法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2022-04-08
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N15/82 专利号:ZL03810041X 申请日:20030429 授权公告日:20070404
专利权的终止
2020-04-10
专利权的转移 IPC(主分类):C12N15/82 登记生效日:20200323 变更前: 变更后: 申请日:20030429
专利申请权、专利权的转移
2012-05-30
专利权的转移 IPC(主分类):C12N15/82 变更前: 变更后: 登记生效日:20120418 申请日:20030429
专利申请权、专利权的转移
2007-04-04
授权
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2005-09-28
实质审查的生效
实质审查的生效
2005-08-03
公开
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发明领域
本发明涉及制备植物的方法，所述植物中杀昆虫蛋白在诱导局部表达的创伤诱导启动子，优选TR2’创伤诱导型启动子的调节下表达；本发明还涉及该方法中使用的嵌合基因和由此得到的植物，以及通过在昆虫进食伤害植物时诱导杀昆虫蛋白局部表达来抵抗食用植物的昆虫的方法。
背景技术
在制备抵抗昆虫进攻的植物的尝试中，大多数通过并且被认为依赖于高水平表达杀昆虫毒素获得了成功(Estruch等，1997；Witowsky &Siegfried，1997)。最尤其是Bt毒素，其作为全长蛋白被发现在植物中表达不足，研究工作集中于通过使用强组成型启动子和通过修饰编码它们的基因来增加这些毒素的表达(Vaeck等，1987；Barton等，1987)。最近，有人提出在易受攻击的组织中或者通过昆虫进食引发来空间调节杀昆虫蛋白的表达可能为抗性操纵提供好处(Peferoen & Van Rie，1997)。对于转基因昆虫抗性植物，获得管理机构批准的一个主要条件是昆虫抗性操纵策略的实用性。目前有利的策略是将转基因植物对靶害虫的100％毒性(通过高剂量表达特定毒素并且在害虫的整个生命周期中进行表达来实现)和非转基因植物的庇护作用(这使得靶害虫群体得以维持)联合起来(De Maagd等1999)。为了能够遵守这种策略，在制备昆虫抗性植物时强组成性启动子的使用得到了进一步的鼓励。
昆虫抗性的诱导型表达最初在马铃薯蛋白酶抑制剂基因(pin I和pin 2)上进行了检查，该基因是植物自然防御系统的一部分，其确保在植物受创后在整株植物中产生全身性信号(Green和Ryan，1972；Hilder等1987)。稻中pin 2基因的导入导致稻植株中该蛋白的高水平全身性积累，该植株显示出对主要害虫的增加的抗性(Duan等，1996)。Breitler等(2001)描述了使用玉米蛋白酶抑制剂(MPI)基因的C1区来驱动稻中cry 1B编码序列的创伤诱导表达，发现第一代转化株可以有效地保护稻抵抗钻心虫攻击，在此创伤诱导表达被描述为局部的和全身性的。
在小规模实验室实验中，用置于大豆诱导型vspB启动子控制下的cry1Ab3基因转化的转基因甘蓝叶和用置于35S启动子控制下的相同基因转化的叶对小菜蛾一样具有毒性，但是没有显示出创伤诱导性(Jin等，2000)。
根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的甘露碱合酶基因的TR2’启动子(最初被认为指导组成型表达)((Velten等1984；Vaeck等1987)已经被用于指导番茄中天然Cry1Ab基因的创伤诱导型表达，其导致相对低的表达和仅仅中等的昆虫控制水平(Reynaerts & Jansens，1994)。尽管已有人提出可以广泛应用于Bt蛋白表达(Peferoen，1997)，但是对烟草和其他双子叶植物中TR2’启动子的表达模式的报导却存在分歧(Ni等，1995)。通常，优选使用单子叶植物启动子以在单子叶植物中最优表达基因(Shimamoto，1994)并且已经发现一些启动子在单子叶植物和双子叶植物中具有不同的顺式作用元件(Luan等，1992)。在玉米原生质体中研究了TR2’启动子的不同元件对其活性的贡献(Fox等，1992)，但是没有关于单子叶植物中TR2’启动子的表达模式的报导。此外，发现最强的缺失突变体的活性比CaMV35S启动子活性低20倍(Fox等，1992)。
农杆菌甘露碱合酶启动子一直被表征为组成型、根特异性和组织特异性启动子，例如，见美国专利6291745、6320100和63133378。在美国专利5641664中，认为用于指导转化的双子叶植物中基因表达的各种组成型和器官-和组织特异性启动子也适于在转化的单子叶植物中使用。在该专利中作为用于转化植物细胞的适宜外来组成型启动子的一般列表的一部分，提到了TR1’和TR2’启动子，它们分别驱动农杆菌T-DNA的1’和2’基因的表达，并且被称为创伤诱导的启动子。但该专利没有显示用TR2’或TR1’启动子转化的单子叶植物，也没有提示这些启动子在单子叶植物中是创伤诱导的启动子或者可用于单子叶植物中杀昆虫蛋白的表达。
本发明描述了TR2’启动子可怎样用于指导单子叶植物中杀昆虫蛋白的创伤诱导表达以得到杀昆虫抗性。TR2’启动子的这种创伤诱导表达导致杀昆虫蛋白表达的强烈但是局部的增加。因为该蛋白的限制性表达将对在工程化作物农艺性状的维持上起重要作用的功能产生最小的负担，因此，对植物活力和生长造成的推定影响(这种影响可以在高水平表达一些Bt蛋白时，特别是在反复近交后观察到，如在WO 00/26378中关于Cry2Ab的报导)将可能被减小。当设想将不同性状(或者不同Bt蛋白)叠加在一起时，这也是一个重要的因素。由于只有在靶害虫接触时才得到高剂量表达水平，这种植物将符合现今的IRM策略。此外，空间和时间上受限的(即，受伤时，在易受伤的组织中)表达模式与昆虫毒素特异性的组合将可能减少对非靶生物体的暴露，可以想到这比植物组成性产生毒素更有利。因此，对于主要农作物如玉米和稻，确保有效昆虫抗性的有效调节表达系统不论从管理还是从农业角度看都是有意义的。
发明概述
本发明涉及在单子叶植物中获得杀昆虫蛋白的创伤诱导表达的方法，该方法包括向植物基因组中导入外来DNA，所述外来DNA是嵌合基因，含有在包含TR2’启动子的启动子区控制下的编码杀昆虫蛋白的DNA序列。根据本发明的一个特定实施方案，杀昆虫蛋白为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)毒素。在本发明优选的实施方案中，杀昆虫蛋白是具有抗单子叶植物害虫活性的杀昆虫蛋白，最优选地，该杀昆虫蛋白可以是Cry1Ab、Cry1F、Cry2Ae、Cry9C或Cry2Ab蛋白或者其杀昆虫片段或突变体。
从而，本发明一个优选的实施方案涉及通过向植物、植物细胞或组织提供含有处于包含TR2’启动子的启动子区控制下的编码杀昆虫蛋白的DNA序列的外来DNA，在植物、植物细胞或植物组织，更尤其是单子叶植物，特别是禾本科(尤其是玉米)植物、植物细胞或植物组织中获得昆虫抗性，优选高剂量昆虫抗性的方法。根据本发明，TR2’启动子用于增加植物受伤时，例如昆虫进食时杀昆虫蛋白的表达。因此，根据本发明的特定实施方案，单子叶植物中杀昆虫蛋白的表达水平(优选在温室中通过ELISA测定法测量)在没有受伤或者受侵袭时是低的(即，叶中低于0.005％总可溶蛋白(从几株，优选至少3株，尤其是至少5株相同转化事件的植物进行多次测量的平均值))，但在受伤或受侵袭组织，特别是叶子中，24小时内表达增加，优选至少两倍，最优选增加5到100倍。
根据本发明优选的实施方案，含有处于创伤诱导型TR2’启动子控制下编码杀昆虫蛋白的DNA序列的嵌合基因被用于通过指导杀昆虫蛋白在昆虫进食部位局部表达而对单子叶植物，特别是禾本科植物，最尤其是玉米赋予昆虫抗性。因此，本发明涉及用于在单子叶植物中得到创伤诱导表达的嵌合基因。在本发明的特定实施方案中，在未受伤的、未被侵袭的植物的叶子中表达(如在温室中测量的)是低的或检测不到的(小于总可溶蛋白的0.005％(从几株，优选至少3株，尤其是至少5株相同事件的植物得到的多个测量值的平均值)，而一旦受到侵袭，在18小时内杀昆虫蛋白的水平在受侵袭的组织中被局部诱导增加(至少两倍，优选增加至少5到100倍或更多)。根据本发明的该方面，提供了植物，更尤其是单子叶植物，该植物由于在它们的基因组中存在含有处于用以确保在创伤组织中表达的TR2’启动子控制下的编码杀昆虫蛋白的DNA序列的外来DNA而具有昆虫抗性。根据本发明的一个实施方案，植物中杀昆虫蛋白的表达为，在没有受伤的植物中(例如，当在温室中生长时)，杀昆虫蛋白以低水平或检测不到的水平(即，低于总可溶蛋白的0.005％(从几株，优选至少3株，尤其是至少5株相同事件的植物得到的多个测量值的平均值))在叶、茎、种子和花粉中，优选至少在叶和花粉中，尤其是至少在叶中表达，而当植物被昆虫咬食时，杀昆虫蛋白在受创伤的组织，优选叶中增加到足够杀死进食的昆虫的水平，优选达到总可溶蛋白的至少0.01％的浓度。
根据本发明的优选的实施方案，TR2’启动子被用于单子叶植物中以通过指导杀昆虫蛋白(其为Bt毒素)进行创伤诱导表达而赋予植物抗昆虫抗性。编码Bt毒素的这种DNA序列的实例是本领域中熟知的并且在本文中描述。
根据本发明的一个实施方案，在玉米中使用TR2’启动子指导Bt毒素创伤诱导表达，基于在靶昆虫进食时在植物中局部高剂量表达所述毒素，而尤其适于赋予玉米抗欧洲玉米螟(ECB)抗性。本发明的植物或植物部分(细胞或组织)在它们的基因组中含有外来DNA，该外来DNA含有处于TR2’启动子控制下编码杀昆虫蛋白的DNA序列，因此本发明植物或植物部分受伤时将产生对ECB幼虫，尤其对第4龄期的ECB幼虫具毒性的杀昆虫蛋白水平，该杀昆虫蛋白水平可通过此处描述的昆虫功效测定法确定。优选地，得到至少97％，优选至少99％，最优选100％的ECB四龄幼虫死亡率。
