利用其作为非特异性佐剂，和作为用于异源抗原的辅佐载体。

说明书

发明领域

本发明涉及来自棒杆菌(Corynebacteria)的热休克蛋白(hsp)基因及其编码的蛋白质。具体而言，本发明涉及从节杆菌属(Arthrobacter)分离的hsp70 DNA序列和氨基酸序列，以及其同源序列。此外，本发明还涉及节杆菌hsp70的多种用途：用于制备疫苗，尤其是鱼类疫苗；作为佐剂；以及作为抗原的载体。

发明背景

针对细胞内病原体的成功的疫苗不仅将通过主要组织相容性复合体(MHC)II类途径刺激体液免疫反应，而且(更加重要地)将通过激活MHC I类途径诱导感染细胞的毁坏。后一反应是通过在感染细胞中外源蛋白质的胞质降解。从而将异物片段传递到细胞表面以呈递增至CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)而完成的。激活MHC I类途径失败是基于纯化的重组抗原的疫苗的普遍缺陷。

热休克蛋白(“Hsps”)是原核和真核细胞产生的分子伴侣蛋白质家族，并且它们在大量细胞内和细胞间加工过程中具有主要作用，尤其是在抗原加工和在细胞表面将抗原片段提呈至MHC I系统。某些hsp蛋白质与其它肽的融合蛋白已经成功地用于体内引发特异的针对所述肽的CTL反应。

而且，hsps是目前已知的针对众多细菌、真菌、蠕虫和原生动物疾病的抗病原体免疫反应的靶点。利用多种不同病原体hsps(主要源于分枝杆菌(mycobacterial))的哺乳动物免疫可诱导强免疫反应并提供对由这些病原体引起的疾病的预防作用。推测对致病hsps的哺乳动物免疫应答的强度部分是由于这些蛋白质上存在多个B和T细胞表位。

一株节杆菌(棒杆菌科的成员)活的非毒力株棒杆菌以“Renogen”名称作为疫苗进行出售，试图保护鲑鱼和其它养殖鱼类不得细菌性肾病(BKD)。该菌株的特性公开于专利WO 98/33884。该种疫苗是独特的，因为它是第一个已经获得许可用于水产养殖的活培养物。

令人惊喜的是，目前已经表明节杆菌hsp70能够有效地应用于针对多种鱼类病原体的疫苗。

发明概述

第一方面，本发明提供了分离的包含节杆菌hsp70基因的序列及其片段，或相关序列的核酸序列。该基因包括ORF、5′UTR和3′UTR，以及任意成分启动子、增强子、调控子、终止子和定位元件。

第二方面，本发明提供了分离的包含节杆菌hsp70蛋白质及其免疫原性片段，或相关蛋白质的氨基酸序列。

另一方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含：编码节杆菌hsp70蛋白质的核酸序列、或节杆菌hsp70蛋白质、或富含hsp70的节杆菌细胞提取物。该疫苗组合物能够用于制备人或兽使用的药物，包括用于水产养殖。

在本发明的另外一方面还提供了编码节杆菌的全部或部分hsp70蛋白质与异源多肽的融合蛋白的核酸序列。也提供了融合蛋白本身。

在本发明的另外一方面还提供了一种实体，其包含含有全部或部分节杆菌hsp70蛋白质的多肽，该多肽共价或非共价地连接至异源分子。

在本发明的另外一方面还提供了节杆菌hsp70蛋白质或核酸序列作为疫苗抗原、作为佐剂，或作为异源分子载体的用途，其目的在于治疗或预防动物疾病。

在本发明的另外一方面还提供了在动物体内诱导或增强对免疫原或半抗原免疫应答的方法，该方法包括将这样的药物组合物施用于所述动物，所述药物组合物包含与异源分子共价或非共价连接的本发明hsp70氨基酸序列，其中异源分子包括所述的免疫原或半抗原。

在本发明的另外一方面还提供了治疗性或预防性治疗鱼类中感染性疾病的方法，包括将治疗组合物施用于所述的鱼类，该治疗组合物含有根据本发明的hsp70核酸序列或氨基酸序列。

在本发明的另外一方面还提供了节杆菌hsp70启动子驱动异源基因表达的用途。

在本发明的另外一方面还提供了分离的热休克蛋白或编码热休克蛋白的核酸分子在制造用于免疫鱼类使其抵抗病原性疾病的疫苗组合物的用途；或者说是提供了用于预防或治疗鱼类病原性疾病的方法，包括将含有分离的热休克蛋白或编码热休克蛋白的核酸分子的组合物施用于所述鱼类。所分离的热休克蛋白优选地是细菌例如节杆菌来源的hsp70。

图表说明

图1描述SEQ ID NO：1，即从节杆菌ATCC 55921分离的hsp70基因的DNA序列(5′-3′)，包括5′和3′UTR序列。

图2显示了SEQ ID NO：2，即预测的由图1 hsp70基因序列编码的氨基酸序列。

发明详述

在图1和2中分别提供了本发明分离的hsp70基因新序列和所编码的分离或纯化的蛋白质。本发明包含与图表中所提供的序列基本上同源的核酸序列和氨基酸序列。“基本上同源”意思是指当与参考序列比较时具有至少60％同源性，优选地为至少70％同源性，更加优选地为与参考序列至少有80％、85％、90％、95％、98％或更高的同源性。

为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同源性，将序列比对以进行最佳比较(例如可以将缺口导入第一个氨基酸或核酸序列以与第二个氨基酸或核酸序列进行最佳比对，并且为了比较的目的可以忽略在缺口处插入的非同源序列)。不需要两个序列具有相同的长度。除非特别指明，否则贯穿被比较序列的序列长度就是比对的全部范围。任选地，为了比较目的比对的一条参考序列的长度至少是该参考序列长度的至少30％，优选地是至少40％、更加优选地是至少50％，甚至更加优选地是至少60％，并且甚至更加优选地是至少70％、80％或90％。可将同源性分析限定于参考序列的任意特定部分，例如关于hsp70，人们可能希望将参考序列限定为该基因或蛋白质的氨基末端的一半，或更加明确地限定为结构叶II(Flaherty等，(1990)Nature 346：623-628和Zhu等，(1996)Science 272：1606-1614)。

当第一(参考)序列中的一个位置被与该序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸所占据时，分子在那个位置是同源的(即在那个位置具有同一性)。关于核酸序列比较，由于遗传密码的简并性，在两个比较分子中含有编码相同氨基酸的核苷酸的编码三联体的特定位置也具有同源性。

两个序列之间的百分比同源性是序列共享的同源位置数的函数(即，％同源性＝同源位置数/总位置数)。任选地，运用数学运算法能够实现序列比较和百分比同源性测定。适当的运算法被整合入Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：430-10的NBLAST和XBLAST程序。

本发明的核酸序列也包括在严格条件下与参考序列SEQ ID NO：1杂交的序列。本发明理解中的“严格”杂交条件如Sambrook等，MolecularCloning，A Laboratory Manual，冷泉港实验室出版社(1989)，1.101-1.104，所描述的那样进行定义，即用1xSSC缓冲液和0.1％SDS在55℃，优选地在62℃且最优选地在68℃洗涤1小时之后，特别是用0.2xSSC缓冲液和0.1％SDS在55℃，优选地在62℃且最优选地在68℃洗涤1小时之后，仍能观察到阳性杂交信号。

