关节软骨再生材料及其制造方法、关节软骨的再生方法及培养方法以及移植用人造关节软骨

摘要

提供关节软骨再生用材料及其制造方法，关节软骨再生用材料可以在接近自然的环境下，与邻接的周围已存在的关节软骨在良好的状态下一体化，在连续的状态下，可以早期再生具有原始厚度的关节软骨。还有，提供了在生物体内或者生物体外关节软骨的再生方法及培养方法，进而，提供由这些方法得到的移植用人造关节软骨。使用包含各气孔通过开口部位三维连通、气孔率在50％以上90％以下、平均气孔径在100μm以上600μm以下的羟基磷灰石多孔体的关节软骨再生用材料，再生·培养关节软骨。

说明书

技术领域

本发明涉及关节软骨再生材料及其制造方法、关节软骨的再生方法及培养方法以及移植用人造关节软骨，更具体而言，涉及可以再生关节部位特有软骨的材料及其制造方法、以及在生物体内或者生物体外再生关节软骨的方法、培养关节软骨的方法以及采用陶瓷多孔体为基材的移植用人造关节软骨。

背景技术

关节为骨与骨之间的可动结合的连接部位，此连接部位的相互骨端表面(关节面)上覆盖有一层关节软骨。然后，相互的骨端骨膜将连接部包裹成一体形成关节囊。被关节囊覆盖的骨与骨之间形成被称为关节腔的空间，其间充满关节液。

前述形成关节面的软骨，通常，人体膝关节的厚度约为2mm，由于外伤或疾病等造成面积为1-4mm²的损伤的话，通过自然治愈有再生的可能性，但是，如果损伤在20mm²，自身再生就很困难，并且，伴随着非常大的痛苦。

进而，由于肿瘤、坏死等种种原因，在关节软骨完全失去的情况下，为了恢复关节机能，必须实施在该位置埋入人工关节等治疗。

可是，人造关节毕竟是类似关节机能而人造构成的，由于生物体的排异性，维持生物体的亲和性非常困难。

另外，由于人造关节在生物体内严格的环境下，要求有复杂的动作，因此，要维持20年以上是非常困难的，由于其用作原材料的树脂或者金属等老化或者产生磨耗粉末等，也会产生机能低下或者痛苦的情况，可以说在耐久性方面不充分。

从而，作为人造关节治疗的替代品，迫切需要关节软骨自身的再生技术。

另外，对于软骨自身不易形成的软骨形成不全的治疗，也迫切希望不使用人造材料，以生物体组织直接再生关节软骨的技术。

关于再生软骨的技术，虽然提出了几个方案，但是任一方案都是在一般的骨形成的骨化过程的前阶段，一些软骨只是在骨缝隙间分散分布。

例如，在特开平7-88174号公报中，公开了由于使用了atherocollagen的移植体，形成了包括骨膜性连续的骨/软骨的伪骨状骨性隆起。

可是，对于上述移植体中形成的伪骨状骨性隆起，可以说其软骨量不十分充足，作为关节未具备可持续实用性、厚度及数量。

如上所述，关节软骨再生困难，以前，作为关节软骨，连续的膜状或层状软骨的再生实例几乎没有，为了实现实用化，进行了可以足够数量连续地获得这样的软骨的技术开发。

另外，在最近的研究中，有对关节表面进行打孔、将含有骨形成蛋白(BMP：bone morphogentic protein)的胶原蛋白放置在所希望的部位，可再生关节软骨的论文发表。

可是，再生的关节软骨无法与邻近已存在的关节软骨融合连接，可以说不是完全的再生。

另外，胶原蛋白由于BSE(bovine spongiform encephalopathy)、所谓疯牛病等问题，在适用于生物体上存在着敬而远之的倾向。

从而，希望仅仅使用被认可适用于生物体的材料，在再生部分与已存在部分没有界限、融合连接的状态下，再生完全的关节软骨。

在特许第2951342号公报中，公开了使用具有多孔质地部分和致密质地部分两相构造的磷酸钙类的陶瓷，将该陶瓷的致密质地部分作为埋入部分的人造骨辅助材料，可再生玻璃状软骨。

可是，利用上述人造骨辅助材料，对于完全再生，即使是数mm也需要24周的时间，很难说其为早期再生。

本发明旨在解决上述技术课题，目的是提供关节软骨的再生用材料及其制造方法，所述关节软骨的再生用材料在接近自然的条件下，可以在与邻接的周围已存在的关节软骨良好的状态下被一体化，在连续的状态下，可早期再生具有原厚度的关节软骨。

另外，本发明的其他目的是提供生物体内或者生物体外的关节软骨的再生方法及培养方法，进而，提供使用这些方法得到的移植用人造关节软骨。

发明内容

本发明的关节软骨再生用材料，其特征在于，具有羟基磷灰石多孔体，所述多孔体各气孔通过开口部位以三维结构连通，气孔率在50％以上90％以下，平均气孔径在100μm以上600μm以下。

在此，本发明涉及的再生，也用于包含有新形成的意思。

利用具有上述气孔率及气孔形状的羟基磷灰石多孔体，形成关节软骨所必需的间叶细胞、间叶干细胞、骨髓细胞等易于从骨内部进入、固定，因此可早期再生关节软骨。

前述多孔体的气孔是通过搅拌起泡形成的，优选接近于球状的相邻气孔相互之间在接触部位开口，形成连通成连球状的开气孔。

另外，前述多孔体的各气孔间开口部位的平均直径优选20μm以上。

还有，本发明的关节软骨再生用材料，其特征在于，在陶瓷多孔体的气孔内表面上，担载有含有骨形成诱导因子的生物体吸收性材料，所述陶瓷多孔体各气孔通过开口部形成三维连通的连球状开气孔，通过水银孔隙率计测量的细孔直径分布，孔径在5μm以上的气孔体积占全气孔体积的85％以上。

前述骨形成诱导因子优选选自骨形成蛋白(BMP：bonemorphogentic protein)、转化生长因子(TGF-β：transforming growthfactor-β)、骨诱导因子(OIF：osteoinductive factor)、胰岛素样生长因子(IGF：insulin-like growth factor)、血小板源性生长因子(PDGF：platelet-derived growth factor)及成纤维细胞生长因子(FGF：fibroblast growth factor)之一。