本发明还涉及在未受伤的植物叶子中以非常低基础水平表达杀昆虫蛋白的抗昆虫抗性单子叶植物。根据本发明的特定方面，得到单子叶植物，尤其是玉米，这些植物兼有有效昆虫抗性和最优的农艺特征，并且没有由于杀昆虫蛋白的表达而对农艺性状产生不利影响，这可以通过评价植物表型、分离、出苗、活力和农艺级别确定。
根据本发明的另一个方面，得到单子叶植物，尤其是玉米植物，它们具抗昆虫抗性，并尤其适于与其他性状(例如，其他类型的昆虫抗性、除草剂抗性或农艺性状)叠加。
根据本发明的另一个方面，提供了单子叶植物，尤其是玉米植物，它们对一种或多种靶害虫具有抗性，但是在没有受伤时(优选在叶和花粉中，尤其是在叶中)产生的杀昆虫蛋白低到检测不到，从而限制了非靶生物体与杀昆虫蛋白的接触。
根据本发明，具有上述特征的植物通过向植物的基因组中导入处于TR2’启动子控制下的编码杀昆虫蛋白的DNA序列而获得，该TR2’启动子被证明在单子叶植物，尤其是在玉米植物中起着创伤诱导型启动子的功能。
发明详述
如此处所用的术语“基因”指含有一些可操作地连接的DNA片段如启动子区、5’非翻译区(5’UTR)、编码区(可以编码或不编码蛋白)和包括多聚腺苷酸化位点的非翻译3’区(3’UTR)的任何DNA序列。通常在植物细胞中，5’UTR、编码区和3’UTR被转录成RNA，对于编码蛋白的基因，该RNA的编码区被翻译成蛋白。基因可包括额外的DNA片段，例如，内含子。尽管本发明中用于转化的基因需要启动子区，但是含有多聚腺苷酸化位点的3’UTR不必存在于该转移的基因自身中，而可以在插入不含有包括多聚腺苷酸化位点的3’UTR的基因后在上游植物DNA序列中找到。类似地，可以将本发明的编码序列插入植物基因组中位于已经存在的植物启动子下游，以便从这种重构的嵌合基因实现本发明杀昆虫蛋白在植物中的表达(例如，在启动子标记实验(promoter tagging experiments)中)。
术语“嵌合的”当指基因或DNA序列时表示含有至少两种功能上相关的DNA片段(如启动子、5’UTR、编码区、3’UTR、内含子)的基因或DNA序列，其中所述DNA片段天然并不相互连接和/或者来自例如，不同的来源。当相对于植物物种提及基因或DNA序列时，“外来的”用于表明该基因或DNA序列不在那个植物物种中天然存在，或者不天然存在于那个植物物种的那个基因座中。术语“外来DNA”在此处用于指作为转化的结果而掺入到植物或其后代植物的基因组中的DNA序列。
如此处所用的植物、植物组织或植物细胞的基因组指植物、植物组织或植物细胞中的任何遗传物质，包括核、质体和线粒体的基因组。
如此处所用，DNA分子或蛋白质序列的“片段”或“截短形式”指所涉及的原来的DNA或蛋白质序列(核酸或氨基酸序列)的一部分或者其合成版本(如适于在植物中最佳表达的序列)，其长度可变但是其最小长度应足够保证(编码的)蛋白具有生物学活性，而其最大长度不是关键的。序列的“变体”或“突变体”在此处用于表示其序列(核酸或氨基酸)基本上与术语所涉及的序列相同的DNA分子或蛋白质。
“基本相同”的序列指当两个序列被比对(align)时，百分序列同一性(即，具有相同核苷酸或氨基酸的位置的数目除以较短序列的核苷酸或氨基酸的数目)高于70％，优选高于85％，更优选高于90％，特别优选高于95％，最优选为96％到100％。两个核苷酸序列的比对通过如Wilbur和Lipmann(1983)所描述的算法，使用窗口大小20个核苷酸，字长4个核苷酸和缺口罚分4进行。
“杀昆虫的”在此处用于指对农作物昆虫害虫有毒。更具体地，在本发明的上下文中，靶昆虫为单子叶植物，最尤其是玉米的害虫，例如，但不限于主要鳞翅目害虫，如Ostrinia nubilalis(欧洲玉米螟或ECB)、Sesamia nonagrioides(地中海蛀茎夜蛾)和Helicoverpa zea(美洲棉铃虫)，以及主要鞘翅目害虫，如Diabrotica属昆虫、尤其是Diabrotica virgiferavirgifera和Diabrotica undecimpunctata howardi(玉米切根虫)。
如此处所用的“杀昆虫蛋白”或“毒素”应被理解为对昆虫有毒的蛋白、多肽或肽。这种杀昆虫蛋白的实例为Bt Cry毒素、其突变体或杀昆虫片段(如Hfte和Whiteley，1989所综述的，Crickmore等(1998)和WO00/26378，WO 97/40162，和US 6,023,013中描述的那些)，更尤其是Cry2Ae(WO 02/057664)蛋白或其杀昆虫片段、Cry2Ab蛋白或其杀昆虫片段、Cry9C蛋白或其片段或突变体(例如，在WO94/24264或WO99/00407中所描述的那些)、Cry1F蛋白或其杀昆虫片段、和Cry1Ab蛋白或其杀昆虫片段、以及149B1组合的(约14和44千道尔顿)毒素或其杀昆虫片段和Cry3Ab蛋白和其杀昆虫片段或其突变体(如在美国专利6,548,291、6,063,597和6,501,009中所描述的)。其他杀昆虫蛋白有例如VIP，尤其是VIP3A，更尤其是VIP3Aa、VIP3Ab和VIP3Ac蛋白或其杀昆虫片段(Estruch等，1996，WO 96/10083、美国专利6,429,360、5,877,012)，或者mis、war和sup序列编码的蛋白(WO98/18932、WO99/57282)，以及从Xhenorabdus和Photorabdus ssp.分离的毒素，如Photorabdusluminescens产生的毒素(Forst等，1997)。其他杀昆虫蛋白包括，但不限于，马铃薯蛋白酶抑制剂I和II、豇豆蛋白酶抑制剂、大豆的半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Zhao等，1996)或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白，如从稻和玉米分离的那些(Irie等，1996)、胆固醇氧化酶、几丁质酶和凝集素。杀昆虫蛋白可以是原毒素(即，编码杀昆虫蛋白的全长基因的初级翻译产物)。本发明还包括上面提到的蛋白的具有杀昆虫活性的等价物和变体、衍生物、截短物或杂种。如此处所用的Bt毒素，或Bt蛋白指直接或间接(例如，被修饰以提高在植物中的表达或对昆虫的毒性)来自苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)天然产生的蛋白并且含有与天然产生的Bt毒素的毒性片段或至少其域基本相同的序列的如前定义的杀昆虫蛋白。如此处所用的Bt毒素或Bt蛋白可以是晶体蛋白或其杀昆虫部分，或者可以是非晶体蛋白如分泌性蛋白或主要在Bt株系的营养阶段产生的蛋白，或者可以是其杀昆虫突变体或部分。如此处所用的编码杀昆虫蛋白的DNA包括截短的、修饰的、合成的或天然的编码杀昆虫蛋白的DNA序列。
在本发明的特定实施方案中，编码杀昆虫蛋白的DNA为编码Bt毒素的DNA序列，更优选被修饰以增加植物中杀昆虫蛋白的表达的DNA序列。根据本发明的特定实施方案，编码杀昆虫蛋白的DNA序列为修饰的cry1AbDNA序列，其编码Hfte等(1986)描述的Cry1Ab5蛋白的至少一部分，优选编码含有氨基酸位置1-28到氨基酸位置607-725的氨基酸序列，最优选含有氨基酸1-616的蛋白。最优选地，编码的修饰的Cry1Ab蛋白在ATG起始密码子后有丙氨酸密码子(GCT)插入(AlaAsp2…Asp616)。
植物材料中杀昆虫蛋白的表达水平可通过现有技术中描述的许多方法确定，如使用特定引物定量组织中产生的编码杀昆虫蛋白的mRNA(如Cornelissen & Vandewiele，1989所描述的)或者例如通过免疫学检测方法直接特异性检测产生的杀昆虫蛋白的量。更具体地，根据本发明，杀昆虫蛋白的表达水平表示为通过如此处描述的免疫特异性ELISA确定的可溶性杀昆虫蛋白相对于可溶性蛋白总量(例如通过Bradford分析(Bradford，1976)确定)的百分数。本发明中优选的ELISA为夹心ELISA(Clark等，1986)。
如此处所用，“创伤诱导型”启动子或指导创伤诱导性表达模式的启动子是指当植物受伤时，至少在叶中，处于该启动子控制下的编码序列的表达显著增加，即，至少两倍，优选增加5倍，最优选增加20到100倍。如此处所用，“受伤”旨在指由任何类型的昆虫进食引起的至少植物表皮或外部细胞层的机械损伤或者穿孔，此处所用的受伤也可通过用锋利的器具如解剖刀切割叶片来模拟。优选地，根据本发明，植物中杀昆虫蛋白，优选Bt杀昆虫蛋白的创伤诱导表达指V4期植物叶中该蛋白的基础表达(即，没有受伤时，优选在温室中测量时)是低的，最优选低于总可溶蛋白含量的0.005％(从一个转化事件的几株植物得到的平均测量值)，而当出现创伤时，优选到达总可溶蛋白的0.01％以上水平，更优选到达总可溶蛋白含量的0.04％到0.5％或更高(所述值为使用受伤后分离然后体外孵育几小时，例如约12到约60小时，优选约18到约20小时的叶片部分测量获得的值)。使用切下的叶进行体外测定(在这种测定中，在植物受伤后将切下的叶或其部分在体外(例如，在湿润滤纸上于培养皿中)在温室中或生长室中室温下孵育孵育几小时，优选约12到60小时，更优选约18到20小时(以更好反映昆虫进食时的条件))测得的值通常比受伤后不对分离的叶或其部分进行体外孵育而在植物中(in planta)测量到的值给出更高的表达诱导。当在植物叶受伤后但不切除该叶片部分进行体外孵育的情况下约12到60小时，更优选约18到20小时测量时，创伤诱导的蛋白水平通常较低(但仍然显著高于未诱导的背景水平)。对于创伤后植物组织，优选叶中杀昆虫蛋白浓度的测量，以及对于如此处描述的表达增加的测量，优选使用脱离的组织，优选叶在经体外孵育的情况下进行，因为这可能更好地反映了昆虫进食时组织中诱导的实际浓度(对照叶子为新鲜的、未受伤的并且未经历体外孵育的叶，从而更好地反映植物组织中的实际浓度)。如此处所用，创伤诱导型启动子的基础或背景表达水平优选利用从温室生长的植物上新鲜切下的、以前未受伤的叶片材料来测量。根据本发明的特定实施方案，至少在受伤叶片中杀昆虫蛋白的表达在受伤位置处升高至总可溶蛋白量的0.1％。可以相信，在昆虫进食时实际被昆虫摄入的本发明杀昆虫蛋白占总可溶性蛋白的百分数比在植物或其部分中测量到的百分数高，这是因为杀昆虫蛋白为局部表达并且仅有被诱导的(受伤的)组织才被昆虫摄入。而且，对于蛋白浓度测量，为进行杀昆虫蛋白含量分析，将切下一定最小量的植物组织(通常对叶片，切下伤口周围的约2-3mm)，所以可以相信未受伤细胞的存在将降低从样品提取的总可溶蛋白中杀昆虫蛋白的百分数。