本发明序列包括参考核酸序列的片段或氨基酸序列的片段。hsp70核酸参考序列的“片段”是任意含有至少50个，任选地为至少75个或至少100个连续核苷酸的该序列部分。

hsp70蛋白质的“片段”理解为是指具有参考hsp70氨基酸序列的至少25个，任选地为至少35个，或至少45个相邻氨基酸的任意肽分子。“免疫原性”蛋白质片段是能够诱导中和病原体感染性和/或介导抗体补体或抗体依赖性细胞毒性的抗体以对所免疫宿主提供保护的片段。节杆菌hsp70免疫原性片段的一个实例是与分枝杆菌(Mycobacterium)结构域II片段类似的hsp70结构域II片段(Huang Q等，(2000)J.Exp.Med.191(2)：403-8)。节杆菌hsp70结构域II片段是来自SEQ ID NO：2的氨基酸162-365，或由其至少100个邻近氨基酸，更加优选地为至少150个邻近氨基酸，且最优选地为至少200个邻近氨基酸组成的部分。

本发明的氨基酸序列也包括图2序列的衍生物，或该序列的同源物。氨基酸序列“衍生物”是与参考序列或者在氨基酸序列水平(例如其中某些天然存在的氨基酸被合成氨基酸取代物所代替的同源序列)或者在3D水平相关的序列，即具有与参考氨基酸序列大致相同的形状或构型的分子。因此，衍生物包括突变体、模拟物、模拟表位、类似物、单体形式和功能等同物。氨基酸序列衍生物保留了诱导抗体产生的能力，其抗体能够识别并与来自诸如鲑鱼肾杆菌(R.salmoninarum)和鱼类立克次氏体病(Piscirickettsia salmonis)鱼类病原体的抗原进行(交叉)反应，和/或氨基酸序列衍生物还保留了在鱼类中诱导免疫反应的能力，其免疫反应能预防这些病原体的感染。

本发明的hsp70核酸序列不仅含有开放阅读框(ORF)，还包含了5′和3′非编码区(UTR)。本发明包括任意成分启动子、增强子、调控子、终止子和定位元件，以及这些元件在与异源基因连接中的用途。具体而言，本发明扩展至为了驱动异源基因表达而连接到异源基因上的含有节杆菌hsp70(如SEQ ID NO：1所描述)启动子序列或为其基本上同源序列的DNA表达载体。

与此一起列出提供的节杆菌hsp70序列(SEQ ID NO：1)是通过基因组克隆鉴定存在于节杆菌的基因的序列，并且SEQ ID NO：2是从该序列推导出的氨基酸序列。节杆菌的来源菌株培养物在1996年12月20日由美国典型培养物保藏中心(10801 Boulevard大学，马纳萨斯，VA 20110-2209)保藏，其保藏号为ATCC 55921。

相同属物种的hsp蛋白质通常是高度保守的，因此可以预测天然存在的其它节杆菌物种的hsp70基因和蛋白质的序列将不会分别与SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2有较大不同。因此本发明也扩展至这些相关的hsp70分子。来自一个棒杆菌物种的hsp70基因序列的知识有利于相同基因从相关生物体的分离。分离这些基因的方法在本领域是熟知的。

“分离的”hsp70基因可以理解为是指不为节杆菌基因组内天然情况下的基因或序列，而内容。从表达hsp70的细胞物质制备的cDNA文库中可以获得编码hsp70的DNA(hsps是广泛存在的并且大量表达)。也可以从基因组文库中，如按照实施例1中所述的步骤，或通过寡核苷酸合成方法，获得hsp70编码基因。

利用标准蛋白质纯化技术，通过适当的纯化方案能够从细菌细胞来源分离得到天然hsp70蛋白质。例如，利用抗节杆菌ATCC 55921 hsp70抗原的抗体，通过蛋白质印迹或免疫沉淀法，能够确定蛋白质的身份。所纯化蛋白质的N-末端氨基酸序列分析能够用于确定部分或全部氨基酸序列。这使得可设计探针而利于从cDNA文库或基因组文库中分离天然hsp70序列。

使用设计用来鉴定目标基因或其编码的蛋白质的探针(例如抗hsp70的抗体或至少约20-80个碱基的寡核苷酸)能够筛选文库。例如，探针可以设计为与此处公开的节杆菌部分基因序列同源。此外，探针也与其它细菌hsp基因，如弧菌(Vibrio)hsp70基因序列，具有高度同源性。利用标准程序，如Sambrook等在Molecular Cloning：A Laboratory Manual(New York：冷泉港实验室出版社，1989)中所述的方法，可以用所选择的探针筛选cDNA文库或基因组文库。分离hsp70编码基因的另一种方法是利用PCR方法[Sambrook等，见上文；Dieffenbach等，PCR Primer：ALaboratory Manual(冷泉港实验室出版社，1995)]。

用此种文库筛选方法鉴定的序列能够与SEQ ID NO：1中所公开的hsp70或公开数据库如GenBank中保存并可获得的其它已知hsp序列进行比较并进行比对。通过利用计算机软件程序，如使用不同算法测定同源性的BLAST、BLAST-2、ALIGN、DNAstar和INHERIT，进行序列比对，能够确定分子所鉴定的区域或整个全长序列的同一性(在氨基酸或核苷酸水平)。

可以看到节杆菌hsp70蛋白质与其它物种尤其是细菌物种中的同源物具有相似性。已知相关物种间的hsp基因是高度保守的。然而，仍然令人惊奇地发现节杆菌hsp70表现出与来自结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)和麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)在N-末端区域几乎是相同的(事实上最开始的20个氨基酸是完全相同的)。

在实施例2所述的实验中，通过N-末端氨基酸序列分析分析了一种大量存在的明显连接于细胞壁肽聚糖上的大约67kDa的节杆菌表面蛋白。发现N-末端20个残基的氨基酸序列与分枝杆菌hsp70的相应部分是完全相同的，并且相信该67kDa蛋白质对应于本发明的hsp70蛋白质。另一方面，本发明提供了通过SDS-PAGE测定的大约67kDa的经分离热休克蛋白，其定位于节杆菌细胞的细胞壁并具有N-末端氨基酸序列：(M)SRAVGIDLGTTNSVVSVLE。

我们实验的结果证明在鱼类中节杆菌hsp70的免疫原性比得上哺乳动物中分枝杆菌hsp70的免疫原性。由于后来所见的益处，我们相信当用于接种鱼类时，通过Renogen^TM活节杆菌疫苗可以使节杆菌hsp70具有一定程度的疾病防护作用。

本申请实际上首次提供了证据证明任意来源的分离或纯化的热休克蛋白在鱼类疫苗中是有效的。鱼类的免疫系统不能直接与其它物种尤其是哺乳动物的免疫系统相比较，并且对鱼类的免疫系统了解较少。因此令人惊奇的是热休克蛋白能够在鱼类中诱导强的免疫应答。另一方面，本发明涉及分离或纯化的热休克蛋白在制备施用于鱼类的疫苗组合物方面的用途。优选地是热休克蛋白用作疫苗组合物的佐剂，或疫苗组合物中异源分子的载体。热休克蛋白优选地是hsp70家族的成员，但作为选择也可以是任意其它种类的已知热休克蛋白，例如hsp60、hsp90、hsp100或任一小的热休克蛋白(sHSPs)。热休克蛋白可以来自任意物种，原核或真核物种，但优选地是来自细菌物种，如节杆菌。

节杆菌和分枝杆菌具有高度同源的hsp70基因的认识揭示了节杆菌同源物许多无法预料的应用。已经证明分离的分枝杆菌hsp70蛋白质可作为有效的疫苗佐剂。节杆菌hsp70也能够以纯的或分离的形式用作佐剂与抗原相连。此处定义的“佐剂”是指当与抗原联合使用时，或单独施用于相同位点时，可非特异性提高针对抗原的特异性免疫应答的物质。在本发明的一方面，分离或纯化的节杆菌hsp70蛋白质用作动物疫苗尤其是鱼类疫苗的佐剂。在相关应用中，将hsp70基因或其部分克隆到DNA载体上以辅助核酸疫苗。在本发明的范围之内，提供了这样的疫苗组合物，其包含与至少一种其它抗原或抗原编码核酸序列相连的本发明hsp70氨基酸或核酸序列，以及一种或多种可药用赋形剂。其它抗原可以是重组或分离的单一抗原，或者可以是来自病原体的抗原分子混合物。