为了使上述关节软骨再生材料适应于人体，前述骨形成诱导因子特别优选重组人类骨形成蛋白(rhBMP)。

前述骨形成诱导因子优选在生物体吸收性材料中均匀混合。

另外，前述陶瓷多孔体的气孔，优选通过搅拌起泡形成，气孔率在50％以上90％以下，平均气孔径在100μm以上600μm以下，前述连球状开气孔的各气孔间开口部位的平均直径在20μm以上。

进而，前述陶瓷多孔体，优选选自氧化铝、氧化锆、二氧化硅、多铝红柱石、透辉石、硅灰石、硅酸三钙石、斜硅钙石、镁黄长石、钙镁橄榄石、生物体用玻璃及磷酸钙类陶瓷当中的至少一种。

在这些当中，优选磷酸钙类陶瓷，作为此种磷酸钙类陶瓷，可例举羟基磷灰石、磷酸三钙、氟化磷灰石等。本发明特别优选羟基磷灰石。

另外，前述生物体吸收性材料优选具有骨形成诱导因子的渐释放性，具有如此特性的、可以适用的材料有：有机化合物，例如，乳酸及/或者乙醇酸的聚合物、乳酸及/或者乙醇酸的聚合物与聚乙二醇的嵌段共聚物、乳酸及/或者乙醇酸与对二氧杂环己酮(p-ジオキサノン)和聚乙二醇的共聚物、atherocollagen等。

其中，特别优选聚乳酸的数均分子量在400以上1,000,000以下的、聚乳酸与聚乙二醇的摩尔比为25∶75-75∶25的与聚乙二醇的嵌段共聚物(PLA-PEG)。

另外，乳酸及/或者乙醇酸与对二氧杂环己酮和聚乙二醇的共聚物(PLA-DX-PEG)也同样适用。

另外，本发明的关节软骨再生用材料的制造方法，其特征在于，具有下列步骤：将生物体吸收性材料添加到溶剂或分散剂中，然后与骨形成诱导因子混合，制成混合溶液的步骤；将通过搅拌起泡形成气孔、各气孔通过开口部形成三维连通的连球状开气孔的陶瓷多孔体浸润上述混合液体的步骤；除去前述陶瓷多孔体中的溶剂或分散剂，使生物体吸收性材料及骨形成诱导因子担载在陶瓷多孔体的气孔内表面上得到关节软骨再生用材料的步骤。

前述混合液体的制成步骤中，在生物体吸收性材料为有机化合物的情况下，溶剂或分散剂优选丙酮。

本发明的关节软骨的再生方法，其特征在于，将多孔体埋入比关节面的关节软骨层下面深的位置。

利用上述方法，向多孔体内部导入骨细胞，在该多孔体的上面(关节端的表面)形成软骨底骨，进而在其表面可以再生与周围邻接的原有关节软骨具有相同厚度的关节软骨。

前述关节软骨的再生方法中，优选埋入多孔体，使前述多孔体的至少一部分与骨内的间叶细胞、间叶干细胞或者骨髓细胞相接触。

通过埋入的多孔体与前述间叶细胞等接触，可有助于促进关节软骨的再生。

另外，优选埋入该多孔体，使前述多孔体的上面(关节侧的面)能够露出关节面。

为了不妨碍关节软骨在损伤部位恢复到原有的厚度，优选如上述方法确保再生关节软骨复原空间。

进而，埋入前述多孔体后，优选该多孔体至少一部分与关节液相接触。

利用前述多孔体与关节液的接触，可促进关节软骨的再生。

另外，本发明的关节软骨的再生方法中，优选将关节囊切开露出关节面后，在所希望的部位开孔，并在该孔内，比关节软骨层下面更深的位置埋入前述多孔体，然后，缝合前述关节囊。

通过实施上述治疗，可恢复到原有的可运动状态，借此使关节软骨可早期再生。

前述开孔，优选将孔下端开到达至骨髓附近。

通过将孔开到达至骨髓附近的深度，可在多孔体内导入足量的骨髓细胞。

可是，在生长软骨层存在的情况下，只需将前述多孔体至少一部分埋入达到该生长软骨层的深度，无需开孔到骨髓附近，即有可促进关节软骨再生的倾向。

本发明所用前述多孔体，优选气孔率在50％以上90％以下，具有全体细胞可自由进入及移动的连通孔。

利用具有上述气孔率及气孔形状的多孔体，由于关节软骨形成所需的间叶细胞、间叶干细胞、骨髓细胞等易于从骨内部进入、固定，因此可早期再生关节软骨。

另外，前述多孔体，优选具有羟基磷灰石。

羟基磷灰石是骨构成的主要成分，被公认可适用于人体，从与骨的同化性、愈合性、强度、早期恢复等的观点看，是非常适合的材料。另外，作为细胞的培养基非常适合。

进而，作为前述多孔体，可适合使用通过搅拌起泡而形成气孔的多孔体。

通过搅拌起泡而形成气孔的多孔体，气孔的骨架部分致密(例如，气孔率在5％以下)，气孔近似呈球状。因此，对于多孔体的整体，气孔率变大也可得到高强度的多孔体。另外，由于毛细管现象，可得到间叶细胞等或者血液等易于渗透的性状。另外，单位体积的表面积增大，作为进入的细胞培养基的适合性状也易于形成。易于制造气孔大小均匀、整体的零散度少的匀质多孔体。

另外，本发明的关节软骨的再生方法，其特征在于，将含有骨形成诱导因子且具有渐释放性的由多孔体形成的生物体吸收性材料放置并固着在关节面。

另外，前述材料优选至少一部分与关节液接触。

另外，可以将在气孔内表面担载有生物体吸收性材料及骨形成诱导因子的陶瓷多孔体埋设在关节面，在关节面再生关节软骨。

此时，将前述陶瓷多孔体埋设在关节面后，优选该陶瓷多孔体至少一部分与关节液接触。

在上述关节软骨的再生方法中使用的在气孔内表面担载有生物体吸收性材料及骨形成诱导因子的前述陶瓷多孔体，可适合使用如上所述的本发明的关节软骨再生用材料。

另外，前述关节软骨，优选生长成为400μm以上均等厚度。

另外，本发明的关节软骨的培养方法，其特征在于，将含有骨形成诱导因子且具有渐释放性的由多孔体形成的生物体吸收性材料与可成为软骨的细胞接触或放置在其附近位置，使前述材料至少一部分与关节液接触。