如通常在该类转化实验中观察到的，转化后得到一系列不同植物转化事件，优选使用选择方法以选择用于进一步发育(即，用于杂交成适应于特定生产区域的适宜的植物株系)的最佳植物。在这种选择方法中，选择在植物组织，优选在叶和花粉中，最优选在叶中显示低的或检测不到的蛋白水平，而在创伤诱导下于叶中显示表达增加至少5倍的植物。
如此处所用，“温室”指植物的相对稳定的生长环境，该环境使植物脱离正常的大田条件，完全或几乎不受到可损害大田中农作物的昆虫、兔、鸟或其他动物或外部因素(如风或暴风雪)的侵袭。通常的温室大部分由透明材料，如玻璃或塑料制造以允许自然日光到达植物，并且可以调节控制光、生长培养基(土壤或人工基质)、水和营养物供应和/或温度。如此处所用，只要能提供光源和生长培养基以建立正常的植物生长条件，温室也包括没有日光的房间或盒子。因此，为了比较的目的，温室是测量本发明的创伤诱导型构建体在叶中的基础或背景表达水平(非诱导状态)的最适宜的地方。
尽管在大田的植物叶中可获得杀昆虫蛋白的类似的基础或背景表达值，但是预期昆虫侵袭或例如车辆、兔子或鸟等对大田植物的机械伤害将通过诱导本发明的创伤诱导型启动子而增加表达水平，因此通常在大田所有植物中测量到的水平都非真实的基础水平。
如此处所用，“高剂量”表达或“高剂量”昆虫抗性当涉及根据本发明的植物，优选单子叶植物时，指植物中杀昆虫蛋白的浓度(通过ELISA测量为总可溶蛋白的百分数，其中在提取缓冲液(例如，Jansens等1997描述的提取缓冲液)中提取可溶蛋白后使用Bradford分析(Bio-Rad，Richmond，CA；Bradford，1976)测量该总可溶蛋白)，该浓度杀死发育阶段的目标昆虫，该阶段的昆虫比一龄期昆虫幼虫显著较少受到该毒素的影响，优选对该毒素的敏感性低25到100倍，从而可以预期确保完全控制该目标昆虫，最优选地，高剂量昆虫抗性为得到至少97％，优选至少99％，最优选100％的四龄(对于具有5个幼虫龄期的昆虫)或者最后幼虫龄期(例如，具有4个或更少的幼虫龄期的昆虫)的靶昆虫死亡率，其中测量方式为在标准昆虫生物测定法中，优选在全株植物生物测定法中在具有高剂量表达或高剂量昆虫抗性的植物受到昆虫侵袭后10到14天测量。只要根据本发明的转化植物提供了针对一种靶昆虫物种的高剂量昆虫抗性(所述靶昆虫为可以导致植物物种或品种遭到商业上显著损害的昆虫物种，并且该物种通常是开发的转基因植物所针对的昆虫)就足够将该植物定义为给予了根据本发明的“高剂量”表达。本发明还包括被本发明的创伤诱导型嵌合基因转化的、采用昆虫生物测定法测定具有如上述的高剂量昆虫抗性的植物细胞或植物组织，尤其是玉米植物细胞或植物组织，不论其包含在植物中或者存在于体外培养物中。
如此处所用，高剂量当涉及在玉米中控制ECB时指轮生中期(mid-whorl stage)植物产生对L4龄期ECB幼虫具有毒性的杀昆虫蛋白量(欧洲玉米螟：生态学和控制.1996.North Central Regional ExtensionPublication No.327.Iowa State University，Ames，Iowa)，该量可通过毒性测定法用此处描述的人工侵袭来确定，其中用L4幼虫侵袭植物后14天，优选10天在试验中得到至少90％，优选至少97％，更优选至少99％，最优选100％的L4 ECB幼虫死亡率。令人惊奇地，甚至在非诱导状态下只有低表达或者只有通过灵敏的ELISA方案也检测不到的表达时，使用TR2’启动子驱动创伤诱导表达仍可以在本发明的玉米植物中得到杀昆虫蛋白的高剂量表达，并且表达仅仅在昆虫进食时被诱导。如在植物转化实验中常见的，转化后得到的一些植物并不适于进一步发展，因此需要从所得转化事件中选择具有低的基础或背景表达和高剂量创伤诱导表达的适宜植物株系，优选这种植物株系含有仅仅一个编码杀昆虫蛋白的插入DNA。通常，商业上可接受的植物株系可以从100以上，优选数百株最初转化的植株中得到。
根据本发明，“创伤诱导”表达的另一优选特征是启动子的作用是局部的，即，基本局限于直接受创伤影响或者直接围绕受伤组织的那些细胞或组织。这与全身性作用相反，全身性作用直接或间接地(通过反应级联)保证了与植物的天然防御机制相关的蛋白的广泛作用，更具体地保证了这些蛋白的广泛表达。优选地，通过ELISA(见上面)测量温室生长的植物，植物的未受伤组织中杀昆虫蛋白的表达平均不高于总可溶蛋白浓度的0.01％，更优选地不高于总可溶蛋白的0.005％(从来自一个转化事件的几个，优选至少3个，尤其是至少5个植物得到的多个测量值的平均值)。在本发明的一个优选的实施方案中，叶，尤其是玉米叶中创伤诱导型启动子的活性局限于创伤区，并且在距离受伤位点10cm以上，尤其是2cm以上的植物区域，尤其是叶中(例如，在相同植株中低于或高于受伤叶子的叶子中，以及在距离叶上的受伤位点10cm以外，优选2cm以外的同一叶中)将检测不到(使用ELISA测定法)。这有效地将植物，尤其是叶子，优选玉米叶子中的表达限制在需要表达的那些地方(即，昆虫进食或者至少对叶组织打孔以试图进食的地方)，从而使表达造成的植物胁迫(这种胁迫可以由高水平组成型表达导致)被最小化。尤其是当在一个植株中堆积几种编码不同蛋白(例如，不同昆虫控制蛋白)的基因时，对一种或多种引入的基因实施创伤诱导表达被认为是有益的。
在另一个实施方案中，根据本发明的杀昆虫蛋白的创伤诱导表达的特征是表达的快速诱导，使用测定法在受伤后约18到24小时，优选在18、20或24小时测量，表达从基础或背景水平上升到较高蛋白水平(至少为对照量的两倍，优选对照量的至少5到100倍)，在该测定法中，损伤叶片部分、切下该叶并体外孵育上述的一段时间(基础或背景水平在新鲜切下并且以前未受伤的、未体外孵育的叶部分中测量)。
如此处所用，“TR2’启动子”指含有农杆菌TR1’-TR2’二元启动子元件(Velten等1984；Langridge等1989)的TR2’(或甘露碱合酶，简写为mas)功能部分的任何启动子。因此，这可以包含单独的TR2’元件或还包含趋异的TR1’元件(Guevara-Garcia等，1998)或其他(调节)元件(包括但不限于增强子区、内含子，等等)，只要根据本发明的创伤诱导型启动子特征基本保存即可。在本发明的一个优选的实施方案中，即使使用TR1’-TR2’二元启动子(或者其中保留了TR2’启动子元件的任何部分)，也从FR2’启动子区指导转录(从而编码序列可操纵地与TR2’启动子序列相连并位于TR2’启动子序列的下游)。最优选地，如此处所用的TR2’启动子指这样的启动子区，其含有SEQ ID NO：1中从核苷酸位置1到336之间的一个核苷酸位置到核苷酸位置483的片段，优选含有SEQ ID NO：1的核苷酸96到483的序列，最优选含有SEQ ID NO：1或其功能等价物，即，能够在植物，更尤其是在单子叶植物中指导创伤诱导表达的SEQ ID NO：1的变体。这种功能功能等价物包括与含有至少SEQ ID NO：1的核苷酸328到483(含有TR2’启动子元件，Velten等，1984)的核苷酸序列基本相同的序列。这种序列可以从不同农杆菌株系分离。备选地，这种功能等价物相应于可以在聚合酶链式反应中用含有SEQ ID NO：1核苷酸328到483中的至少约25个，优选至少约50个或多达100个连续核苷酸的寡核苷酸引物扩增的序列。TR2’启动子的功能等价物也可以通过SEQ ID NO：1序列中核苷酸的置换、添加或缺失而得到，包括含有SEQ ID NO：1的功能性TR2’部分的杂合启动子。这种启动子序列可以部分或全部合成。
本发明的植物通过控制量的杀昆虫蛋白的创伤诱导表达而受到保护免于昆虫害虫的损害。“控制”指毒性(致死)或杀伤性(亚致死)的量。优选地，诱导时，产生高剂量(如此前定义的)。同时，植物应该具有正常形态并且可以以通常的方式栽培以用于消费和/或生产产品。此外，这种植物应该基本上不需要(针对杀昆虫蛋白的目标昆虫的)化学或生物杀昆虫剂。
可用不同测定法测量杀昆虫蛋白表达在植物中的作用。更具体地，玉米植株中产生的杀昆虫蛋白对欧洲玉米螟或ECB的毒性(此处也叫作ECB功效)可通过在进食生物测定法中用ECB幼虫试验从植物提取的蛋白或者通过对分布在培养皿中的转化植物叶材料上的幼虫的死亡率打分(两种测定法都由Jansen等，1997描述)来体外分析。在大田中，基于叶损伤级别评价第一窝ECB幼虫(ECB1)的侵袭(Guthrie，1989)，而通过评估每株植物茎秆蛀道的总数和茎秆蛀道的长度来指示第二窝ECB(ECB2)的茎秆进食损害(茎秆蛀道长度分析见，例如，Jansen等，1997)。
