使用细胞脱唾液酸决定簇和糖缀合物将细胞靶向组织和器官的方法和组合物

摘要

本发明针对的是将细胞投递至哺乳动物体内靶组织的方法，其中使用糖缀合物将细胞运输至哺乳动物体内的期望器官。依照本发明的方法尤其可应用于施用淋巴样细胞，诸如经白介素－2(IL－2)激活的天然杀伤(NK)细胞、经淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞和/或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和/或细胞毒性淋巴细胞(CTL)，或干细胞，诸如由骨髓或脐带组织衍生的那些干细胞。该方法还可用于将目的基因靶向哺乳动物体内组织，其中包括向哺乳动物体内导入包含目的基因的细胞并施用糖缀合物。

说明书

本申请要求2002年3月15日提交的美国临时申请号60/364,498的受益，本文出于所有目的将其完整收录作为参考。

发明领域

本发明属于临床医学和疗法的领域。本发明涉及使用细胞表面和/或游离糖缀合物上的唾液酸或脱唾液酸决定簇，特别是新近脱唾液酸决定簇(neoasialodeterminant)，将细胞靶向目的器官的方法和组合物。

发明背景

Morell等人确定了当血浆铜蓝蛋白的唾液酸基团被神经氨酸酶切除后，这种血浆蛋白质将由血清中迅速消失。他们揭示了这种现象归结于肝细胞中存在的脱唾液酸糖蛋白(ASGP)受体的摄取(J.Biol.Chem.，243：155，1968)。其后，有报道说ASGP受体只存在于肝细胞中(Adv.Enzymol.，41：99，1974)。根据在将脱唾液酸血浆铜蓝蛋白或脱唾液酸血清类粘蛋白(用氚实验性标记)注射到活体中后只在肝细胞中选择性检测到该同位素的事实鉴定了肝细胞的这种特异摄取。Scheinberg，I.H.等人，“Hepatic removal of circulating proteins”即“循环中蛋白质的肝清除”，在Davidson，C.S.编的《Problems in LiverDiserses》即《肝病中的问题》中，第279-285页，纽约，Stratton公司，1979。另外，还披露了这种受体特异识别并吸收具有D-半乳糖或N-乙酰半乳糖胺作为末端糖基的糖蛋白(Ann.Rev.Biochem.，51：531，1982)。

肝细胞的细胞膜包含与以半乳糖结尾的脱唾液酸糖蛋白联合的细胞结构。这种细胞结构最初命名为肝结合蛋白(HBP)，但是现在称为脱唾液酸糖蛋白(asialoglycoprotein，ASGP)受体。此外，观察到在多种脱唾液酸糖蛋白中，脱唾液酸α(1)-酸糖蛋白即脱唾液酸血清类粘蛋白在注射后由血清消失的速度最快。因此，说明了肝细胞对脱唾液酸-α(1)-酸糖蛋白的摄取既特异又高效(J.Biol.Chem.，245：4397，1970)。ASGP受体是由分子量大约40,00的单一多肽构成的，能够识别在糖链非还原性末端位置具有半乳糖残基的糖蛋白(即脱唾液酸糖蛋白)。

尽管ASGP受体的生理学功能仍不确定，然而认为ASGP受体参与糖蛋白的代谢。事实上，在肝病诸如慢性肝炎、肝硬化和肝癌的况中观察到ASGP血液水平的升高。此外，在通过施用化学药品诱发肝病的实验模型中观察到ASGP受体数量的减少。

考虑到这些现象，有可能通过评估ASGP的数量和质量来诊断肝病，其中使用ASGP样物质即ASGP受体导向化合物来进行测定。事实上，出于治疗和诊断目的，已经将脱唾液酸糖缀合物共价连接了其它试剂作为使将由肝摄取的化学药品(免疫遏制药物)和生物学试剂(抗体)具有靶向的手段(参阅如美国专利号5,346,696、5,679,323、和5,089,604)。

过继细胞免疫疗法一般指采用生物学试剂来实现由免疫介导的反应的治疗方法。目前，大多数过继免疫疗法是自身淋巴细胞疗法(ALT)，使用患者自己的免疫细胞，经过处理以增强由免疫细胞介导的反应或识别体内特异抗原或外来物质，包括癌细胞。治疗是如下进行的：获取患者的淋巴细胞，并在体外将这些细胞暴露于生物制剂和药物以激活细胞的免疫功能。一旦自体细胞得到激活，就将这些离体激活的细胞重新注入患者体内以增强免疫系统，从而治疗各种形式的癌症、传染病、自身免疫病或免疫缺陷病。

过继免疫疗法可以利用例如经白介素-2(IL-2)激活的天然杀伤(NK)细胞、经淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞和/或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和/或细胞毒性淋巴细胞(CTL)。LAK疗法涉及在高浓度IL-2下培养自体外周血淋巴细胞，从而在体外生成LAK细胞。然后在可能还涉及注入IL-2的治疗中将LAK细胞重新注入癌症患者体内。Rosenberg等人，“Cancer immunotherapy using interleukin-2and interleukin-2 activated lymphocytes”即“使用白介素-2和经白介素-2激活的淋巴细胞的癌症免疫疗法”，Annual Review ofImmunology，4：681-709，1986。TIL疗法涉及由单核细胞生成LAK细胞，这些单核细胞最初衍生自由手术切除样本获得的、实体瘤中及其周围存在的炎性浸润细胞。Rosenberg等人，“A new approach to theadoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltratinglymphocytes”即“使用肿瘤浸润淋巴细胞、针对癌症的过继免疫疗法的新方法”，Science，233：1318-1321，1986。最近几年已经开发了过继免疫疗法的许多进一步变化形式。参阅如2002年6月18日授予Wood的美国专利号6,406,699，其中公开并要求保护癌抗原免疫疗法的组合物和方法及其参考文献中公开和引用的方法。

除了癌症免疫疗法，过继免疫疗法可应用于与几种疾病和状况有关的T细胞缺乏或机能失调，包括病毒的循环感染，诸如疱疹病毒(HSV、VZV、CMV)、乙肝病毒、和乳头瘤病毒。参阅如Spiegel，R.J.，“The alpha interferons：Clinical overview”即“α-干扰素：临床综述”，Seminars in Oncology，14：1，1987。还在HIV感染患者的治疗中评估ALT。O.Martinez-Maza，“HIV-Induced ImmuneDysfunction and AIDS-Associated Neoplasms”即“由HIV诱发的免疫机能失调和与AIDS有关的肿瘤”，在《Biological Approaches toCancer Treatment：Biomodulation》即《癌症治疗的生物学方法：生物调控》中，M.Mitchell编，McGraw-Hill公司，第9章，第181-204页，1993。

干细胞是具有更新自身并产生分化细胞类型的独特能力的特殊细胞种类。尽管身体的大多数细胞，诸如心脏细胞或皮肤细胞，已被定型成执行特定功能，然而干细胞未被定型，并保持未被定型直至它接收信号而发育成分化细胞。在1998年，首次分离并培养了来自人类早期胚胎的干细胞。认识到这些干细胞确实能够成为身体中几乎所有的分化细胞。在最近几年，成人中存在的干细胞也显示具有生成替代细胞的能力，可用于许多组织和器官，诸如心脏、肝、胰、和神经系统。由此，这类成人干细胞有希望能够修复或取代遭到许多破坏性疾病和残废损害或破坏的细胞或组织。通过将干细胞靶向身体特定器官，它对于进行这些治疗非常有用。

在现有技术中，通常通过注射到组织中或注入局部循环内而将淋巴细胞和干细胞呈递给期望器官。然而，通过将正常骨髓干细胞和淋巴细胞注射到小鼠中已证明这些细胞定位于肝。Samlowski等人，Immunol.，88：309-322，1984；Samlowski等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，82：2508-2512，1985。

还知道注入哺乳动物的大部分细胞粘附于肺内皮，与细胞类型或生理学归巢特性无关。观察到干细胞在施用后在肺中积累。Morrison等人，Nature Medicine，2：1281-1282，1996；Martino等人，Eur.J.Immunol.，23：1023-1028，1993；Pereira等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：4857-4861，1993；和Gao等人，Cells Tissues Organs，169：12-20，2001。

血清类粘蛋白、脱唾液酸血清类粘蛋白和脱半乳糖/脱唾液酸血清类粘蛋白显示抑制嗜中性粒细胞激活、超氧化物阴离子生成、和血小板激活。Costello等人，Clin.Exp.Immunol.，55：465-472，1984；和Costello等人，Nature，281：677-678，1979。这些蛋白质还诱导瞬时免疫遏制和提供针对TNF攻击的保护。Bennett等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：6109-6113，1980；和Libert等人，J.Exp.Med.，180：1571-1575，1994。血清类粘蛋白展示与肺内皮细胞有特异结合，这看来不依赖糖类识别位点。Schnitzer等人，Am.J.Physiol.，263：H48-H55，1992。此外，血清类粘蛋白显示以依赖剂量的方式结合皮肤毛细血管内皮细胞，从而面对在对照动物中引起渗漏的炎性激动剂时维持正常的毛细血管通透性。Muchitsch等人，Arch.Int.Pharmacodyn.，331：313-321，1996。类似的，注入的血清类粘蛋白结合肾毛细管并恢复肾小球过滤的选择通透性。Muchitsch等人，Nephron.，81：194-199，1999。

还报道了在肝中捕获经过神经氨酸酶处理的淋巴细胞，包括在经静脉内注射了分离自脾或胸腺的淋巴细胞的小鼠中由经过同系神经氨酸酶处理的淋巴细胞对肝细胞的自身免疫反应。Kolb-Bachofen，V.等人，Immunol.，123：2830-2834，1979。关于经过神经氨酸酶处理的大鼠淋巴细胞与培养的肝细胞之间相互作用的研究证明，细胞间的粘附归结于哺乳动物肝膜凝集素(即ASGP受体)与切除了唾液酸残基后淋巴细胞表面上暴露的半乳糖残基之间的立体特异相互作用。Kolb，H.等人，Adv.Exp.Med.Biol.，114：219-222，1979。

综上所述，需要开发通过循环将淋巴细胞和干细胞投递至特定器官的方法。这些方法将提供非侵入性地靶向实体器官诸如肝、心脏、肺和肾的手段。另外，可以靶向非常弥散的组织，诸如不受注射药剂作用的肺。这些方法可用于涉及诸如肝、心脏、肺和肾等器官的过继免疫疗法和再生干细胞疗法。

本发明致力于这些和其它需要。

发明概述

本发明的特点是用于将细胞投递至哺乳动物体内靶组织的方法，包括下列步骤：对哺乳动物施用糖类呈递分子(如糖缀合物)，然后对哺乳动物施用所述细胞。

在用于本文时，术语“施用”指诱导哺乳动物循环中细胞的浓度升高的任何方法，其或是通过外界来源的输注或是通过带动细胞由哺乳动物体内的储库诸如骨髓转移进入循环达到的。本领域众所周知带动干细胞转移的手段，例如使用GM-CSF和GCSF。参阅如Simmons等人，“The mobilization of primitive hemopoietic progenitors into theperipheral blood”即“动员原始造血祖细胞进入外周血”，Stem Cells，12增刊1：187-201，1994。

依照本发明的方法尤其适用于干细胞，诸如由骨髓、外周血、脐带或者由培养扩增的间充质干细胞衍生的那些干细胞。本发明范围内的干细胞包括能够分化成期望靶组织的任何细胞。这些细胞包括多能干细胞、胚胎干细胞、多能成年干细胞、以及祖细胞或前身细胞。

依照本发明的方法同样尤其适用于免疫系统细胞，诸如经白介素-2(IL-2)激活的天然杀伤(NK)细胞、经淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞和/或激活的淋巴细胞，包括但不限于肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。

本发明的方法能够将细胞诸如正常干细胞或免疫细胞靶向靶组织诸如心脏、肝、肾和肺等。在细胞靶向心脏的一些实施方案中，该方法的特点是对哺乳动物施用血清类粘蛋白(orosomucoid，O)或施用脱唾液酸血清类粘蛋白(asialoorosomucoid，ASO)，并施用所述细胞。在细胞靶向肺的实施方案中，该方法的特点是在盐水或血清清蛋白-盐水溶液或不含蛋白质/清蛋白的细胞培养基中对哺乳动物施用细胞。在细胞靶向肝的实施方案中，该方法的特点是对哺乳动物施用血清类粘蛋白或脱唾液酸血清类粘蛋白并施用细胞。在一些实施方案中，血清类粘蛋白是在对哺乳动物施用细胞的同时或之前施用的。依照本发明的方法对于抑制或增强干细胞或免疫细胞在哺乳动物肝中的汇集同样有用，甚至在没有将细胞靶向靶器官时也如此。

本发明的糖缀合物一般可以由通式P-(S)x-Gal表述，其中P是人血清糖蛋白的肽残基，而S是人血清糖蛋白的糖残基；x是1-100的整数，而Gal是半乳糖残基。糖缀合物可以是部分或完全脱唾液酸的。特别有用的糖缀合物包括胎球蛋白、脱唾液酸胎球蛋白、血清类粘蛋白和脱唾液酸血清类粘蛋白。

可以在相对于施用细胞的任何时间范围内对哺乳动物施用糖缀合物。可以在施用细胞之前、之后或同时施用它们。在一个典型实施方案中，在细胞之前施用糖缀合物。可以通过任何合适途径施用糖缀合物和细胞。在优选实施方案中，它们是肠胃外施用于哺乳动物的，而且更优选静脉内方式。