节杆菌hsp70作为佐剂的用途允许医生和兽医们抛开传统的减毒活分枝杆菌佐剂，这种减毒佐剂由于具有回复突变为毒性细菌菌株的危险因而对动物的健康存在危险。这对于水产养殖具有额外的优点，因为将节杆菌hsp70核酸或分离的蛋白质注射入鱼类不会导致在注射位点形成损伤外形的肿胀或肿块，其中所述肿胀或肿块在传统佐剂是常见的，并且降低了鱼类的商业值。

节杆菌hsp70蛋白质不仅能有效辅助含有其它抗原的疫苗，而且其自己本身也具有免疫原活性。节杆菌hsp70能够为预防或治疗多种人类和兽类疾病的疫苗提供活性成分，这些疾病包括鱼类病原体引起的疾病，具体而言是，但不限于，BKD和SRS(鲑类立克次氏体败血病)。本发明的另一方面，疫苗组合物包含作为单一抗原或免疫原成分的分离或纯化的hsp70蛋白质，还包含一种或多种可药用赋形剂。

本发明还提供了包含表达载体及一种或多种可药用赋形剂的核酸疫苗组合物，该表达载体含有本发明的hsp70核酸序列，其编码疫苗组合物中的单一抗原或免疫原成分的抗原。

从节杆菌hsp70与分枝杆菌和其它hsp70s的同源性推断出的高免疫原性潜能也暗示出可制备具有异种分子(非hsp70)的hsp70蛋白质的基因或肽共价结合物(如嵌合物或融合物)，其中所述异种分子通常为但不限于非hsp70蛋白(如半抗原)。在这种方式中，节杆菌hsp70蛋白质作为无佐剂载体刺激针对相伴随的异种分子的体液或细胞免疫应答。此处所用的术语“载体”是指含有T细胞表位的分子，当共价连接于第二分子上时，有助于引发和增强针对第二分子(第二分子可以是蛋白质、肽、寡核苷酸或寡糖)的免疫应答。

当相关的抗原肽不是非常大且免疫原性差，然而将使用其作为疫苗适当的靶时，这种疫苗研发的方法是特别有利的。由节杆菌hsp70携带的异源分子有利地是蛋白质半抗原或非蛋白质分子如糖类分子。

如此处所用，hsp70“融合蛋白质”包括可操作连接于不同多肽(“异源多肽”)上的hsp70多肽。“异源多肽”或“非hsp70多肽”指具有对应于与hsp70蛋白质基本上不同源的蛋白质的氨基酸序列的多肽。在hsp70融合蛋白质内，hsp70多肽能够对应全部或部分hsp70蛋白质(如结构域II部分)。在融合蛋白质内，术语“可操作地连接”表示hsp70多肽和非hsp70多肽融合入彼此的框架。非hsp70多肽能够融合于hsp70多肽的N-末端或C-末端，或者能够嵌入hsp70多肽内部。

通过共价或非共价连接方法而不是通过产生融合蛋白质，将hsp70多肽与异源分子连接是可能的。“异源分子”是非hsp70蛋白质的任意蛋白质、肽、寡核苷酸或寡糖分子。例如，可以将化学间隔臂基团插入多肽之间，如产生通式hsp70-X-异源多肽的分子，其中X是间隔臂基团，如一个或多个氨基酸的短序列。另外，还可以将hsp70多肽通过非酰胺键共价连接入氨基酸的线性链，例如通过化学偶联或通过化学、光(如UV)或辐射诱导的交联连接于非hsp分子。戊二醛和巯基-结合接头是适当的化学交联接头的实例。特定的可能性是EDC+NHS或硫代-NHS、硫代-SMCC、硫代-SBED和SAED，它们都是以试剂盒形式商业可得的。

在本发明优选的实施方案中，将hsp70多肽共轭连接于半抗原。半抗原是能够结合抗体，但除非共价连接于大的载体分子上才会诱导免疫应答的低分子量物质(如肽或寡糖)。

将hsp70与抗原细胞的全部蛋白质或者通过将细胞裂解物、级分、提取物、病毒颗粒等等体外复合得到的颗粒进行连接是可能的。

异源分子或多肽可以是任何来源，但是最可能的是致病生物的成分。具体而言它们可以是来自病毒、细菌、原生动物、蠕虫，或动物，特别是水生动物的真菌病原体的多肽。

通过将hps70基因克隆进入表达载体以产生大量纯化或分离的重组hsp70蛋白质(或hsp70融合蛋白质)，从而使分离的hsp70基因能够以传统的方式被利用。通过非重组技术也能够获得纯化的hsp70抗原。蛋白质是丰富的并且通过传统纯化方法能够从节杆菌细胞中提取得到。另外，使用标准肽合成技术也能够化学合成hsp70蛋白质或多肽。含有该纯化或分离的重组或非重组蛋白质的疫苗可以称为基于抗原的疫苗。

“分离的”或“纯化的”蛋白质定义为基本上不含有细胞物质或其它来自从其中得到hsp70蛋白质的细胞或组织的污染蛋白质，或者为基本上不含有化学合成时的化学前体或其它化学品。术语“基本上不含有细胞物质”包括这样的hsp70蛋白质制备物，其中蛋白质是从其从中分离或重组产生的细胞的成分中分离得到的。在一个实施方案中，术语“基本上不含有细胞物质”包括含有少于约30％(干重)非hsp70蛋白质(此处也指“污染蛋白质”)，更加优选地为少于约20％非hsp70蛋白质，而且更加优选地为少于约10％非hsp70蛋白质，并且最优选地为少于约5％非hsp70蛋白质的hsp70蛋白制备物。当通过重组技术产生hsp70蛋白质或其生物学活性部分时，基本上不含有培养基也是优选的，即培养基表现出约少于蛋白质制备物体积的20％，更加优选地为约少于10％，并且最优选地为约少于5％。

hsp70“丰富”的节杆菌细胞提取物也可以作为分离或纯化hsp70的替代物用于实施本发明。通过失活或杀死节杆菌全细胞、裂解细胞、通过常规方法分级所得到的细胞裂解液，以及鉴定hsp70蛋白质比其它级分更丰富的级分(例如通过Western印迹法)，能够得到“富集的”细胞提取物。通过在导致热休克蛋白表达增加的条件下(即在加热或其它细胞压力条件下)培养节杆菌细胞，并失活或杀死、和裂解细胞，也能够制备hsp70富集的细胞提取物。任选地将所得到的细胞提取物(裂解液)进行分级并鉴定hsp70丰富级分。

优选地通过标准重组DNA技术产生本发明的hsp70嵌合或融合蛋白质。例如，按照常规方法将编码不同多肽序列的DNA片段共同连接入读码框内，例如通过应用钝末端或突出末端进行连接、限制性酶消化以提供适当的末端、适当补平粘性末端、碱性磷酸酶处理以避免不期望的连接，以及酶连接。在另一个实施方案中，通过包括自动化DNA合成仪的常规技术能够合成融合基因。另外，利用在两个连续的基因片段之间产生互补突出端的锚定引物，能够进行基因片段的PCR扩增，随后能够将这两个连续的基因片段复性并重新扩增产生嵌合基因序列(见，例如，CurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel等编辑，JohnWiley & Sons：1992)。