本发明的植物任选地还可以在它们的基因组中包含编码除草剂抗性的基因。更特别地，除草剂抗性基因为bar或pat基因，其赋予植物对草铵膦的耐受性，即植物可耐受除草剂LibertyTM。对LibertyTM的耐受性可以用不同方法检验。例如，可通过LibertyTM喷雾应用检验耐受性。喷雾处理应在植物的V2和V6期之间进行以便得到最佳结果。耐受性植物的特征是对植物喷雾至少200克活性成分/公顷(g.a.i./ha)，优选400g.a.i./ha，可能高达1600g.a.i./ha(正常大田比率的4倍)，不会杀死植物。播撒应用应该以28-34盎斯LibertyTM+3lb硫酸铵/英亩的比率应用。最好以每英亩20加仑水体积使用平扇型喷嘴应用，同时小心不要直接喷雾到植物的轮中以避免对叶表面造成灼伤。除草剂的效果应该在48小时内出现并且在5-7天内清楚可见。其他除草剂抗性基因的实例为编码苯敌草抗性的基因(如pmph基因；US 5,347,047；US 5,543,306)、编码草甘膦抗性的基因(如EPSPS基因，US 5,510,471)、编码溴苯腈抗性的基因(如在US 4,810,648中描述的)、编码磺酰脲抗性的基因(如在EPA 0 360 750中描述的)、编码对除草剂茅草枯的抗性的基因(如在WO 99/27116中描述的)和编码对氨基氰的抗性的基因(如在WO 98/48023和WO 98/56238中描述的)和编码谷氨酰胺合成酶抑制剂如PPT的抗性的基因(如在EP-A-0 242 236、EP-A-0 242246、EP-A-0 257 542中描述的)。
根据本发明的一个优选的实施方案，含有处于TR2’启动子控制下编码杀昆虫蛋白的DNA的嵌合基因可以与其他嵌合基因组合被(同时或相继)导入植物中，从而在植物中得到不同性状(也称作“叠加”)。类似地，含有包括处于TR2’启动子控制下编码杀昆虫蛋白的DNA的嵌合基因的本发明植物尤其适于与其他性状组合。这些其他性状包括，但不限于例如由嵌合基因编码的赋予昆虫抗性、除草剂抗性、胁迫或干旱耐受性的那些性状，或者修饰植物的其他农艺特征的性状。此类性状也可包括合成将要从植物回收的产物。
向植株、细胞或组织的基因组中导入外来DNA或嵌合基因可通过不同方法实现并且不是本发明的关键。单子叶植物的成功的遗传转化已经通过多种方法实现，这些方法包括农杆菌介导的转化(例如在US 6,074,877或US 6,140,553中对玉米的转化)、微粒轰击法(例如，Chen等，1994描述的)、DNA摄入原生质体(如Data等1999；Poulsen，1996描述的)和电穿孔法(D’Halluin等，1992)。
下面的非限制性实施例描述用于在植物中表达的、含有处于TR2’启动子控制下编码杀昆虫蛋白的DNA序列的嵌合基因的构建，以及由此得到的昆虫抗性植物。除非在实施例中特别说明，所有重组DNA技术都根据Sambrook和Russell(2001)《分子克隆：实验指南》(Molecnlar Cboning：Alaboratong Manual)第三版，冷泉港实验室出版社，NY，及Ausubel等(1994)Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols，USA的第一和第二卷及Brown(1998)Molecular Biology LabFax，第二版，Academic Press(UK)的第一和第二卷中描述的标准方案进行。植物分子操作的标准材料和方法在BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications，UK联合出版的R.D.D.Croy的PlantMolecular Biology Labfax(1993)中描述。聚合酶链式反应的标准材料和方法可以参见Dieffenbach和Dveksler(1995)PCR Primer：A LaboratoryManual，冷泉港实验室出版社和McPherson等(2000)PCR-Basics：FromBackground to Bench，第一版，Springer Verlag，德国。
在整个说明书和实施例中，参考序列表中给出的下面的序列：
SEQ ID NO：1：TR2’启动子的优选实施方案的核苷酸序列
SEQ ID NO：2：pTSVH0212的序列
SEQ ID NO：3：修饰的cry1Ab编码序列
实施例
实施例1：具有处于TR2’启动子控制下的外来基因的事件的产生
a)事件的形成
为了评价编码杀昆虫基因的DNA序列的创伤诱导表达，产生了包含含有指导修饰的cry1Ab蛋白表达的TR2’启动子(Velten等1984)的启动子区的构建体。含有置于T-DNA两边界之间的目的基因(也称作“TR2’-Cry1Ab”)的质粒pTSVH0212被用于农杆菌介导的转化(WO 98/37212)。
在表1中提供了PTSVH0212构建体的结构。对于组成型表达杀昆虫蛋白的对照植物，用如下构建体进行转化，这些构建体含有编码修饰的Cry1Ab蛋白的DNA序列，该DNA序列处于花椰菜花叶病毒35S启动子(Franck等1980)(称为35S-cry1Ab)控制下，或者处于水稻GOS2基因启动子(de Pater等，1992)的控制下并具有来自Petunia的cab22前导序列(Harpster等1988)(也称为′Gos/cab-cry1Ab′)或者来自水稻GOS2基因的5′前导序列，含有GOS转录产物的第二外显子、第一内含子和第一外显子(de Pater等，1992)(称为′Gos/gos-cry1Ab′)。所有构建体都含有35S-bar基因。
表1.pTSVH0212(TR2’-cry1Ab)中遗传元件的核苷酸位置。
基于对Liberty的耐受性选择再生的小植株。
b)事件的评价
检验农杆菌转化体中T-DNA左边界处载体序列的存在。用初始转化体(T0)的叶进行Southern印迹分析。
实施例2：杀昆虫蛋白的创伤诱导表达
i)杀昆虫蛋白的基础表达
使用Jansens等，1997中描述的提取方法和缓冲液提取可溶蛋白后，通过Cry1Ab夹心ELISA，用缩聚的(polycondensated)抗Cry1Ab多克隆兔抗血清的IgG级分作为第一抗体，用抗Cry1Ab的单克隆抗体作为第二抗体，确定修饰的Cry1Ab杀昆虫蛋白的基础表达水平。V3期植物的叶样品、R1期植物的花粉和叶以及收获时的叶、茎和花粉采自温室中的植物(玉米各期的确定方法见“玉米植株是怎样发育的”，特别报导No.48，Iowa州立科学与技术大学，Cooperative Extension Service，Ames，Iowa，1993年6月再版；也见含有相关信息的网站：http：//www.extension.iastate.edu/pages/hancock/agriculture/corn/corn_develop/CornGrowthStages.html：)。作为比较的样品采自用Gos/gos-cry1Ab构建体转化的植物。
结果以检测到的Cry1Ab蛋白占总可溶蛋白(使用Bradford测定法(Bio-Rad，Richmond，CA；Bradford，1976)测量)的百分数在表2中提供。平均值代表取自一个转化事件的不同植物株系的5个样品的平均值。
表2用TR2’-cry1Ab和Gos/gos-cry1Ab构建体转化的植物的不同组织中Cry1Ab蛋白的表达
对于用TR2’-cry1Ab构建体转化得到的植物，发现温室中修饰的Cry1Ab蛋白的基础表达的平均值在从V3期、R1期或收获时得到的所有叶样品中都低于检测限(总可溶蛋白的0.001％或0.000％)。发现茎中杀昆虫蛋白的平均基础表达在大多数收获时的植物中为总可溶蛋白的约0.01％。在用Gos/gos-cry1Ab构建体得到的植物中，Cry1Ab蛋白的表达在所有叶样品中高于0.2％，并且在收获时采集的一些茎样品中高达1％以上。
ii)杀昆虫蛋白的创伤诱导表达
在温室中进行研究以确定机械损伤时在非转化的植物、用TR2’-cry1Ab构建体得到的植物和用Gos/cab-cry1Ab构建体得到的植物中杀昆虫Cry1Ab蛋白的表达。通过切割损伤叶和根。在完全展开的叶子上产生伤口，用解剖刀在叶片上产生每mm一个垂直的切口但不损伤中脉。机械损伤之前和之后18小时采集叶样品。通过ELISA在切下的叶部分(围绕伤口2到3cm切下叶部分)上测量Cry1Ab蛋白水平(表3)，其中这些切下的叶部分在生长室中20℃下在培养皿中的Murashige和Skoog培养基(MS培养基，其组成见R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993)，BIOS Scientific Publications Ltd (UK)和Blackwell ScientificPublications，UK，联合出版)湿润的滤纸上孵育18小时——从植物上切下类似大小的对照叶片并将其立即置于干冰上用于蛋白测量(无体外孵育)。平均值代表每个转化事件的5株植株的平均。
表3：机械损伤之前和之后不同植物部分中杀昆虫蛋白的表达
在被检验的不同TR2’-cry1Ab事件的叶、茎和谷粒中Cry1Ab蛋白的表达再次或者不存在或者接近检测极限。在V4和开花期的植物叶和花粉中没有发现显著表达。对于这些植物，在根中发现约为总可溶蛋白的0.02-0.03％的组成型表达。当叶被机械损伤时，Cry1Ab蛋白的表达被诱导并上升到0.05-0.1％。35S-cry1Ab事件在V3植物的叶子中显示出约0.5％Cry1Ab蛋白的组成型表达，而且此表达与创伤无关。在开花和收获期，受伤之前和之后测量到的表达水平为约0.1-0.2％。
一个类似分析(其中在温室生长的植物上进行植物中(in planta)创伤(不对切下的叶部分作体外孵育))导致更低的表达值，但是创伤时仍然显示出显著增加的表达。
在该分析中，二龄ECB幼虫被置于VT期WI602-0402的5棵玉米植株上夹叶虫盒(clip-cage)中。对于每株植株，60小时后，从夹叶虫盒中受损叶区和距夹叶虫盒上下2cm或10cm的叶，以及从具有夹叶虫盒的叶子的上面和下面的叶采集样品。在实验开始时也采集叶样品。对样品进行Cry1AbELISA，计算平均值(粗体)和标准差。结果在下面的表4中显示。
表4.TR2’-Cry1Ab植株中Cry1Ab浓度(通过昆虫进食引进损伤)。
在另一分析中，将事件WI604-1602和WI606-1206的5株VT期植株在温室中用解剖刀损伤。对于每株植株，40小时后，从损伤的叶区(通常围绕创伤位点2到3m)、从相同叶上受损区的上和下2cm到10cm，以及从位置高于和低于受伤叶的叶采集样品。也在实验开始时采集了叶样品。对样品进行Cry1AbELISA，计算平均值(粗体)和标准差。
结果在下面的表5中显示。
