鉴定与跨膜蛋白相互作用的化合物的方法

摘要

本发明提供了一种筛选能与跨膜蛋白相互作用的化合物的方法，还提供了一种确定例如跨膜蛋白等蛋白质之间是否能够寡聚化的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及筛选能够与跨膜蛋白相互作用的化合物的方法。本发明进一步涉及筛选能够二聚化或寡聚化形成两个或两个以上蛋白质复合体的跨膜蛋白的方法。

背景技术

在下文的描述中，本说明书末尾列出了具体的参考文献，这些文献均以参见的方式引入本说明书中。

跨膜蛋白分为几个主要类别，包括G蛋白偶联受体、转运蛋白、酪氨酸激酶受体、细胞因子受体和LDL(低密度脂蛋白)受体。根据结构和序列的同源性，可将G蛋白偶联受体(GPCR)分为几个家族。家族1(也称为家族A或视紫红质样家族)是到目前为止最大的亚类，其包括下列分子的受体：小分子如儿茶酚胺、多巴胺和去甲肾上腺素，肽如阿片样物质、促生长素抑制素和血管加压素，糖蛋白激素如促甲状腺激素，刺激激素和增味剂分子的全部种类(George等，2002年)。家族2或称家族B包括例如胰高血糖素、甲状旁腺激素和胰液素的受体。这些GPCR的特征为均具有含有几个半胱氨酸的长氨基末端，所述半胱氨酸可形成二硫键桥。家族3或称家族C包括的受体例如促代谢型谷氨酸受体、Ca²⁺敏感性受体和γ氨基丁酸(GABA)B受体。上述受体也具有复杂的氨基末端的特征。虽然所有GPCR均具有七次跨膜(TM)螺旋，但是各个GPCR家族之间并没有序列同源性。

GPCR是已知的最大的一类细胞表面信号传导的中介分子，其分布在体内的每个细胞上。GPCR的作用调节了全部生理功能，例如包括脑、心脏、肾、肺、免疫系统和内分泌系统的功能。过去10年中的大量努力鉴定出了许多新的GPCR，包括先前已知配体的多受体亚型和尚未鉴定出内源性配体的许多受体，后者称为“孤儿”受体或oGPCR(Lee等，2001年；Lee等，2002年；Bailey等，2001年)。

目前，GPCR已经成为临床上用于治疗各种疾病的许多药物的成功靶点，估计当前市场上约50％药物的靶向这些分子。在已知的GPCR中，大约335种受体是药物开发的潜在靶点，其中195种的配体已知，剩余的140种为oGPCR，后者的配体等待鉴定。尽管各种方法学上的进步加速了发现新受体的速度，但是发现配体和药物的速度却远远落后了。虽然常规的、小规模的药理学筛选分析方法最初被用于发现许多GPCR的配体和药物，但是人们一直在寻找更为新颖的分析方法。

由于超过80％的细胞表面受体是GPCR，因此其成为新药开发的丰富资源，并构成了与新药开发高度相关的蛋白靶点群。因为GPCR与药物之间的相互作用可被限制在仅具有所述受体的细胞表面和组织上，所以与GPCR相互作用的药物具有高度选择性的潜能。发现GPCR并意识到其是重要的药物靶点，这一点引起了人们在制药学方面的强烈兴趣，该兴趣在于设计出检测和筛选与GPCR相互作用的化合物的更好方法。因而，为了实现以更快的速度筛选和发现药物的目标，迫切需要开发一些改良的分析方法。需要将检测受试化合物和所述受体之间相互作用的能力最优化，这是药物开发过程中最初的基础步骤。

用以加速鉴定全部GPCR的改良的配体鉴定策略将对所述受体的生理功能进行定义，人们并认识到其在发现新药中的潜能。尽管明确了的药物靶点中蕴藏着巨大财富，但是即使在经过鉴定的GPCR中，也只发现少量高选择性亚型特异性的药物，而制药机构也正面临着缺乏有前途的先导化合物的局面。与前3年相比，在1999-2001年的三年中，排名前20的制药公司认可的新药产品的数量显著减少(Smith，2002年)。因此，确实需要改良的多用途的分析系统，该系统能够以快速有效的方式测试和鉴定内源性配体和与所述受体相互作用的新化合物，并且该系统适于自动化。