另外，也可将在气孔内表面担载有生物体吸收性材料和骨形成诱导因子的陶瓷多孔体可成为软骨的细胞接触或放置在其附近位置，或者，也可在陶瓷多孔体的气孔内导入可成为软骨的细胞，使前述陶瓷多孔体至少一部分与关节液接触，培养关节软骨。

在此，对于可成为软骨的细胞，优选间叶干细胞。

此外，在气孔内表面担载有生物体吸收性材料及骨形成诱导因子的陶瓷多孔体的气孔内表面的至少一部分中，在形成骨后，进而，在前述陶瓷多孔体的表面至少一部分中，也可根据上述培养方法进行关节软骨的培养。

在上述培养方法中，作为在气孔内表面担载有生物体吸收性材料及骨形成诱导因子的上述陶瓷多孔体，可适合使用前述本发明的关节软骨再生用材料，另外，前述关节软骨，优选培养成为400μm以上均等厚度。

另外，本发明的移植用人造关节软骨，其特征在于，在气孔内表面担载有生物体吸收性材料及骨形成诱导因子的陶瓷多孔体表面的至少一部分形成关节软骨。

前述移植用人造关节软骨中，优选关节软骨为400μm以上均等厚度。

另外，前述移植用人造关节软骨，优选在上述陶瓷多孔体的气孔内，在骨细胞固定形成的骨表面的至少一部分中，形成软骨细胞层，或者，在前述陶瓷多孔体的气孔内，在骨细胞固定形成的骨表面的至少一部分中，形成不含陶瓷多孔体的骨细胞层，进而，在该骨细胞层表面至少一部分上形成软骨细胞层。

在此，作为在气孔内表面担载有生物体吸收性材料及骨形成诱导因子的前述陶瓷多孔体，可适合使用上述本发明的关节软骨再生用材料。

而且，本发明的关节软骨的再生方法或者培养方法，其特征在于，与生物体内的关节软骨或者从生物体中提取的关节软骨接触或在其附近，逐渐释放骨形成诱导因子。

此时，前述骨形成诱导因子，优选在关节液存在的状态下逐渐释放。

附图说明

图1为实施例1的关节软骨再生用材料的埋设部分6周后的显微镜照片图示。

图2为图1A-A’间局部的放大照片图示。

图3为图2上层部分的放大照片图示。

图4为比较例1的关节软骨再生用材料的埋设部分6周后的显微镜照片图示。

图5为图4的C’部分附近的放大照片图示。

图6为图5上层部分的放大照片图示。

图7及图8为本发明的羟基磷灰石制的陶瓷多孔体的电镜照片图示，图7的放大率为150倍，图8的放大率为10,000倍。

图9为通过水银孔隙率计测量图7及图8所示陶瓷多孔体的细孔分布图表。

图10为兔膝关节大腿骨关节软骨附近的示意图。

图11为图10中所示多孔体的埋入部分的放大图示。

图12为关节软骨的再生部分的放大图示。

图13为关于兔膝关节在大腿骨关节表面开孔使下端至骨髓附近的示意图。

具体实施方式

以下，参照部分图，对本发明进行详细说明。

本发明的关节软骨再生用材料具有羟基磷灰石多孔体，所述羟基磷灰石多孔体各气孔通过开口部位以三维结构连通，气孔率在50％以上90％以下，平均气孔径在100μm以上600μm以下。

利用具有上述气孔率及其孔形状的羟基磷灰石多孔体，形成关节软骨所必需的间叶细胞、间叶干细胞、骨髓细胞等或者血液等易于从骨内部进入、并固定，因此可早期再生关节软骨。

再者，前述平均气孔直径可利用树脂包埋的方法进行测量。

当前述气孔率不足50％的情况下，上述间叶细胞等难于进入多孔体内部，导致关节软骨早期再生困难。

另一方面，当前述气孔率超过90％的情况下，上述间叶细胞等的固定性低劣，此种状态也导致关节软骨早期再生困难，还有，得不到良好的强度。

前述气孔率更优选65％以上85％以下。

另外，前述多孔体根据需要也可以以颗粒状使用。

前述多孔体的气孔优选通过搅拌起泡形成，接近于球状的相邻气孔相互间在接触部位开口，形成连通成连球状的开气孔。

如上所述，本发明所用多孔体，可适合使用具有总体上细胞可自由进入及移动的连通孔的多孔体。

另外，前述多孔体的各气孔间开口部的平均直径优选20μm以上，更优选40μm以上。此开口部的平均直径可通过水银孔隙率计(水银压入法)进行测量。

这种多孔体已经在例如特开2000-302567号公报中公开。

或者，本发明的关节软骨再生用材料，其特征在于，在陶瓷多孔体的气孔内表面上，担载有含有骨形成诱导因子的生物体吸收性材料，所述陶瓷多孔体各气孔通过开口部形成三维连通的连球状开气孔，通过水银孔隙率计测量的细孔直径分布，孔径在5μm以上的气孔体积占全气孔体积的85％以上。

作为前述骨形成诱导因子，可使用从骨组织中提取的各种相关骨形成的蛋白质成分。可例举有，骨形成蛋白(BMP：bone morphogenticprotein)、转化生长因子(TGF-β：transforming growth factor-β)、软骨源形成蛋白(CDMP：cartilage-derived morphogentic protein)、骨诱导因子(OIF：osteoinductive factor)、胰岛素样生长因子(IGF：insulin-like growth factor)、血小板源性生长因子(PDGF：plateletderived growth factor)、成纤维细胞生长因子(FGF：fibroblast growthfactor)、结缔组织生长因子(CTGF：connective tissue growth factor)、血管内皮细胞生长因子(VEGF：vascular endothelial growth factor)、肝细胞生长因子(HGF：Hepatocyte growth factor)、胎盘源性生长因子(PIGF：placenta-derived growth factor)、血管生成素(angiopoietin)、bisphosphonate、甲羟戊酸路径抑制剂、信号传送促进剂等。