表5：TR2’-Cry1Ab植物株系中Cry1Ab浓度(通过解剖刀损伤)
在额外的大田试验中的测量确证了植物中Cry1Ab的低基础表达水平(使用从植株采集的新鲜叶材料，不体外孵育)：在大田试验中，每个含有pTR2’-Cry1Ab构建体的事件取5株自交植物株系，大田中总可溶蛋白的0.001％到0.003％为Cry1Ab蛋白(每个事件的5株植株的平均(平均标准差0.001到0.004％))。而且，另一大田试验证明在大田中人工用ECB幼虫侵袭的玉米植株比不用昆虫侵袭的植株有更多Cry1Ab蛋白。在该试验(8株植株)中发现的Cry1Ab的表达水平平均是：在营养期的叶子中为总可溶蛋白的0.001到0.002％，在R1叶子中为总可溶蛋白的0.003到0.046％，在R5-6叶子中为总可溶蛋白的0.009到0.017％(使用采自植株的新鲜叶材料，不体外孵育)。如预期的，大田中昆虫侵袭使一些植物中Cry1Ab蛋白浓度增加(样品从植物上随机采集)。
实施例3：具有创伤诱导表达的植物的昆虫抗性
a)对抗受控的ECB4龄幼虫侵袭的功效
将轮生中期玉米植株置于树脂玻璃圆筒中并用10或15只4龄欧洲玉米螟幼虫侵袭。10天后，解剖植物并计算每株植物的幼虫存活百分数。结果在表6中提供。
表6.抗四龄ECB幼虫的功效
发现在受控侵袭中对四龄ECB幼虫的控制功效在所有检验的TR2’-cry1Ab植株中都为100％。对照植株显示出平均最大值为50％的死亡率。由于考虑到四龄ECB幼虫对修饰的Cry1Ab蛋白的敏感性比一龄幼虫低25到100倍，在TR2’-cry1Ab植株中产生的蛋白水平可被认为是“高剂量”，尽管创伤诱导后在这些植株中测量到的表达值通常仍然相对较低。
b)抗ECB的功效
在温室和大田试验中评价14个事件对ECB的功效(表7)。结果表示为每植株上蛀道的平均长度与蛀道的最大长度的比(括号内为标准差)(平均长度(sd)/最大长度/植株)。在温室中，蛀道的平均长度来自对10株植株的测量。在大田中，ECB功效表示为针对10株一组的不同组得到的3个值的平均。5个单拷贝事件中的4个(通过星号表示)给出了总的ECB2控制，确定为小于3.5cm平均蛀道长度。
表7：温室和大田试验中ECB功效
在所试验的所有场所中第二次自交(穗行育种)后在植物上没有观察到不同TR2’事件对农艺性状的不利之处。
c)抗Sesamia nonagrioides的功效
将含有TR2’-cry1Ab构建体的5株轮生中期玉米植株每株用2个卵块侵袭。14天后记下损伤并对幼虫的数目计数。对5株植株计算平均损伤级别(表示为平均每植株的植株高度和蛀道长度(cm))。结果在表8中给出。
表8
结果表明在受试的TR2’-cry1Ab植株中也有对地中海蛀茎夜蛾(Mediterranean stalk borer)的良好控制。
实施例4比较分析
对使用MPI启动子(Breitler等，2001描述为创伤诱导启动子)和如上所用相同的Cry1Ab编码序列的玉米植株进行表达分析以比较大田中基础(未诱导的)水平和创伤诱导。在该MPI启动子控制下表达杀昆虫Cry1Ab蛋白部分的玉米植株在温室试验中在叶中显示出占总可溶蛋白至少约0.04％的Cry1Ab蛋白基础平均表达水平。此外，在使用2个MPI-Cry1Ab事件的最初温室试验中，发现受伤时表达水平的某种变化，但是当测量从这些植物新鲜采集的植物材料中的浓度及体外孵育的脱离的叶部分中的浓度时(在这两种情况下，在引起创伤后21和42小时在不同样品中测量浓度)，在这些事件中没有观察到创伤诱导引起为基础(平均)水平至少5倍的Cry1Ab蛋白(平均)表达增加(机械损伤后)。因此，在使用MPI启动子的这些分析中没有或者仅仅有弱的Cry1Ab蛋白表达的诱导(与基础蛋白表达水平比较而言)。
而且，在比较分析中，还对使用TR2’启动子的本发明植株的大田性状与表达Cry1Ab蛋白部分的商业玉米植株进行了比较。在这些分析中，使用从事件MON810和Bt11(详细描述见有关这些批准的玉米事件的出版的USDA申请书)得到的玉米植株，这些植株使用35S启动子以得到高组成型表达水平，并且公知它们提供了高剂量的昆虫抗性。
在一个大田试验中，对于5个不同的Cry1Ab-TR2’玉米事件，用欧洲玉米螟人工侵袭导致的平均蛀道长度(以cm/茎表示，在劈开茎后测量，见Jansens等(1997)中的描述))分别为0、0、0.04、0和0.21cm，然而，对于MON810玉米，平均蛀道长度为0.3，对于Bt11玉米则为0.13(在未转化的对照玉米株系中，在相同试验中发现蛀道长度为12.2到39.92cm)。
所以，在玉米中对创伤诱导型TR2’启动子的比较分析表明玉米中处于TR2’启动子控制下的杀昆虫蛋白的表达提供了高水平昆虫抗性，其可以与具有组成型启动子的商业事件中得到的昆虫抗性相媲美。
在另一个大田试验中，对于5个不同的Cry1Ab-TR2’玉米事件，用西南玉米秆草螟人工侵袭造成的平均蛀道长度(以cm/茎表示，在劈开茎后测量，见在Jansens等(1997)中的描述))分别为0.53、0.68、0.3、0.64和0.6cm，然而，对于MON810玉米，平均蛀道长度为0.43，对于Bt11玉米则为0.15(在未转化的对照玉米株系中，在相同试验中发现蛀道长度为32到39.6cm，一些植株由于蛀道引起茎干破裂而不再直立)。
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gttttggttt tttcttgtgg ccgtctttgt ttatattgag atttttcaaa tcagtgcgca 120
agacgtgacg taagtatccg agtcagtttt tatttttcta ctaatttggt cgtttatttc 180
ggcgtgtagg acatggcaac cgggcctgaa tttcgcgggt attctgtttc tattccaact 240
ttttcttgat ccgcagccat taacgacttt tgaatagata cgctgacacg ccaagcctcg 300
ctagtcaaaa gtgtaccaaa caacgcttta cagcaagaac ggaatgcgcg tgacgctcgc 360
ggtgacgcca tttcgccttt tcagaaatgg ataaatagcc ttgcttccta ttatatcttc 420
ccaaattacc aatacattac actagcatct gaatttcata accaatctcg atacaccaaa 480
tcg 483
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cggcaggata tattcaattg taaatggctc catggcgatc gctctagagg atctgcgatc 60
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taacgtcatg cattacatgt taattattac atgcttaacg taattcaaca gaaattatat 240
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gcctccaggg acttcagcag gtgggtgtag agcgtggagc ccagtcccgt ccgctggtgg 600
cggggggaga cgtacacggt cgactcggcc gtccagtcgt aggcgttgcg tgccttccag 660
gggcccgcgt aggcgatgcc ggcgacctcg ccgtccacct cggcgacgag ccagggatag 720
cgctcccgca gacggacgag gtcgtccgtc cactcctgcg gttcctgcgg ctcggtacgg 780
aagttgaccg tgcttgtctc gatgtagtgg ttgacgatgg tgcagaccgc cggcatgtcc 840
gcctcggtgg cacggcggat gtcggccggg cgtcgttctg ggtccatggt tatagagaga 900
gagatagatt tatagagaga gactggtgat ttcagcgtgt cctctccaaa tgaaatgaac 960
ttccttatat agaggaaggg tcttgcgaag gatagtggga ttgtgcgtca tcccttacgt 1020
cagtggagat gtcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt ggttggaacg tcttcttttt 1080
ccacgatgct cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc actgtcggca gaggcatctt 1140
gaatgatagc ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta ggagccacct tccttttcta 1200
ctgtcctttc gatgaagtga cagatagctg ggcaatggaa tccgaggagg tttcccgaaa 1260
ttatcctttg ttgaaaagtc tcaatagccc tttggtcttc tgagactgta tctttgacat 1320
ttttggagta gaccagagtg tcgtgctcca ccatgttgac gaagattttc ttcttgtcat 1380
tgagtcgtaa aagactctgt atgaactgtt cgccagtctt cacggcgagt tctgttagat 1440
