小麦高光效和抗逆相关的苹果酸脱氢酶、其编码基因及培育抗逆植物的方法

摘要

本发明提供了一种与小麦高光效和抗逆相关的苹果酸脱氢酶、编码该酶的基因和含有该基因的植物表达载体。本发明还提供了利用本发明的基因培育高光效和抗逆性的转基因植株的方法。

说明书

发明领域

本发明涉及与小麦高光效和抗逆相关的苹果酸脱氢酶、编码该酶的基因和含有该基因的表达载体。

发明背景

苹果酸脱氢酶负责催化草酰乙酸和苹果酸之间的相互转换，它普遍存在于各种动物、植物和大多数细菌中，在多种代谢过程中起重要作用。在植物细胞中根据其辅酶的特异性和在细胞内的分布通常可以区分出五个类型(Gietl，C.，1992，Biochim.Biophys.Acta，1100：217-234)：(1)依赖于NADP的叶绿体MDH(EC 1.1.1.82)，此种类型的酶是苹果酸穿梭循环的一部分，它在保持细胞质和基粒之间还原力的平衡方面起重要作用。在C4植物中它还参与向叶鞘细胞叶绿体中富集CO₂。(2)依赖于NAD的线粒体MDH，它是三羧酸循环的一部分，在所有的真核细胞中普遍存在，在植物中它还参与光呼吸和C4植物叶鞘细胞中对CO₂的富集作用。(3)依赖于NAD的微体MDH，它存在于乙醛酸循环体和过氧化物体中，在乙醛酸循环和苹果酸-天门冬酸穿梭过程中起重要作用，同时也参与到光呼吸中。(4)依赖于NAD的叶绿体MDH，这种酶研究的较少，只在少数几种植物中如冰叶日中花(Mesembryanthemumcrystallinum)(Winter，K.等，1982，Plant Physiol，69：300-307)，红叶藜(Chenopodium rubrum)(Amino，S.，1992，Z Naturforsch，47：545-552)和单细胞绿藻(Chlamydomonas reinhardtii)(Willeford，K.O.and Gibbs.M.，1989，Plant Physiol，90：788-791)中发现有此种酶活性的存在，但是直到最近才在拟南芥菜的cDNA找到其确切存在的证据(Berkemeyer.M.等，1998，J Biol Chem，273：27927-27933)。但是其生物学作用尚不清楚。(5)依赖于NAD的细胞质MDH(cyMDH)。

在植物中对依赖于NADP的叶绿体MDH，依赖于NAD的线粒体MDH和依赖于NAD的微体MDH都已经有了广泛的研究，但是对其他类型的MDH却知之甚少，特别是依赖于NAD的细胞质MDH(cyMDH)。cyMDH(EC 1.1.1.37)通常认为在细胞质和细胞器之间进行有关底物和还原力交换的各种穿梭循环中发挥作用。在具有景天酸代谢循环的景天科植物中，植物在晚上凉爽和湿润的环境下利用MDH合成苹果酸，储存CO₂，而在白天干旱和高温的情况下，气孔关闭，CO₂从苹果酸中脱羧释放出来，供给植物进行光合作用的需要，从而保证了植物对干旱环境的适应(Borland，A.M.，等，1998，Planta 205：342-351)。在水稻中的研究表明，耐盐品种的耐盐适应性与其细胞质中的MDH活性有关(RitambharaG.等，2000，Plant Science 156：23-34)。芹菜叶片受到高盐条件的刺激能明显增加细胞质中的MDH活性(Aloni，B.等，1981，Plant Science Letters，20：239-250)。这表明细胞质中的苹果酸代谢及其相关的苹果酸脱氢酶在提高植物的光合效率、适应干旱和盐碱等不良环境中具有重要作用，因而在植物基因工程技术领域中具有广泛的应用潜力。

