一种测试真菌产孢培养条件的方法

摘要

本发明公开了一种测试真菌产孢培养条件的方法，该方法包括以下步骤：1)使待测真菌在基础培养基中或适宜该真菌生长的培养基中进行营养生长至产孢前；2)将步骤1)中得到的产孢前的营养菌丝体分别转移至具有不同营养成分、不同营养源、营养成分的不同浓度和/或不同pH的新鲜培养基中，进行产孢培养，测试所述待测真菌的产孢营养条件及pH条件；或/和将步骤1)中得到的产孢前的营养菌丝体直接在不同环境条件中进行产孢培养，测试所述待测真菌产孢的环境条件。利用该两步培养法确定的适宜产孢培养条件对于指导真菌制剂的生产，尤其是提高固态发酵过程孢子产量具有十分重要的指导意义。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域中一种测试真菌产孢培养条件的方法。

背景技术

农业病虫草害给农业生产带来巨大的损失，全世界每年因此减产约13％。目前的防治措施仍以化学防治为主，虽有较好的效果，但用药量大、污染环境，并且会引起药害，产生抗药性，近年来食品安全问题日益受到人们的关注，生物农药的研发正在成为解决这一问题重要而有效的途径。

真菌生物农药是微生物农药的重要组成部分，在植物病虫草害的生物防治中发挥了重要作用。据不完全统计，全世界登记的真菌生物农药已经有30种(生物种)58个产品，如虫生真菌制剂方面，仅绿僵菌和白僵菌制剂即有20多个，用于植物病害防治的真菌制剂，有Trichoderma spp.、Phlebia gigantea、Gliocladium virens等。国内对真菌生防制剂的研究始于20世纪50年代，现已具有一定的规模，如利用刺盘孢菌防治菟丝子，白僵菌大面积防治松毛虫，绿僵菌防治蝗虫及农林害虫，淡紫拟青霉防治线虫病及木霉防治土传病害等。但迄今仍未能规模化生产，主要原因有两个：一是菌种性状存在一定的缺陷，二是工业化生产技术落后、生产水平较低。

真菌孢子是真菌生物农药最主要的组分，其大量生产是制约真菌生物农药的关键因素，而明确营养因子和培养条件对真菌生长和产孢的影响是进行规模化生产的前提。碳源、氮源、维生素和矿物质等营养是真菌生长不可缺少的物质和能量来源，以往对真菌营养要求的研究都是通过在不同的营养基质中接种菌体(孢子和/或菌丝体)，进行固体或液体培养，测定各种营养条件下真菌生长及产孢水平，并结合经济核算，以此作为大规模生产中获得高孢子产量的营养条件。但通过从接种到最后产孢的一步法来确定真菌产孢的生产工艺参数及调控指标不可避免存在一定的问题。一步法是在同一种限定培养基上完成其生长和产孢全过程，而真菌的生长和产孢是两个不同的阶段，其间真菌对营养物质的利用和代谢过程存在很大的差异，因而一步法并不能真正反映真菌产孢过程中对碳氮源、无机盐及其维生素、微量元素等不同营养物质的实际需求，并且真菌由生长阶段转到产孢阶段营养成分已有大量消耗，加之各类真菌对基质中不同营养元素的利用比率不同，即真菌开始其产孢过程时可利用的基质中的有效成分及其含量全部是未知的，此时再以初始的营养条件作为真菌产孢的调控参数势必造成很大的偏差。

此外，培养基中碳氮比的选择对微生物整个发酵过程具有显著的影响，含量或比例不当，都会影响菌体的生长、产物的积累，或引起pH值异常，而菌体在其生长和产孢两个阶段对碳氮比的最适要求也不一样，一般产孢阶段营养含量较低，并且含氮比例增加。只有找到不同阶段最佳的碳氮比，才有可能实现高生物量、高孢子产量。维生素和一些微量元素对有些真菌的生长繁殖是极为重要，甚至是必不可少的，但不同阶段微生物对其需求、利用往往不同，而有些则是在某一阶段有特殊的需求，适时、适量添加，对于生产中，尤其对固液两相生产中降低成本、有效提高产量有着极其重要的实际意义。

除了对营养物质的需求，真菌生长还要受到一定环境因子的制约。对于大多数真菌而言，生长较适的pH值为4-8，而形成孢子所需的pH值范围要窄。真菌在代谢过程中会产生许多中间产物，从而引起基质pH值的变化，进而影响菌体的生长繁殖过程。一步法中起始pH值并不能代表产孢阶段的pH条件，其最佳pH值亦不能反映产孢阶段最适宜的pH条件。