cctcgatttg aatcttagac tccatgcatg gccttagatt cagtaggaac taccttttta 1500
gagactccaa tctctattac ttgccttggt ttatgaagca agccttgaat cgtccatact 1560
ggaatagtac ttctgatctt gagaaatatg tctttctctg tgttcttgat gcaattagtc 1620
ctgaatcttt tgactgcatc tttaaccttc ttgggaaggt atttgatctc ctggagattg 1680
ttactcgggt agatcgtctt gatgagacct gctgcgtagg aacgcggccg ctgtacaggg 1740
cccgggcata tggcgcgcca tggttttggt ttcacgtgtg gaagatatga atttttttga 1800
gaaactagat aagattaatg aatatcggtg ttttggtttt ttcttgtggc cgtctttgtt 1860
tatattgaga tttttcaaat cagtgcgcaa gacgtgacgt aagtatccga gtcagttttt 1920
atttttctac taatttggtc gtttatttcg gcgtgtagga catggcaacc gggcctgaat 1980
ttcgcgggta ttctgtttct attccaactt tttcttgatc cgcagccatt aacgactttt 2040
gaatagatac gctgacacgc caagcctcgc tagtcaaaag tgtaccaaac aacgctttac 2100
agcaagaacg gaatgcgcgt gacgctcgcg gtgacgccat ttcgcctttt cagaaatgga 2160
taaatagcct tgcttcctat tatatcttcc caaattacca atacattaca ctagcatctg 2220
aatttcataa ccaatctcga tacaccaaat cgccaaaacc atggctgaca acaaccccaa 2280
catcaacgag tgcatcccct acaactgcct gagcaaccca gaggtggagg tgctgggtgg 2340
tgagaggatc gagaccggtt acacccccat cgacatcagc ctgagcctga cccagttcct 2400
gctgagcgag ttcgtgcctg gtgctggctt cgtgctggga ctagtggaca tcatctgggg 2460
catcttcggt cccagccagt gggatgcctt cctggtgcag atcgaacagt taattaacca 2520
aagaatagaa gaattcgcta ggaaccaagc catctctaga ctggagggcc tgagcaacct 2580
gtaccagatc tacgccgaga gcttccgcga gtgggaggct gaccccacca acccagccct 2640
gcgcgaggag atgcgcatcc agttcaacga catgaactct gccctgacca ccgccatccc 2700
actcttcgct gtccagaact accaggtccc tctcctgtct gtctatgtgc aagctgccaa 2760
cctccatctc agcgtccttc gcgacgtgag cgtctttggg cagaggtggg ggttcgacgc 2820
tgccaccatc aacagccgct acaacgacct gacgcgtctg atcggcaact acaccgacca 2880
cgcagtgaga tggtacaaca ctgggcttga gagggtctgg ggtcccgaca gccgcgactg 2940
gatcaggtac aaccagttca ggcgtgaact cactctcacc gtcttggata tcgtcagtct 3000
cttccccaac tacgacagca ggacctaccc tatccggact gtgagccagc tgacccgcga 3060
gatctacacc aaccccgtgc tggagaactt cgacggcagc ttcaggggct ctgcccaggg 3120
catcgagggc agcatccgca gcccccacct gatggacatc ctgaacagca tcaccatcta 3180
cactgacgcc cacaggggtg agtactactg gtctggccac cagatcatgg cttctcccgt 3240
gggcttcagc ggtcccgagt tcaccttccc cctgtacggc acaatgggca acgctgcccc 3300
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gtacaggagg cccttcaaca tcggcatcaa caaccagcag ctgagcgtgc tggatggcac 3420
cgagttcgcc tacggcacca gcagcaacct gcccagcgcc gtataccgca agagcggcac 3480
tgtggacagc ctggacgaga tcccacccca gaacaacaac gtgcccccta ggcaggggtt 3540
ctctcatcgc ctctcacacg tgagcatgtt ccgcagcggc ttcagcaaca gcagcgtgag 3600
catcatcagg gctcccatgt tcagctggat ccaccgcagc gctgagttca acaacatcat 3660
tccaagtagc cagatcactc agatcccact caccaagagc accaacctgg gctccgggac 3720
tagcgttgtc aagggaccag ggttcactgg aggcgacatc ctgaggagga ccagcccagg 3780
ccagatcagc accttaaggg tgaacatcac cgctcccctc agccaacgct acagggtcag 3840
gatcaggtac gcttccacca ccaacctgca gttccacacc agcatcgacg gcaggcccat 3900
caaccagggc aacttcagcg ccaccatgag cagcggcagc aacctgcaga gcggaagctt 3960
ccgcactgtg ggcttcacta ccccattcaa cttctccaac ggcagcagcg tgttcaccct 4020
gtctgcccac gtgttcaaca gcggcaacga ggtgtacatc gacaggatcg agtttgtccc 4080
agctgaggtg accttcgaag ctgagtacga ctgaggctag ctagagtcct gctttaatga 4140
gatatgcgag acgcctatga tcgcatgata tttgctttca attctgttgt gcacgttgta 4200
aaaaacctga gcatgtgtag ctcagatcct taccgccggt ttcggttcat tctaatgaat 4260
atatcacccg ttactatcgt atttttatga ataatattct ccgttcaatt tactgattgt 4320
accctactac ttatatgtac aatattaaaa tgaaaacaat atattgtgct gaataggttt 4380
atagcgacat ctatgataga gcgccacaat aacaaacaat tgcctgcagg tcgacggccg 4440
agtactggca ggatatatac cgttgtaatt tgtcgcgtgt gaataagtcg ctgtgtatgt 4500
ttgtttgatt gtttctgttg gagtgcagcc catttcaccg gacaagtcgg ctagattgat 4560
ttagccctga tgaactgccg aggggaagcc atcttgagcg cggaatggga atggatttcg 4620
ttgtacaacg agacgacaga acacccacgg gaccgagctt cgaatctggc aattccggtt 4680
cgcttgctgt ccataaaacc gcccagtcta gctatcgcca tgtaagccca ctgcaagcta 4740
cctgctttct ctttgcgctt gcgttttccg gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg 4800
taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc 4860
aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata 4920
ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta 4980
catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc 5040
ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg 5100
ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac 5160
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taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt 5280
atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct 5340
cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg 5400
ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata 5460
accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca 5520
gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc 5580
tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat 5640
agttaagcca gtatacactc cgctatcgct acgtgactgg gtcatggctg cgccccgaca 5700
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acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa 5820
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gtccgcgccc tggtagattg cctggccgta ggccagccat ttttgagcgg ccagcggccg 5940
cgataggccg acgcgaagcg gcggggcgta gggagcgcag cgaccgaagg gtaggcgctt 6000
tttgcagctc ttcggctgtg cgctggccag acagttatgc acaggccagg cgggttttaa 6060
gagttttaat aagttttaaa gagttttagg cggaaaaatc gccttttttc tcttttatat 6120
cagtcactta catgtgtgac cggttcccaa tgtacggctt tgggttccca atgtacgggt 6180
tccggttccc aatgtacggc tttgggttcc caatgtacgt gctatccaca ggaaagagac 6240
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cctgccccgc ctcctccttc aaatcgtact ccggcaggtc atttgacccg atcagcttgc 6420
gcacggtgaa acagaacttc ttgaactctc cggcgctgcc actgcgttcg tagatcgtct 6480
tgaacaacca tctggcttct gccttgcctg cggcgcggcg tgccaggcgg tagagaaaac 6540
ggccgatgcc gggatcgatc aaaaagtaat cggggtgaac cgtcagcacg tccgggttct 6600
tgccttctgt gatctcgcgg tacatccaat cagctagctc gatctcgatg tactccggcc 6660
gcccggtttc gctctttacg atcttgtagc ggctaatcaa ggcttcaccc tcggataccg 6720
tcaccaggcg gccgttcttg gccttcttcg tacgctgcat ggcaacgtgc gtggtgttta 6780
accgaatgca ggtttctacc aggtcgtctt tctgctttcc gccatcggct cgccggcaga 6840
acttgagtac gtccgcaacg tgtggacgga acacgcggcc gggcttgtct cccttccctt 6900
cccggtatcg gttcatggat tcggttagat gggaaaccgc catcagtacc aggtcgtaat 6960
cccacacact ggccatgccg gccggccctg cggaaacctc tacgtgcccg tctggaagct 7020
cgtagcggat cacctcgcca gctcgtcggt cacgcttcga cagacggaaa acggccacgt 7080
ccatgatgct gcgactatcg cgggtgccca cgtcatagag catcggaacg aaaaaatctg 7140
gttgctcgtc gcccttgggc ggcttcctaa tcgacggcgc accggctgcc ggcggttgcc 7200
gggattcttt gcggattcga tcagcggccg cttgccacga ttcaccgggg cgtgcttctg 7260
cctcgatgcg ttgccgctgg gcggcctgcg cggccttcaa cttctccacc aggtcatcac 7320
ccagcgccgc gccgatttgt accgggccgg atggtttgcg accgtcacgc cgattcctcg 7380
ggcttggggg ttccagtgcc attgcagggc cggcagacaa cccagccgct tacgcctggc 7440
caaccgcccg ttcctccaca catggggcat tccacggcgt cggtgcctgg ttgttcttga 7500
ttttccatgc cgcctccttt agccgctaaa attcatctac tcatttattc atttgctcat 7560
ttactctggt agctgcgcga tgtattcaga tagcagctcg gtaatggtct tgccttggcg 7620
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catggctggc gtgtctgcca ggctggccaa cgttgcagcc ttgctgctgc gtgcgctcgg 7740
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atgagttttg atttaatttc agcggccagc gcctggacct cgcgggcagc gtcgccctcg 7860
ggttctgatt caagaacggt tgtgccggcg gcggcagtgc ctgggtagct cacgcgctgc 7920
gtgatacggg actcaagaat gggcagctcg tacccggcca gcgcctcggc aacctcaccg 7980
ccgatgcgcg tgcctttgat cgcccgcgac acgacaaagg ccgcttgtag ccttccatcc 8040
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cgaacacgta cccggccgcg atcatctccg cctcgatctc ttcggtaatg aaaaacggtt 8700
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gtcaagcatc ctggccagct ccgggcggtc gcgcctggtg ccggtgatct tctcggaaaa 9300
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ggtgctgacg cgggcatagc ccagcaggcc agcggcggcg ctcttgttca tggcgtaatg 9420
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ttgtaggtgg accagttggt gattttgaac ttttgctttg ccacggaacg gtctgcgttg 9960
tcgggaagat gcgtgatctg atccttcaac tcagcaaaag ttcgatttat tcaacaaagc 10020
cacgttgtgt ctcaaaatct ctgatgttac attgcacaag ataaaaatat atcatcatga 10080
acaataaaac tgtctgctta cataaacagt aatacaaggg gtgttatgag ccatattcaa 10140
cgggaaacgt cttgctcgag gccgcgatta aattccaaca tggatgctga tttatatggg 10200
tataaatggg ctcgcgataa tgtcgggcaa tcaggtgcga caatctatcg attgtatggg 10260
aagcccgatg cgccagagtt gtttctgaaa catggcaaag gtagcgttgc caatgatgtt 10320
acagatgaga tggtcagact aaactggctg acggaattta tgcctcttcc gaccatcaag 10380
cattttatcc gtactcctga tgatgcatgg ttactcacca ctgcgatccc cgggaaaaca 10440