对植物中cyMDH在基因水平的研究工作开展的较少。阿根廷科学家从菠萝叶片中纯化出一种蛋白质，并证明它属于cyMDH(Cuevas andPodesta，2000，Physiol Plant，108：240-248)。德国科学家从景天科植物冰叶日中花(Mesembryanthemum crystallinum)中分离到一种编码cyMDH的cDNA，但是对其生化特性未做研究(Ocheretina and Scheibe，1997，Gene，199：145-148)。美国科学家从苜蓿中分离到的另外一个cyMDH的cDNA，并在大肠杆菌中表达出相关的蛋白质，证明其表现出对NAD⁺高的还原活性和对NDAH高的氧化活性(Miller，S.S.等，1998，Plant J，15：173-184)。至今，在国内外尚未见有关在小麦中有苹果酸脱氢酶基因研究的报道。

无论在中国还是在世界范围内，小麦都是最重要的农作物之一。它也是适应性最广的作物，其产量在包括玉米、水稻和马铃薯在内的重要农作物中位居第一。但是小麦属于C3植物，其光合效率低于C4植物，如玉米，同时在生产实践中，由于环境逆境如干旱、盐碱所造成的损失十分巨大。利用小麦的苹果酸脱氢酶基因，通过基因工程手段，调节基因的表达活性，改善苹果酸代谢，获得高光效和抗逆境的小麦新品系有着十分重要的意义。

发明内容

本发明通过提供在小麦中一种胞质型的苹果酸脱氢酶基因和由其编码的蛋白质，达到调节小麦中的苹果酸代谢，并进一步调节小麦的光合效率和抗逆性，增强小麦抵御外界逆境如干旱和盐碱的目的。本发明的另一个目的是提供可将上述基因翻译成活性蛋白质的表达质粒。

本发明的一个目的是提供一种小麦中胞质型的苹果酸脱氢酶。

本发明的另一个目的是提供一种编码小麦胞质型的苹果酸脱氢酶的基因。

本发明的再一个目的是提供一种含有本发明的基因并将基因翻译成活性蛋白质的表达质粒，以及可以转化植物细胞的植物表达载体。

本发明提供了一种编码小麦胞质型的苹果酸脱氢酶的DNA序列，它选自下组：

(1)、编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的DNA序列或

(2)、与(1)的序列能够杂交，并能够编码具有活性的胞质型的苹果酸脱氢酶的DNA序列。

所述的杂交条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS)中，65℃预杂交30min；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65℃杂交12hr；弃杂交液，加入洗膜液I(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，5％SDS)，65℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，1％SDS)，65℃洗膜2次，每次30min。

本发明的DNA序列可以具有SEQ ID NO：1所示的序列。此序列为编码小麦胞质型的苹果酸脱氢酶基因(cyMDH)的全长cDNA，命名为TaMDH。该序列共由1340个碱基组成，其中，5’端未翻译区包括44个碱基，3’端未翻译区包括294个碱基(其中包括51个碱基组成的PolyA)，编码区由1002个碱基(从45位到1046位)组成，其中A占23.35％(234个)，C占22.55％(226个)，G占27.54％(276个)，T占26.55％(266个)，A+T占49.90％(500个)，C+G占50.10％(502个)。在国际基因序列数据库(GenBank\EMBL\DDBJ)中的基因同源性分析表明，TaMDH基因是小麦中未曾报道的新基因，它与从冰叶日中花(Mesembryanthemum crystallinum)和苜蓿(Medicago sativa)中分离出的胞质型苹果酸脱氢酶基因具有同源性。

本发明还提供了一种由上述的DNA序列编码的氨基酸序列。这种氨基酸序列最好具有SEQ ID NO：2所示的序列。该蛋白质序列包括333个氨基酸，如SEQ ID NO：2所示。在该蛋白质序列中，疏水氨基酸占134个，亲水氨基酸占74个，碱性氨基酸占31个，酸性氨基酸占36个，该蛋白质的分子量为35.5 KD，等电点为5.9。该蛋白质是国际上未曾报道的新蛋白质。

本发明还提供了一种含有上述DNA序列的表达载体，以及另外一种植物表达载体。它可以是含有上述的DNA序列的表达载体pET-28a，或者用于植物细胞转化的含有actin启动子和Bar选择基因标记的载体。这两种表达载体的构建过程如下：