在这些骨形成诱导因子中，优选使用选自骨形成蛋白(BMP)、转化生长因子(TGF-β)、软骨源性形成因子(CDMP)、骨诱导因子(OIF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)之中的一种或二种以上。进而，为了使前述骨形成用材料适用于人体，更优选基本上不含有源于人类的其他蛋白质的人类骨形成蛋白(hBMP)。

特别是，从免疫性等临床安全性及品质稳定的材料可大量购得的角度出发，优选通过基因重组技术得到的重组人类骨形成蛋白(rhBMP)。就是说，对含有具有编码人类骨诱导因子碱基序列的重组DNA的细胞或者微生物等的转化体进行培养，通过单离、精制利用这些转化体而产生的rhBMP而制成。

作为这些rhBMP，可例举rhBMP-2、rhBMP-3、rhBMP-4(也称为rhBMP-2B)、rhBMP-5或者rhBMP-6、rhBMP-7、rhBMP-8、rhBMP的异源双体或者它们的变体、局部损失体等，可以将它们单独或者二种以上混合使用。其中，为了使软骨再生，优选效果大的rhBMP-2或rhBMP-7，特别优选rhBMP-2。

为了发挥前述骨形成诱导因子的骨形成作用，需要有可担载它的基材。对于此种基材，本发明中使用陶瓷多孔体，所述陶瓷多孔体各气孔通过开口部形成三维连通的连球状开气孔，通过水银孔隙率计测量的细孔直径分布，孔径在5μm以上的气孔体积占全气孔体积的85％以上。

由于这种基材的构造之故，使骨架十分致密、整体具有良好的强度，可以长期稳定地支撑生物体吸收性材料。而且，由于气孔自身大而均匀，通过前述气孔的大开口部，可以使细胞或者体液迅速且有效地移动及循环。

另外，前述基材的各气孔形状近乎球状，尽管气孔率大，由于仍保持其形状不会破坏，因此其气孔内的表面积大，可以在气孔内表面高密度地担载生物体吸收性材料及骨形成诱导因子。

前述骨形成诱导因子，从确保在材料整体上均匀形成关节软骨的观点出发，优选在生物体吸收性材料中均匀混合存在。

前述陶瓷多孔体，以从骨内部到软骨形成部位的细胞或营养易于被导入、易于遍及整体等的角度出发，气孔率优选50％以上90％以下，更优选65％以上85％以下。另外，平均气孔直径优选100μm以上600μm以下。

另外，前述陶瓷多孔体的各气孔间的开口部部分的平均直径优选20μm以上，更优选40μm以上。

图7及图8为本发明的羟基磷灰石制的陶瓷多孔体的电子显微镜照片图示，图7的放大率为150倍，图8的放大率为10,000倍。

另外，图9为通过水银孔隙率计(水银压入法)测量上述羟基磷灰石制陶瓷多孔体的细孔分布图表。

具有上述气孔的陶瓷多孔体，通过搅拌起泡可简单制造出来。通过搅拌起泡形成的陶瓷多孔体，因为气孔骨架致密、气孔近乎球形、高强度，因而是优选的。

具体而言，例如，通过以下制造方法，可得到上述陶瓷多孔体。以羟基磷灰石为材料举例说明。

首先，向羟基磷灰石粉末中添加作为交联聚合性树脂的聚乙烯亚胺等，以水为分散剂，混合、破碎，调制成浆状。

然后，在此浆状物中加入起泡剂聚氧乙烯十二烷基醚等，搅拌使其发泡。

进而，添加山梨醇缩水甘油醚等交联剂，将得到的泡沫状浆状物进行铸型，在固定了发泡结构的状态下进行干燥后，在1100-1300℃左右的温度煅烧，由此得到羟基磷灰石陶瓷多孔体。

前述陶瓷多孔体，优选对生物体无害的、并且，具有良好机械强度性质的陶瓷，具体而言，优选选自氧化铝、氧化锆、二氧化硅、多铝红柱石、透辉石、硅灰石、硅酸三钙石、斜硅钙石、镁黄长石、钙镁橄榄石、生物体用玻璃及磷酸钙类陶瓷中的至少一种。

在这些当中，从生物体适应性优异的角度考虑，优选磷酸钙类陶瓷，作为此种磷酸钙类陶瓷，可例举羟基磷灰石、磷酸三钙、氟化磷灰石等。本发明中，特别从与骨的同化性、愈合性、强度观点看，优选作为骨构成主要成分的羟基磷灰石。

另外，为了在几周到十几周的关节软骨再生的适当期间内，将前述骨形成诱导因子逐渐释放，与前述骨形成诱导因子复合的生物体吸收性材料是不可缺少的。在希望形成关节软骨的部位上直接涂抹骨形成诱导因子，会使该骨形成诱导因子马上流失，无法形成软骨。

从而，作为与骨形成诱导因子复合的生物体吸收性材料，优选具有骨形成诱导因子渐释放性、对生物体无害、在生物体内部组织慢慢吸收的同时，慢慢释放骨形成诱导因子的生物体吸收性材料。

作为具有如此特性的材料，虽然也可以使用磷酸三钙等无机材料，但是从被生物体吸收的时间易控性的观点出发，优选有机化合物。对于有机化合物，可通过调整其分子量以达到调整渐放时间，进而，可以使基材陶瓷多孔体的气孔内均匀且大范围地密布骨形成诱导因子。

再者，从消除由于菌类而导致的感染的观点出发，优选使用通过合成得到的有机化合物。

作为前述生物体吸收性材料，具体而言，可适合使用具有疏水性及亲水性两种性质的高分子材料。例举有，乳酸及/或者乙醇酸的聚合物、乳酸及/或者乙醇酸的聚合物与聚乙二醇的嵌段共聚物、乳酸及/或者乙醇酸与对二氧杂环己酮和聚乙二醇的共聚物(PLA-DX-PEG)、atherocollagen等。

其中，特别是从生物体内部组织的吸收速度及骨形成诱导因子的释放速度、对前述陶瓷多孔体的粘着性、弹性等的观点出发，优选聚乳酸-聚乙二醇共聚物(PLA-PEG)，进而，聚乳酸(PLA)的数均分子量为400以上1,000,000以下，更优选400以上5,000以下。另外，聚乳酸(PLA)与聚乙二醇(PEG)的摩尔比优选25∶75-75∶25。特别是更优选整体的数均分子量在9,000以上9,700以下，摩尔比为60∶40-70∶30。