通过将天然包含目的基因或经其转化的细胞导入哺乳动物，依照本发明的方法还可用于将目的基因靶向哺乳动物体内组织。通过对哺乳动物施用包含编码基因产物的功能基因的细胞并对哺乳动物施用糖缀合物，这些方法可用于治疗哺乳动物中特征为基因产物缺乏的疾病。依照这些方法，可以施用包含外源功能性目的基因的细胞并将其定位于体内特定器官，在此它能够发挥功能而生成缺乏的基因产物。

同样，通过对哺乳动物施用细胞并施用糖缀合物，依照本发明的方法可用于治疗哺乳动物中特征为组织损伤的疾病。因为干细胞具有生成多种组织和器官(诸如心脏、胰、和神经系统)的取代细胞的潜力，所以可以将干细胞靶向身体内特定器官，以修复或取代遭到许多破坏性疾病和残废损伤或破坏的细胞或组织。在一些实施方案中，疾病可以是心脏病、肺病、肾病或肝病，例如心肌梗死、肺气肿、囊性纤维化、微量蛋白尿、肾炎、中风或肝炎。

通过对哺乳动物施用糖缀合物并施用动员干细胞进入循环的化学药品或生物药品，依照本发明的方法还可用于治疗哺乳动物中特征为组织损伤的疾病。循环中被动员干细胞的浓度可能受到限制，因为某些器官可能汇集干细胞，从而限制将有效剂量投递至受损器官。通过抑制汇集，本发明的糖缀合物提高了器官中的细胞剂量；从而提高生成取代细胞的潜力。包括动员干细胞的试剂的这些方法还可用于多种组织和器官，诸如心脏、胰、和神经系统。可以将被动员的干细胞靶向体内特定器官，以修复或取代遭到许多破坏性疾病和残废损伤或破坏的细胞或组织。在干细胞被动员的一些实施方案中，疾病可以是心脏病、肺病、肾病、神经学疾病或肝病，诸如例如心肌梗死、肺气肿、囊性纤维化、微量蛋白尿、肾炎、中风或肝炎。

在其它实施方案中，本发明提供了包含细胞和糖缀合物如糖蛋白的制药学组合物。可用于本发明的糖蛋白包括例如胎球蛋白、血清类粘蛋白(O)和脱唾液酸血清类粘蛋白(ASO)。在其它方面，本发明的特点是制造的产品，包括包装材料和包装材料中所包含的制药学试剂，其中制药学试剂包含本发明的糖缀合物，其能够依照本发明在治疗上有效地将细胞靶向期望器官，且其中包装材料包含标签，其依照本发明指示所述制药学试剂可用于将细胞靶向期望器官。在一些实施方案中，制造的产品还包括额外试剂，诸如用于制备将要施用的细胞悬浮液的溶液，和/或印刷的说明书，用于依照本发明对细胞进行靶向。这些产品包括例如用于在哺乳动物中治疗组织损伤或将功能基因或基因产物投递至组织、包括细胞和糖蛋白的试剂盒。可用于本发明的制造产品的糖蛋白包括胎球蛋白、脱唾液酸胎球蛋白、血清类粘蛋白和脱唾液酸血清类粘蛋白。

在还有一些实施方案中，本发明提供了用于衍生干细胞或淋巴样细胞群从而生成携带脱唾液酸决定簇的细胞制剂以促进肝捕获的方法。具体而言，本发明提供了衍生化的、激活的干细胞或淋巴细胞，这些细胞在其表面上具有通过酶或化学手段生成的脱唾液酸决定簇使得这些细胞在肠胃外施用后循环、结合、并通过ASGP受体被肝汇集或捕获。本领域知道用唾液酸酶诸如神经氨酸酶处理整个存活细胞的方法。参阅如Neubauer，R.H.等人，“Identification of normal andtransformed lymphocyte subsets of nonhuman primates withmonoclonal antibodies to human lymphocytes”即“使用针对人淋巴细胞的单克隆抗体鉴定非人灵长类的正常和经转化淋巴细胞子集”，J.Immunol.，130：1323-1329，1983；Kolb-Bachofen，V.等人，1979，见上文；和Kolb，H.等人，1979，见上文。

例如，本发明提供了衍生干细胞从而在这些细胞的表面上生成新近脱唾液酸决定簇的方法，目的是将这些细胞导向肝以修复或再生肝功能和结构，或者用于投递正常基因或经过基因工程改造的细胞，以治愈或改善疾病状况。本发明这个方面的可操作元素是指导注入的携带人工产生的新近脱唾液酸糖决定簇的干细胞定位的能力、它们与受者生成微嵌合体的能力、以及新决定簇被肝特异汇集的机制。由此，这些携带新近脱唾液酸糖决定簇的细胞的同化将导致微嵌合(衍生的干细胞与遗传学异常的原始宿主细胞的混合物)。经修饰的干细胞至少将表达逆转或改善疾病表型所需要的异常或缺失蛋白质或调控功能的最小需求量。经修饰的干细胞可以衍生自患者的血液、骨髓或生成干细胞的其它器官，诸如脂肪组织，或者可以衍生自另一个体或干细胞系。

通过用生成“新近脱唾液酸决定簇”的酶对细胞表面进行衍生化而特异推动肠胃外施用的激活后淋巴细胞的肝汇集，本发明还提供了用于操纵淋巴样溶细胞性细胞的体内细胞运输模式的方法。由此，激活的淋巴样细胞群具有能够结合ASGP受体的细胞表面脱唾液酸决定簇，而且通过生成新细胞表面脱唾液酸决定簇的酶处理，这种结合能够得到进一步的增强。

通过促进肠胃外施用的经衍生而生成细胞表面脱唾液酸决定簇的细胞的肝捕获(通过ASGP受体)，这些方法可用于例如提高针对肝转移或原发性肝肿瘤的过继免疫疗法的效率。多种癌症在转移到肝后难以治疗。例如，在收获骨髓或自体干细胞产品用于移植之前，必须消除乳腺癌向肝的转移。为了实现完全反应，化疗本身可能需要几个月。它常常导致骨髓遏制，使得由个体收获干细胞极其困难。在肿瘤耐受化疗的情况中，治疗选择将会很少。过继免疫疗法确实存在，可以在培养中“训练”患者自身细胞识别肿瘤，然后将这些细胞静脉内转移到患者体内以寻找并破坏肿瘤。

若肿瘤主要在肝中，则进行几个循环的特异致力于由肝消除肿瘤的治疗可能是有用的。依照本发明，这可以通过用酶(包括但不限于唾液酸酶，诸如神经氨酸酶)处理激活的淋巴样细胞群(已经在培养中生长或受“训练”)或修饰细胞表面糖基化位点以暴露脱唾液酸决定簇的其它处理来实现。这些决定簇的数目因而显著增加，与携带“正常”数目的脱唾液酸决定簇的细胞相比，经修饰细胞因而更易于结合肝ASGP受体且较少解离。

携带新近脱唾液酸糖决定簇的淋巴样细胞的同化作用导致微嵌合，正如上文关于干细胞所述，即注入的经过或未经基因工程改造的淋巴细胞与该部位存在的原始宿主淋巴样细胞的混合物。通过分开并进入循环且征募其它细胞群来参与局部免疫应答，注入的淋巴样细胞将提高或增强免疫应答。肝环境理想地适合于免疫应答的发展，这要归结于先天免疫系统细胞以及窦状隙和脉管系统特别是门静脉系中消化性抗原呈递细胞(professional antigen presenting cells)的存在。

例如，几项研究显示，通过对肝局部施用激活的淋巴细胞，可以实现对例如转移性皮肤黑素瘤的应答。参阅如Keilhoiz，U.等人，“Regional adoptive immunotherapy with interleukin-2 andlymphokine-activated killer(LAK)cells for liver metastasis”即“使用白介素-2和经淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞、针对肝转移的局部过继免疫疗法”，Eur.J.Cancer，3OA：103-105，1994。使用经过修饰而生成额外细胞表面脱唾液酸决定簇的激活淋巴细胞的本发明方法能够通过肝动脉或门静脉或外周静脉而将激活后的淋巴细胞局部投递至肝，无需使用侵入性操作来将这些细胞投递至原发性肝或非肝瘤，或者投递至远离原发性肝或非肝癌的转移性损伤处。

附图简述

图1提供了肝中骨髓干细胞和淋巴细胞的肝捕获的示意图。细胞表面上的脱唾液酸糖决定簇与肝细胞表面上的ASGP受体发生反应，导致肝中骨髓干细胞和淋巴细胞的定位。包括脱唾液酸糖缀合物在内的糖缀合物可阻断细胞表面上的脱唾液酸糖决定簇与肝细胞表面上的ASGP受体之间的这些相互作用。

图2显示了本发明的两种例示性糖蛋白的糖类结构。

图3显示了不同糖类对ASGP受体的相对结合亲和力。

图4显示了不同糖类对ASGP受体的相对结合亲和力。

图5显示了用于研究NK/LAK细胞粘附(1)人肝癌细胞系(HEP2G)(相对于人肝组织的细胞展示最小偏差的一种脱唾液酸糖蛋白受体阳性(ASGPR+)细胞系)，和(2)人肾细胞癌细胞系(CAKI-2)(一种ASGPR-细胞系)单层培养物的实验系统的示意图。

图6显示了测试脱唾液酸胎球蛋白(ASF)和胎球蛋白(F)在4℃对NK/LAK细胞(表述为NK/LAK活性)粘附HEP2G单层的影响的结果图。在存在完全唾液酸化的对照蛋白质即胎球蛋白即F(LAK-NA/F)时，LAK活性(50％)在4℃粘附人最小偏差肝癌，HEPG2。在存在脱唾液酸胎球蛋白即ASF(LAK-NA/ASF)时，LAK活性不粘附HEPG2单层。在只存在ASF时，将LAK细胞保温，即没有进行对单层的粘附(LAK/ASF)。对照细胞不杀伤RAJI靶(对照)。^**这代表了三名不同供体。

图7显示了测试脱唾液酸胎球蛋白(ASF)和胎球蛋白(F)在23℃对NK/LAK细胞粘附HEP2G和CAKI-2细胞的影响的结果。效应细胞群是：未经处理的3日龄LAK制剂(LAK)和经过霍乱弧菌(Vibrio cholera)神经氨酸酶处理的相同细胞群(LAK/NS)。在存在ASF或F时LAK对HEPG2(ASGPR+)和CAKI-2(ASGPR-)的粘附在K562上进行测定。(LAK＝3日龄LAK；K5＝K562靶；FET＝胎球蛋白；ASF＝脱唾液酸胎球蛋白；LAK/CAKI/ASF/K5＝LAK对经过ASF预处理的CAKI的粘附，在K562上进行测定)。

图8显示了如图7所示测试脱唾液酸胎球蛋白(ASF)和胎球蛋白(F)在23℃对NK/LAK细胞向HEP2G和CAKI-2细胞的粘附产生的影响的额外结果。在存在ASF或F时，经过神经氨酸酶处理的LAK与HEPG2(ASGPR+)和CAKI-2(ASGPR-)的粘附(LAK/NS＝经过神经氨酸酶处理的LAK；范例-LAK/CAK/NS/ASF/K5＝经过神经氨酸酶处理的LAK对经过ASF预处理的CAKI的粘附，在K562上进行测定)。

图9显示了如图7所示测试脱唾液酸胎球蛋白(ASF)和胎球蛋白(F)在23℃对NK/LAK细胞向HEP2G和CAKI-2细胞的粘附产生的影响的额外结果。在存在ASF或F时LAK粘附HEPG2(ASGPR+)和CAKI-2(ASGPR-)的情况在RAJI上进行测定。(LAK＝3日龄LAK；R＝RAJI靶；FET＝胎球蛋白；ASF＝脱唾液酸胎球蛋白；LAK/CAKI/ASF/R＝LAK对经过ASF预处理的CAKI的粘附，在RAJI上进行测定)。

图10显示了如图7所示测试脱唾液酸胎球蛋白(ASF)和胎球蛋白(F)在23℃对NK/LAK细胞向HEP2G和CAKI-2细胞的粘附产生的影响的额外结果。在存在ASF或F时经过神经氨酸酶处理的LAK粘附HEPG2(ASGPR+)和CAKI-2(ASGPR-)。(LAK/NS＝经过神经氨酸酶处理的LAK；范例-LAK/CAK/NS/ASF/R＝经过神经氨酸酶处理的LAK对经过ASF预处理的CAKI的粘附，在RAJI上进行测定)。

图11显示了测试细胞表面修饰对NK/LAK细胞粘附HEP2G细胞单层的影响的结果。5日龄LAK、经过神经氨酸酶处理的LAK、和对照(无IL-2)的细胞毒性活性，在K562上进行测定。

图12显示了如图11所示测试细胞表面修饰对NK/LAK细胞粘附HEP2G细胞单层的影响的额外结果。5日龄LAK、经过神经氨酸酶处理的LAK、和对照(无IL-2)的细胞毒性活性，在RAJI细胞上进行测定。

