人B淋巴细胞刺激因子单克隆抗体的重链和轻链可变区基因及其应用

摘要

本发明涉及人B淋巴细胞刺激因子单克隆抗体的重链和轻链可变区基因，由所述基因编码的多肽，含有所述基因的载体及所述的基因和多肽在制备BLyS相关的自身免疫性疾病的临床检测试剂中的应用，以及其制备方法。所述的重链可变区基因全长为342bp，其核苷酸序列如1所示，其编码的氨基酸序列如3所示；所述的轻链可变区基因全长为321bp，其核苷酸序列如2所示，其编码的氨基酸序列如4所示。利用基因工程表达产生的蛋白质保留了与抗体结合的能力，且scFv分子小，容易通过基因工程技术的改造，与一些其他效应分子结合，为构建生物导弹打下基础；还大大降低成本了，利于工业化生产。

说明书

技术领域

本发明涉及人B淋巴细胞刺激因子单克隆抗体的重链和轻链可变区基因，由所述基因编码的多肽，含有所述基因的载体及所述的基因和多肽在制备BLyS相关的自身免疫性疾病的临床检测试剂中的应用，以及其制备方法。具体地，本发明的重链和轻链可变区基因来自BALB/C小鼠杂交瘤细胞ABL-1。

背景技术

人B淋巴细胞刺激因子(hBLyS)是Moore PA等人(Science.1999 Jul9；285(5425)：260-3)1999年新发现的一种与人体免疫调控密切相关的细胞因子，属肿瘤坏死因子(TNF)超家族，为II型跨膜蛋白，主要在人体外周血单核细胞、脾脏、淋巴结、骨髓等组织中表达，并能在某些金属蛋白酶的作用下以胞外可溶性部分(hsBLyS)游离于外周血中发挥作用。hsBLyS是一种淋巴细胞的共刺激因子，对活化的B细胞有强烈的促进增殖和分化的刺激作用：对正常的B细胞，在用PMA和Anti-IgM预活化后，hsBLyS能诱导其大量增殖并分泌各型免疫球蛋白，其中大部分为IgM和IgA。在体内，hBLyS对囊外B细胞的活化及抗原特异性IgM的分泌；免疫球蛋白的同型转换；脾脏生发中心(GC)的形成有重要作用；同时hBLyS对CD4⁺和CD8⁺亚型T细胞也有间接活化作用。hBLyS作为B淋巴细胞发育的正调节因子，在体内具有促进B淋巴细胞的分化，存活的作用，而过多的hBLyS可导致B淋巴细胞的过度活化而引起自身免疫性疾病，证据如下：(1)hBLyS转基因小鼠由于过度表达hBLyS，导致了自身耐受的破坏，血清和组织中出现多种自身抗体，同时伴有系统性红斑狼疮样症状。(2)狼疮样模型小鼠(NZB×NZWF1和MRL-lpr/lpr)中，血清hBLyS滴度明显升高，而且hBLyS的水平与疾病的进展呈平行的关系。(3)在多种自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎和系统性硬化症及重症肌无力等)患者血清中均可检测到hBLyS滴度明显升高。2003年BLyS(M.Petri et al.，abstract 1712，ACR 2003meeting)被作为临床上诊断系统性红斑狼疮的一种Biomarker。所以BLyS抗体的研制对于BLyS相关的自身免疫性疾病的诊断和治疗意义重大。

单克隆抗体由两条相同的重链和轻链组成。每一条重链(VH)和轻链(VL)都分为恒定区和可变区两大部分。其中，VH和VL共同组成抗原结合部位。抗体的特异性正是由这一部位决定的。VH和VL长约110氨基酸，分别占轻重链的1/2和1/4。在抗原结合部位中真正与抗原决定簇空间构象互补的是3个氨基酸变化较大的区域(CDR)。与可变区相对的是骨架区，其氨基酸序列相对保守。scFv是由VH和VL与一柔性氨基酸短肽拼接而成。