在TaMDH基因编码区两侧合成引物，并分别引入BamHI及NotI酶切位点，其引物序列分别为：

5’-引物：5’-CGGGATCCATGGCTGCGAAGGAACCGATG-3’3’-引物：

5’ATAAGAATGCGGCCGCTTACGCCAGGCATGAGTAGG-3’。

经过PCR扩增出TaMDH基因的全长编码区，以BamHI与NotI双酶切下，连接到表达载体pET-28a的相应酶切位点上(见图1)，通过酶切和序列分析证明此表达载体的完整性和正确性。将表达载体转化大肠杆菌1477菌株，经过IPTG诱导后，将大肠杆菌蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳分析，证明TaMDH基因已在大肠杆菌中翻译出正确的蛋白质。将上述大肠杆菌菌株经过37℃培养和IPTG诱导后，进行菌体裂解，分离菌体蛋白质，并对该蛋白质进行苹果酸脱氢酶活性分析，所用底物为苹果酸，得到其酶活性为121.4μmol^-1min^-1mg protein^-1，证明此蛋白质具有苹果酸脱氢酶的催化活性。

经过PCR扩增出TaMDH基因的全长编码区，以BamHI与NotI双酶切下，连接到含有Actin启动子和Bar选择基因标记的载体(见图2)，通过酶切分析证明此表达载体的完整性和正确性。此植物表达载体可以通过基因枪法或花粉管通道转化植物细胞，从而改善植物的苹果酸代谢，提高其光合效率和抗逆性。

分别从小麦的根、茎、叶组织中提取总RNA，经过电泳后用毛细管法转移到尼龙膜上，与小麦MDH基因探针杂交，放射自显影检测杂交结果，以rRNA探针为对照使杂交信号标准化。以此方法检测TaMDH基因在小麦不同部位的表达。得到的结果表明该基因在小麦根、茎和叶等营养生长组织中均有表达。

本发明提供了与小麦高光效和抗逆相关的苹果酸脱氢酶基因和与其相关的蛋白质产物。应当指出的是，在本发明技术领域的一般技术人员应用本发明的TaMDH基因或其TaMDH基因表达质粒，通过转基因生物技术，构建植物表达载体，用构建的植物表达载体转化植物细胞和将转化的植物细胞培育成植株，转化是通过农杆菌介导、基因枪法或花粉管通道是能够实现本发明的目的，可开发出具有高光效和抗逆性的转基因植物，例如，培育出以调控小麦营养生长组织中的苹果酸代谢，从而改变小麦的光合效率，并增加抵御外界不良环境能力的转基因小麦或其它的抗逆转基因植株。正如本发明的一个优选实施例所表明的那样，利用转基因获得小麦新品系，增加小麦营养生长组织中的苹果酸合成，改善抵御外界不良环境的能力。

为此，本发明的最后的一个重要目的是提供一种应用本发明的TaMDH基因构建的植物表达质粒，通过植物转基因生物技术，培育具有高光效和抗逆相关的转基因植株的方法。

说明附图：

图1：表示TaMDH基因表达质粒。

图2：表示TaMDH基因的植物表达载体

具体实施方式

实施例一、小麦苹果酸脱氢酶基因探针的分离及序列分析将小麦(Triticum aestivum L)种植于温室中，正常浇水和施肥，至生长到2-3个节间，采集根、茎、叶组织，用TRI试剂(Molecular Research Center，Inc，Cincinnati，USA)提取总RNA，用PolyAT tract^mRNA Isolation试剂盒(Promega公司，Madison，USA)分离Poly(A)⁺RNA，用紫外分光光度计分析RNA的含量和纯度。

反转录合成cDNA第一条链的条件为：Poly(A)⁺RNA 1ug，5μmol/L引物5’-GACTCGAGTCGACATCGA(T)₁₇-3’，0.5mmol/L dNTP，50单位RNasin，65℃保温10分钟，在冰上冷却后，加入200 U SuperScript^TM IIRNase H--Reverse Transcriptase(Gibco)，42℃保温1小时，加EDTA至终浓度10mM，并于95℃保温10分钟，在冰上冷却。