本发明的另一方面涉及含有编码hsp70(或其部分)的核酸序列的载体，优选地为表达载体。如此处所用，术语“载体”指能够运送已经连接在其上面的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，是指额外的片段能够连接到其中的环状双链DNA环。另外一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA片段能够被连接入病毒基因组。某些载体能够指导可操作连接于其上面的基因的表达。此类载体在此处称为“表达载体”。一般而言，用于重组DNA技术的表达载体通常是质粒形式。然而，本发明试图包括此类其他形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，它们能行使等效的功能。

本发明的重组表达载体包含本发明以适于在宿主细胞中表达核酸的形式存在的核酸，这意味着重组表达载体含有一个或多个基于宿主细胞选择用于表达的可操作连接于所表达的核酸序列上的调节序列。本发明的表达载体可以用于在hsp70抗原(作为DNA疫苗)目的受体中表达或者在宿主生物而不是最终的受体中表达(为了产生重组抗原疫苗)。

在表达载体中，“可操作地连接”意思是指将靶核苷酸序列以允许核苷酸序列表达的方式连接于调节序列上(例如，在体外转录/翻译系统中或者将载体导入宿主细胞后在宿主细胞中)。术语“调节序列”意思指包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如，多聚腺苷酸化作用信号)。例如，在Goeddel；Gene Expression Technology：Methods in Enzymology185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)中叙述了此类调节序列。调节序列包括那些在多种类型宿主细胞中指导核苷酸序列组成型表达的序列和那些仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列表达的序列(例如组织特异型调节序列)。本领域的技术人员可以理解表达载体的设计可能依赖于诸如所转化的宿主细胞的选择、预期蛋白质的表达水平等等的因素。本发明的表达载体能够被导入宿主细胞从而产生如此处所述的核酸编码的蛋白质或多肽，包括融合蛋白质或多肽(例如，hsp70蛋白质、突变体形式的hsp70、具有异源肽的hsp70融合蛋白质等等)。

本发明的另一方面涉及已经通过转化将本发明的重组表达载体导入其中的宿主细胞。宿主细胞可以是任意原核或真核细胞(包括多细胞真核生物中的真核细胞)。例如，hsp蛋白质能够表达于诸如大肠杆菌(E.coli)的细菌细胞、昆虫细胞(利用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞中。其它适宜的宿主细胞对于本领域技术人员是熟知的(例如，Goeddel，见上文)。重组表达载体可以设计在宿主鱼类细胞中表达(DNA疫苗接种之后)。另外，重组表达载体能够在体外进行转录或翻译，例如利用T7启动子调节序列和T7聚合酶。

蛋白质在原核生物中表达最通常的是利用指导融合或非融合蛋白质表达的含有组成型或诱导型启动子的载体在大肠杆菌中进行。融合载体将大量氨基酸加到此处所编码的蛋白质上，通常是加到重组蛋白质的氨基末端。通常，在融合表达载体中，在融合部分和重组蛋白质的连接点处导入了蛋白质分解的裂解位点，使得在随后的融合蛋白质纯化中重组蛋白质能够与融合部分分离。此类酶以及它们的同源识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括分别将谷光甘肽S-转移酶、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A融合于靶重组蛋白质上的pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene 67：31-40)、pMAL(New EnglandBiolabs，Beverly，Mass.)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，N.J.)。

hsp70基因能够被掺入核酸疫苗(NAV)，从而使活动物的宿主细胞摄入NAV，并在细胞溶胶中进行hsp70基因的表达。由于细胞内hsp70抗原的短肽被转运至细胞表面，在那里它们能够与MHC I系统相联系，NAV来源的hsp70抗原被理想地定位以诱导细胞免疫反应。

插入DNA载体的hsp70基因能够直接接种(例如口服、肌肉内或腹膜内)入鱼类体内以在鱼类细胞中进行体内表达。DNA疫苗接种也能够在其它动物物种中进行。因此，在本发明的一方面中提供了含有可药用载体和DNA质粒的核酸疫苗，在DNA质粒中编码节杆菌hsp70的核酸序列可操作连接于转录调节序列。转录调节序列包括启动子、多聚腺苷酸化作用序列和其它核苷酸序列，例如具有非甲基化CpG二核苷酸的免疫刺激寡核苷酸，或者编码其它抗原蛋白质或佐剂性细胞因子的核苷酸序列。真核或病毒转录调节序列的存在允许hsp70基因在鱼类细胞中表达。为了制备疫苗组合物DNA自身能够在细菌细胞中进行复制，但是通常缺乏允许hsp70基因在原核细胞中表达的转录调节序列。为了得到最佳的体内表达，优选地可以选择所预防接种鱼类内源性的转录调节序列。例如，可以考虑内源性细胞因子或肌动蛋白基因启动子。DNA可以裸露形式存在或者能够将其与促进细胞摄入的制剂(例如脂质体或阳离子脂类)一起施用。在专利US5,780,448中对鱼类DNA疫苗接种技术进行了更加详细的叙述，该专利此处引用作为参考。

本发明还涉及利用连接入分子的hsp70蛋白质的结合物产生针对分子的单克隆或多克隆抗体的方法。在这个实施方案中，将有效量结合物(即，在宿主体内导致免疫反应的量)导入动物宿主，从而导致在宿主体内产生该物质的抗体。将抗体从宿主取出并用已知的技术(例如层析法)纯化，从而导致产生多克隆抗体。另外，用本发明方法产生的抗体能够用于产生利用已知技术能生产单克隆抗体的杂交瘤细胞。

在本发明的一个实施方案中，节杆菌hsp70基因的启动子序列用于驱动异源基因即不是编码节杆菌hsp70基因的基因的表达。该启动子能够插入生物体染色体DNA中异源基因的上游，或者插入染色体外质粒或其它表达载体。例如，在期望过表达内源节杆菌基因的事件中，或者期望将外源基因插入节杆菌内源性质粒的事件中，响应诸如热休克的刺激上游hsp70启动子能够驱动该异源基因的表达。

按照本发明的方法制备的疫苗适合适用于任意具有体液和/或细胞免疫系统的动物物种。人类包含于本发明上下文中“动物”和“哺乳动物”的意义之内。节杆菌hsp70能够用于辅助任意用于哺乳动物、鸟类、爬行动物或鱼类(有鳍鱼类或甲壳类动物)的疫苗。同样，节杆菌hsp70能够作为共价吸附抗原的载体用于疫苗中，任选地去除任意传统佐剂(所谓的“非佐剂”疫苗)。节杆菌hsp70也能够作为免疫原(任选地为单一免疫原)用于疫苗中以提高对特异疾病，特别是BKD、鲑类立克次氏体败血症(SRS)，以及其它鱼类传染病，的免疫反应。

术语“疫苗”使用含义广泛，并且不仅包括用于针对病原体免疫的组合物，还包括抗肿瘤疫苗、基于自身抗原的疫苗(例如用于化学阉割)等等。在兽类疫苗接种领域内，任意非人类动物都能够被预防接种，包括养殖陆地动物的大部分物种，即牛、马、羊、猪和家禽鸟类。对于水产养殖，本发明的疫苗能够应用于甲壳类动物或有鳍鱼类，特别是处理诸如鲑鱼、鳟鱼(trout)、鲤鱼(carp)、海鲷(sea bream)、海鲈(sea bass)、黄尾鱼(yellowtail)、鲶鱼(catfish)、大比目鱼(halibut)、黑线鳕(haddock)的硬骨鱼，或者任选地处理诸如甲壳动物(如虾、对虾(prawns)、龙虾、蟹)和软体动物(如牡蛎(oysters)、贻贝(mussels))的其它水生物种。这里不限制适于在疫苗中与节杆菌hsp70序列组合的候选抗原。致病抗原可以来源于细菌、病毒、原生动物、线虫动物和真菌。一个特殊的焦点在于鱼类致病生物的抗原，特别是表面抗原。