国外有报道从噬菌体展示文库筛选到BLyS的抗体(Baker KP等ArthritisRheum.2003 Nov；48(11)：3253-65.)，但由于这种抗体是没有经过免疫过的，一般亲和力较抵，不适合作为临床检测试剂。国内有BLyS抗体杂交瘤细胞株建立的报道(张志方等，中山医科大学学报，2002年03期)，但迄今为止还没有相关基因序列的报道。

发明内容

为了寻找针对用于BLyS相关的自身免疫性疾病的临床检测试剂，针对抗体杂交瘤细胞株应用于大规模生产上容易突变，细胞株不稳定，容易丢失，代价昂贵等诸多缺点，本发明应用基因工程手段，提供了一种人B淋巴细胞刺激因子单克隆抗体轻链可变区基因和重链可变区基因及其表达产物，并组装了scFv型的基因工程抗体片段，使得大规模廉价生产抗体成为可能。

本发明的另一个目的在于人B淋巴细胞刺激因子单克隆抗体及其scFv抗体片段在制备用于BLyS相关的自身免疫性疾病的检测试剂中的应用。

根据本发明的一个方面，本发明涉及一种人B淋巴细胞刺激因子单克隆抗体轻链可变区基因和重链可变区基因，其中，所述的重链可变区基因全长为342bp，其核苷酸序列如<400>1所示，其编码的氨基酸序列如<400>3所示；所述的轻链可变区基因全长为321bp，其核苷酸序列如<400>2所示，其编码的氨基酸序列如<400>4所示。

一种表达载体，其含有所述重链可变区基因及轻链可变区基因。具体可以是如图2所示的pET28a-scFv。

涉及上述表达载体所表达的多肽，能够与BLyS作用，可以用于制备BLyS相关的自身免疫性疾病的检测试剂。

和基因工程生产所述scFv蛋白的方法是：从BLyS单克隆细胞株分离出抗体的轻重链可变区基因，并组装scFv，用组装的scFv构建原核表达载体，转化大肠杆菌，构建基因工程菌，并诱导表达，对表达产物进行分离、纯化和复性。

作为优选的方案，具体操作是：

1)从BLyS单克隆细胞株ABL-1分离抗体的可变区基因：

收集生长良好，能分泌BLyS单克隆抗体的杂交瘤细胞株ABL-1，用TRIZOL试剂提取总RNA，

设计兼并引物，VH采用引物VH Back(5’-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3’)和引物VH For(5’-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3’)，

VL基因采用引物VL back(5’-GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA-3’)和引物VLFor(5’-GTTAGATCTCGAGCTTGGTCCC-3’)按照Promega公司一步法RT-PCR试剂盒分别扩增VH和VL，分别采用RT-PCR方法，钓取抗体可变区VH和VL基因，分别克隆进入载体pMD18-T；

2)VH，VL基因扩增产物的克隆：

引物设计如下：

VH P₁(5’-ACCATGGAATTCCTGCAGGAGTCTGGTGGCTTG-3’)，含有EcoRI酶切位点，

VH P₂(5’-AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACGGTG-3’)，

VL P₁(5’-CAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTAGTGACATTGAGCTCAC-3’)，

VL P₂(5’-GTGGTGAAGCTTTCACTCGAGCTTGGTACCACCTC-3’)，含有HindIII酶切位点，

采用Over-lap PCR，在VH和VL之间设计一段柔性linker(G₄S)₃，VH-linker-VL，克隆于高效原核表达载体pET28a；

3)高效表达，纯化，复性scFv：

pET28a-scFv转化进入BL21(DE3)，IPTG诱导表达，收集包含体沉淀，尿素溶解，Ni²⁺-IDA His-bind亲和层析纯化蛋白，稀释法和透析法对目的蛋白复性，纯化的蛋白稀释到复性缓冲液I：50mM Tris-HCl、0.15mM NaCl、2M urea、0.5Mm还原型谷胱甘肽、0.1mM氧化型谷胱甘肽、pH8.0，终浓度为100μg/ml，复性24h，然后将蛋白装入复性缓冲液II：50mmol/L Tris-HCl、0.15mol/LNaCl、pH8.0，透析复性12h，超滤管Centricon 30浓缩蛋白，13％SDS-PAGE检测，蛋白-20℃保存。