图13显示了如图11所示测试细胞表面修饰对NK/LAK细胞粘附HEP2G细胞单层的影响的额外结果。在用神经氨酸酶、2，3-或2，6-唾液酸转移酶进行细胞表面修饰后LAK活性对HEPG2(ASGPR+)的粘附。(范例：LAK/HEP/NASE/K5＝经过神经氨酸酶处理的LAK粘附HEPG2，在K562上进行测定)。

图14显示了如图11所示测试细胞表面修饰对NK/LAK细胞粘附HEP2G和CAKI-2细胞单层的影响的额外结果。在用神经氨酸酶、2，3-或2，6-唾液酸转移酶进行细胞表面修饰后LAK活性对CAKI-2(ASGPR-)的粘附。(图13和14中的虚线是相同对照)。

图15显示了如图11所示测试细胞表面修饰对NK/LAK细胞粘附HEP2G和CAKI-2细胞单层的影响的额外结果。在用神经氨酸酶、2，3-或2，6-唾液酸转移酶进行细胞表面修饰后LAK活性对HEPG2(ASGPR+)的粘附。

图16显示了如图11所示测试细胞表面修饰对NK/LAK细胞粘附HEP2G和CAKI-2细胞单层的影响的额外结果。在用神经氨酸酶、2，3-或2，6-唾液酸转移酶进行细胞表面修饰后LAK活性对CAKI-2(ASGPR-)的粘附，在RAJI细胞上进行测定。

发明详述

A.导言

本发明致力于用于将细胞投递至哺乳动物体内靶组织的方法。该方法包括下列步骤：对哺乳动物同时或顺序施用糖类呈递分子(如糖缀合物)和细胞。在本发明的方法中，认为糖缀合物，尤其是脱唾液酸糖缀合物，包括脱唾液酸血浆蛋白质诸如脱唾液酸血清类粘蛋白(脱唾液酸α-1-酸糖蛋白)，可瞬时结合肝ASGP受体，从而竞争性抑制携带脱唾液酸决定簇的细胞粘附这些受体。不希望受到理论的约束但推测缺唾液酸化和脱唾液酸化的蛋白质/糖缀合物(也称为脱唾液酸糖缀合物)和携带相似决定簇的细胞在肝中因结合肝ASGP受体而被缚或“捕获”(见图1)。脱唾液酸糖缀合物对受体的占据抑制了携带相似的目的决定簇的细胞在肝中汇集。

另外，本公开书显示本发明的糖缀合物可预防注入的细胞在肺泡脉管系统中集中。这个发现说明细胞的肺汇集可能与内皮细胞上炎性受体的表达有关，与重输注综合症类似(参阅如Kilgore等人，Cardiovasc.Res.，28：437-444，1994；和Eror等人，Clin.Immunol.，90：266-275，1999)。这得到了下面的报告的支持：血清类粘蛋白、ASO和脱半乳糖/脱唾液酸血清类粘蛋白抑制嗜中性粒细胞激活、超氧化物阴离子生成、以及血小板激活，正如上文所述。

本发明还证明，通过改变施用的特定糖缀合物，糖蛋白可用于将细胞运输或靶向至身体特定器官。这些方法可用于改善骨髓和干细胞移植、组织修复、基因疗法或过继免疫疗法的功效。

在细胞靶向肺的实施方案中，这些方法的特点是在盐水或血清清蛋白-盐水溶液中对哺乳动物施用细胞。在造血干细胞靶向心脏的一些实施方案中，这些方法的特点是对哺乳动物施用脱唾液酸血清类粘蛋白并施用细胞。在间充质干细胞靶向心脏的其它实施方案中，这些方法的特点是对哺乳动物施用血清类粘蛋白并施用细胞。在造血干细胞靶向肝的实施方案中，这些方法的特点是对哺乳动物施用血清类粘蛋白并施用细胞。在间充质干细胞靶向肝的其它实施方案中，这些方法的特点是对哺乳动物施用脱唾液酸血清类粘蛋白并施用细胞。在一些实施方案中，血清类粘蛋白或脱唾液酸血清类粘蛋白是在对哺乳动物施用细胞之前在至少两次输注中施用的。依照本发明的方法也可用于抑制细胞在哺乳动物肝中的汇集，甚至在没有将细胞靶向靶器官时也可如此。

脱唾液酸糖缀合物，例如脱唾液酸胎球蛋白和其它脱唾液酸血浆蛋白质，能够结合肝实质和枯否细胞ASGP受体。阻断这些受体结合并捕获携带脱唾液酸决定簇的细胞，诸如骨髓细胞，可促进并延长它们系统循环的时间间隔。在骨髓干细胞的情况中，施用这些化合物可预防骨髓干细胞的损失和破坏并提高移入的效率。骨髓细胞具有能够结合ASGP受体的细胞表面脱唾液酸决定簇，而且这种结合能够被ASGP的应用所抑制。

本发明基于的是如下观察结果：在将人外周造血干(CD34+)细胞或间充质干细胞注入免疫缺陷小鼠的颈静脉后，它们主要定位于肺中。若在细胞之前注入脱唾液酸血清类粘蛋白，则造血干细胞主要定位于心脏，而间充质干细胞定位于肝。或者，若在细胞之前注入血清类粘蛋白(O)，则造血干细胞定位于肝，而间充质干细胞主要定位于心脏。

与不进行蛋白质输注时发生的定位相比，这些蛋白质输注引起更大量的向特定器官的定位。此外，因脱唾液酸血清类粘蛋白的影响而定位于心脏的造血干细胞在输注后一小时离开血管空间并在心肌细胞中观察到。此外，一旦进入组织，这些细胞就丧失了它们的CD34抗原，指示它们进入了分化成心肌细胞或心脏构件(如血管)的过程。另外，证明了CD34+细胞在一小时时由脉管系统移动到肺组织。在经过血清类粘蛋白处理的小鼠中，在肝实质中发现了干细胞簇，还证明它们丧失了CD34抗原，再次说明分化成肝细胞/肝实质。

本发明证明了以无损伤的方式将高浓度的干细胞导向特定器官的能力。这增强了干细胞迁移到靶组织中并分化成期望细胞类型的概率和速率。本发明利用了将血清类粘蛋白或ASO投递至接近心脏的血管引起输注的干细胞在心脏中积累的观察结果。不希望受到理论的约束，推测注入糖蛋白使得紧挨输注部位的下游内皮变得敏感，这使得内皮细胞结合干细胞并增强它们穿过内皮而进入组织的迁移，由此可以引起该效果。

使用糖缀合物得到的这些发现指示干细胞输注的大多数能够在靶器官中集中，从而提供了投递有效摄取细胞剂量的手段。这样就有可能非侵入性靶向实体器官，诸如心脏，从而与侵入性直接注射法相抗衡。可能更重要的是，糖缀合物提供了靶向非常弥散的组织的手段，诸如不受注射药剂作用的肝和肾。

已认识到由骨髓、外周血或脐带血回收的造血干细胞(HSC)以及由骨髓基质细胞、来自吸脂术脂肪的基质细胞回收的或由清除了脐血的胎盘中的静止基质祖细胞扩增的间充质干细胞(MSC)似乎在它们的分化能力上几乎可互换，而且可作为多能干细胞发挥作用。

这些细胞显示在定位于特定器官和组织后分化成功能细胞：肝中的肝细胞和胆管细胞(cholangiocyte)，心脏中的心肌细胞和动脉平滑肌细胞和内皮细胞，肺泡中的肺细胞I和II和肺中的支气管上皮，用于软骨恢复的软骨细胞，以及肠粘膜细胞、心脏中的小、中和大血管，等。

B.干细胞

干细胞可能是取代许多破坏性疾病中丧失的细胞的关键，诸如帕金森病、糖尿病、急性和慢性心脏病、末期肾病、肝功能衰竭、和癌症。对于许多疾病，没有有效治疗方法，但是目标是找到取代天然过程所丧失的东西的方法。

至今为止，发表的科学论文指出已经在脑、骨髓、外周血、血管、骨骼肌、皮肤和消化系统的上皮、角膜、牙齿的牙髓、视网膜、肝、和胰中鉴定了成人干细胞。由此，已经在由所有三个胚胎胚层发育而成的组织中发现了成人干细胞。

作为定义，本领域这样理解下列术语：

“干细胞”指来自胚胎、胎儿或成人，且在某些条件下具有长期或者在成人干细胞的情况中是指在生物体的整个寿命期间再生自身的能力的细胞。它还能够生成构成身体的组织和器官的分化细胞。

“多能干细胞”具有生成由三个胚层(中胚层、内胚层、和外胚层)发育而成的细胞类型的能力。身体的所有细胞都是由这三个胚层生成的。人多能干细胞的唯一已知来源是由早期人胚胎和注定成为生殖腺一部分的胎儿组织分离并培养的那些干细胞。

“胚胎干细胞”衍生自称为内细胞群的一组细胞，它是称为胚泡的早期(4-5天)胚胎的一部分。一旦脱离胚泡，内细胞群的细胞可以被培养成胚胎干细胞。这些胚胎干细胞自身并不是胚胎。

“成人干细胞”指分化组织中存在的、自我更新并在转移到适当组织后分化产生它所放置的组织中的所有分化细胞类型的未分化细胞。成人干细胞能够在生物体的一生中生成相同拷贝的自身。这种特性称为“自我更新”。成人干细胞常常分裂生成祖细胞或前身细胞，后者再分化或发育成具有特征形态和专门功能的“成熟”细胞类型，如肌细胞收缩或神经细胞发送信号。成人干细胞的来源包括骨髓、血液、眼睛的角膜和视网膜、脑、骨骼肌、牙髓、肝、皮肤、胃肠道内层和胰。

来自骨髓的干细胞是研究得最多的一类成人干细胞。目前，它们在临床上已被用于通过移植恢复骨髓的各种血液和免疫成分。目前在骨髓中鉴定了两种主要的干细胞类型：通常视为形成血液和免疫细胞的造血干细胞(HSC，或CD34+细胞)，和通常视为形成骨、软骨、肌肉和脂肪的基质(间充质)干细胞(MSC)。然而，最近证明了这两种骨髓衍生干细胞在形成相同组织的能力方面有广泛可塑性和多能性。

位于骨骼骨髓腔内的骨髓是成人体内造血的唯一部位。它产生大约六十亿个细胞每千克体重每天。造血活性(红色)骨髓在出生后退化，直至青春期晚期，然后它集中于下部头骨、肩和腰带、肋骨、和胸骨。脂肪细胞代替手、脚、腿和臂骨骼中的造血细胞(黄骨髓)。脂肪在成人中占据了红色骨髓大约百分之五十的空间，而且进一步的脂肪变态随着衰老而缓慢继续。在很老的个体中，可能发生脂肪凝胶状转化成粘液状物质(白色骨髓)。如果存在长期需要，诸如患有溶血性贫血，黄色骨髓可以回复成造血活性骨髓。由此，可以通过增加红色骨髓的体积和缩短由祖细胞发育(转变)成成熟细胞所需要的时间来扩大造血。

骨髓基质主要由窦网组成，它在骨内膜由皮层毛细管起源，并在进入全身静脉循环的收集血管中终止。三层窦壁由内皮细胞、不发达的薄基底膜、和外膜网状细胞(能够转化成脂肪细胞的成纤维细胞)组成。内皮和网状细胞是造血细胞因子的来源。造血在窦间空间进行，而且受到刺激性和抑制性细胞因子的复杂阵列、细胞-细胞接触、胞外基质成分对附近细胞的影响的控制。在这种独特环境中，淋巴造血干细胞分化成所有的血细胞类型。生成并释放成熟细胞以维持稳态血细胞水平。由于失血、溶血、发炎、免疫细胞减少(immunecytopenias)、和其它原因，系统可能会满足对额外细胞的更大需求。可以通过预防肝经由肝ASGP受体的捕获来提高骨髓干细胞的输注效率。

“祖细胞或前身细胞”存在于胎儿或成人组织中，而且是部分分化的；它分裂并生成分化细胞。研究人员通常能够将前身细胞/祖细胞与成人干细胞区分开来，依据是干细胞分裂后，两个新细胞中的一个常常是能够再次复制自身的干细胞。相反，祖细胞/前身细胞分裂后，它能够形成更多的祖细胞/前身细胞，或者它能够形成两个分化细胞。祖细胞/前身细胞能够取代受损或死亡的细胞，由此维持组织诸如肝或脑的完整性和功能。

用于分离并培养可用于本发明的干细胞的方法是众所周知的。脐带血是造血干细胞的丰富来源。由脐带血获得的干细胞和由骨髓或外周血获得的干细胞对于移植用途显得非常相似。胎盘是间充质干细胞的极佳的、易得到的来源。此外，间充质干细胞显示可以由脂肪组织和骨髓基质细胞衍生，且推测存在于其它组织中。尽管能够衍生成人干细胞的器官在质量上和数量上存在显著差异，但细胞之间的最初差异可能相对肤浅，而且可以通过它们所展示的可塑性相似范围得到平衡。例如，在适当条件下，造血和间充质成人干细胞都能够变成心肌细胞。对成人干细胞潜力的完整阐述才刚开始。

可以使用已知方法来分离干细胞以用于转导和分化。例如，在小鼠中，通过处死小鼠并用剪刀切下腿骨来分离骨髓细胞。还可以通过用结合不需要的细胞(诸如CD4+和CD8+(T细胞)、CD45+(panB细胞)、GR-1(粒细胞)、和lad(分化抗原呈递细胞))的抗体淘选骨髓细胞而由骨髓细胞分离干细胞。关于这个方案的范例可参阅Inaba等人，I.Exp.Med.，176：1693-1702，1992。