真菌的生长、产孢同温度、湿度、光照、通气等环境条件密切相关。一般地，真菌生长的最适温度为20-30℃，形成孢子所需的温度范围大多较生长的温度范围窄。真菌在生长阶段对干燥十分敏感，而湿度与孢子能否顺利形成也有很大关系。光照能够影响真菌的生长速度、合成能力和孢子形成，尤其对孢子的形成有显著的促进作用。大多数真菌为好气菌，在发酵工业中保证氧的供给，同时又不造成能源的浪费是提高产量、有效降低成本的一个关键因素。环境条件的监测在真菌制剂的生产中具有十分重要的意义，而以往对真菌产孢过程中工艺参数的确定含有很多不确定因素，如生物量的减少造成孢子产量的降低。

发明创造内容

本发明的目的是提供一种测试真菌产孢培养条件的方法。

本发明所提供的测试真菌产孢培养条件的方法，包括以下步骤：

1)使待测真菌在基础培养基中或适宜该真菌生长的培养基中进行营养生长至产孢前；

2)将步骤1)中得到的产孢前的营养菌丝体分别转移至具有不同营养成分、不同营养源、营养成分的不同浓度和/或不同pH的新鲜培养基中，进行产孢培养，测试所述待测真菌的产孢营养条件及pH条件；或/和将步骤1)中得到的产孢前的营养菌丝体直接在不同环境条件中进行产孢培养，测试所述待测真菌产孢的环境条件。

步骤1)中所述待测真菌可按照下述方法培养至产孢前：将待测真菌的孢子和/或菌丝体接种于PDA平板，25℃下培养5-10d，在0.05％Tween-80溶液中洗脱孢子，得到孢子悬液；在固体基础培养基或适宜该真菌生长的固体培养基上覆盖无菌玻璃纸，其上涂布得到的孢子悬液，25℃下培养3-4d，得到产孢前的营养菌丝体。

步骤2)中，可以用单因素实验或多因素实验按常规方法测试所述待测真菌产孢的一项或多项营养条件及环境条件。

在单因素营养条件实验中是将步骤1)中得到的产孢前的营养菌丝体分别转移至具有不同营养成分、不同营养源、营养成分的不同浓度或不同pH的新鲜培养基中，在其它培养条件均相同的条件下进行产孢培养，测试所述待测真菌产孢的该项营养条件或pH条件，具体可按照下述方法进行测试：将产孢前的营养菌丝体分别转移至具有不同营养成分、不同营养源或不同营养成分浓度的新鲜培养基上，继续培养3-7d(具体时间依照待测真菌的实际生长情况而定)，0.05％Tween-80溶液洗脱孢子，测定孢子产量，得出待测真菌的产孢营养条件；所述待测真菌的产孢pH条件可按照下述方法进行测试：将产孢前的营养菌丝体转入营养成分、营养源和营养成分浓度均相同，pH范围为3.5-9.5的具有不同pH的新鲜培养基中，在其它培养条件相同的条件下进行产孢培养，测试所述待测真菌的产孢pH；在单因素环境条件实验中是将步骤1)中得到的产孢前的营养菌丝体直接在不同梯度的一项环境条件(其它环境条件均相同)中进行产孢培养，测试所述待测真菌产孢的该项环境条件，具体可按照下述方法进行测试：将产孢前的营养菌丝体分别直接改变温度、湿度、光照或通气状况，测试所述待测真菌产孢的环境条件。其中，温度范围可控制在15-35℃，湿度可为20-100％rh，光照周期可为0-24h/24-0h，通气状况可采用液体培养中的转速或固体培养中的换气量来衡量。

步骤2)中所述营养条件包括碳源、氮源、碳氮比、无机盐、微量元素和维生素等营养成分的具体种类、组合和浓度；所述环境条件包括温度、湿度、光照和通气状况等影响真菌产孢的环境条件；

上述基础培养基为葡萄糖20g，NaNO₃2g，K₂HPO₄1g，MgSO₄0.5g，KCl0.5g，FeSO₄0.01g，pH6.5。

本发明的方法是将真菌的营养生长阶段和产孢阶段分别进行独立培养的两步培养法，该方法更能真实地反映生防菌株在产孢阶段对营养元素及其环境条件的要求，进而根据不同的需要在大规模生产中进行调控。利用该两步培养法确定的适宜产孢培养条件对于指导真菌制剂的生产，尤其是提高固态发酵过程孢子产量具有十分重要的指导意义。

具体实施方式

实施例1、淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)产孢营养条件的确定

淡紫拟青霉是植物寄生线虫的重要寄生菌。本发明人所在实验室自黑龙江桦南县大豆田中大豆胞囊线虫体内分离到一株淡紫拟青霉-M-14菌株，已在我国东北等地大面积应用于线虫病的生物防治(该菌及其制剂已获国家专利，专利号为ZL95121114.5)。