我们利用基因工程手段首先从分泌BLyS的单克隆抗体的杂交瘤细胞株中获得了单克隆抗体的轻重链可变区基因，并组装了scFv小分子抗体，克隆到pET28a表达载体中，并能在大肠杆菌中进行高效表达，其产生的蛋白质保留了与抗体结合的能力，能够与BLyS作用，而且与传统意义上杂交瘤抗体比较具有以下优势：scFv分子小，容易通过基因工程技术的改造，与一些其他效应分子结合，为构建生物导弹打下基础；杂交瘤细胞株不容易保存，规模化生产成本高，而基因工程抗体可以采用原核表达系统，可以很方便的生产抗体，成本大大降低，利于工业化生产。因此基因工程抗体的生产较杂交瘤细胞株产生抗体优势明显，从而可以代替传统杂交瘤细胞株生产抗体。此外，BLyS的基因工程抗体可以用来制作BLyS的亲和层析介质用于BLyS的纯化。

附图说明

图1是ABL-1抗体可变区VH和VL的RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析结果，其中泳道1为标准蛋白；泳道2为VH基因，分子量大约在340bp；泳道3为VL基因，分子量大约在330bp；泳道4为VH-linker-VL基因，大小在750bp左右。

图2是ABL-1 scFv基因的组装以及表达载体构建的示意图。

图3是ABL-1 scFv的诱导表达，纯化和鉴定的分析结果，其中(A1)：标准蛋白；(A2)：未诱导全菌蛋白；(A3)：诱导后全菌蛋白；(A4)：超声上清；(A5)：超声沉淀；(A6)：纯化产物；(B1)：Western blotting检测蛋白的表达。

图4是非竞争性ELISA测定ABL-1 scFv与hsBLyS的结合示意图。

图5是竞争性ELISA测定ABL-1 scFv抑制ABL-1单克隆抗体与hsBLyS的结合示意图。

图6是Western blotting检测ABL-1 scFv与hsBLyS的结合，其中(A1)：标准蛋白；(A2)：纯化hsBLyS蛋白；(B)：ABL-1mAb与hsBLyS的结合(C)：ABL-1scFv与hsBLyS的结合；(D)：无关IgG与hsBLyS的结合(作为阴性对照)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

实施例1：从BLyS单克隆细胞株ABL-1分离抗体的可变区基因收集生长良好，能分泌BLyS单克隆抗体的杂交瘤细胞株ABL-110⁷个(本研究室构建，按照“Current protocol in immunology”Production of MonoclonalAntibodies)，用TRIZOL试剂提取总RNA。

RT-PCR钓取VH基因：

参照Promega公司的(Access RT-PCR System and Access RT-PCRIntroductory System)提供的方法：一步法RT-PCR试剂盒分别扩增VH基因：

VH基因采用引物VH Back(5’-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3’)和引物VH For(5’-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3’)，

RT-PCR反应总共为50μl体系：1μg的总RNA，10μl的5×AMV/Tf1反应缓冲液，浓度为10pmol的引物VH Back和VH For各5μl，浓度为500uM的dNTP1μl，3mM的MgSO₄2μl；5u AMV逆转录酶1μl和5u Tf1 DNA聚合酶1μ。反应步骤：48℃逆转录反应45分钟；94℃变性30秒；55℃退火1分钟；68℃延伸1分钟，共35个循环。

RT-PCR钓取VL基因：

VL基因采用引物VL back(5’-GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA-3’)和VL For(5’-GTTAGATCTCGAGCTTGGTCCC-3’)。按照Promega公司一步法RT-PCR试剂盒扩增VL。50μl反应体系如下：1μg的总RNA，10μl的5×AMV/Tf1反应缓冲液，浓度为10pmol的引物VL back和VL For各5μl，浓度为500uM的dNTP1μl，3mM的MgSO₄2μl；5u AMV逆转录酶1μl和5u Tf1 DNA聚合酶1μ。反应步骤：48℃逆转录反应45分钟；94℃变性30秒；60℃退火1分钟；68℃延伸1分钟，共35个循环。反应结束后，1％琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图1。