再者，根据需要也可添加与前述陶瓷多孔体同样材质的陶瓷成分。

同样，数均分子量在5,000以上20,000以下，优选8,000以上10,000以下。乳酸及/或者乙醇酸与对二氧杂环己酮与聚乙二醇的共聚物(PLA-DX-PEG)也适用作生物体吸收性材料。其数均分子量更优选8,900以上9,400以下。

此PLA-DX-PEG，共聚物中的乳酸及/或者乙醇酸和对二氧杂环己酮和聚乙二醇的比例，优选摩尔比为26-60∶4-25∶25-70。

关于此PLA-DX-PEG的具体制法，可使用特开2000-237297号公报中记载的制备方法等。

上述关节软骨再生用材料，可以通过具有下列步骤的制造方法得到：将生物体吸收性材料添加到溶剂或分散剂中后，与骨形成诱导因子混合，制成混合液的步骤；将通过搅拌起泡形成气孔、各气孔通过开口部形成三维连通的连球状开气孔的陶瓷多孔体浸润上述混合液的步骤；除去前述陶瓷多孔体中的溶剂或分散剂，使生物体吸收性材料及骨形成诱导因子担载在陶瓷多孔体的气孔内表面上，得到关节软骨再生材料的步骤。

另外，在前述混合液的制成步骤中，作为溶剂或者分散剂优选使用丙酮、二氯甲烷、氯仿、乙醇等，特别是优选丙酮。优选这些溶剂或分散剂起着使生物体吸收性材料及骨形成诱导因子在陶瓷多孔体内表面均匀担载的作用，其后可通过挥发、冷冻干燥或者减压干燥等方法去除，在所得关节软骨再生用材料中无残存。

下面，对本发明的关节软骨的再生方法进行说明。

本发明的关节软骨的再生方法，其特征在于，将多孔体埋入比关节面的关节软骨层下面更深的位置。

根据上述方法，从骨内部向多孔体内部导入骨细胞，进而，在该多孔体的上面(关节侧的面)形成称为软骨底骨的不含有多孔体的骨层。然后，在前述软骨底骨的上面可以再生与周围邻接的原有关节软骨具有相同厚度的关节软骨。

在本发明的关节软骨的再生方法中，首先，切开关节囊露出关节面。例如，图10示出膝关节的关节软骨再生模式图。

图10所示，在大腿骨11的膝关节中，关节软骨12所需再生的部位，由关节面向纵深方向磨削骨进行打孔。然后，在该孔内将与该孔形状近似相等的多孔体14埋入比关节软骨12的层下面更深的位置。

前述多孔体14，如图10所示，被埋入到其中至少一部分与大量存在间叶细胞、间叶干细胞或者骨髓细胞等的部位接触的位置。

通过埋入多孔体14，使之与前述间叶细胞、间叶干细胞、骨髓细胞等接触，可有助于促进关节软骨的再生。

此时，前述的开孔，如图13所示，打孔到骨髓细胞大量存在的部位，优选其下端到达骨髓附近。

由于打孔到达骨髓附近的深层位置，因此充足的骨髓细胞可以导入到多孔体14的内部。

还有，如此深度开孔的深层部位，可以用多孔体颗粒等填埋，也可以空洞的形式直接存在。

软骨生长层13存在的情况下，优选将前述多孔体14至少一部分埋入到该软骨生长层13的深度位置。

一般情况下，虽然软骨生长层13会伴随着生长、老化而消失，但是，在前述软骨生长层13存在的情况下，如上所述，将多孔体14埋入到可接触到它的位置，与不接触软骨生长层13的情况比较，确认有可得到优良关节软骨的再生效果的倾向。

另外，前述多孔体14的厚度薄的话，即使磨削骨打孔深度很浅也可埋入，对骨的创伤也会很小，但是从来自骨内部的细胞易于侵入等的观点出发，优选在前述孔内可充分固定的厚度。

另外，根据本发明的方法，为了在关节软骨损伤的原有部位恢复到原有的厚度，优选在希望关节软骨再生的部位，以不会产生妨碍的方式，就是说，以多孔体14的上面露出的状态埋入多孔体。

图11为图10中埋入多孔体14的位置的放大图示。

如图11所示，将多孔体14在比已存在的关节软骨12的层下仅深d的位置，就是说，形成凹部P的状态下，进行埋入固定。然后，将该多孔体14的上面露出于关节面，缝合关节囊，处理完毕。

处理结束后，经过一段时间，骨内所含间叶细胞、间叶干细胞、骨髓细胞等或血液等由骨内部浸透多孔体14，或者，由凹部P的侧面，就是说，由B所示箭头方向，向前述凹部P供给。

然后，骨细胞进入多孔体14的内部，在如图12所示状态下，再生关节软骨。

就是说，埋入多孔体14的部分在含有该多孔体14的状态下，在该部分中形成骨。另外，与此同时，在前述多孔体14的上面，如图12所示，形成了不包含多孔体14的被称之为软骨底骨15的新骨层。

进而，在软骨底骨15的上面形成关节软骨12。再生的关节软骨形成的厚度与周围邻接的已经存在的关节软骨相同，以良好的状态形成一体化。而且，以连续圆滑的状态形成，其表面的边缘没有出现龟裂、损伤、凹凸不平等现象。

一方面，在多孔体14的上面被埋入到与已存在的关节软骨12的层下面同等深度的位置，或者，被浅度埋入的情况下，就是说，在未形成凹部P的状态下埋入时，无法形成关节软骨，或者，关节底骨也无法形成。

并且，边缘部分的关节软骨下面D，与其他部分的关节软骨层相比，有些许变厚的倾向。

根据被埋入的多孔体14上面的深度位置的不同，前述边缘部位的关节软骨下面D的形成状态会有不同，据此，可以认为骨内部的间叶细胞等的供给状态是其中一个要因。

经推测，如上所述，由于将多孔体14在比已存在的关节软骨12的层下面仅深d的位置，就是说，在形成凹部P的状态下进行埋入，间叶细胞等也可由凹部P的侧面得到供给，或者，由于提早修复损伤部位的自然愈合力的作用，在边缘部位的关节软骨下面D，关节软骨层变厚。