hsp70氨基酸或核酸序列能够与来自于感染甲壳类动物或鱼类的疾病的细菌、原生动物、病毒或真菌抗原相联合，或共轭连接用于疫苗组合物，抗原包括来自：传染性鲑鱼贫血症病毒(ISAV)、传染性胰腺坏死病毒(IPNV)、传染性造血细胞坏死病毒(IHNV)、神经坏死病毒(NNV)、鲑鱼胰腺疾病病毒(SPDV)、鲤鱼春季病毒血症病毒(SVCV)、病毒出血性败血症病毒(VHSV)、黄头鱼病毒(YHV)、Taura综合症病毒(TSV)、白斑综合症病毒(WSSV)、鲑鱼肾杆菌(细菌性肾病的诱因)、鱼类立克次氏体病(鲑类立克次氏体败血症的诱因)、弧菌属物种(Vibrio spp)、气单胞菌属物种(Aeromonas spp)、Yersinia ruckerii、假单胞菌属物种(Pseudomonasspp)、海鱺发光杆菌(Photobacterium damselae)的抗原(或它们的编码序列)，等等。已经纯化和/或克隆并表达了大量且数量不断增加的来自于这些或其它致病生物的多肽，并将其共轭偶联节杆菌hsp70或其编码序列，或以联合方式提供，应用于疫苗组合物。优选的实例包括IPNV蛋白质VP1、VP2、VP3和NS及其编码核苷酸序列；公开于专利WO 01/10469的ISAV蛋白质，包括血凝素、核衣壳、聚合酶和片段7 P4和P5蛋白质，以及其编码核苷酸序列；公开于专利WO 01/68865的鱼类立克次氏体蛋白质，包括OspA和IcmE及其编码核苷酸序列；野田村病毒(nodavirus)蛋白质，如核衣壳；和来自SPDV的结构蛋白质及其编码核苷酸序列(公开于专利WO 99/58639)。根据本发明优选的疫苗组合物包含携带融合于IPNV VP2序列或IPNV VP3序列读码框内的hsp70核苷酸序列的DNA表达载体。任选地，疫苗含有携带hsp70-VP2融合基因的第一质粒和携带hsp70-VP3融合基因的第二质粒。

hsp70序列也能够与来自于其它动物病原体和寄生虫的抗原(或其编码序列)联合使用或共轭偶联于其上，动物病原体和寄生虫包括：牛病毒的腹泻病毒(BVDV)、牛疱疹病毒(BHV)、足或口疾病病毒、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、副流感3型病毒(P13)、传染性牛鼻气管炎病毒(IBR)、猪呼吸道和生殖综合症病毒(PRRSV)、分枝杆菌、利什曼原虫(Leishmania)、埃里希体(Ehrlichia)、艾美球虫(Eimeria)、梭菌(Clostridia)、巴斯德菌(Pasteurella)、支原体(Mycoplasma)(例如牛支原体(M bovis)、猪肺炎支原体(M.hyopneumoniae))、钩端螺旋体(Leptospira)、短螺菌(Brachyspira)、沙门菌(Salmonella)、布鲁氏菌(Brucella)、新孢子虫(Neospora)、隐孢子虫(Cryptosporidium)、梭杆菌(Fusobacterium)、大肠杆菌、轮状病毒(Rotavirus)、冠状病毒(Coronavirus)、溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)、睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、锥虫(Trypanosoma)、无形体(Anaplasma)、密螺旋体(Treponema)，等等。

本发明包括与任意上述抗原或其编码序列相联合的hsp70序列在制造用于治疗或预防由抗原来源的疾病因子感染引起的疾病的可药用组合物的用途。

与hsp70基因或蛋白质联合提供的疫苗抗原可以是化学共轭偶联于hsp70(以嵌合或融合蛋白质形式)或者它们可以作为单独的分子与单一疫苗组合物一起提供。作为另一种选择，hsp70基因或蛋白质可以与抗原或抗原编码核酸序列在试剂盒中一起提供，用于分别、相继或同时施用。与hsp70基因或蛋白质联合提供的疫苗抗原可以是菌苗、细胞提取物、重组蛋白质、质粒负载的基因，或活/减毒病原体株。

用中性或盐形式的本发明融合蛋白质或分离的hsp70蛋白质，或单独施用或与可药用载体或赋形剂混合施用免疫受试者是可能的。一般，将疫苗制备为液体溶液或悬浮液；也可以制备在施用之前适于溶解于、或悬浮于液体载体中的固体形式的疫苗。可以将制剂乳化或者将活性成分包封进脂质体载体。本发明的药物组合物可以立即释放形式或通过延长释放进行施用。

例如，可药用载体为水、盐水、葡萄糖、甘油、辅助物质诸如变湿或乳化制剂、膨胀制剂、粘合剂、分散剂、稀释剂、润滑剂、pH缓冲剂、或传统佐剂诸如胞壁酰二肽、阿夫立定、氢氧化铝、油、皂甙、嵌段共聚物以及本领域已知的其它物质。

为了免疫受试者，hsp70抗原或hsp70基因载体可以进行胃肠外施用，通常通过适当载体进行肌肉注射，但是任选地通过皮下途径、通过静脉内注射或通过真皮或鼻内递送。关于鱼类免疫，典型的施用途径是通过注射入腹膜腔、以饲料口服、或通过浸浴。本发明优选的抗原疫苗组合物是适于通过注射或浸浴施用的形式。DNA疫苗接种通常通过肌肉内注射进行。

有效剂量依赖于受试者的大小和种类，并根据施用方式而改变。通过医生或兽医进行试验和校正误差能够确定最佳剂量。一般，单一剂量hsp70抗原将在每公斤体重约0.01-1000μg范围之内，优选地在每公斤0.5-500μg，更加优选地在每公斤0.1-100μg。对于DNA疫苗，每只动物从最小剂量10pg增加至1000μg剂量的质粒将足以适于体内抗原表达。

作为本发明的部分所公开的新抗原也用于筛选致病蛋白质的抗体。本发明还包括这些抗原的诊断用途，例如用作诊断试剂盒的制剂，用于测试动物体致病生物的存在。

针对此处所公开的纯化hsp70抗原和/或hsp70融合蛋白质的抗体也包括在本发明的范围之内。值得注意此类抗体在疾病处理和鱼类保健方面可能同时具有诊断和治疗用途。多克隆抗体和单克隆抗体都可以用于该方面。用蛋白质免疫诸如小鼠的动物和选择产生免疫原特异的单克隆抗体的杂交瘤的方法在本领域中是众所周知的(见，例如Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495-497)。夹心测定法和ELISA可作为诊断测定的特定实例提及。

本发明hsp70核酸序列具有诊断学应用，例如设计用于PCR扩增分析的引物。

实施例

实施例1：来自节杆菌ATCC 55921基因组的hsp70基因的分离和序列测定

将5ml节杆菌培养物在含有卡那霉素(30μg/ml)的LB中30℃振荡培养过夜。然后利用Puregene DNA分离试剂盒(Gentra)或Instagene^TM树脂按照制造商的说明书进行DNA提取。

简并PCR

将在核苷酸水平几种分枝杆菌和链霉菌(streptomyces)hsp70(dnaK)序列具有最大相似性的区域用于设计PCR和序列测定的简并引物。所选择的引物是dnak-1Fdeg(5′-gtcggnatcgacctvggnac-3′)和dnak-4Rdeg(5′-gcggtsggctcgttgac-3′)。这些引物用于在复性温度为50℃的PCR反应中扩增节杆菌DNA。通过凝胶电泳估计所扩增的DNA的质量。将10μl一份样本在1X Tris-硼酸电泳缓冲液(TBE)中，100V电压，0.8％琼脂糖凝胶电泳大约1小时。然后从胶上切割650bp的产物并利用Qiaquick纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化。利用Qiagen PCR净化试剂盒按照制造商的说明净化PCR产物并按照制造商的说明利用BigDye引物化学(Applied Biosystems)和用于PCR的每条引物进行序列测定。利用ABI PRISM(8r)BigDye终止循环测序快速反应混合物，～600ng DNA模板、3.2pmol适当的引物并加ddH₂O至20μl，制备延伸反应混合物。循环序列测定条件如下：热循环仪设为25个循环，包括96℃10秒、50℃5秒和60℃4分钟。序列分析表明该片段含有第一个约400bp的dnaK基因。