在人中，可以由多种来源获得CD34+造血干细胞，包括脐血髓、和活动化外周血。可以通过抗体亲和流程来实现CD34+细胞的纯化。Ho等人，Stem Cells，13增刊31：100-105，1995描述了用于分离CD34+细胞的亲和柱分离流程。还可参阅Brenner，Journal ofHematotherapy，2：7-17，1993。用于分离、纯化和培养扩增间充质干细胞的方法是已知的。MSC的特异抗原也是已知的(参阅美国专利号5,486,359和5,837,539)。

C.糖类呈递细胞

可用于本发明的糖类呈递分子可以是能够呈递适当糖类结构从而增强或抑制将目的细胞靶向靶组织的任何分子。可以使用糖类分子来进行靶向功能，诸如寡糖、多糖，或者可以将糖类结构结合大型分子或载体上，本文称为糖缀合物。通常，糖类分子将连接天然存在的载体(如作为糖蛋白或糖脂的一部分)或合成载体(如经过改造的多肽序列)。技术人员将认识到许多载体可用于呈递适当结构。适当载体分子的范例包括多肽、脂、诸如此类。本领域描述了使用脱唾液酸糖类模块的靶向化合物的制备和使用(参阅如美国专利号5,679,323、5,089,604、5,032,678和5,284,646)。技术人员将认识到这些化合物还可作为可用于本发明的糖类呈递分子。

在糖缀合物是糖蛋白的情况中，它一般可以由通式P-(S)x-Gal表述，其中P是人血清糖蛋白的肽残基，而S是人血清糖蛋白的糖残基；x是1-100的整数，而Gal是半乳糖残基。特别有用的糖缀合物包括胎球蛋白、脱唾液酸胎球蛋白(见图2)、血清类粘蛋白、脱唾液酸血清类粘蛋白、半乳糖键合聚葡糖胺、诸如此类。

本发明的方法能够将细胞诸如干细胞靶向靶组织诸如心脏、肝、肾和肺等。肠胃外施用糖缀合物，诸如脱唾液酸血清类粘蛋白，可用于阻断肝ASGP受体，使得携带表面脱唾液酸决定簇的细胞(例如花生凝集素(PNA)+细胞)继续循环并移动到骨髓空间。脱唾液酸血清类粘蛋白是显示可结合肝ASGP受体并广泛用于鉴定这种受体的一种糖蛋白。

根据所呈递的糖类，不同化合物对于ASGP受体具有不同结合亲和力(见图3和4)。由此，技术人员可以通过使用呈递不同糖类结构的化合物来调控细胞靶向。

静脉内施用糖缀合物，尤其是ASGP诸如脱唾液酸血清类粘蛋白，可用于阻断肝ASGP受体，使得携带表面脱唾液酸决定簇的细胞继续循环并移动到骨髓空间或目的器官。可以在相对于细胞的任何时间范围内对哺乳动物施用糖缀合物，但是在一些实施方案中，在施用细胞之前施用糖缀合物。可以通过任何合适途径施用脱唾液酸糖缀合物和细胞，但是在一些实施方案中，它们是经静脉内施用于哺乳动物的，而在其它实施方案中，它们是肠胃外施用的。在细胞靶向肺的实施方案中，这些方法的特点可以是在盐水或血清清蛋白-盐水溶液中对哺乳动物施用细胞。在将造血干细胞靶向心脏的一些实施方案中，这些方法的特点可以是对哺乳动物施用脱唾液酸血清类粘蛋白并施用细胞。在将间充质干细胞靶向心脏的其它实施方案中，这些方法的特点可以是对哺乳动物施用血清类粘蛋白并施用细胞。在将造血干细胞靶向肝的实施方案中，这些方法的特点可以是对哺乳动物施用血清类粘蛋白并施用细胞。在将间充质干细胞靶向肝的其它实施方案中，这些方法的特点可以是对哺乳动物施用脱唾液酸血清类粘蛋白并施用细胞。在一些实施方案中，血清类粘蛋白或脱唾液酸血清类粘蛋白是在对哺乳动物施用细胞之前或之后在至少两次输注中施用的。依照本发明的方法对于抑制细胞在哺乳动物肝中的汇集同样有用，甚至在没有将细胞靶向靶器官时也如此。

α-(1)-酸糖蛋白(血清类粘蛋白或AAG)是人血浆的正常组分(650±215μg/ml)，在与急性发炎和癌症有关时它的浓度提高了高达五倍，因而被看作是急性阶段蛋白质。血清类粘蛋白由单一多肽链构成，分子量是44,100，而且包含大约45％糖类，包括12％唾液酸。它是带最多负电荷的血浆蛋白质。血清类粘蛋白的某些生物学特性与其唾液酸含量有关。由此，血清类粘蛋白的清除和免疫原性在脱唾液酸后显著增加。血清类粘蛋白的生物学功能在很大程度上是未知的。血清类粘蛋白具有抑制某些淋巴细胞反应性的能力，包括应答伴刀血球蛋白A、植物血球凝集素和异源细胞的母细胞化，而且这些抑制效果在脱唾液酸后得到增强。有报道说不符合生理学的大量(5-15mg/ml)血清类粘蛋白抑制由ADP和肾上腺素诱导的血小板聚集，而且有证据表明缺乏唾液酸的血清类粘蛋白种类在几种慢性疾病状况中升高。

D.基因疗法

本发明还致力于使用活细胞将治疗性基因投递到体内。在一些实施方案中，治疗性基因是转基因。例如，由体内获取投递细胞，即一类肝细胞、淋巴细胞、或成纤维细胞，并通过本领域熟炼技术人员众所周知的载体将治疗性转基因导入这些细胞，诸如直接基因转移法中所使用的那些载体。尽管仍然处于实验室阶段，测试了经过遗传修饰的细胞，然后使其生长并扩增，最后输注回患者体内。或者，携带正常内源基因的异源细胞能够逆转特定靶组织中的缺乏症。使用携带转基因或正常内源基因的细胞在本文中称为基因疗法。

与直接将基因转移到体内相比，使用经过遗传修饰的细胞的基因疗法提供了几项独特优点。首先，向投递细胞中加入治疗性转基因是在患者体外进行的，这为临床医生提供了重要的控制措施，因为他们能够只选择并使用既包含转基因又生成足够量治疗剂的那些细胞。

对于具有治疗目的的基于干细胞的基因疗法尝试，大约三分之一集中于癌症(如卵巢癌、脑癌、乳癌、骨髓瘤、白血病、和淋巴瘤)，三分之一集中于人免疫缺陷病毒病(HIV-1)，还有三分之一集中于所谓的单基因病(如Gaucher氏病、重度联合免疫缺陷(SCID)、范可尼贫血、法布里氏病、和白细胞粘附缺陷)。

综上所述，通过对哺乳动物导入包含目的基因的细胞并施用糖缀合物，依照本发明的方法可用于将目的基因(或是转基因或是内源基因)靶向哺乳动物体内组织。通过对哺乳动物施用包含编码基因产物的功能基因的细胞并对哺乳动物施用糖缀合物，这些方法可用于治疗哺乳动物中特征为基因产物缺乏的疾病。干细胞可以作为载体用于将基因投递至体内特定组织。基于干细胞的疗法是癌症研究中的主要研究领域。

本发明为输注的细胞诸如干细胞提供了定位，从而向受到由基因缺乏引起的疾病困扰的患者提供该功能基因。在基于遗传学的疾病的许多情况中，该基因产物的低水平生成将有效减轻或治愈该疾病。通过将来自正常供体的干细胞输注到患者体内而提供缺乏的基因，可以指导干细胞定位于选择的器官或组织，在该器官或组织中引起该患者的微嵌合，该基因产物可以由该器官或组织投递至患者。因此，本发明提供了指导输注细胞定位的能力，诸如具有稳定的、正常的基因的异源干细胞。然后，这些输注细胞生成受者的稳定微嵌合体。

本领域技术人员知道引起许多基于遗传学的疾病的遗传缺陷。能够治疗的例示性基因和疾病包括囊性纤维化中的CTFR蛋白质以及与肝中凝血病有关的蛋白质。例如，可以使用基因疗法来实现血友病A的治疗。在这些实施方案中，可以输注细胞，诸如脐带血造血干细胞，以投递完整的正常因子VIII基因。或者，转化细胞中可以包含正常的野生型因子VIII基因。可以指导携带功能性因子VIII基因的这些细胞定位于肝，优选通过在输注干细胞之前输注血清类粘蛋白或脱唾液酸血清类粘蛋白来达到。细胞转化成干细胞，并开始向血液中分泌因子VIII。

依照本发明的基因疗法的其它实施方案包括治疗血友病B(因子IX缺乏)、以及抗凝血酶III、蛋白C、和蛋白S缺陷。尽管这些疾病都涉及凝血系统，然而基因疗法可能包括治疗不同组织，诸如肌营养不良、囊性纤维化、诸如此类。

E.将转基因导入干细胞

用于将转基因导入细胞的方法是众所周知的。本领域普通技术人员知道用于在哺乳动物细胞内投递和表达核酸的多种方法。这些方法包括例如病毒载体、基于脂质体的基因投递(WO 93/24640；ManninoGould-Fogerite，BioTechniques，6(7)：682-691，1988；美国专利号5,279,833；WO 91/06309；Felgner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84：7413-7414，1987；和Budker等人，Nature Biotechnology，14(6)：760-764，1996)。熟炼技术人员知道的其它方法包括孔(美国专利号5,545,130、4,970,154、5,098,843、和5,128,257)、直接基因转移、细胞融合、沉淀法、微粒轰击、和由受体介导的摄取(美国专利号5,547,932、5,525,503、5,547,932、和5,460,831)。还可参阅美国专利号5,399,346。

广泛使用的逆转录病毒载体包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、及其联合的那些载体。参阅如Buchscher等人，J.Virol.，66(5)：2731-2739，1992；Johann等人，J.Virol.，66(5)：1635-1640，1992；Sommerfelt等人，Virol.，176：58-59，1990；Wilson等人，J.Virol.，63：2374-2378，1989；Miller等人，J.Virol.，65：2220-2224，1991；PCT/US94/05700；以及Rosenburg和Fauci，在《Fundamental Immunology》即《基础免疫学》中，第三版，Paul编，1993)。

基于AAV的载体也可用于用靶核酸转导细胞，如在体外核酸和多肽生成中，以及在体内和离体基因疗法流程中。关于AAV载体的综述请参阅West等人，Virology，160：38-47，1987；美国专利号4,797,368；WO 93/24641；Kotin，Human Gene Therapy，5：793-801，1994；Muzyczka，J.Clin.Invst.，94：1351，1994；以及Samuiski，见上文。许多发表物中描述了重组AAV载体的构建，包括Lebkowski，美国专利号5,173,414；Tratschin等人，Mol.Cell.Biol.，11：3251-3260，1985；Tratschin等人，Mol.Cell.Biol.，4：2072-2081，1984；Hermonat和Muzyczka，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6466-6470，1984；以及Samulski等人，J.Virol.，63：3822-3828，1989。

通常将逆转录病毒载体用于可用于本发明的细胞。这些载体可能包括例如HIV-2颗粒中包装的HIV-2可包装核酸(通常使用包装细胞系)。作为将基因导入靶细胞的方法，细胞转导载体具有可观的商业价值。具体而言，可以使用基因疗法流程，其中将本发明的细胞转导载体用于在体内或离体流程中用治疗性核酸转导靶细胞。基因疗法提供了用于抗击由基因缺陷引起的慢性疾病、传染性疾病诸如HIV及非传染性疾病诸如癌症的方法。

干细胞诸如CD34+干细胞可用于细胞转导和基因疗法的离体流程中。本发明利用了干细胞在体外分化成其它细胞类型或能够导入哺乳动物(诸如细胞供体)的特点，其中，它们将迁入骨髓中(除非靶向另一种器官以便分化)。由此，本发明延伸至将干细胞导向特定器官以再生组织，诸如导向心脏以再生心肌细胞，导向肺以再生肺泡，和导向肾以再生组织，以及将细胞诸如CD34+干细胞导向器官以通过提供有效量的所缺乏基因产物来缓解遗传异常。使用细胞因子诸如GM-CSF、IFN-γ和TNF-α在体外使CD34+细胞分化成临床上重要的免疫细胞类型的方法是已知的(参阅Inaba等人，J.Exp.Med.，176：1693-1702，1992；以及Szabolcs等人，缺杂志名，154：5851-5861，1995)。Yu等人，PNAS，92：699-703，1995描述了使用逆转录病毒载体转导来自人胎儿脐血的CD34+细胞的方法。

F.制药学组合物

在其它实施方案中，本发明提供了包含本发明的细胞和糖缀合物的制药学组合物。例示性糖蛋白包括血清类粘蛋白和脱唾液酸血清类粘蛋白。在其它方面，本发明涉及包括细胞和糖蛋白的试剂盒，用于治疗组织损伤，或用于将功能基因或基因产物投递至哺乳动物体内组织。通常将干细胞呈递给期望器官，其或是通过直接注射到组织中，通过输注到局部循环中，或是通过带动来自骨髓的自体干细胞迁移来达到的，在可行的情况中，这伴随着在带动迁移之前预先切除捕获干细胞的器官，即脾切除术。