由于无法预测需要激活oGPCR的信号传导通路，因此需要一套检测所述受体与化合物相互作用的分析系统，该系统独立于前述预测，其中，所述受体激活了效应器系统(例如腺苷酸环化酶、PLC(磷脂酶C)、cGMP(环鸟苷酸单磷酸)和磷酸二酯酶的活性)。将配体与GPCR和oGPCR配对是一项重要的工作；然而，GPCR配体和效应器系统的多样性会限制一些已有的配体鉴定分析方法的使用，因此需要新的方法来发现药物。

最近，几种采用精密分析系统的方法检测了组织提取物、大配体库和感兴趣的特定配体，成功地发现了许多所述oGPCR的内源性配体。所述方法收集在参考文献“反向药理学(Reverse Pharmacology)”(Howard等，2001年)中。各种检测方法被用来分析细胞针对一种激动剂化合物而诱导出来的活性，这些方法包括荧光成像板读数器(FluorescenceImaging Plate Reader)分析方法(FLIPR，分子设备公司(Molecular DevicesCorp.)，桑尼维尔(Sunnyvale)，加利福亚州)和Barak等人(1997年)，以及专利号为5,891,646和6,110,693的美国专利公开的以下方法：在刺激GPCR的条件下，使用β-视紫红质抑制蛋白(arrestin)-绿色荧光融合蛋白对视紫红质抑制蛋白向细胞表面的转位进行成像。

所述方法的潜在缺陷在于：(1)成像结果并非受体本身；(2)蛋白转位的成像需要复杂的计算机分析技术；(3)筛选拮抗剂之前必需鉴定出激动剂；和(4)信号传导的发生必需存在特异性G蛋白偶联。

传统的GPCR的配体结合和信号传导的模型建立在单受体参与所述过程的假设上，并且该GPCR的单受体模型已经被广泛接受。然而，从20世纪90年代中期开始，大量的报道证实了许多GPCR的寡聚化现象(George等的综述，2002年)，并且目前已认识到寡聚化现象是GPCR结构和生物学功能的一个固有特性。某些受体亚型也会形成异源寡聚体，而这些所述受体的功能特征与同源受体群有所不同。目前，对GPCR寡聚化现象的研究并没有发现二聚体和更大复合物之间的差别，因此“二聚体”一词是可以与“寡聚体”和“多聚体”互换的。并没有结论性的数据能够确定功能性的GPCR的寡聚体有多大。重要的是，通过异源寡聚化作用产生的新特性表明了GPCR产生多种功能的机制。GPCR的同源寡聚化作用作为一种普遍存在的现象而被接受了，而大量GPCR已知能够组装形成异源寡聚体受体复合物(George等，2002年)。例如，GABA-B1和GABA-B2受体的单体没有功能，而只有在共表达时才会形成功能性受体(White等，1998年)。异源寡聚体受体复合物的组装可形成新的受体-配体结合、信号传导或细胞内转运特性。例如，共转染μ和δ阿片受体导致具有功能性特征的寡聚体的形成，所述功能性特征不同于两种单个受体的任何一种的功能特征(George等，2000年)。μ和δ阿片受体相互作用形成的寡聚体产生了新的药理学特性和G蛋白偶联特性。当μ和δ阿片受体同时表达时，高选择性的激动剂(DAMGO、DPDPE和吗啡)的效能降低，且发生效能排序的改变，而某些内源性配体内吗啡肽1(endomorphin-1)和亮啡肽(Leu-enkephalin)的亲和力增加，上述现象表明形成了新的配体结合袋(George等，2000年)。与单独表达的μ和δ受体不同，共表达所述受体显示出对百日咳毒素不敏感的信号传导，该现象可能是由于与不同亚型的G蛋白相互作用引起。因此，从鉴定潜在的药物靶点，到寻找确定一对特定GPCR能否形成异源寡聚体的方法来看，上述现象都是非常有用的。

在很多报道中，通过其具有的免疫共沉淀的能力已经尝试性地鉴定出了一些异源寡聚体。然而，两个GPCR免疫共沉淀的结果有两种可能的解释：不是两个受体在物理上直接相互作用，就是二者都通过与一个共同的第三个蛋白质(或多个蛋白质)接触而相互作用。通过发展能量转移检测方法来检测受体寡聚体是一种替代的方法，该方法采用生物发光共振能量转移(BRET)或荧光共振能量转移(FRET)的原理。虽然采用所述方法检测的能量转移的两个受体分子上标记的荧光团的间距少于100埃，但是能否可靠地区别受体构象的变化和从头寡聚化仍不清楚。