为了获得另外的hsp70/dnaK基因序列，将简并引物用于扩增节杆菌hsp70基因的下游部分。这些引物选自Galley等(1992)Biochemica etBiophysica Acta 1130：203-208。[正向引物hsp70通用-F1(5′CAR GCNCAN AAR GAY GCN GG 3′)，反向引物hsp70通用-R1：(5′GCN CANGCY TCR TCN GGR TT 3′)]。将引物设计复性于hsp70基因内两个高度保守区域以产生650bp的产物。

PCR反应包括(50μl总体积)：5μl 10XPCR缓冲液、5μl 25mMMgCl₂、2.5μl 10mM每种dNTPs、2μl Hsp70通用-F1(200μM)、2μlHsp70通用-R1(200μM)、0.5μl Amplitaq DNA聚合酶(5U/μl)、10μlInstagene法提取的DNA、23μl ddH2O。PCR反应循环如下：94℃2分钟，然后40个PCR循环包括：94℃1.0分钟、50℃或者58℃0.5分钟，和72℃1.0分钟。PCR循环以72℃3.0分钟延伸步骤完成。如上所述将PCR产物进行电泳、纯化和序列分析。发现该片段的序列重叠并延伸第一序列测定试验中所鉴定的约400bp序列的3′端。

基因组步移

基因组步移用于延伸已鉴定序列的序列5′端和3′端。按基因组步移手册(Clontech)中所述的序列设计引物。最初，制备4个基因组文库(Dra I、EcoR V、Pvu II、Stu I)，随后制备3个另外的文库(Alu I、Sca I和SnaF1)。所有文库和随后的PCR反应如基因组步移手册中所述。

5′端基因组步移产生与以前所获得序列重叠的～500bp的片段。5′端延伸物含有hsp70基因的起始密码子和5′UTR。5′端步移未能延伸基因。RACE

3′RACE用于获得额外的3′端序列。利用Purescript(Gentra)RNA分离试剂盒按照制造商说明书从节杆菌(如上述培养的)过夜培养物中分离RNA。利用Boehringer Mannheim 5′3′RACE试剂盒按照制造商说明书进行3′RACE。根据已知序列的3′末端设计RACE引物。除了含有10％DMSO和用55℃复性温度之外，如所述进行PCR反应。扩增出一条～1.0kb的条带并利用Invitrogen TOPO序列分析试剂盒按照随试剂盒提供的步骤将条带克隆入pCR4载体。利用载体引物筛选克隆并将所选克隆生长过夜，然后利用Invitrogen SNAP小量试剂盒进行DNA提取并利用上述引物进行序列分析。

利用Genecode序列分析软件组合重叠群。利用重叠群化序列进行Genbank搜索确定该序列是hsp70。

通过上述的基因组步移获得了hsp70基因的剩余部分和3′UTR。此外，利用Genecode序列分析软件鉴定了重叠群。利用重叠群化序列进行Genbank搜索确定该序列包括具有3′UTR和5′UTR的hsp70基因。

实施例2：节杆菌细胞壁蛋白质的特性

电泳和Western印迹

23℃孵育48小时之后通过直接从胰胨豆胨琼脂(TSA)平板取出传代培养的细菌制备节杆菌ATCC 55921细胞悬浮液。将细菌重悬于10ml含有pH 7.2的100mM Tris-HCI缓冲液、1mM EDTA和0.1％Triton-X100(BioRad Laboratories，Hercules，CA)的“TET”缓冲液中至光密度大约为50OD660单位(这里已经估计1OD600为1×10⁹细胞)，并以6500g离心。弃上清并将细胞悬浮于另外10ml TET中，并且重复离心步骤。将细胞沉淀重悬于4ml TET并以1ml等份分装于1.5ml微量管中。将其中一份与另外200μl 5mg ml^-1鸡蛋白溶菌酶混合并在37℃振荡孵育过夜(18小时)。最大速度在台式微量离心机中离心细胞悬浮液5分钟。将150μl无细胞上清液与50μl NuPage 4X LDS样本缓冲液(Invitrogen Carlsbad，CA)混合并在70℃振荡孵育10分钟。在8％Mini Protean II胶(Biorad)上分析10μl一份所得上清液并用半干转印仪20V转印30分钟将蛋白质Western印迹至PVDF膜(Millipore，Bedford MA)。印迹后立即用0.1％丽春红S(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)漂洗1分钟并用蒸馏水洗涤几次脱色直到可以看到印迹的蛋白质。在用蒸馏水反复洗涤去除粉红色染色并空气干燥膜准备下一步染色之前，用铅笔标记标记分子量标准和某些蛋白质作为免疫染色之后的参考点。

对于用于氨基酸分析的蛋白质条带的考马斯蓝鉴定，将脱色的膜在含有50％甲醇、7％醋酸和0.1％R-250的溶液中孵育10分钟，然后利用不含考马斯蓝的上述溶液脱染背景。随后将印迹膜在去离子蒸馏水中漂洗10分钟并空气干燥，通过利用自动化蛋白质测序仪(Applied Biosystems)的Edman降解法进行N-末端氨基酸序列分析。

通过将干燥的印迹膜用含有1∶200稀释的抗体(兔抗-节杆菌多克隆抗体)的1％酪蛋白tris-缓冲盐溶液pH 7.4(cTBS)(BioRad)中孵育60分钟，用TBS 10秒钟洗涤2次，然后用含有1∶2000稀释的山羊抗兔免疫球蛋白碱性磷酸酶(Pierce，RockfordIL)孵育完成了免疫反应性抗原的显影。用1-步NBT/BCIP(Pierce)反应大约3分钟显色并通过在蒸馏水中洗涤终止从而完成染色显影。全部孵育过程以终体积10ml在red振荡器台上(Hoefer，San Francisco，CA)进行。通过图像采集器和相关软件(AmershamPharmacia Biotech，Uppsala Sweden)得到文件。通过将抗原迁移与预染分子量标准(BioRad)精确宽度范围进行比较完成了对分子量的估计。通过利用First Order Lagrange计算相对迁移率完成对分子量的估计。

抗血清产生

通过用0.5ml含有3份4×10⁸预先在无菌Dulbecco盐溶液中洗涤的细胞和1份弗氏不完全佐剂的悬浮液免疫注射新西兰大白兔产生节杆菌抗原的多克隆抗血清。4周后将相同体积的物质注射入兔。6周时从外周耳静脉收获5ml血并使血液形成凝块然后离心收获血清。

结果

溶菌酶处理的节杆菌悬浮液的SDS-PAGE分析显示在150和10kDa之间存在蛋白质条带范围。其中突出的主要蛋白质带约为67、63和59kDa。67kDa蛋白质显然与节杆菌细胞壁肽聚糖相交联，因为其仅在用溶菌酶处理之后才释放。

当将SDS-PAGE蛋白质谱进行Western印迹并用节杆菌全细胞抗血清进行染色，鉴定出主要免疫反应条带为122和67kDa。将67kDa蛋白质的N-末端进行测序发现为SRAVG IDLGT TNSVV SVLE。利用BLAST蛋白质-蛋白质比对进行同源性搜索鉴定出该序列与结核分枝杆菌hsp70蛋白质100％同源。认为该67kDa蛋白质与通过基因组序列分析鉴定的hsp70蛋白质相同并在此处公开。