第一轮PCR的引物为M1：5’-GACTCGAGTCGACATCG-3’，M2：5’-ATGAThGCnmGnGGnrT-3’，条件为：3μL cDNA反应液，1μmol/L引物，0.4mmol/L dNTP，2.5 U Taq DNA聚合酶(Gibco公司，Grand Island，NY，USA)，于95℃变性5分钟，50℃复性2分钟，72℃延伸40分钟，然后进行40个循环(95℃1分钟，55℃1分钟，72℃3分钟)，最后72℃延伸10分钟。

第二轮PCR引物为M3：5’-ATGyTnGGnsCnrAyCArCC-3’，M4：5’-TCnykdATrTGrTCrCAnGC-3’，条件为：使用1μL第一轮PCR反应液，于95℃变性5分钟，其它反应同第一轮。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，采用GlassMAX^DNA Isolation试剂盒(Gibco公司，Grand Island，NY，USA)纯化电泳产物。纯化后连接在pGEM-T Easy载体上(Promega公司，Madison，USA)。连接条件为16℃12小时。转化受体菌为E.coli DH5α，感受态细胞的制备采用CaCl₂处理方法(Sambrook，J.等(eds)，Molecular cloning:A laboratory manual，2^nd ed.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。将连接产物加入到感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热激90秒，加入LB液体培养基，37℃保温45分钟，涂布在含氨苄青霉素(100ug/ml)和X-Gal(20ug/ml)的LB平板上，37℃培养过夜。白色克隆接种于LB液体培养基上(含氨苄青霉素100ug/ml)，37℃培养过夜，提取质粒，进行酶切分析后，以ABI 377 DNA序列分析仪进行序列分析，确定小麦的MDH探针。

序列分析的结果表明，所分离的探针具有683个核苷酸，与冰叶日中花(Mesembryanthemum crystallinum)和苜蓿(Medicago sativa)中分离出的胞质型苹果酸脱氢酶基因具有同源性。并且，其编码的蛋白质具有苹果酸脱氢酶的催化活性中心IWGNH。

实施例二、小麦苹果酸脱氢酶基因的筛选和序列分析

以小麦茎Poly(A)⁺RNA为模板，以ZAP载体(Stratagene公司，LaJolla，CA，USA)合成cDNA，经过体外包装，构建成小麦茎的cDNA文库。取50ng探针DNA，加50uCi³²P-dCTP进行标记，37℃保温1小时，加EDTA至终浓度10mM终止反应。探针通过Sephadex G-50柱后，于100℃煮沸10分钟，立即在冰上冷却，进行杂交。

取50000 pfu铺平板，并将其转移到硝酸纤维素膜上，于0.5MNaOH加1.5M NaCl变性2分钟，1.5M NaCl加0.5M Tris-HCl(pH8.0)复性5分钟，0.2M Tris-HCl(pH7.5)加2×SSC漂洗30秒，将膜夹在两层Whatman滤纸中，80℃真空烘烤2小时，之后加入杂交液(6×SSC，5×Denhardt，0.5％SDS，100μg/mL鱼精DNA，50％甲酰胺)，42℃保温2小时，加入标记的探针，42℃杂交过夜，经过6×SSC加0.1％SDS室温下洗两次，每次30分钟，再用0.1×SSC加0.1％SDS于65℃洗两次，每次20分钟，之后于-80℃下放射自显影，确定阳性克隆后，将噬菌斑取下，于SM溶液中4℃提取过夜，再按同样的程序进行两轮筛选。

对于获得的阳性噬菌斑，按Stratagene公司提供的方法将其转化为质粒DNA，经过酶切分析后，采用ABI 377 DNA序列分析仪进行序列分析。

测得的DNA序列如SEQ ID NO 1所示，将其命名为TaMDH。它是小麦中胞质型的苹果酸脱氢酶基因，是迄今尚未报道的新基因。

实施例三、小麦苹果酸脱氢酶基因编码蛋白质的翻译

人工合成一对引物：

5’-引物：5’-CGGGATCCATGGCTGCGAAGGAACCGATG-3’

3’-引物：

5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTACGCCAGGCATGAGTAGG-3’

在引物两端分别引入BamHI及NotI酶切位点，以TaMDH基因为模板，进行PCR扩增，扩增条件：10ng DNA，1μmol/L引物，0.4mmol/LdNTP，2.5 U Taq DNA聚合酶(Gibco公司，Grand Island，NY，USA)。于95℃变性5分钟，然后进行30个循环(95℃1分钟，55℃1分钟，72℃1.5分钟)，最后72℃延伸10分钟。

PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，采用GlassMAX^DNA Isolation试剂盒(Gibco公司，Grand Island，NY，USA)纯化电泳产物，用BamHI及NotI双酶切后，连接在载体pET-28a(Novagen Company，USA；Cat No.69872-3)上，转化大肠杆菌1477感受态细胞，转化细胞冰浴30分钟后，42℃热激50秒，加入LB液体培养基，37℃保温45分钟，涂布在含卡那霉素(50ug/ml)的LB平板上。将抗性菌落于LB液体培养基(含卡那霉素50ug/ml)中37℃震荡培养过夜，再进行1/100稀释后，37℃震荡培养2小时，加入IPTG至终浓度1mM，继续培养3小时，12000g离心10分钟，收集菌体，菌体加入100ul裂解液(50mM Tris-HCl pH6.8，100mM二硫苏糖醇，2％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油)，100℃煮沸5分钟，菌体蛋白按常规方法进行SDS-PAGE电泳(凝胶浓度12％)，结果显示在细菌中有小麦苹果酸脱氢酶蛋白质的表达，其结构如SEQ ID NO2所示。

实施例四、苹果酸脱氢酶活性的测定    

将IPTG诱导后的大肠杆菌50ml于4000g离心10分钟，加入4ml菌体裂解液(20mMTris-HCl pH7.5，1mM PMSF，2mM二硫苏糖醇，100ug/ml溶菌酶)，30℃保温15分钟，用超声波处理20次，4000g离心10分钟，取上清液进行酶活测定。酶活测定反应液包括100mM甘氨酸缓冲液(pH10)，2.5mM NAD，85mM苹果酸，1ul蛋白溶液，总体积500ul，在30℃下测定A₃₄₀的增加来计算苹果酸脱氢酶的活性。蛋白质含量按Bio-Rad公司的方法(Bradford，M.M，1976，Anal.Biochem.，72：248-254)测定。

结果显示，以苹果酸为底物，其酶活性为121.4μmol^-1min^-1mgprotein^-1，证明此蛋白质具有苹果酸脱氢酶的催化活性。这表明TaMDH基因所编码的蛋白质具有催化苹果酸脱氢的功能，因而能够控制小麦组织中的苹果酸代谢。

实施例五、小麦组织中TaMDH基因表达产物的检测

采用Northern blot杂交检测小麦不同组织中的TaMDH基因的表达产物，从不同小麦组织中分离的总RNA样品，按常规方法在1.4％琼脂糖/甲醛变性凝胶电泳上分离，以20×SSC按毛细管法转移到尼龙膜上(转移时间12小时)，尼龙膜夹在两层Whatman滤纸中，80℃真空烘烤2小时，将膜放在杂交瓶中，之后加入杂交液(6×SSC，5×Denhardt，0.5％SDS，100μg/mL鱼精DNA，50％甲酰胺)10ml，42℃预杂交2小时，加入标记的苹果酸脱氢酶基因探针，42℃杂交过夜，经过6×SSC加0.1％SDS室温下洗两次，每次30分钟，再用0.1×SSC加0.1％SDS于65℃洗两次，每次10分钟，于-80℃下放射自显影一周。显影后的膜加入0.1×SSC加0.1％SDS于95℃洗两次，每次15分钟，之后加入含有18S rRNA探针的杂交液，42℃杂交过夜。将膜取出，按相同的程序洗膜，于-80℃下放射自显影1小时。

对杂交的信号经过Phosphor Image扫描，并与rRNA信号标准化，得到小麦不同组织中TaMDH相对表达量，如表1所示：

表1.小麦不同组织中TaMDH基因的表达量(以叶为100)