VH和VL基因扩增产物的克隆：

引物设计如下：

VH P₁(5’-ACCATGGAATTCCTGCAGGAGTCTGGTGGCTTG-3’)，含有EcoRI酶切位点，

VH P₂(5’-AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACGGTG-3’)，

VL P₁(5’-CAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTAGTGACATTGAGCTCAC-3’)，

VL P₂(5’-GTGGTGAAGCTTTCACTCGAGCTTGGTACCACCTC-3’)，含有HindII酶切位点，

PCR产物使用胶回收试剂盒纯化。取载体pMD18-T 1μl，PCR产物4μl，T4连接酶1μl，5μlT4连接酶缓冲液(2倍)，16度连接18小时。连接产物10μl转化感受态大肠杆菌DH5α。铺板，第二天挑取单克隆，采用菌落PCR鉴定，并送交上海博亚公司测序。测序结果如序列表<400>1和<400>2所示。

实施例2：scFv基因的组装

为获得scFv，在VH和VL之间添加一柔性linker(G₄S)₃，为防止在扩增过程中引人突变，我们采用高保真酶Pyrobest(大连宝生物).整个组装示意图为图2，结果如图1。

第一轮PCR反应扩增VH：

50μl PCR反应体系如下：5μl的10×反应缓冲液；浓度为10μM的引物VH P₁和VH P₂ 2.5μl：4μl的dNTP；35μl H₂O；高保真Pyrobest酶0.5μl。95℃变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共26个循环；72℃，延伸5min。

第二轮PCR反应扩增VL：

50μl PCR反应体系如下：5μl的10×反应缓冲液；浓度为10μM的引物VL P₁和VL P₂ 2.5μl：4μl的dNTP；35μl H₂O；高保真Pyrobest酶0.5μl。95℃变性5min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共26个循环；72℃，延伸5min。

割胶回收PCR产物。

第三轮PCR反应扩增VH-linker-VL：

50μl PCR反应体系如下：5μl的10×反应缓冲液；浓度为10μM的引物VH P₁和VL P₂ 2.5μl：4μl的dNTP；35μl H₂O；高保真Pyrobest酶0.5μl，上两轮PCR产物各1μl做为模板。95℃变性5min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共26个循环；72℃，延伸5min。反应。1％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收产物。

实施例3：scFv基因的酶切消化和连接

双酶切pET28a：

EcoRI和HindIII为Takara产品。2μl的10×M反应缓冲液；10μl的载体pET28a；EcoRI和HindIII各1μl；7μl H₂O。37℃反应6小时。：

双酶切实施例2中的第三轮扩增产物：

2μl的10×M反应缓冲液；10μl的第三轮PCR产物；EcoRI和HindIII各1μl；7μl H₂O。37℃反应6小时。

1％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收产物。

连接反应：

T4连接酶为Takara产品。2μl的连接反应缓冲液H₂O；上轮酶切产物各1μl；16μl H₂O。16℃反应12小时。

取10μl产物转化转化感受态DH5α。铺板，第二天挑取单克隆，采用菌落PCR鉴定，并送交上海博亚公司测序。

实施例4：scFv单链抗体在大肠杆菌中的诱导表达。

挑取测序正确的克隆转化感受态BL21(DE3)。挑取单个菌落接种到3ml LB培养液(含50μg/ml卡那霉素)中，37℃培养10小时，收集细菌，按1∶100接种到50ml含相同浓度抗生素LB中，37℃培养至OD600＝0.6时，加IPTG(1mmol/L)诱导，37℃培养5小时，13％SDS-PAGE检测表达情况。结果如图3，清楚表明表达的蛋白分子量在27Kd左右。主要存在于包含体内。

实施例5：表达产物的分离纯化和复性

4℃ 5000g/min离心10min收集菌体，以5ml 50mmol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl重悬沉淀，然后冰上超声(超声5s，间隙5s，反复160次)，至细胞悬液不再粘稠。室温12000g/min离心10min，分别收集上清和沉淀。沉淀加入2.5ml Binding缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl，8M urea，5mM咪唑，pH8.0)，室温溶解2小时。室温12000g/min离心10min，收集上清。取Ni²⁺-IDA His-bind resin 1ml装柱，按照Novagen公司提供的操作手册纯化蛋白。