可以在注入干细胞之前、同时、或之后施用糖缀合物。在一些实施方案中，可以使用静脉内液袋来施用糖缀合物，它包含在含有或不含蛋白质的盐水或葡萄糖溶液中，或者在不含血清的培养基中，包括但不限于RPMI 1640或AIM-V。在这些实施方案中，糖缀合物可以在相同袋中或在“piggyback”中与细胞混合。糖缀合物还可以在施用细胞后继续施用，以延长全身循环时间或增加特定器官积累。可以按照将治疗剂量的细胞投递至靶器官所需重复这个流程。考虑到来自动物研究的数据证明3-7mg糖缀合物每ml血容量(可高达12mg/小鼠)的剂量没有副作用，使用该制剂时不用过多担心脏毒性。

离体转导细胞的施用可以是通过任何常用于导入细胞或分子使之最终接触血液或组织细胞的途径。可以以任何合适方式施用转导细胞，优选使用制药学可接受载体。可以找到对患者施用本发明内容中的这些细胞的合适方法，而且尽管有一种以上路径可用于施用特定组合物，然而特定路径常常可以提供比其它路径更直接且更有效的反应。

制药学可接受载体部分是由施用的具体组合物以及用于施用组合物的具体方法决定。因此，本发明的制药学组合物存在多种合适配方。

适用于肠胃外施用的配方，诸如例如关节内、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、和皮下路径，包括水性和非水性等渗无菌注射液以及水性和非水性无菌悬浮液，其中前者可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、和使得配方与预期受者血液等渗的溶质，后者可以包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、和防腐剂。肠胃外施用是一种有用的施用方法。配方可以装在单剂或多剂密闭容器中，诸如安瓿和小瓶中，而在一些实施方案中，配方可以储藏在冻干条件下，只需要在使用前添加无菌液态载体例如水用于注射。可以将这些配方与可带动期望类型的成人干细胞进入循环的因子一起施用。

可以由先前描述的无菌粉剂、颗粒、和片剂种类制备即时注射溶液和悬浮液。也可以如上所述肠胃外施用用上文离体疗法中所描述的载体转导的细胞，只是冻干方式通常是不合适的，因为冻干会破坏细胞。

在本发明的内容中，施用于患者的剂量应当足以在患者中随着时间流逝实现有利治疗反应。剂量将由所采用特定细胞的功效和患者状况以及待治疗患者的体重决定。剂量大小还将由在特定患者中施用细胞类型所伴随的任何不利副作用的存在、本质、和程度决定。确定疾病的治疗或预防中所施用的细胞的有效量时，医师应当评估循环血浆水平，而在取代疗法的情况中，还应当评估目的基因产物的生成。

可按照已经建立的方法制备用于再输注的转导细胞。参阅Abrahamsen等人，J.Clin.Apheresis，6：48-53，1991；Carter等人，J.Clin.Apheresis，4：113-117，1988；Aebersold等人，J.Immunol.Methods，112：1-7，1988；Muul等人，J.Immunol.Methods，101：171-181，1987；以及Carter等人，Transfusion，27：362-365，1987。培养大约2-4周后，细胞数目可能达到1×10⁶-1×10¹⁰。在这个方面，细胞的生长特征将因患者的不同和细胞类型的不同而变化。在再输注转导细胞前大约72小时，取小样分析表型和表达治疗剂的细胞所占百分比。

对于施用，在应用于群众和患者的全面健康时，可以以根据细胞类型的LD-50和细胞类型在各种浓度下的副作用所确定的速率来施用本发明细胞。可以通过单一或分开的药剂来进行施用。还可以使用刺激组织或空间内生成并排出成人干细胞的外源施用因子来带动成人干细胞迁移，可以包括但不限于骨髓或脂肪组织。可以在带动干细胞迁移的同时、之前和/或之后，或者在外周循环中的细胞数量对于期望的治疗终点是最理想的时候施用例示性糖缀合物。

G.过继免疫疗法

早就显示静脉内施用的LAK细胞主要在肺和肝中汇集(Lotze，M.T.等人，“The in vivo distribution of autologous human andmurine lymphoid cells grown in T cell growth factor(TCGF)-Implication for the adoptive immunotherapy of tumors”即“在T细胞生长因子(TCGF)中培养的自体人和鼠淋巴样细胞的体内分布-肿瘤过继免疫疗法的含义”，J.Immunol.，125：1487-1493，1980)，这可能归结于LAK细胞表面上的脱唾液酸决定簇与内皮细胞、Kupffer细胞、和肝细胞表面上的ASGP受体间的相互作用(Kolb等人，1979，见上文；Kolb-Bachofen等人，1984，见上文)，而且LAK疗法能够显著减小这些器官中的转移性肿瘤(Rosenberg，1987，见上文)。静脉内注射的鼠骨髓细胞、经过神经氨酸酶处理的淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞、和LAK细胞都享有这种相同的运输模式(Samlowski等人，1984，见上文；Samlowski等人，1985，见上文；Kolb等人，1979，见上文；Kolb-Bachofen等人，1984，见上文；Rolstad，B.等人，“Natural killer cell activity in the rat V.The circulation patternsand tissue localization of peripheral blood large granular lymphocytes(LOL)”即“大鼠V中的天然杀伤细胞活性。外周血大颗粒淋巴细胞(LOL)的循环模式和组织定位”，J.Immunol.，136：2800-2808，1986；Rosenberg，1987，见上文)。此外，所有这些细胞在其表面都具有脱唾液酸决定簇。Kradin，R.L.等人(“Tumor-derivedinterleukin-2-dependent lymphocytes in adoptive immunotherapy oflung cancer”即“肺癌过继免疫疗法中的由肿瘤衍生的、依赖白介素-2的淋巴细胞”，Cancer Immunol.Immunother.，24：76-85，1987)让患者在接受¹¹¹In标记的由肿瘤衍生的、依赖白介素-2的淋巴细胞(衍生自肺中的转移性腺癌)后进行伽马摄像机成像。衍生自人肿瘤的这些T“杀伤”细胞也移动至肝和肺。根据人LAK细胞在肝中的这种优先定位和它们杀伤肝细胞癌的能力，Hsieh等人(“Lysis ofprimary hepatic tumors by lymphokine activated killer cells”即“由淋巴因子激活的杀伤细胞对原发性肝肿瘤的消融”，Gut，28：117-124，1987)进行了这种肿瘤治疗的I期试验。还提出对于肝肿瘤的治疗而言，通过插入肝动脉的导管选择性施用LAK细胞和IL-2应当是一种有效的施用手段，这可能降低副作用的程度和范围(Fagan，E.A.等人，“Immunotherapy for Cancer：the use of lymphokine-activatedkiller(LAK)cells”即“癌症免疫疗法：由淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞的用途”，Gut，28：113-116，1987)。

人、大鼠、和小鼠肝显示可通过高亲和力肝脱唾液酸糖蛋白受体对切除唾液酸后由半乳糖残基构成的末端(即脱唾液酸糖蛋白)和老化的脱唾液酸红血球的识别而特异汇集、捕获、或“清除”脱唾液酸血清糖蛋白(如脱唾液酸转铁蛋白)(Ashwell，G.，“The role ofcell-surface carbohydrates in bingding phenomena”即“细胞表面糖类在结合现象中的作用”，在《Mammalian Cell Membranse》即《哺乳动物细胞膜》中，第4卷，Butterworth，伦敦，OX，1977；Asbwell等人，“Carbohydrate-specific receptors of the liver”即“肝的糖类特异受体”，Ann.Rev.Biochem.，51：531-554，1982；Harford等人，“The hepatic receptor for asialoglycoproteins”即“脱唾液酸糖蛋白的肝受体”，在《The Glycoconjugates》即《糖缀合物》中，第4卷，B部分，M.I.Horowitz编，Academic出版社，纽约，1982)。人、大鼠和兔ASGP受体显示实际上相同的特征：特异性、阳离子要求、最佳pH、亲和力、亚基大小、以及依赖温度的受体内在化和脱唾液酸配体降解(Dunn等人，“Low temperature selectively inhibitsfusion between pinocytotic vesicles and lysosomes during heterophagyof ¹²⁵I-asialofetuin by the perfused rat liver”即“在输注大鼠肝对¹²⁵I-脱唾液酸胎球蛋白的异噬过程中低温选择性抑制胞饮小泡与溶酶体之间的融合”，J.Biol.Chem.，225：5971-5978，1980；Schwartz等人，“Characterization of the ASGP receptor in a continuous hepatomaline”即“连续肝瘤系中ASGP受体的鉴定”，J.Biol.Chem.，256，8878-8881，1981；Ashwell等人，1982，见上文；Mueller等人，“Receptor-mediated endocytosis of asialoglycoproteins by rathepatocytes：receptor-positive and receptor-negative endosomes”即“由受体介导的大鼠肝细胞对脱唾液酸糖蛋白的内吞：受体阳性和受体阴性内吞泡”，J.Cell.Biol.，102：932-947，1986。在5-20℃，配体受体复合物不内在化；而在37℃，该复合物内在化并降解，而且受体以未损坏状态循环至细胞表面。Mueller等人，1986，见上文)。平均而言，包含225,000个受体的细胞每细胞每分钟能够使大约30,000个可溶性配体分子内在化；每个功能受体每八分钟能够结合一个配体并使之内在化(Schwartz等人，1982，见上文)。肝细胞与Kupffer细胞和肝内皮细胞共享脱唾液酸或GalNAc/Gal特异受体(Kolb-Bachhofen等人，1984，见上文)，而且肝瘤系HEPG2就这种受体而言已经充分鉴定(Schwartz等人，1981，见上文)。每个HEPG2细胞有150,000个高亲和力位点，而每个正常肝细胞有500,000个；二者的Kd都是大约7×10⁹M。由此，使用充分鉴定的脱唾液酸糖蛋白受体对细胞系诸如HEPG2的粘附作为体内粘附的体外模型(见下文实施例)是一种费用上有效且简单的系统，可用于确定体内运输研究中将遭遇的参数和可能的问题。

肠胃外施用脱唾液酸糖缀合物(如脱唾液酸胎球蛋白)以阻断脱唾液酸糖蛋白受体早已显示可通过阻断肝ASGP受体继而阻断这些细胞的肝汇集而将骨髓输注的效率提高5-10倍(Samlowski等人，1984，见上文)。考虑到LAK细胞在其表面上具有脱唾液酸决定簇，正如本文体外研究所示(见实施例5-16)，那么它们也最有可能在肝中通过ASGP受体摄取或汇集。这将导致能够参与肿瘤缩小或消融的LAK效应细胞循环数目的净损失。汇集的LAK细胞可能不能到达肿瘤。依照本发明，可以通过阻断肝ASGP受体来预防肝汇集。最后，通过静脉内施用脱唾液酸糖缀合物，或者用唾液酸酶或唾液酸转移酶修饰LAK细胞表面，可以消除这些细胞的肝汇集，继而提高LAK疗法的功效。这将容许在治疗过程中使用较少的LAK细胞或较少次数的LAK治疗或者甚至较少的IL-2，从而降低与LAK疗法有关的毒性。

理论上，LAK疗法应当是对于癌症治疗而言最安全且毒性最小的疗法之一；然而，它尚未达到期望目标(Rosenberg，1987，见上文；Durant，“Immunotherapy of cancer：The end of the beginning？”即“癌症免疫疗法：一开始就结束”，N.Eng.J.Med.，316：939-940，1987)。一些研究人员显示，LAK细胞还杀伤未经修饰的正常细胞，包括正常淋巴细胞、内皮细胞、和肝细胞，而其他研究人员的结果并不如此。通过增加循环“杀伤”细胞数目，从而改进这些细胞将遭遇定位于外周、而非主要在肝中汇集的肿瘤细胞的概率，本发明改进了LAK疗法的功效。因此，消除肝汇集应当能够改善LAK疗法对定位于肝以外器官的肿瘤的反应速率。预防LAK细胞的肝汇集还应当能够降低与这种疗法有关的严重毒性和肝损伤。另外，这还将降低由捕获的淋巴细胞对肝实质的自身免疫破坏引起的永久损伤的可能性(Kolb-Bachofen等人，1979，见上文；Anderson等人，“Toxicity ofhuman recombinant interleukin-2 in the mouse is mediated byinterleukin-activated lymphocytes”即“人重组白介素-2在小鼠中的毒性是通过由白介素激活的淋巴细胞介导的”，Lab.Investigation，59：598-612，1988)。

实施例

流程

在麻醉状态下(公共动物护理和使用委员会方案#AM87046-07)，将静脉内套管置于NOD-SCID小鼠的外部颈静脉中，从而能够静脉内有效投递¹¹¹In标记的干细胞。由麻醉状态苏醒后经口服施用泰诺林酏剂。用100-250μl溶于盐水的5％人血浆清蛋白悬浮经过简单放射性标记的CD34+细胞，并注射到套管中，然后用50μl清蛋白-盐水进行冲洗。通过核医学使小鼠成像。