在上述处理中，埋入多孔体，缝合关节囊后，优选关节囊内充满关节液。

可认为前述多孔体由于至少一部分与关节液接触，因此受到某些刺激，可以促进关节软骨的再生。

另外，在可运动关节的状态下，优选给予负重的变化、关节液的压力变化等刺激。给予如此刺激，可对关节软骨的再生产生促进作用。

作为前述多孔体，优选气孔率在50％以上90％以下，具有总体上细胞可自由进入及移动的连通孔。    

前述多孔体，如果对生物体无害的、并且，具有良好机械强度的材质，无论无机物、有机物或者无机物与有机物的复合材料都可以。另外，生物体吸收性材料也可以。

具体而言，适合使用钛、氧化铝、氧化锆、二氧化硅、多铝红柱石、透辉石、硅灰石、硅酸三钙石、斜硅钙石、镁黄长石、钙镁橄榄石、生物体用玻璃、磷酸钙类陶瓷、乳酸及/或者乙醇酸的聚合物或者共聚物、胶原蛋白等。

也可以将这些材料2种以上进行复合使用。

在这些当中，优选优于生物体适应性的、已公认也可使用于人体的磷酸钙类陶瓷，例如，可适合使用羟基磷灰石、磷酸三钙、氟化磷灰石等。

本发明从与骨的同化性、愈合性、强度、早期恢复的观点出发，特别优选作为骨构成主要成分的羟基磷灰石。

使用上述成分构成的多孔体进行关节软骨的再生时，即使不使用骨形成诱导因子等特殊因子，也可以再生关节软骨，但是为了进一步确保再生，优选与前述多孔体一同使用骨形成诱导因子。

进而，作为关节软骨的再生方法，优选将含有骨形成诱导因子且具有渐释放性的由多孔体形成的生物体吸收性材料放置并固着在关节面。例如，以患者自身的骨作为培养基，在其表面也可以形成关节软骨。

前述骨形成诱导因子，由于单独在前述多孔体上直接涂抹会导致其马上流失，优选具有骨形成诱导因子渐释放性、对生物体无害、在生物体内部组织慢慢吸收的同时，慢慢释放骨形成诱导因子的生物体吸收性材料中均匀混合。

以前述生物体吸收性材料作为多孔体的情况下，其多孔体本身由于具有多数的连通气孔，因此使体液或者细胞容易导入，优选以该生物体吸收性材料作为培养基，在其表面等再生关节软骨。

对于这种生物体吸收性材料，具体而言，可适合使用上述材料。

另外，前述生物体吸收性材料优选至少一部分与关节液接触。

另外，将气孔内表面担载有生物体吸收性材料及骨形成诱导因子的陶瓷多孔体埋设到关节面，在关节面也可再生关节软骨。根据如此方法，容易固定关节软骨。

此时，前述陶瓷多孔体，优选在比邻接的关节软骨表面稍深的位置，就是说，形成凹现状进行埋设。由于如此安置可确保关节软骨的再生的空间，并且，可使再生的关节软骨与邻接的关节软骨间无缝隙地同化连接。

认为与骨形成诱导因子一起，关节液自身或者含于其中的特定成分可促进关节软骨的再生或形成。就是说，在关节液中可能含有维持修复关节软骨的物质。

从而，即使在使用了含有上述骨形成因子并具有渐释放性的材料，或者在气孔内表面担载有生物体吸收性材料及骨形成诱导因子的陶瓷多孔体时，如果将它们埋设在与关节液自身或者含于其中的特定成分不接触的位置，也不会形成关节软骨。

为此，前述陶瓷多孔体在埋设到关节面后，优选该陶瓷多孔体至少一部分与关节液接触。

如上述再生的关节软骨，为了确保具有充分的关节机能，其厚度在400μm以上，更优选形成500μm以上的均匀厚度。

如此，为了得到具有充分量的连续的关节软骨，可适合使用上述本发明的关节软骨再生用材料作为上述再生方法中的气孔内表面担载有生物体吸收性材料及骨形成诱导因子的陶瓷多孔体。

而且，如上所述，如果使用本发明的关节软骨再生用材料，即使不使用骨形成诱导因子等特殊因子，即使用已公认了的适用于人体的羟基磷灰石制成的特定多孔体，也可使关节软骨早期再生到原始厚度。

根据如上所述本发明的方法，例如，对于因剧烈运动等而造成的关节软骨大面积损伤的患者，也可实施如下的方法，在不影响关节软骨机能的关节面侧部位置提取自身关节软骨移植到患部，将本发明的关节软骨再生用材料填充由此产生的侧面部位的孔，填补被提取的关节软骨。

另外，通过使用本发明的关节软骨再生用材料，也可以将从患者处提取软骨细胞或者间叶细胞、间叶干细胞、骨髓细胞等，于体外采用与生物体内关节部分同样的环境下形成，在该环境下进行关节软骨的培养，然后移植到患部。由此，也可以确立替代原来给患者带来莫大负担和痛苦的人造关节治疗的治疗方法。

下面，对本发明的关节软骨的培养方法进行说明。本发明的关节软骨的培养方法，其特征在于，将含有骨形成诱导因子且具有渐释放性的由多孔体形成的生物体吸收性材料放置在与可成为软骨的细胞相接触或其附近位置，使前述材料至少一部分与关节液接触，培养关节软骨。

根据该方法，可以利用自身的关节液在体外进行关节软骨的培养。虽然，在体外培养的关节软骨本身的移植很困难，但是，在与体外培养的骨一体化的状态下，或者，通过在体外培养的关节软骨周围放置未分化细胞等方法，可移植体外培养的关节软骨。

另外，将在气孔内表面担载有生物体吸收性材料及骨形成诱导因子的前述陶瓷多孔体，放置在与可成为软骨的细胞相接触或其附近位置，或者，将可成为软骨的细胞导入陶瓷多孔体的气孔内，使前述陶瓷多孔体至少一部分与关节液接触，也可培养关节软骨。