组织    叶    茎    根相对表达量    100    112    45

结果表明，小麦苹果酸脱氢酶基因TaMDH在营养生长组织中表达均有明显的表达。在根中的表达量稍低于茎和叶中的表达。

实施例六、TaMDH蛋白在苹果酸代谢中的催化特性

苹果酸脱氢酶可以催化草酰乙酸和苹果酸之间的相互转换，但是不同功能的苹果酸脱氢酶在反应的方向性上有很大的不同，从而在不同程度上影响了苹果酸的代谢，并进一步影响到其生物学功能。将小麦的苹果酸脱氢酶TaMDH在大肠杆菌中表达，用1mM IPTG诱导大肠杆菌100ml菌液，于4000g离心10分钟，加入10ml菌体裂解液(50mMTris-HCl pH8.5，500mM NaCl，10％甘油，1％Triton X-100，1mMPMSF，20mM二硫苏糖醇，100ug/ml溶菌酶)，30℃保温15分钟，用超声波处理20次，4000g离心10分钟，取上清液，过Ni-NTA His-BindResins亲和层析柱(Novagen，USA)，得到纯化的TaMDH蛋白，以此蛋白质分别测定其催化草酰乙酸还原和苹果酸氧化的活性。草酰乙酸还原的测定采用100mM Tris缓冲液(pH7.5)，0.225mM NADH，0.06-1.2mM草酰乙酸，1ul蛋白溶液，总体积1000ul，在30℃下测定A₃₄₀的降低来计算酶的活性。苹果酸氧化的测定采用100mM甘氨酸缓冲液(pH10)，2.5mM NAD，1-50mM苹果酸，1ul蛋白溶液，总体积500ul，在30℃下测定A₃₄₀的增加来计算酶的活性。采用双倒数法计算Km，Vmax，kcat，以及kcat/Km等酶动力学常数，结果如表2所示。

表2.TaMDH对苹果酸氧化和草酰乙酸还原的催化特性

底物Vmax(μmol^-1min^-1mg protein^-1) Km(mM) kcat/Km (min^-1mM^-1)苹果酸草酰乙酸121.4±2.33118.2±77.3 3.53±0.24  1339.8 3.23±0.15  37657.6

结果表明，TaMDH催化草酰乙酸还原的活性明显大于苹果酸氧化，其比值可以达到28.1(草酰乙酸还原/苹果酸氧化)。因此此种苹果酸脱氢酶可以富集CO₂，从而改善小麦的光合效率，并在增加抵御外界不良环境(如干旱)中具有重要的作用。

序列表

<110>中国科学院植物所

<120>小麦高光效和抗逆相关的苹果酸脱氢酶、其编码基因及培育抗逆植物的方法

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1340

<212>DNA

<213>wheat，Triticum aestivum L.