小鼠：1-2月龄的NOD-SCID雌性小鼠(非肥胖性糖尿病/LtSz-scid/scid)来自缅因州巴港的杰克逊实验室。在专用隔离室中在微型隔离笼中饲养这些动物。空气经过HEPA过滤，而且在层流罩中在设备内操作动物。所有食物、衬垫、和水都经过灭菌。NOD-SCID小鼠理想的适合于异种移植肿瘤以及造血细胞和淋巴细胞的研究，因为它们的免疫功能不全，包括NK活性大大降低。参阅如Hogan等人，Biology of Blood & Marrow Transplantation，3：236-246，1997；Noort等人，Bone Marrow Transplantation，22增刊1：S58-60，1998。

试剂或细胞的所有施用都是通过静脉内或腹膜内进行的。

干细胞：由衍生自已故癌症患者的成分血干细胞收集产物分离CD34+干细胞。使用与磁珠(MACS分离柱，Miltenyi Biotec，奥本，加利福尼亚州)缀合的抗CD34抗体将它们纯化至95-99％纯度并冷藏。

通过FDA监控的付费骨髓捐献程序获得的人间充质干细胞(hMSC；PT-2501)购自Poietics Technologies，Bio Whittaker(Walkerville，马里兰州)。依照制造商的建议将细胞解冻，重悬，并在间充质干细胞基本培养基(MSCBM)中放射性标记。

施用的蛋白质：在含有0.16mM辛酸盐、10mM Tris、150mMNaCl，pH7.0的缓冲液中施用血清类粘蛋白(α-1-酸糖蛋白)和脱唾液酸血清类粘蛋白(ASO)。

麻醉和镇痛：每只20-30g小鼠腹膜内施用0.04ml啮齿类麻醉混合物(啮齿类混合物处方：1.5ml 50mg/ml氯胺酮、1.5ml 20mg/ml甲苯噻嗪、0.5ml 50mg/ml乙酰丙嗪)。如下所述腹膜内施用麻醉剂即啮齿类麻醉混合物：

1)用于手术-每只20-30g小鼠0.04ml，和

2)用于成像-每种20-30g小鼠0.02ml。

手术后镇痛：麻醉部分减弱后经口服施用泰诺林60μl/20g小鼠(6.10mg)。手术后立即经口施用镇痛剂即泰诺林60μl(6.10mg)/20g小鼠，或者在首次发现伤痛征候时施用。麻醉剂配方中所含的甲苯噻嗪也可作为镇痛剂。

手术流程(标准套管安置)：如上所述麻醉动物后，将用于缝合装满柠檬酸盐盐水的套管的线浸泡在70％乙醇中。用操作台上的纸带固定经过麻醉的动物，腹部向上。将锁骨以下至耳的区域刮毛。用Betadine清洁刮毛区域，并用70％乙醇冲洗。在右颈部由肋骨架上部至颌骨垂直切开皮肤以暴露胸锁乳突肌，外部颈静脉就在下面。为了清楚暴露手术区，用线钩(用小重物固定)拉紧皮肤。这不应扭曲下面的组织，但是应当稳定区域以便于观察和插入套管。使用显微镊清除静脉上面的脂肪和筋膜。使用4O丝质手术缝合线打一个半结以截断上腔静脉中的循环。用夹紧的止血钳固定线的一头。将第二根线绕着静脉底部成环，打一个半结而无需拉紧。一旦将套管插入外部颈静脉后，此环用于固定套管。用显微剪在静脉表面割一个小口。将套管插入静脉，斜面向上。使套管沿对角线向下滑动直至锚与静脉壁齐平，并扎紧下面的结。通过推动盐水穿过它来测试套管。确认没有泄漏后完成下面的结。用上面的线绕着套管打一个全结。监测套管中的盐水水流。用上面的线从下面穿过，抓住组织，并用这根线绕着套管再打一个结。用上面的线和下面的线的末端打一个全结。这固定了绕过套管套筒的上面和下面的线以预防意外逐出。夹紧套管，除去注射器。将套管置于颈部皮肤的下面，并在旋转动物(背部向上)的同时由颈背紧贴枕部下面取出。在接近出口的适当位置，用自动小夹钉住套管的热收缩部分。将套管切成合理长度(1.5-2.0英寸)，并塞入一个线团。将动物翻身到其最初位置并用自动小夹封闭颈部，小心不要刺破套管。

手术流程(达芬奇微口血管系统套管安置)：达芬奇微口血管系统(Da Vinci Biomedical，南兰开斯特，麻萨诸塞州)是能够早在运输实验前两周就植入而无明显损失的封闭注射路径。本质差异是端口不像以前那样外在的。这消除了由咀嚼和抓搔引起套管污染和损坏的额外风险。

在最初的切割前用Betadine清洁切割部位。然后将小鼠绑在手术台上(背部向上)。做3-4mm的切口。接着，在胸部做4-5mm切口。由后面的切口至前面的切口做一通道，用于由背至胸插入套管。推动肝素穿过套管。然后使用止血钳拉出套管。由背部组织松松的扯起皮肤以放置端口。将端口缝合在脖子上部中间的组织下面。使用三联结在两个位置进行缝合。接着，翻转小鼠使之背部向下、胸部向上。然后以一定角度切断套管，使得至少1mm且至多2mm套管插入颈静脉。除去一些脂肪和组织后，分离胸腔中的颈静脉。将小鼠的四肢向下绑在两侧，因为这促使胸部向上并进一步暴露颈静脉。一旦分离出颈静脉，围绕它放置两条缝合线。结扎静脉顶端，要求足以减缓血流，但又不完全止住血流。下面的结距离顶端1-2mm，而且不扎紧。下面的结稍后用于固定套管的位置并止住颈静脉的过度出血。接着，在颈静脉上在两个结之间做一个小切口，从而能够将套管插入静脉。一旦将套管置于静脉中，将下面的结围绕静脉中的套管扎紧。接着，注入肝素穿过套管，检查套管是否泄漏。确认没有泄漏后，关闭这两个切口。

¹¹¹铟-oxine标记流程：使用用于标记自体淋巴细胞的AmershamHealthcare流程的改版进行成人CD34+或间充质干细胞(hMSC¹¹¹In-oxine标记。

收集组织用于组织病理学：安乐死后收集组织。一小时成像后，收集器官，并将器官的一半在10％中性缓冲福尔马林中固定，将另一半在OTC中冷冻用于冰冻切片。本文呈现的影像来自固定化组织。

用于收集小鼠组织的尸检流程：首先由颈前区域至耻骨边缘沿中线切开皮肤，然后沿着白线由胸骨至耻骨剖开腹部，沿着接近尾部的肋骨切开从而侧向翻开腹壁。首先在大约肋骨软骨接合的水平切断肋骨从而翻开胸骨，然后根据需要切开横膈膜和心包。首先延伸翻开的胸骨至包括腹侧颈肌以暴露气管。在颈中区域切断气管和食道并向后翻开，根据需要切断粘连以全部取出胸廓脏器。取出胸廓脏器后，解离出整个心脏并浸泡在10％中性缓冲福尔马林中。浸泡后，用锯齿状组织镊轻轻按摩心脏，迫使固定剂进入心腔。然后将气管连同连接的肺浸泡在固定液中，无需进一步解离。将脾暴露，切断网膜粘连，取出整个脾并浸泡在福尔马林固定液中。首先切断直肠并翻开内脏，同时根据需要切断粘连，从而取出胃和肠道。取出整个肝并整个浸泡在福尔马林固定液中。取出肾并整个浸泡在福尔马林固定液中。将胰与前面的十二指肠切开，并浸泡在福尔马林固定液中。

用于石蜡处理和切片的组织的修整：将心脏置于修理板上，右心室在上，而左心室在下、贴着修整板。由上至下做一个切口，穿过右心室和心房以及心脏底部的大血管，继续穿过室间隔和左心腔，得到大致相等的两半。将每一半置于分开的包埋盒中，盒中装有固定液饱和过的泡沫垫，并标上“心脏1”和“心脏2”。将整个左肺和右肺与中间组织分开，并平放在盒中固定液饱和过的泡沫垫上，标上“左肺”和“右肺”。由右侧和中间肝叶获取肝切片并置于适当标记的盒中。以相似方式切割并处理左侧和中间肝叶。将整个脾置于适当标记的包埋盒中，定向是长边在下，利用弯曲来增加最初切片的面积。对于一个肾，由肾的中点获取整冠切片。对另一个肾进行纵向切片。将两个切片置于一个盒中。将收集的胰置于适当标记盒中的福尔马林饱和泡沫垫上。

成像流程：核医学。使用啮齿类麻醉混合物将NOD-SCID小鼠麻醉。一旦麻醉，将小鼠置于泡沫塑料半圆柱体小鼠定位装置(MPD)上，并用圆筒短袜覆盖。与将小鼠置于平台上相比，MPD能够更好的在视觉上分开肺与肝。放置小鼠的泡沫塑料和覆盖小鼠的圆筒短袜维持舒适的温度，从而容许更长时间的成像而无需额外麻醉。将MPD置于西门子E.Cam伽马摄像机的两个镜头之间的窄台上，并以2-D或SPECT静态或动态成像。使用⁵⁷Co-斑点标记物来标记解剖学位置(鼻、尾、套管、等)。使用西门子ICON系统对目的区域或注射剂量百分比分析数据(如肝、脾、心脏)。

CT成像：使用Arata，L.，“Clinical Uses for Medical ImageRegistration：Experiences at Three Hospitals”即“医学成像记录的临床用途：三家医院的经验”，PACMEDTec檀香山讨论会记录，夏威夷，1998年8月17-21日和Nelson等人，Electromedica，68：45-48，2000描述的方法，进行CT扫描(G.E.医学系统高速螺旋隧洞)以评估肿瘤，而且能够记录/比对核医学影像与CT影像，以确定注射的放射性标记干细胞的准确位置。在核医学成像过程中动物仍处于麻醉状态下进行CT扫描。在核医学扫描之前或之后，立即将麻醉的动物转移到CT上。通常每只动物只进行一次CT。通过将CT影像与核医学SPECT影像融合，从而将CT用于在解剖学上准确定位放射性标记的物质。

使用西门子E.Cam双镜头伽马摄像机的伽马摄像机成像监测下文实施例中所描述的所有人干细胞的体内运输模式。将小鼠置于小鼠定位装置(Mouse Positioning Device，MPD)上，并置于成像台上的探测器之间。

实施例1：静脉内施用的ASO将人CD34+导向心脏

脱唾液酸血清类粘蛋白(ASO)/高剂量HSC：若在输注5.75×10⁶个HSC之前先施用3.3mg ASO，则输注后立即能在心脏中发现有77±1％的注入细胞，1.5小时时心脏区域中保留了75±5％，24小时时下降到52±1％。

对来自缅因州巴港的杰克逊实验室的2月龄NOD-SCID雌性小鼠(非肥胖性糖尿病/LtSz-scid/scid)通过颈外静脉套管静脉内施用5.75×10⁶个¹¹¹In-标记的人CD34+(hCD34+)外周血干细胞。通过静脉内施用3.3mg脱唾液酸血清类粘蛋白(ASO)对小鼠进行预处理后，施用放射性标记的CD34+干细胞。使用西门子E.Cam双镜头伽马摄像机通过伽马摄像机成像追踪体内运输模式，从注射后立即开始直至输注后36小时。由衍生自已故癌症患者的成分血干细胞收集产物分离人CD34+。使用与磁珠(MACS分离柱，Miltenyi Biotec，奥本，加利福尼亚州)缀合的抗CD34抗体将它们纯化至95-99％纯度并冷藏。

在ASO后施用的放射性标记CD34+干细胞立即移动到心脏。利用放置在套管水平的⁵⁷Co-点来源方便了解剖学定位。在1.5小时时多达79.2％的注射剂量位于心脏中。根据输注后追踪影像，这些细胞早期尚未移动到肝和脾，但在24小时后可在肝中找到。然而，24小时时最初注射剂量的51.6-53.2％仍保留在心脏中。在36小时时进行套管在体内时的摄像和除去套管并放置在处死动物旁的摄像。这些影像显示了注射细胞并未被捕获在套管里，而确实是在心脏中。

实施例2：静脉内施用的O使人CD34+细胞移动至肝和脾而非心脏中

血清类粘蛋白/高剂量HSC：若在输注5.75×10⁶个HSC之前先施用5.5mg血清类粘蛋白，则输注后立即能在肝和脾中发现有74±3％的注入细胞，1.5小时时肝区域中保留了74±4％的细胞，24小时时下降到63±1％。

重复实施例1中所述的制备和流程。

对来自缅因州巴港的杰克逊实验室的2月龄NOD-SCID雌性小鼠(非肥胖性糖尿病/LtSz-scid/scid)通过颈外静脉套管静脉内施用5.75×10⁶个¹¹¹In-标记的人CD34+(hCD34+)外周血干细胞。通过静脉内施用5.5mg血清类粘蛋白(O)对小鼠进行预处理后，施用放射性标记的CD34+干细胞。

如实施例1中所述对小鼠进行成像并监测放射性标记的hCD34+细胞的生物学分布。在O后施用的放射性标记hCD34+立即移动到肝/脾区域并在该处保留至36小时。利用放置在套管水平的⁵⁷Co-点来源方便了解剖学定位。肝/脾区域的定位的范围为输注后的76.3％至24小时时的63.6％。在心脏的区域内没有发现¹¹¹In-标记的细胞。

在36小时时进行套管在体内时的摄像和除去套管并放置在处死动物旁的摄像。这些影像显示了注入细胞并未被捕获在套管里。发现放射性位于套管放置处或以下，即在肝/脾区域内。