如此，在培养的关节软骨周围，放置可成为软骨的细胞，就是说，放置未分化的细胞，可以移植体外培养的关节软骨。

在此，作为上述可成为软骨的细胞，有间叶干细胞、软骨细胞、通过基因重组形成软骨细胞的细胞等，虽无特定限制，但是更优选间叶干细胞。

并且，在上述培养方法中，前述材料至少一部分与关节液接触时，为了接近于关节囊内的环境，亦可对关节液加压。

此外，在气孔内表面担载有生物体吸收性材料及骨形成诱导因子的陶瓷多孔体的气孔内表面的至少一部分中，在形成骨后，进而，在其表面的至少一部分，也可根据上述培养方法进行关节软骨的培养。

如此操作，由于在被培养的关节软骨正下方，同样培养的骨在一体化状态下形成，由此也可以移植体外培养的关节软骨。

如上所述培养出的关节软骨，为了充分确保其关节的机能，其厚度在400μm以上，更优选形成500μm以上的均匀厚度。

如此，为了得到具有充分量的连续的关节软骨，可适合使用上述本发明的关节软骨再生用材料作为上述培养方法中的在气孔内表面担载有生物体吸收性材料及骨形成诱导因子的陶瓷多孔体。

下面，对本发明的移植用人造关节软骨进行说明。本发明的移植用人造关节软骨，其特征在于，在气孔内表面担载有生物体吸收性材料及骨形成诱导因子的陶瓷多孔体的表面的至少一部分形成关节软骨。

这种移植用人造关节软骨可依照上述关节软骨的培养方法得到。

另外，优选的是，前述移植用人造关节软骨，在上述陶瓷多孔体的气孔内固定骨细胞而形成的骨表面的至少一部分中形成软骨细胞层，或者，在前述陶瓷多孔体的气孔内，在固定有骨细胞而形成的骨的表面的至少一部分，形成不包含陶瓷多孔体的骨细胞层，进而，在该骨细胞层表面的至少一部分上形成软骨细胞层。

如上所述，向体内仅移植关节软骨，由于从与骨的附着性观点出发有一定困难，所以在移植用人造关节软骨中，如上所述，优选软骨细胞层与其下面的骨或者骨细胞一体化。

此时，作为气孔内表面担载有生物体吸收性材料及骨形成诱导因子的陶瓷多孔体，可以适合使用上述本发明的关节软骨再生用材料。

此外，本发明的关节软骨的再生或形成方法或者培养方法，其特征在于，在与生物体内的关节软骨或者从生物体上提取的关节软骨相接触的或者其附近的位置，逐渐释放骨形成诱导因子。优选与已存在的生物体关节软骨一体地形成关节软骨层，另外，根据生物体软骨细胞的活性化的考虑，可促进关节软骨的再生或形成或者培养。

此时，前述骨形成诱导因子，优选在关节液的存在条件下逐渐释放。

以下，以实施例为基础对本发明进行具体说明，本发明不受下述

实施例的限制。

[实施例1]

将100mg由DL-丙交酯、对二氧杂环己酮、聚乙二醇形成的数均分子量为9300的共聚物PLA-DX-PEG(PLA∶DX∶PEG＝45∶17∶38(摩尔比))和20μg rhBMP-2进行混合，以丙酮进行稀释，制成凝胶状混合物。

用此凝胶状混合物浸润通过搅拌起泡制成的羟基磷灰石多孔体(直径4mm、长度4mm、气孔率75％、平均气孔径200μm、通过水银孔隙率计测量的5μm以上的气孔体积占97％以上)后，经过一定时间的放置，使丙酮挥发，在羟基磷灰石多孔体的气孔内表面上，形成生物体吸收性材料与骨形成诱导因子的均匀混合层，得到关节软骨再生用材料。

将得到的关节软骨再生用材料埋设到按其大小开孔的兔大腿骨关节面后，复原其关节，然后缝合切开部位。

此时，将关节软骨再生用材料在比周围软骨组织的下端稍深(约深0.4mm)的位置固定。

3、6、12周后，从表面观察前述材料的埋设部位。

3周后，关节软骨仅再生了一点点，6周后，外观上基本上再生到原始程度。进而，12周后，已完整再生。

图1、图2及图3为6周后的埋设部位的显微镜照片图示。

图1中，A-A’间为埋设了关节软骨再生用材料的部位。在关节表面1的下层，形成再生的关节软骨2的层X。另外，在前述再生关节软骨层X与陶瓷多孔体层Z之间，存在有不含陶瓷多孔体，仅由骨组成的层Y。

而且，已确认在陶瓷多孔体的气孔内，骨细胞进入，骨已经再生。

图2为图1的A-A’间局部的放大照片图示。图3为更进一步，其上层部分的放大照片图示。

如图1所示，6周后，经确认已形成的再生关节软骨层X的厚度约为500μm(约为兔正常关节软骨的2/3)。

另外，在图1、图2及图3的A和A’的部分，前述再生关节软骨2与原关节软骨的边缘形成难以辨认的接合，此附近的再生关节软骨层X(Q部分)，确认所形成的特别厚。

而且，如图3所示，在再生关节软骨层2中，大量软骨细胞3被确认。

进而，12周后，埋设部位(A-A’间)已经恢复到无法区分的状态。

[比较例1]

除不含骨形成诱导因子外，其他与实施例1相同，制造出关节软骨再生用材料。

与实施例1作法相同，将得到的关节软骨再生用材料埋设到兔大腿骨关节面，3、6、12周后，从表面观察埋设部位。

这里，将关节软骨再生用材料在与周围软骨组织的下端深度基本相同的位置固定。

3、6、12周后，骨虽然形成，但是未发现关节软骨的再生。

图4、图5及图6为6周后的埋设部分的显微镜照片图示。图4中，C-C’间为埋设了关节软骨再生用材料的部分。

图5为图4的C-C’间局部的放大照片图示。图6为更进一步图示其上层部分的放大照片。

如图4所示，经过6周后，埋设部分(C-C’间)与原关节软骨的边缘部分，特别是C’部分可清晰辨认出。

另外，如图6所示，在前述材料的埋设部分(C-C’间)，虽然发现有纤维软骨4，但是未能发现关节软骨的形成。

而且，由于未能发现2型胶原蛋白，所以可以确认纤维软骨4不是关节软骨。

进而，12周后也未发现软骨的形成。

[比较例2]