实施例3 hsp70的重组表达

将节杆菌热休克蛋白70全部编码序列克隆入pET30EKLIC载体(Novagen)表达非融合或融合肽。N-融合标签含有包括多种特征的55个氨基酸允许靶蛋白质的进一步纯化(包括His-标签、S-标签、肠激酶裂解位点)。已知作为结构域II的定位于HSP70蛋白质内的200个氨基酸的活性基序也以非融合和融合肽的形式进行了克隆。

在大肠杆菌DE3细胞中进行重组HSP70和重组结构域II的表达。一旦达到适当的细胞密度，将DE3培养物分入2个独立的烧瓶。在一瓶培养物中加入IPTG底物诱导蛋白质表达而第二瓶培养物作为对照。基本上发现以融合或非融合表达的HSP70和结构域II以可溶形式存在于细胞质或与大肠杆菌周质相关联。因此，正如节杆菌中的天然蛋白质，在大肠杆菌中重组HSP70及其结构域II成功地靶向细胞膜。在蛋白质N末端含有融合标签显示出不影响蛋白质的转位。基于这些观察全长HSP70和结构域II都能够将其它抗原序列转位到细胞表面。

实施例4基于hsp70基因融合的针对IPNV的核酸疫苗

用稀释于清洁水族箱水中的苯佐卡因麻醉在流动淡水中养殖的二岁龄前大西洋鲑鱼(Salmo salar)(35-40g)。疫苗接种前将6条鱼用致死过量的麻醉剂处死并从尾静脉取血得到免疫前血清。

将含50μl疫苗的核酸疫苗和PBS对照通过肌肉内注射预防接种于左背侧面，刚好背鳍下面。疫苗接种每次重复进行40条鱼(每组80条，分在两个水族箱中)。疫苗接种后允许将鱼恢复养殖于淡水中并并分到适当的水族箱中。

进行测试的核酸疫苗为：pUKrsxHSP70-ipnVP2和pUKrsxHSP70-ipnVP3。这些质粒分别携带着在CMV启动子控制下的节杆菌hsp70全部编码序列和IPNV VP2或IPNV VP3的融合读码框。pUKrsxHSP70-ipnVP2进行了单独测试，并且两种质粒也进行了联合测试。

为了进行比较，也制备了含有与先前研究的已知序列3′端融合的IPNVP2蛋白质的质粒以提高VP2成分免疫保护功效的大约20％(即“金标准”基于VP2的IPNV核酸疫苗)。

疫苗接种后6周将鱼转移至海水。在攻击的前一天，从每个重复组取4条鱼抽取血清样本。还从注射位点提取肌肉样本并用福尔马林固定以寻找存在的疫苗。攻击后第21天，从每个重复组最大限度对4条存活的鱼抽取血清样本。攻击后，死亡的鱼一旦观察到立即取出采取肾样本并冻存以通过ELISA进行分析。

通过与标记的已经通过腹膜内注射毒性IPNV(10⁶cfu)进行攻击的同胞鱼共同生活进行攻击，转移至海水后攻击持续4-6周。20周后终止试验。

结果表明所有基于IPNV VP2序列的核酸疫苗，包括hsp70-VP2融合体，都对病毒攻击具有保护作用。

实施例5针对ISAV的疫苗中的重组Hsp70

开始实验之前将大西洋鲑鱼幼鱼在提供流动井水(10℃)充气的0.5m储水箱中适应一周并在整个实验过程中每天进行喂食。每组55条鱼分为2缸25条以提供重复处理组。当用ISAV攻击时大西洋鲑幼鱼发生60和80％之间的死亡率。

将鱼麻醉然后通过腹膜内注射0.2ml盐水，或0.2ml含有特定重组蛋白质的盐水进行预防接种。阴性对照是注射PBS(盐水)。处理组为：(A)His-标签纯化的节杆菌hsp70重组蛋白质，12μg；(B)ISAV重组His-标签核壳蛋白(NC)，12μg；(C)His-标签纯化的节杆菌hsp70重组蛋白质，12μg，与His-标签ISAV NC，12μg，的混合物；(D)His-标签纯化的节杆菌hsp70重组蛋白质，12μg，交联于His-标签ISAV NC，12μg；(E)His-标签纯化的节杆菌hsp70结构域2重组蛋白质，12μg，与His-标签ISAV NC，12μg，的混合物；(F)His-标签纯化的节杆菌hsp70结构域2重组蛋白质，12μg，交联于His-标签ISAV NC，12μg。

处理组D和F使用了共价交联的蛋白质。EDC和硫代-NHS用作交联剂，并按照标准步骤施用。

采用共同生活攻击，其中少量鲑鱼采取腹膜内注射0.1ml培养的毒性ISAV(每条鱼～10⁴ TCID₅₀)并加入到每缸处理鱼中。每天监测每缸的死亡率。

通过比较特定时间点不同处理组和对照组之间的死亡率估计相对百分比存活率。

                             序列表

<110>诺瓦提斯公司

<120>来自节杆菌的Hsp70

<130>VA/H-32534A

<150>GB 0216414.3

<151>2002-07-15

<160>2

<170>PatentIn版本3.1

<210>1

<211>2464

<212>DNA

<213>节杆菌(Arthrobacter sp.)