实施例3：O使Hcd34+细胞移动至肝/脾，而无显著的向心脏移动

血清类粘蛋白/低剂量HSC：若在输注0.5×10⁶个HSC(先前细胞剂量的十分之一)之前先施用11mg血清类粘蛋白，则输注后立即能在肝和脾中发现有43±2％的注入细胞，1小时时肝区域保留了40±3％的细胞。

重复实施例1中所述的制备和流程。对来自缅因州巴港的杰克逊实验室的2月龄NOD-SCID雌性小鼠(非肥胖性糖尿病/LtSz-scid/scid)通过外部颈静脉套管静脉内施用0.5×10⁶个¹¹¹In-标记的人CD34+(hCD34+)外周血干细胞。通过静脉内施用11.0mg血清类粘蛋白(O)对小鼠进行预处理后，施用放射性标记的CD34+干细胞。

如上所述对小鼠进行成像并监测放射性标记的hCD34+细胞的生物分布。在注射后约1小时，处死小鼠并收集器官，将器官的一半在10％中性缓冲福尔马林中固定。对人CD34细胞进行免疫组织化学染色并通过原位杂交使人DNA显影后，用显微镜检查组织切片。在输注后最初十分钟和一小时进行的核医学监测显示了放射性标记的hCD34+细胞定位于肝/脾区域。

对CD34进行免疫组织化学染色后心脏的显微镜检查证明了心脏内血管中存在hCD34+细胞。在肺中肺泡隔膜中可以看到一些hCD34+细胞。在肝窦状隙内可以看到具有干细胞形态的细胞簇。人DNA的原位杂交清楚显示了在心肌或室间隔中没有hCD34+细胞，但肺中有。

实施例4：先ASO后O可将hCD34+细胞导向心脏和肺中而非肝/脾区域

脱唾液酸血清类粘蛋白(ASO)+血清类粘蛋白(O)/低剂量HSC：在注入的ASO引起HSC定位于心脏时，将方案改成在大剂量ASO后追加大剂量血清粘蛋白，以测试HSC在心脏中的积累是否维持。若在注入0.5×10⁶个HSC之前先施用3.3mg ASO，然后5.5mg血清类粘蛋白，则HSC再次在心脏集中。这造成44±5％的注入细胞在输注后立即在心脏中积累。1小时时心脏中保留了37±3％的注入细胞。虽然注入细胞在心脏中的百分数从实施例1所示的约75％减少到了此实施例的44％，但是心脏中的定位仍是细胞的主要集中信号。

重复实施例1中所述的制备和流程。对来自缅因州巴港的杰克逊实验室的2月龄NOD-SCID雌性小鼠(非肥胖性糖尿病/LtSz-scid/scid)通过外部颈静脉套管静脉内施用0.5×10⁶个¹¹¹In-标记的人CD34+(hCD34+)外周血干细胞。通过静脉内施用3.3mg ASO及随后的5.5mg O对小鼠进行预处理后，施用放射性标记的CD34+干细胞。

如实施例1所述对小鼠进行成像并监测放射性标记的hCD34+细胞的生物学分布。在注射后最初10分钟和1小时进行的核医学监测显示了放射性标记的hCD34+细胞定位于心脏中。

在注射后约1小时时，处死小鼠并收集器官，将器官的一半在10％中性缓冲福尔马林中固定。

对CD34细胞进行免疫组织化学染色后对心脏进行的显微镜检查揭示了室间隔中的hCD34+细胞簇，以及那些簇中形态上与染色细胞相似但是CD34阴性的细胞。这些影像反映了核医学研究所描绘的生物学分布。原位杂交显著证明了hCD34+细胞在存在于心脏中。CD34的免疫组织化学染色和人DNA的原位杂交都证明了注入的干细胞定位于肺中，而且很容易在肺泡隔片、血管、和其它结构中看到。DNA的检测揭示了肺和心脏中存在的细胞比CD34染色所预测的多得多。在肝、脾或肾中没有找到hCD34+细胞或形态类似hCD34+细胞的细胞。

实施例5：在5％人血清白蛋白中施用的HSC(不含血清类粘蛋白或ASO)主要移动至肺

血浆白蛋白/高剂量HSC：在未预先注入蛋白质的情况下通过导管施用HSC时，0小时时在肺中发现有78±13％的注入细胞，1小时时是54±10％，12小时时是50±13％。对同样处理的小鼠的肺进行的组织学检查证明了注入细胞位于肺泡隔片和血管系统中。

通过植入2月龄雌性NOD-SCID小鼠外部颈静脉中的套管静脉内施用0.1ml含5％人血清白蛋白的盐水中的2.7×10⁶个¹¹¹In-标记HSC。如实施例1所述对小鼠进行成像并监测放射性标记的hCD34+细胞的生物学分布。

在含5％人血清白蛋白的盐水中施用的放射性标记HSC立即移动至肺。利用位于肩胛骨和鼻下面套管出口位置水平的⁵⁷Co点源方便了地对经标记细胞进行解剖学定位。此外，通过CT全身扫描、横向和冠状切片证实了导管处的位置标记物处于隔膜处。套管出口位置处的夹子作为界标。在鼻标记的下面和套管标记的上面看到了肺，在套管标记的下面看到了肝和脾。在最初成像时多达95.4％的注入细胞定位于肺中(表1)。在四只小鼠中，最初成像时肺中的细胞占到了全身掺入细胞的52.6-95.4％。1小时时，HSC主要定位于肺中，血液循环中能够看到一些计数。在一只小鼠中，在1小时时在套管标记下面看到一些定位，这可能是肝和脾；然而，轮廓不清楚。12小时时，在该小鼠中，在肝/脾区域中发现了放射性标记的CD34+干细胞。然而，在12小时成像时，在其它动物的肺中仍保留了最初注入剂量的34.7％以上(范围为34.7-68.5％)的。

尽管注射后(起始或0小时时间点)肺中的定位随动物而变化，但是肺的最初定位与随后扫描中保留的百分数更为恒定。1小时时使用背部成像，肺区域保留了最初定位于肺的细胞的72.1-75.5％。12小时时使用背部成像，在成像的三只小鼠中，肺中保留了最初肺掺入的78％、72.1％和50.5％。

实施例6：血清类粘蛋白使MSC导向心脏

血清类粘蛋白/低剂量MSC：若在输注人间充质干细胞(0.56×10⁶个细胞)之前先施用11mg血清类粘蛋白，则0小时时在心脏中发现有68±7％的注入细胞，1小时时则有61±3％。

MSC来自Bio Whittaker(Poietics Division，冷藏的PT-2501，＞750,000个细胞/安瓿)并如上文实施例所述用¹¹¹In标记，只是在含5％人血清白蛋白(HSA)的基本干细胞培养基(Poietics)中标记、清洗、和注射MSC。对2月龄雌性NOD-SCID小鼠通过植入外部颈静脉的达芬奇微端口血管系统套管施用0.21ml含5％人血清白蛋白(HSA)的基本干细胞培养基中的0.56×10⁶个¹¹¹In标记的人间充质干细胞(MSC)。就在施用MSC前，静脉内施用0.2ml中的11.0mg血清类粘蛋白。

如实施例1所述对小鼠进行成像并监测放射性标记的MSC细胞的生物学分布。在最初(0小时)和输注后1小时时进行的伽马摄像机监测显示放射性标记的MSC定位于心脏区域。对目的区域影像的分析揭示了注入的放射性中大约61.7-75.5％最初定位于心脏，而且1小时时仍有大约58-64％的注入细胞保留在该区域。通过CT扫描(冠状切片)确认了套管、膈膜、心脏、肺、和肝的定位。原位杂交显示人细胞主要位于心脏中而非肝中。

实施例7：先ASO后血清类粘蛋白将MSC导向肝/脾

MSC来自Bio Whittaker(Poietics Division，冷藏的PT-2501，＞750,000个细胞/安瓿)并用¹¹¹In标记。如实施例6所述，在含5％人血清白蛋白(HSA)的基本干细胞培养基(Poietics)中标记、清洗、和注射MSC。

脱唾液酸血清类粘蛋白(ASO)+血清类粘蛋白/低剂量MSC：此实施例设计用于比较低细胞剂量下MSC与HSC(实施例4)的运输，因此采用实施例4中所使用的顺序注入ASO和血清类粘蛋白。在注入人间充质干细胞(0.56×10⁶个细胞)之前先顺序输入4.3mg ASO和5.5mg血清类粘蛋白。0小时时在肝和脾中发现有63±5％的注入细胞，1小时时则有57±7％。

在0.21ml含5％人血清白蛋白(HSA)的基本干细胞培养基中静脉内施用0.56×10⁶个¹¹¹In标记的MSC。在施用MSC之前，静脉内施用含4.3mg ASO的0.1ml，随后施用含5.5mg血清类粘蛋白的0.1ml。ASO、血清类粘蛋白和MSC都是通过植入外部颈静脉的达芬奇微端口血管系统套管施用于2月龄雌性NOD-SCID小鼠的。

如实施例1所述对小鼠进行成像并监测放射性标记的MSC细胞的生物学分布。最初和输注后1小时的伽马摄像机监测显示放射性标记的MSC位于肝/脾区域。对目的区域最初影像的分析揭示了所注入放射性的大约59.2-66.7％定位于肝/脾，而且1小时时仍有大约51.9-61.1％的注入细胞保留在该区域。

通过CT扫描确认了套管、膈膜、心脏、肺、和肝的定位。原位杂交确认了伽马摄像机生物学分布数据。含人DNA的细胞主要发现于肝中。

实施例8：单用盐水、单用RPMI-1640、或含5％人血清清蛋白(不含血清类粘蛋白或ASO)的盐水施用的MSC移动至肺和肾

MSC来自Bio Whittaker(Poietics Division，冷藏的PT-2501，＞750,000个细胞/安瓿)并用¹¹¹In标记。如实施例6所述，单用盐水、单用RPMI-1640培养基(GIBCO BRL，格兰德岛，纽约州)和含5％人血清白蛋白(HSA)的盐水标记、清洗、和注射MSC。

单用盐水-单用0.20ml盐水静脉内施用1.14×10⁶个¹¹¹In-标记的MSC。MSC是通过植入于2月龄雌性NOD-SCID小鼠外部颈静脉的达芬奇微端口血管系统套管施用的。

如实施例1所述对小鼠进行成像并监测放射性标记的MSC细胞的生物学分布。最初的输注后伽马摄像机监测显示放射性标记的MSC位于肺区域。对目的区域最初影像的分析揭示了所注入放射性的95％定位于肺。1小时时，分别有87％和4％定位于肺和肾；24小时时，分别有61％和13％定位于肺和肾；而48小时时，则分别有59％和14％定位于肺和肾。

通过CT扫描确认了套管、隔膜、心脏、肺、和肝的定位，而⁵⁷Co-斑点标记物则用于标记解剖学位置(鼻、尾部、套管等)。

单用RPMI-1640溶液-单用0.20ml RPMI-1640溶液静脉内施用1.14×10⁶个¹¹¹In-标记的MSC。MSC是通过植入于2月龄雌性NOD-SCID小鼠外部颈静脉的达芬奇微端口血管系统套管施用的。

如实施例1所述对小鼠进行成像并监测放射性标记的MSC细胞的生物学分布。最初的输注后伽马摄像机监测显示放射性标记的MSC位于肺区域。对目的区域最初影像的分析揭示了所注入放射性的大约95％定位于肺。1小时时，分别有74％和7％定位于肺和肾；24小时时，分别有69％和9％定位于肺和肾。

通过CT扫描确认了套管、隔膜、心脏、肺、和肝的定位，而⁵⁷Co-斑点标记物则用于标记解剖学位置(鼻、尾部、套管等)。

含5％人血清白蛋白(HSA)的盐水-用0.20ml含5％HSA的盐水静脉内施用1.14×10⁶个¹¹¹In-标记的MSC。MSC是通过植入于2月龄雌性NOD-SCID小鼠外部颈静脉的达芬奇微端口血管系统套管施用的。

如实施例1所述对小鼠进行成像并监测放射性标记的MSC细胞的生物学分布。最初的输注后伽马摄像机监测显示放射性标记的MSC位于肺区域。对目的区域最初影像的分析揭示了所注入放射性的94％定位于肺。1小时时，分别有87％和2％定位于肺和肾；24小时时，分别有59％和11％定位于肺和肾；而48小时时，则分别有57％和14％定位于肺和肾。

结果

下文表1总结了上文所述实验的结果。

表1.实施例1-8的结果总结

干细胞/蛋白质大剂量肺中注入细胞的百分数肝/脾中注入细胞的百分数心脏中注入细胞的百分数肾中注入细胞的百分数HSC/无蛋白质0小时时78±3％；12小时时54±10％HSC/血清类粘蛋白0小时时74±3％1.5小时时74±4％24小时时63±1％HSC/ASO0小时时77±1％1.5小时时75±5％24小时时52±1％MSC/无蛋白质0小时时95％1小时时87％24小时时61％[大多数在0小时，Gao等人，Cells，Tissues，Organs，169：12-20，2001][48小时时相当多，Gao等人，Cells，Tissues，Organs，169：12-20，2001]1小时时4％24小时时13％48小时时14％MSC/血清类粘蛋白0小时时68±7％1小时时61±3％MSC/ASO0小时时63±5％1小时时57±7％