将与实施例1相同方法制造的关节软骨再生用材料埋设在兔大腿骨关节侧面，3、6、12周后，观察埋设部分。

其结果是，6周后虽然发现骨的再生，但其表面未形成软骨。

如上所述，使用本发明的担载有骨形成诱导因子的关节软骨再生用材料的情况(实施例1)，与未担载骨形成诱导因子的情况(比较例1)相比较有所不同，有充分量连续性关节软骨形成被确认。

另外，将担载有骨形成诱导因子的关节软骨再生用材料与关节液接触的情况(实施例1)，可形成关节软骨，而不与关节液接触的情况(比较例2)，发现未形成关节软骨。

[实施例2]

通过搅拌起泡制造由羟基磷灰石构成的气孔率75％、气孔直径200μm的多孔体，并将其加工成直径4mm、长4mm的圆筒状体。

切开兔的膝关节，在其大腿骨关节面上以直径4mm打孔，该孔深至一部分到达生长软骨层3的位置，将所得多孔体埋入该孔内，其表面比关节软骨层深1mm，即如图11中d＝1mm的位置，然后将其关节复原，进而，缝合切开部位，达到可运动状态。

对5只兔(n＝5)进行了上述处理。

[实施例3]

制造了与实施例2相同的由羟基磷灰石构成多孔体。

将此多孔体埋入到其表面比关节软骨层深2mm处，即如图11中d＝2mm的位置，除此之外其他一切与实施例2相同，对兔的膝关节实施处理。

[比较例3]

制造了与实施例2相同的由羟基磷灰石构成多孔体。

将此多孔体埋入到其表面与关节软骨层的下面相同深度位置，即如图11中d＝0的位置，除此之外其他一切与实施例2相同，对兔的膝关节实施处理。

[比较例4]

制造了与实施例2相同的由羟基磷灰石构成多孔体。

将此多孔体埋入到其表面比关节软骨层的下面的深度位置浅0.5mm的位置，除此之外其他一切与实施例2相同，对兔的膝关节实施处理。

[比较例5]

作为对比实验，切开兔的膝关节，在其大腿骨关节面上开直径4mm、深4mm的孔，在该孔内不埋入任何东西，将其关节复原，进而，缝合切开部位，达到可运动状态。

对5只兔(n＝5)进行了上述处理。

3周后，对上述实施例2、3及比较例3-5中所实施处理的各部分进行观察。

其结果是，将多孔体埋入比关节软骨层的下面更深的位置(实施例2、3)的情况下，虽然仅经过了短短的3周时间，在多孔体上面已形成关节底骨，并且具有与邻接的正常关节软骨相同的厚度，发现约60％已基本上完全再生有关节软骨。

此再生的关节软骨已形成连续的圆滑的边缘部的表面。

另外，在再生的关节软骨与周围邻接的正常关节软骨的边缘部分的下面，发现所形成的关节软骨稍微加厚了。

另一方面，将多孔体埋入与关节软骨层的下面深度相同的位置，或者，稍浅的位置(比较例3、4)的情况下，关节软骨没有再生。

由此，可得出结论，在关节软骨层与多孔体之间如果没有关节底骨形成的空间，将无法再生关节软骨。

另外，作为对比实验，未埋入多孔体(比较例5)的情况下，关节软骨完全没有再生。

[实施例4]

用100mg由DL-丙交酯、对二氧杂环己酮、聚乙二醇形成的数均分子量为9300的共聚物PLA-DX-PEG(PLA∶DX∶PEG＝45∶17∶38(摩尔比))和20μg的rhBMP-2进行混合，以丙酮进行稀释，制成凝胶状混合物。

用此凝胶状混合物浸润与实施例2相同方法制造的由羟基磷灰石构成的多孔体后，经过一定时间的放置，使丙酮挥发，在羟基磷灰石多孔体的气孔内表面上，形成生物体吸收性材料与骨形成诱导因子的均匀混合层，成为关节软骨再生用材料。

使用此关节软骨再生用材料，与实施例2相同，对兔膝关节实施处理。

3周后，观察实施处理的部分，在使用了由担载有生物体吸收性材料和骨形成诱导因子的多孔体构成的关节软骨再生用材料的情况下(实施例4)，约100％都几乎完整地再生有关节软骨，与仅由多孔体构成的关节软骨再生用材料(实施例2、3)相比较，可认为关节软骨再生的可靠性更优越。特别认为，在整体厚度的均匀性上具有优越性。

[实施例5]

制造了与实施例2相同的由羟基磷灰石构成多孔体。

切开兔的膝关节，在大腿骨关节面开直径4mm未达生长软骨层的孔，除此之外，其他一切与实施例2相同，对兔的膝关节实施处理。

还有，为了能够放入前述孔内，对前述多孔体的长度进行了适当的微调整。

[实施例6]

制造了与实施例2相同的由羟基磷灰石构成多孔体。

切开兔的膝关节，在大腿骨关节面开直径4mm贯穿生长软骨层到达骨髓附近的孔，除此之外，其他一切与实施例2相同，对兔的膝关节实施处理。

还有，前述孔内底部留为中空。

3周后，观察实施处理的部分，在开孔未达生长软骨层的情况下(实施例5)，及开孔贯穿生长软骨层到达骨髓附近的情况下(实施例6)，都在多孔体上面形成关节底骨，并且在其表面已确认再生有关节软骨。

但是，在开孔未达生长软骨层的情况下(实施例4)，约20％几乎以完整状态再生关节软骨，其中，再生的关节软骨的厚度不均匀，等到完全再生出关节软骨，还需要一定时间。

另一方面，开孔贯穿生长软骨层到达骨髓附近的情况(实施例6)，与开孔部分到达生长软骨层的情况(实施例2)相同，确认约60％几乎完整地再生关节软骨。

产业化上的可利用性

通过使用本发明的关节软骨再生用材料，可在接近于自然的状态下进行关节软骨的再生，使实用水平的关节软骨的形成成为可能。

另外，通过本发明的关节软骨的再生方法及培养方法，使用仅被认可适用于人体的材质构成的材料，在接近于自然的环境下，可与周围邻接的已存在的关节软骨在良好的状态下一体化，在连续的状态下，可早期再生出具有原始厚度的关节软骨。

进而，如果使用通过这些方法得到的本发明的移植用人造关节软骨，由于在生物体适应性及固着性方面具有优越性，因此可确立一种替代给予患者巨大负担及痛苦的传统人造关节治疗的治疗方法。