<400>1

ctgcgaatgt ccacgtggtg cgtgcagtga tgcgcttgaa gggcatcgca ccgcgctgaa     60

ccgggttcga cccggtccca ctgagttcgc caactgagtg ggacaagccc gttctgtccc    120

agtcacgcgg tcgactcagt gggaccacgc cgcagcgcga tcgatggtcg ccgcacagct    180

ttttccaaag ttgagcacag gtggctcaac ttagacttga cattggtcgg ctcaagcgta    240

aagttgatat cagaacactc aacttgtaag aaatcccgaa aggaaaaaac atgtcacgtg    300

cagtaggcat cgacctcgga accaccaact cggtggtttc cgtcctcgaa ggcggcgagc    360

ccgtcgtcat cgcgaacgcc gaaggcggcc gcaccacccc ctcagtcgtc gcgttctcca    420

agagcggtga agtcctggtc ggcgaaatcg ccaagcgcca ggccgtcaac aacatcgatc    480

gcaccatcgc ctcggtcaag cgccacatgg gcaccgactg gaccgtcggc atcgacgaca    540

agaagtacac cgcgcaggaa atctccgccc gcaccctgat gaagctcaag aacgacgccg     600

agtcctactt gggcgaaaag gtcaccgacg cggtgatcac ggttcctgcc tacttcaacg     660

acgccgagcg ccaggccacc aaagaagccg gtgagatcgc cggcctgaac gtgctgcgca     720

tcgtcaacga gcccactgcg gcggcgctgg cctatggctt ggacaaaggc aaagaagacg     780

aactcatcct ggtcttcgac ctcggtggcg gcaccttcga cgtctcgctg ctggaagtcg     840

gcaaagacga cgacggcttc tccacgatcc aggtccgcgc cacctccggc gacaaccgcc     900

tgggcggcga cgactgggat cagcggatcg tcgactactt gctgaaccag ctcaaggtca     960

agggcatcga cctctccaag gacaagatcg cgctgcagcg tctgcgcgaa gcttccgagc    1020

aggccaagaa ggaactctcc tcggccacca gcaccaacat ctcgctgcag tacctctcgg    1080

tcacccctga cggtccggtg cacttggacg agcagctgac ccgggcgaag ttccaggaac    1140

tgaccgctga tctgctcgag cgcaccaaga agccgttcca ggacgtgatc gccgaggccg    1200

ggatcaaggt ttccgacatc gaccacatcg tgctggtcgg cggttccacc cggatgcccg    1260

cagtgaccga attggtcaag cagctggccg gtggcaagga gccgaacaag ggcgtcaacc    1320

cggacgaggt ggtcgccgtc ggcgccgcgc tgcaagccgg cgtgctcaag ggcgaacgca    1380

aagacgtgct gctcatcgac gtcaccccgc tttccctcgg catcgaaacc aagggcggcg    1440

tgatgaccaa gctgatcgag cggaacaccg cgattccgac caagcggtcc gagaccttca    1500

ccacggcgga cgacaaccag ccttcggtgg ccatccaggt gttccaaggc gagcgcgagt    1560

tcacccggga caacaagccg ttgggcacct tcgaactgac cggcatcgca ccggctccgc    1620

gcggcgtgcc gcaggtcgaa gtcaccttcg acatcgacgc caacggcatc gtgcacgtgt    1680

cggccaaaga caagggcacc ggcaaggagc agtcgatgac catcaccggc ggttcctcgc    1740

tgtccaagga agacatcgag cgcatggtcg ccgacgccga ggcacacgct gcagaggaca    1800

aggcccggcg cgagcaggcc gaggcccgca acagcgccga gcagctggcg tactcggtgg    1860

acaagatcct caccgacaat gacgacaagc tgccggaaga ggtcaagacg gaggtcaagg    1920

ccgacgtcgg ggcgctcaag accgcgctgg ccggcaccga tgaggacgcg gtcgaggcgg    1980

cctcggagaa gctgcaggct tcgcagacca aactcggcgg agcgatttac gcttcggccc    2040

aggccgaggg tgccgccgct gccggtgacg ccccgagcga aggtgccaag cccgacgaag    2100

acatcgtcga cgccgagatc gtggacgaag aagaaccgaa gaacgagaag aagtagtcat    2160

gtccgaccag agccaatctg atcagggccg caaccccgaa aaagacgaaa ccgacgtgga    2220

cccggcaacg ggtcccgccg gggacgttcc ggaggagcag gatcctttgg cgcaagtcga    2280

agacatcctg aacaatgccg aggtgcccgc cgacgagtcg gtggcccagg gcgccgggca    2340

ggtggatgcc gcagaactca agaacgatct gctgcgcttg caggccgaat acgtgaacta    2400

ccgcaaacgc gtcgagcggg acaccagccc gggccgtcga ccacgcgtgc cctatagtaa    2460

gggc                                                                 2464

<210>2

<211>621

<212>PRT

<213>节杆菌

<400>2

Met Ser Arg Ala Val Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser Val Val

1               5                   10                  15

Ser Val Leu Glu Gly Gly Glu Pro Val Val Ile Ala Asn Ala Glu Gly

            20                  25                  30

Gly Arg Thr Thr Pro Ser Val Val Ala Phe Ser Lys Ser Gly Glu Val

        35                  40                  45

Leu Val Gly Glu Ile Ala Lys Arg Gln Ala Val Asn Asn Ile Asp Arg

    50                  55                  60

Thr Ile Ala Ser Val Lys Arg His Met Gly Thr Asp Trp Thr Val Gly

65                  70                  75                  80

Ile Asp Asp Lys Lys Tyr Thr Ala Gln Glu Ile Ser Ala Arg Thr Leu

                85                  90                  95

Met Lys Leu Lys Asn Asp Ala Glu Ser Tyr Leu Gly Glu Lys Val Thr

            100                 105                 110

Asp Ala Val Ile Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ala Glu Arg Gln

        115                 120                 125

Ala Thr Lys Glu Ala Gly Glu Ile Ala Gly Leu Asn Val Leu Arg Ile

    130                 135                 140

Val Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Gly Leu Asp Lys Gly

145                 150                 155                 160

Lys Glu Asp Glu Leu Ile Leu Val Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe

                165                 170                 175

Asp Val Ser Leu Leu Glu Val Gly Lys Asp Asp Asp Gly Phe Ser Thr

            180                 185                 190

Ile Gln Val Arg Ala Thr Ser Gly Asp Asn Arg Leu Gly Gly Asp Asp

        195                 200                 205

Trp Asp Gln Arg Ile Val Asp Tyr Leu Leu Asn Gln Leu Lys Val Lys

    210                 215                 220

Gly Ile Asp Leu Ser Lys Asp Lys Ile Ala Leu Gln Arg Leu Arg Glu

225                 230                 235                 240

Ala Ser Glu Gln Ala Lys Lys Glu Leu Ser Ser Ala Thr Ser Thr Asn

                245                 250                 255

Ile Ser Leu Gln Tyr Leu Ser Val Thr Pro Asp Gly Pro Val His Leu

            260                 265                 270

Asp Glu Gln Leu Thr Arg Ala Lys Phe Gln Glu Leu Thr Ala Asp Leu

        275                 280                 285

Leu Glu Arg Thr Lys Lys Pro Phe Gln Asp Val Ile Ala Glu Ala Gly

    290                 295                 300

Ile Lys Val Ser Asp Ile Asp His Ile Val Leu Val Gly Gly Ser Thr

305                 310                 315                 320

Arg Met Pro Ala Val Thr Glu Leu Val Lys Gln Leu Ala Gly Gly Lys

                325                 330                 335

Glu Pro Asn Lys Gly Val Asn Pro Asp Glu Val Val Ala Val Gly Ala

            340                 345                 350

Ala Leu Gln Ala Gly Val Leu Lys Gly Glu Arg Lys Asp Val Leu Leu

        355                 360                 365

Ile Asp Val Thr Pro Leu Ser Leu Gly Ile Glu Thr Lys Gly Gly Val

    370                 375                 380

Met Thr Lys Leu Ile Glu Arg Asn Thr Ala Ile Pro Thr Lys Arg Ser

385                 390                 395                 400

Glu Thr Phe Thr Thr Ala Asp Asp Asn Gln Pro Ser Val Ala Ile Gln

                405                 410                 415

Val Phe Gln Gly Glu Arg Glu Phe Thr Arg Asp Asn Lys Pro Leu Gly

            420                 425                 430

Thr Phe Glu Leu Thr Gly Ile Ala Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln

        435                 440                 445

Val Glu Val Thr Phe Asp Ile Asp Ala Asn Gly Ile Val His Val Ser

    450                 455                 460

Ala Lys Asp Lys Gly Thr Gly Lys Glu Gln Ser Met Thr Ile Thr Gly

465                 470                 475                 480

Gly Ser Ser Leu Ser Lys Glu Asp Ile Glu Arg Met Val Ala Asp Ala

                485                 490                 495

Glu Ala His Ala Ala Glu Asp Lys Ala Arg Arg Glu Gln Ala Glu Ala

            500                 505                 510

Arg Asn Ser Ala Glu Gln Leu Ala Tyr Ser Val Asp Lys Ile Leu Thr

        515                 520                 525

Asp Asn Asp Asp Lys Leu Pro Glu Glu Val Lys Thr Glu Val Lys Ala

    530                 535                 540

Asp Val Gly Ala Leu Lys Thr Ala Leu Ala Gly Thr Asp Glu Asp Ala

545                 550                 555                 560

Val Glu Ala Ala Ser Glu Lys Leu Gln Ala Ser Gln Thr Lys Leu Gly

                565                 570                 575

Gly Ala Ile Tyr Ala Ser Ala Gln Ala Glu Gly Ala Ala Ala Ala Gly

            580                 585                 590

Asp Ala Pro Ser Glu Gly Ala Lys Pro Asp Glu Asp Ile Val Asp Ala

        595                 600                 605

Glu Ile Val Asp Glu Glu Glu Pro Lys Asn Glu Lys Lys

    610                 615                 620