收集Elution缓冲液洗脱的蛋白，测定蛋白浓度，用复性缓冲液I(50mmol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl，2M urea，0.5mmol/L还原型谷胱甘肽，0.1mmol/L氧化型谷胱甘肽pH8.0)稀释蛋白至终浓度为100μg/M1。复性24h，接着将蛋白装人透析袋，用复性缓冲液II(50mmol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl，pH8.0)透析复性12h。超滤管Centricon 30(Millipore，USA)浓缩蛋白。13％SDS-PAGE检测。蛋白-20℃保存。

实施例6：scFv单链抗体与hsBLyS结合活性测定

1)非竞争ELISA法测定：

10μg/ml hsBLyS(NaHCO₃，pH9.6)4℃包板过夜。第二天用1％脱脂牛奶封闭(37℃，2h)。系列稀释的scFv分别与hsBLyS孵育(37℃，2h)。以抗His单克隆抗体(Novagen，USA)为一抗，HRP偶联的羊抗小鼠IgG为二抗，常规ELISA检测(参照Current protocol in immunology unit2.1-2.3)。结果如图4

2)竞争ELISA法测定：

10μg/ml hsBLyS(NaHCO₃，pH9.6)4℃包板过夜。系列稀释的scFv分别与ABL-1 mAb混合，与hsBLyS孵育(37℃，2h)。用HRP偶联的羊抗小鼠IgG检测scFv抑制ABL-1 mAb与hsBLyS的结合。结果如图5，结果证实ABL-1 scFv与ABL-1单克隆抗体是同一表位结合hsBLyS。

3)Western blotting测定：

取hsBLyS 20μl，13％SDS-PAGE电泳，转移至硝酸纤维素薄膜，1％BSA封闭后，加scFv 37℃孵育2h，抗His单克隆抗体(Novagen，USA)为一抗，HRP偶联的羊抗小鼠IgG为二抗，TMB显色。(具体参照Current protocol in immunology unit8.10)。结果如图6，结果表明ABL-1 scFv与ABL-1单克隆抗体识别hsBLyS的线性表位。

                          序列表

<110>南京师范大学

<120>人B淋巴细胞刺激因子单克隆抗体的重链和轻链可变区基因及其应用

<160>4

<210>1

<211>342

<212>DNA

<213>小鼠(Mus)

<400>1

gtgcaactgc aggagtcagg aggaggcttg gtacagcctg ggggttctct gagactctcc 60

tgtgcaactt ctgggttcac cttcactgat tactacatga gctgggtccg ccagcctcca 120

ggaaaggcac ttgagtggtt gggttttatt agaaacaaag ctaatggtta cacaacagag 180

tacagtgcat ctgtgaaggg tcggttcacc atctccagag ataattccca aagcatcctc 240

tatcttcaaa tgaacaccct gagagctgag gacagtgcca cttattactg tgcaagagat 300

atcacccttc tgggccaagg gaccacggtc accgtctcct ca 342

<210>2

<211>321

<212>DNA

<213>小鼠(Mus)

<400>2

gacattgagc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga acgggtcacc 60

atgacctgca ctgccagctc aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120

ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccca 180

gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 240

gctgaagatg ctgccactta ttactgccac cagtatcatc gttccccgta cacgttcgga 300

ggggggacca agctcgag 318

<210>3

<211>114

<212>PRT

<213>小鼠(Mus)

<400>3

Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

 1                5                  10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp

                 20                  25                  30

Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

                 35                  40                  45

Trp Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu

                 50                  55                  60

Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

                 65                  70                  75

Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu

                 80                  85                  90

Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ile Thr Leu Leu Gly

                 95                 100                 105

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

                110             114

<210>4

<211>106

<212>PRT

<213>小鼠(Mus)

<400>4

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu

 1               5                   10                  15

Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser

                 20                  25                  30

Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro

                 35                  40                  45

Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

                 50                  55                  60

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr

                 65                  70                  75

Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His

                 80                  85                  90

Gln Tyr His Arg Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu

                 95                 100                 105