实施例9

以下实验的主要目的是确定人LAK细胞群是否通过ASGP受体特异结合人肝瘤细胞，如果是这样，那么确定如何操纵此细胞识别系统来使淋巴细胞具有靶向。一般实验方案使用相似的含唾液酸-脱唾液酸血浆蛋白质在体外系统中模拟与携带ASGP受体的肝细胞的接触，正如图5所示。

NK/LAK与人最小偏差肝细胞瘤单层的粘附活性

将对照细胞(未经IL-2处理)或LAK细胞(经过IL-2处理的人外周血淋巴细胞，用10U IL-2/ml培养了3天)于4℃粘附至HEP G2细胞单层达2小时。用培养基中的脱唾液酸胎球蛋白(ASF，200μg/ml)或培养基中的胎球蛋白(F，对照，200μg/ml)预处理单层细胞。将对照或LAK细胞在单层细胞上进行保温后，将这些细胞轻轻倒出、清洗、并测试在⁵¹Cr-释放测定法中针对NK耐受性靶Raji的细胞毒性能力。E∶T比例是40∶1、20∶1、10∶1、和5∶1；显示了平均值的标准误差；将E∶T比率对LOG E∶T作图。图6图示了结果。

结论：通过将这些细胞在经过对照(完全唾液酸化)蛋白质胎球蛋白(不阻断ASGP受体)处理的HEPG2单层上保温，LAK活性降低了大约50％。将这些细胞在经过脱唾液酸胎球蛋白(以阻断ASGP受体)预处理的HEPG2单层上保温未能消除LAK活性。LAK或对照制剂在与胎球蛋白或脱唾液酸胎球蛋白(200μg/ml)于4℃保温2小时后具有与未处理LAK细胞群相同的活性。这些数据支持这样的观点，即LAK细胞结合肝ASGP受体，而且这种结合可以通过用脱唾液酸胎球蛋白阻断这种受体而得到抑制。这一发现的延伸是LAK细胞的肝汇集至少部分归结于ASGP受体，而且施用脱唾液酸糖缀合物诸如脱唾液酸胎球蛋白能够预防这种捕获并改变LAK细胞运输。

23℃时对HEPG2(ASGP受体阳性，“ASGPR+”)和CAKI-2(ASGP受体阴性，“ASGPR-”)的粘附

此实验与上文相同，只是对单层的粘附是在23℃而非4℃进行2小时。使用了两种单层：HEPG2，一种ASGPR+细胞系；和CAKI-2(人肾细胞癌)，一种ASGPR-细胞系。使用的效应细胞群是：未处理的3日龄LAK制剂(LAK)和用霍乱弧菌神经氨酸酶处理的相同细胞群(LAK/NS)(30mU/1×10⁷个细胞/200μl)。经过神经氨酸酶处理的细胞群是脱唾液酸阳性淋巴细胞对照。不管是否经过处理，所有细胞群在测定时的存活率都大于90％。将每种效应细胞群在单用培养基、200μg/ml ASF或F中保温作为对照。所有效应细胞都在RAJI(LAK敏感靶；NK不敏感靶)或K562(NK/LAK敏感靶)上进行测定；E∶T比例和图解显示与上文相同。

结果：上面的实验给出了下面结果(见图6-8)。对于下面的讨论，对RAJI的活性将称为“LAK”活性；对K562的活性将称为“IL-2激活的NK”活性。一些研究人员认为NK和LAK识别并杀死使用相同靶结构的靶细胞(新鲜和培养的肿瘤细胞)。

(1)将未经处理(LAK)或经过处理(LAK/NS)的效应细胞与ASF或F预保温不影响效应细胞杀伤RAJI或K562细胞的能力。

(2)神经氨酸酶处理增强了LAK对RAJI的活性，但不增强IL-2激活的NK对K562的活性(见图11和12)

(3)经过或未经过神经氨酸酶处理的IL-2激活的NK对HEPG2的粘附在23℃可被ASF部分抑制，但不被F抑制。(图7和8)

(4)LAK活性对HEPG2的粘附在23℃可被ASF或F抑制。(图9和10)

(5)经过神经氨酸酶处理的细胞群的LAK活性对HEPG2的粘附只能略微被ASF抑制，而不能被F所抑制。(图10)

(6)IL-2激活的NK或LAK活性对CAKI-2的粘附在23℃不被ASF或F抑制。(图7-10)

结论：LAK活性(在RAJI靶细胞上进行测定)和IL-2激活的NK活性(在K562靶细胞上进行测定)展示对ASGPR+细胞系HEPG2有不同粘附特征。在23℃使用ASF时，LAK活性对HEPG2的粘附不受抑制；而IL-2激活的NK活性对HEPG2的粘附则被部分抑制。在4℃时，事实上所有LAK活性都可受到ASF抑制而不能粘附于HEPG2单层。对CAKI-2(ASGPR-)单层的粘附则不会在23℃被ASF阻断。

这些数据说明，对HEPG2单层的粘附部分是由ASGP受体介导的，而对CAKI-2单层的粘附则不涉及此受体。一种可行的假设是LAK/NK细胞通过至少两种或识别结构而结合HEPG2：1)ASGPR，它结合LAK/NK细胞群上的脱唾液酸决定簇；和2)针对靶表位的“LAK”或“NK”识别结构。前者应当可被ASF抑制；后者则不应当如此。与CAKI-2(ASPGR-)的结合不应受到ASF的抑制，这归结于与靶表位结合的LAK/NK细胞识别结构。这一点可以通过实验数据(见下文)得到进一步的支持，在该实验中，向针对经标记靶CAKI-2的LAK效应细胞的⁵¹Cr-释放测定法中添加了250μg/孔的ASF或F。即使在1mg/ml的浓度，ASF也未抑制LAK杀伤CAKI-2靶的能力。

根据Schwartz等人，“Characterization of the ASGP receptor ina continuous hepatoma line”即“ASGP受体在连续肝瘤系中的表征”，J.Biol.Chem.，256：8878-，1981；Schwartz，A.L.等人，“Recyclingof the ASGP receptor：biochemical and immunocytochemicalevidence”即“ASGP受体的循环：生物化学和免疫细胞化学的证据”，Phil.Trans.R.Soc.Lond.，300：229-235，1982，ASGPR在23℃时发生再循环，而在4℃时则不会如此。在抑制粘附的能力方面所看到的差异可以由ASGPR再循环的温度依赖性来解释，还可能是靶细胞上的LAK识别结构所致。在4℃时通过ASGPR或LAK识别结构的LAK：靶细胞结合都可能具有与23℃时不同的配体亲和力，或者，能在温度升高时，其它粘附分子能够增强效应细胞：靶细胞相互作用。即，在4℃时，HEPG2上以任何可观亲和力结合LAK的唯一受体是ASGPR，而此静态受体在此温度下能够容易的受到其配体ASF的抑制。在23℃时，不仅是ASGPR介导LAK细胞结合靶细胞；在存在配体ASF时，ASGPR进行再循环，至少将LAK识别结构留给靶细胞，并可能以其它次级粘附分子“巩固”相互作用。

这些数据还说明LAK(在RAJI上进行测定)和IL-2诱导的NK(在K562上进行测定)细胞对HEPG2的粘附有不同亲和受体或不同结合/解离速率。

理论上，神经氨酸酶处理应当增了LAK细胞与HEPG2单层的结合，因为通过这种处理生成了额外数目的脱唾液酸决定簇，但事实并非如此。如果脱唾液酸决定簇的数目早就足以占据HEPG2上最大数目的ASGPR，那么增加这些决定簇的数目将不会改变最终的结果。还有可能存在涉及结合的特定脱唾液酸决定簇，而且生成更多但无关的决定簇并不会增强粘附。这提出了一种有趣的可能性，即LAK和IL-2激活细胞群可能在参与这种HEPG2粘附的配体上有所不同。

LAK细胞杀伤肿瘤靶的作用在靶的预处理中或添加到⁵¹Cr-释放测定法中不被ASF或F阻断

因为脱唾液酸决定簇可能在LAK-靶细胞相互作用和LAK运输及肝粘附中都发挥作用，所以确定在体内使用脱唾液酸糖蛋白试剂来改变运输模式是否也抑制细胞毒性活性从而使得这种操作达不到预定效果是重要的。在测定中向预保温的靶细胞中添加250μg/孔的脱唾液酸胎球蛋白或胎球蛋白并不阻断LAK杀伤肿瘤靶CAKI-2。LAK制剂是标准的5日制剂；然而，使用3日制剂也重复了这些数据。(从一式四份样品测定特异释放百分比，这些样品每分钟原始计数的差异小于10个百分点；测定过程进行了标准的4小时保温。)

表2.CAKI-2靶的⁵¹铬释放百分比

测定中添加的试剂 40∶1 20∶1 10∶1 5∶1培养基 48 49 23 14F 58 42 27 16ASF 52 41 24 13

自发释放(单用培养基)：2183cpm。

自发释放(单用胎球蛋白)：2267cpm。

自发释放(单用脱唾液酸胎球蛋白)：2147cpm。

总释放量：30600cpm。

用神经氨酸酶或2，3-和2，6-唾液酸转移酶修饰细胞表面后NK/LAK活性的粘附

以每10⁷个细胞30mU霍乱弧菌神经氨酸酶、0.48mU 2，3-或10mU2，6-唾液酸转移酶的量处理(依照B.1.2.3&1.2.4中的方案)在AIM-V培养基(Gibco)培养的5日LAK制剂(20U/ml；1个Dupont单位＝44.5个BRMP单位)。将一些效应细胞在培养基即含10％PBS的RPMJ 1640中于23℃保温2小时。将来自未经处理的LAK、经过神经氨酸酶处理的LAK、经过2，3-或2，6-唾液酸转移酶处理的LAK的2×10⁷个效应细胞悬浮于15ml培养基中，并在HEPG2(ASGPR+)或CAKI-2(ASGPR-)单层上于23℃保温2小时。每15分钟摇动培养瓶。除了未粘附细胞对照，还轻轻倒出这些单层上的未粘附细胞，并针对K562和RAJI进行测定。图11-16显示了结果。所用E∶T比例是40、20、10和5比1。

结果：小结见上文表2。图11-16图解了这些数据。

(1)IL-2激活的NK(杀伤K562靶)不受任何细胞表面修饰的影响(图11、12和13，顶部的4条虚线)；而LAK活性(杀死RAJI)得到神经氨酸酶处理的显著增强(图12、15和16)，但不受2，3-或2，6-唾液酸转移酶处理的影响(图15和16)。

(2)与未经处理的LAK相比，LAK细胞表面的修饰没有改变对CAKI-2的粘附(在RAJI上进行测定)(图15)。相反，神经氨酸酶处理促进IL-2激活的NK活性对CAKI-2的粘附(图14，底部实线；在K562上进行测定)，用2，3-唾液酸转移酶进行的处理也是如此(图14，神经氨酸酶上面的实线)。用2，6-唾液酸转移酶进行的处理不影响LAK或IL-2激活的NK对CAKI-2的粘附。

(3)细胞表面修饰没有显著改变LAK活性对HEPG2的粘附(图15)；然而，2，6-唾液酸转移酶处理显著促进IL-2激活的NK的粘附(图13，底部实线)；而相反的是，2，3-唾液酸转移酶处理显著防止了这些细胞粘附HEPG2(图13，顶部实线)。

结论：IL-2激活的NK杀伤和LAK受到神经氨酸酶处理的不同影响。

IL-2激活的NK对HEPG2的粘附因细胞表面修饰而改变；LAK粘附不受这些修饰的影响。这可能归结于可以添加到LAK细胞表面的唾液酸的量，这可以通过2，3-和2，6-唾液酸转移酶的剂量应答来测定。

IL-2激活的NK对HEPG2的粘附在23℃能够被ASF部分抑制(先前有过报告)，也可通过由2，3-唾液酸转移酶添加唾液酸来抑制(而2，6-唾液酸转移酶处理促进粘附)。

有必要确定在23℃或甚至37℃时添加更高浓度的ASF(或另一种脱唾液酸化合物，如脱唾液酸GM1-糖)作为ASGPR再循环的补偿手段是否能够防止IL-2激活的NK或LAK的粘附。同样的，用2，3-和2.6-唾液酸转移酶进行剂量应答实验以实现最大量添加唾液酸可能能够剖析粘附机制，因为每种酶添加至不同的结构：2，3-唾液酸转移酶添加至与丝氨酸/苏氨酸连接的O-连接糖，而2，6-唾液酸转移酶添加至与天冬酰胺连接的N-连接糖。这些糖基转移酶在区别对IL-2激活的NK(杀伤K562)负责的细胞群与对LAK(杀伤RAJI)负责的细胞群时可能是同等重要的。

说明书中提及的所有发表物、专利、专利申请、和其它文件都指示本发明所属领域的熟练技术人员的水平。本文出于所有目的完整收录所有发表物、专利、专利申请、和其它文件作为参考，正如同样程度的专门且个别指出本文出于所有目的完整收录每一份个别发表物专利、专利申请、和其它文件一样。使用小标题只是为了方便查阅文献而非以任何方式意欲限制文献的内容。

尽管为了清楚理解而作为例示和实例略为详细的描述了上述发明，然而显然可以在本发明所附权利要求的范围内进行某些改变和修饰。