<400>1

ccactctccc tatccccgtg tccagaatct accccccggc tccaatggcg gcgaaggaac    60

cgatgcgcgt gctcgtcacc ggcgccgcag gacaaatcgg atatgctctt gttcccatga    120

ttgccagggg agttatgctt ggtgcagacc agcctgttat tctgcatatg ctggatattg    180

aatttgctgc tgaagctctt aaaggcgtca agatggagtt gatcgatgcc gcatttccac    240

ttctcaaggg agttgttgca acaactgatg ttgttgaggc ttgcactggt gtgaatgttg    300

cggttatggt tggtggattc cccaggaagg aaggaatgga aaggaaggat gttatgacga    360

aaaatgtttc aatctacaaa gctcaagcat ctgctcttga agctcatgca gcccccaatt    420

gcaaggtttt ggttgttgcc aacccagcaa acaccaatgc tctcatcctg aaggagtttg    480

ctccatctat ccctgagaag aacatcagtt gtttgacccg cctagaccac aacagggcac    540

tcggtcagat ttctgagaga cttggtgtcc aagtttctga cgttaagaat gctattatct    600

ggggtaatca ctcgtccagt cagtatcctg atgttaacca tgccactgtg aagactccca    660

gtggagagaa gcctgttcgt gaacttgttc aagatgatga atggctaaat ggggagttca    720

ttgccactgt ccagcagcgt ggtgctgcaa tcatcaaagc gaggaagctc tccagtgctc    780

tctctgctgc cagctcagct tgtgatcaca tccgtgactg ggttctggga accgctgagg    840

gaacatttgt ttccatgggt gtgtactctg atggttcata cggtgtgcct gctggtctta    900

tctactcctt cccagtaacg tgcagtggtg gtgaatggac aattgttcaa gggctcccga    960

tcgatgagtt ctcgaggaag aagatggatg cgaccgccca ggagctgtca gaggagaagg    1020

cgttggccta ctcatgcctg gcgtaaatcc acattcgaag ggcagctgct cctctggatg    1080

ttttgaataa atgaaacctt ccgctcttta gaaactctcg tctccaccca gaacagcccg    1140

cacatcgcga tgcatgctcc ttttcgctgg ttttccaagt gtgtatgaat gaggcttgta    1200

gctccccttt tgcctgatga tttacaggac agtacatttg ctgcaagagt gaaacaattt    1260

gacacctgat tagaatcaac ttgtttttca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    1320

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa                                                1340

<210>2

<211>333

<212>PRT

<213>wheat Triticum aestivum L.

<400>2

Met Ala Ala Lys Glu Pro Met Arg Val Leu Val Thr Gly Ala Ala Gly

1               5                   10                  15

Gln Ile Gly Tyr Ala Leu Val Pro Met Ile Ala Arg Gly Val Met Leu

            20                  25                  30

Gly Ala Asp Gln Pro Val Ile Leu His Met Leu Asp Ile Glu Phe Ala

        35                  40                  45

Ala Glu Ala Leu Lys Gly Val Lys Met Glu Leu Ile Asp Ala Ala Phe

    50                  55                  60

Pro Leu Leu Lys Gly Val Val Ala Thr Thr Asp Val Val Glu Ala Cys

65                  70                  75                  80

Thr Gly Val Asn Val Ala Val Met Val Gly Gly Phe Pro Arg Lys Glu

                85                  90                  95

Gly Met Glu Arg Lys Asp Val Met Thr Lys Asn Val Ser Ile Tyr Lys

            100                 105                 110

Ala Gln Ala Ser Ala Leu Glu Ala His Ala Ala Pro Asn Cys Lys Val

        115                 120                 125

Leu Val Val Ala Asn Pro Ala Asn Thr Asn Ala Leu Ile Leu Lys Glu

    130                 135                 140

Phe Ala Pro Ser Ile Pro Glu Lys Asn Ile Ser Cys Leu Thr Arg Leu

145                 150                 155                 160

Asp His Asn Arg Ala Leu Gly Gln Ile Ser Glu Arg Leu Gly Val Gln

                165                 170                 175

Val Ser Asp Val Lys Asn Ala Ile Ile Trp Gly Asn His Ser Ser Ser

            180                 185                 190

Gln Tyr Pro Asp Val Asn His Ala Thr Val Lys Thr Pro Ser Gly Glu

        195                 200                 205

Lys Pro Val Arg Glu Leu Val Gln Asp Asp Glu Trp Leu Asn Gly Glu

    210                 215                 220

Phe Ile Ala Thr Val Gln Gln Arg Gly Ala Ala Ile Ile Lys Ala Arg

225                 230                 235                 240

Lys Leu Ser Ser Ala Leu Ser Ala Ala Ser Ser Ala Cys Asp His Ile

                245                 250                 255

Arg Asp Trp Val Leu Gly Thr Ala Glu Gly Thr Phe Val Ser Met Gly

            260                 265                 270

Val Tyr Ser Asp Gly Ser Tyr Gly Val Pro Ala Gly Leu Ile Tyr Ser

        275                 280                 285

Phe Pro Val Thr Cys Ser Gly Gly Glu Trp Thr Ile Val Gln Gly Leu

    290                 295                 300

Pro Ile Asp Glu Phe Ser Arg Lys Lys Met Asp Ala Thr Ala Gln Glu

305                 310                 315                     320

Leu Ser Glu Glu Lys Ala Leu Ala Tyr Ser Cys Leu Ala

                325                 330