gcattccagg tattagaaga atatcctgat tcaggtgaaa atattgttga tgcgctggca 10500
gtgttcctgc gccggttgca ttcgattcct gtttgtaatt gtccttttaa cagccgcgta 10560
tttcgtctcg ctcaggcgca atcacgaatg aataacggtt tggttgatgc gagtgatttt 10620
gatgacgagc gtaatggctg gcctgttgaa caagtctgga aagaaatgca taaacttttg 10680
ccattctcac cggattcagt cgtcactcat ggtgatttct cacttgataa ccttattttt 10740
gacgagggga aattaatagg ttgtattgat gttggacgag tcggaatcgc agaccgatac 10800
caggatcttg ccatcctatg gaactgcctc ggtgagtttt ctccttcatt acagaaacgg 10860
ctttttcaaa aatatggtat tgataatcct gatatgaata aattgcagtt tcatttgatg 10920
ctcgatgagt ttttctaatc agaattggtt aattggttgt aacactggca gagcattacg 10980
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ccaactggtc cacctacaac aaagctctca tcaaccgtgg ctccctcact ttctggctgg 11160
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atacagaagc tgggcgaaca aacgatgctc gccttccaga aaaccgagga tgcgaaccac 11340
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atggcttgtt atgactgttt ttttggggta cagtctatgc ctcgggcatc caagcagcaa 11760
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gtacatttgt acggctccgc agtggatggc ggcctgaagc cacacagtga tattgatttg 12000
ctggttacgg tgaccgtaag gcttgatgaa acaacgcggc gagctttgat caacgacctt 12060
ttggaaactt cggcttcccc tggagagagc gagattctcc gcgctgtaga agtcaccatt 12120
gttgtgcacg acgacatcat tccgtggcgt tatccagcta agcgcgaact gcaatttgga 12180
gaatggcagc gcaatgacat tcttgcaggt atcttcgagc cagccacgat cgacattgat 12240
ctggctatct tgctgacaaa agcaagagaa catagcgttg ccttggtagg tccagcggcg 12300
gaggaactct ttgatccggt tcctgaacag gatctatttg aggcgctaaa tgaaacctta 12360
acgctatgga actcgccgcc cgactgggct ggcgatgagc gaaatgtagt gcttacgttg 12420
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tgggcaatgg agcgcctgcc ggcccagtat cagcccgtca tacttgaagc tagacaggct 12540
tatcttggac aagaagaaga tcgcttggcc tcgcgcgcag atcagttgga agaatttgtc 12600
cactacgtga aaggcgagat caccaaggta gtcggcaaat aatgtctaac aattcgttca 12660
agccgacgcc gcttcgcggc gcggcttaac tcaagcgtta gatgcactaa gcacataatt 12720
gctcacagcc aaactatcag gtcaagtctg cttttattat ttttaagcgt gcataataag 12780
ccctacacaa attgggagat atatcatgaa aggctggctt tttcttgtta tcgcaatagt 12840
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cttggtcgtt ccggtaccgt gaacgtcggc tcgattgtac ctgcgttcaa atactttgcg 12960
atcgtgttgc gcgcctgccc ggtgcgtcgg ctgatctcac ggatcgactg cttctctcgc 13020
aacgccatcc gacggatgat gtttaaaagt cccatgtgga tcactccgtt gccccgtcgc 13080
tcaccgtgtt ggggggaagg tgcacatggc tcagttctca atggaaatta tctgcctaac 13140
cggctcagtt ctgcgtagaa accaacatgc aagctccacc gggtgcaaag cggcagcgg 13199
<210>3
<211>1854
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码修饰的cry1Ab蛋白的序列
<400>3
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gaggtggagg tgctgggtgg tgagaggatc gagaccggtt acacccccat cgacatcagc 120
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atcgaacagt taattaacca aagaatagaa gaattcgcta ggaaccaagc catctctaga 300
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cagaggtggg ggttcgacgc tgccaccatc aacagccgct acaacgacct gacgcgtctg 600
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gtataccgca agagcggcac tgtggacagc ctggacgaga tcccacccca gaacaacaac 1260
gtgcccccta ggcaggggtt ctctcatcgc ctctcacacg tgagcatgtt ccgcagcggc 1320
ttcagcaaca gcagcgtgag catcatcagg gctcccatgt tcagctggat ccaccgcagc 1380
gctgagttca acaacatcat tccaagtagc cagatcactc agatcccact caccaagagc 1440
accaacctgg gctccgggac tagcgttgtc aagggaccag ggttcactgg aggcgacatc 1500
ctgaggagga ccagcccagg ccagatcagc accttaaggg tgaacatcac cgctcccctc 1560
agccaacgct acagggtcag gatcaggtac gcttccacca ccaacctgca gttccacacc 1620
agcatcgacg gcaggcccat caaccagggc aacttcagcg ccaccatgag cagcggcagc 1680
aacctgcaga gcggaagctt ccgcactgtg ggcttcacta ccccattcaa cttctccaac 1740
ggcagcagcg tgttcaccct gtctgcccac gtgttcaaca gcggcaacga ggtgtacatc 1800
gacaggatcg agtttgtccc agctgaggtg accttcgaag ctgagtacga ctga 1854
机译： 用于在植物中表达基因的嵌合调控区，用于在植物质粒中诱导基因表达以表达怪异过程基因的基因盒带表达以及在植物过程中用于基因异常诱导性表达的基因诱导表达的过程在植物质粒和奇怪的植物转基因中
机译： 分离的核酸，表达盒，表达载体，细胞，转基因植物，后代和植物种子，以及从脂肪酸合成或脂类代谢产生具有增加水平的基因产物的植物的方法，具有增加水平的植物亚麻酸（gla）的诱导，以在缺乏或缺少gla的植物中诱导至少一种γ-亚麻酸（gla）或十八碳烯酸（ota）的产生，从而减少用于合成脂肪酸的基因的产生或植物中的脂质代谢或脂质代谢，以及共抑制植物中脂肪酸或脂质代谢的天然基因的合成
机译： DNA分子的化学诱导型启动子遗传序列和包含该构建序列的多聚体，包含遗传构建的GeneticA植物，启动子/诱导子和该植物的表达系统的组合，其中包括该序列，一种转基因植物当基因与植物中的序列和表达过程结合时，诱导基因表达的序列的使用