将M-14接种于PDA平板上，25℃下培养7d，取菌块，加入0.05％Tween-80溶液中，充分振荡，制备10⁶/ml浓度的孢子悬液。选用3种碳源(甘露糖、蔗糖、可溶性淀粉)及3种氮源(缬氨酸、大豆蛋白胨、酵母提取物)中各1种，配制成9种不同碳氮源组合的培养基(其中每种培养基中碳氮浓度分别为8.0g C/L、0.33gN/L)，每1000ml培养基中加入1g K₂HPO₄，0.5g MgSO₄，0.5g KCl，0.01g FeSO₄。同时设以葡萄糖作为碳源(碳浓度为8.0g C/L)，以NaNO₃作为氮源(氮浓度为0.33gN/L)其它成分相同的对照。取10μl M-14孢子悬液分别接种于覆盖灭菌玻璃纸的上述培养基中心，均匀涂布，25℃下培养4d，将菌体连同玻璃纸一起分别转移至与上述培养基成分相同的新鲜培养基上继续培养，4d后0.05％Tween-80溶液洗脱孢子，血球计数板记录不同营养基质中的产孢量。测定结果表明，对于M-14菌株，目前常用的一步法与本发明的两步培养法均以可溶性淀粉/大豆蛋白胨配比最佳，单位面积产孢量分别为11.4*10⁶/cm²和9.4*10⁶/cm²。但该两步法同时显示出8.0g C/L、0.33gN/L的淀粉/酵母提取物不能作为M-14菌株产孢的有效营养基质(产孢量仅为0.4*10⁶/cm²)，而常规的一步法却表明它们可应用于生产进行大量产孢(孢子含量为6.4*10⁶/cm²)，说明在本发明的方法确定的营养条件下进行生产，更能避免不必要的损失。

实施例2、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)产孢营养条件的确定

球孢白僵菌是一类重要的虫生真菌，IBC1201菌株是中国农科院生物防治研究所提供的一株优良菌株，依据本发明的两步培养法技术对其产孢条件进行了筛选。除待测菌株为IBC1201，其它实验方法及待测营养条件均与实施例1同。实验结果表明该两步培养法得出以蔗糖/酵母提取物培养基为最佳，产孢量可达14.4*10⁶/cm²，而淀粉/大豆蛋白胨培养基和淀粉/酵母提取物培养基产孢水平较一般。常规的连续培养法中淀粉/大豆蛋白胨培养基和淀粉/酵母提取物培养基对菌株产孢最为有利，固体培养基上孢子含量可分别达到11.9和11.4*10⁶/cm²，若以蔗糖/酵母提取物作为碳氮源，产孢量为7.6*10⁶/cm²。

实施例3、绿色木霉(Trichoderma viride)产孢营养条件的确定

木霉作为一类重要的生防菌能够有效防治多种植物病害。TV-1菌株由云南省烟草科学院提供，在云南用于烟草赤星病的防治。除待测菌株为TV-1，其它实验方法及待测营养条件均与实施例1同。结果表明常用的连续的一步培养法和本发明的两步培养法得到不同的结论：两步法培养过程中木霉产孢水平显著高于连续的一步培养法，其中以酵母提取物为最佳氮源，显著高于其它无机、有机氮源，不同碳源条件下(甘露糖、蔗糖、可溶性淀粉)，其孢子含量均大于15*10⁶/cm²，而在一步法中没有优势氮源，利于产孢的几种培养基质：蔗糖/缬氨酸、淀粉/酵母提取物、淀粉/大豆蛋白胨、甘露糖/大豆蛋白胨中孢子产率分别为2-4*10⁶/cm²，差异不显著。

实施例4、淡紫拟青霉M-14产孢最佳碳源起始浓度、碳氮比的确定

按照实施例1的方法将淡紫拟青霉M-14孢子接种于蔗糖、大豆蛋白胨、无机盐组成的基础培养基(蔗糖20g，大豆蛋白4.1g，NaNO₃2g，K₂HPO₄1g，MgSO₄0.5g，KCl0.5g，FeSO₄0.01g，pH6.5)上，4d后转移至不同碳源浓度及碳氮比的新鲜上述成分的基础培养基中，其中碳源浓度分别为1g/l，2g/l，4g/l，8g/l，16g/l，氮浓度分别为0.2g/l，0.4g/l，0.8g/l，1.6g/l，继续培养4d，测定真菌产孢的变化。本发明的两步培养法表明碳源浓度为2.0g C/L、C/N＝10∶1时最利于产孢，而一步法中碳源起始浓度一般为8.0g C/L，并不能反映产孢过程的需求值。

实施例5、M-14产孢最适温度条件的确定

按照实施例1的方法在PDA上接种淡紫拟青霉M-14孢子悬液，25℃下培养4d，然后分别转入不同温度：22℃、25℃、28℃、31℃、34℃的生化培养箱中继续培养产孢，结果表明28℃下获得产孢量的最大值。