转运蛋白属于蛋白质泵，其能够将分子、离子和其它化学物质运入和运出细胞，且事实上存在于所有细胞中。根据结构、序列的同源性和转运的分子的不同，可将转运蛋白分为几个家族。不同的转运蛋白分别用于转运下列物质：单胺神经递质如多巴胺、5-羟色胺、去甲肾上腺素和GABA，氨基酸如甘氨酸、牛磺酸、脯氨酸和谷氨酸，囊泡单胺、乙酰胆碱和GABA/甘氨酸，糖类如葡萄糖和二糖，有机阳离子和有机阴离子，寡肽和肽，脂肪酸、胆汁酸和核苷，水和肌酸。从细胞内向外转运大分子的泵例如P-糖蛋白(多药耐药性蛋白质)家族，所述大分子例如药物、毒素和抗生素。也有几种相关的转运蛋白的功能依然未知(Masson等，1999年)。所述转运蛋白属于膜蛋白，且含有一段通常具有12个跨膜结构域的多肽。谷氨酸和天冬氨酸转运蛋白属于一个单独的家族，该家族的成员具有6-10个跨膜结构域，并与其它转运蛋白没有同源性(Masson等，1999年)。该家族成员的氨基端和羧基端均位于膜的胞内一侧。

单胺转运蛋白被认为参与了大量神经和精神疾病的发病过程，所述疾病包括抑郁症、帕金森氏病、精神分裂症、药物成瘾症、抽动秽语综合征(Tourette′s syndrome)和注意力缺陷障碍。多巴胺转运蛋白(DAT)是精神兴奋药例如可卡因和哌醋甲酯的主要靶点。今天，所述转运蛋白已经成为临床上用于治疗各种疾病的许多药物的成功靶点，尤其是抗抑郁药物，包括氟西汀、舍曲林(sertraline)和其它相关的5-羟色胺选择性的再摄取抑制物(SSRI)。尽管随着分子技术的进步，已经鉴定出了已知的转运蛋白，但是发现配体和药物的速度却落后了。传统上，药理学筛选检测方法被用来发现某些转运蛋白的配体和药物，但是目前急需寻找新的检测方法。用以加快确定全部转运蛋白的改良的配体鉴定策略，将进一步确定所述转运蛋白的生理功能，并认识到所述转运蛋白在发现新药物中的潜能。即使在经过鉴定的转运蛋白中，也只发现少量的高选择性的特异药物。

酪氨酸激酶受体家族成员具有类似的结构特征，该特征为该家族成员均具有一个胞外配体结合结构域、单个跨膜结构域和一个胞内结构域，所述胞内结构域具有起信号传导作用的酪氨酸激酶活性。受体酪氨酸激酶有许多亚家族，例如表皮生长因子(EGF)受体(也称为HER1或erbB1)，其为该亚家族四个成员中的一个，其他成员为HER2、HER3和HER4。EGF受体(EGF-R)的主要配体是EGF、TGF-α(转化生长因子α)、肝素结合表皮生长因子、双调蛋白、betacellulin和epiregulin(Shawver等，2002年)。EGF-R的激活导致该受体与另一个EGF-R单体二聚化，或者与所述HER亚家族的另一个成员二聚化。家族成员之间形成的异源二聚体形成了配体结合和信号传导的显著的多样性(Yarden和Sliwkowski，2001年)。EGF-R在各种组织广泛表达，并介导了许多重要功能，例如细胞生长和组织修复。EGF-R的过表达见于许多类型的癌症中，例如头颈部癌、肺癌、喉癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、甲状腺癌、黑色素瘤和神经胶质瘤，且与所述癌症预后不良相关(Nicholson等，2001年)。因此，人们具有极大的兴趣并有必要来开发以EGF-R为靶标的药物，以及辅助鉴定所述药物的方法。

受体酪氨酸激酶的其他亚家族有例如血管内皮因子受体(四个成员)和成纤维细胞生长因子受体(四个成员)。所述受体在血管生成作用中具有重要作用，也在以致癌作用为特征的不受控制的血管增殖中具有重要作用(Hanahan和Folkman，1996年)。

细胞因子受体是跨膜蛋白，其具有一个胞外配体结合结构域和一个胞内结构域，后者具有内在激酶活性或者能够与胞内激酶相互作用的接头区域。根据所述受体的结构复杂性，可将其分为数个亚类。“简单”受体包括生长激素受体、红细胞生成素受体和白介素受体，“复杂”受体包括肿瘤坏死因子受体家族、4-螺旋细胞因子受体家族、胰岛素/胰岛素样受体家族和粒细胞集落刺激受体(Grotzinger，2002年)。

胰岛素和胰岛素样生长因子(IGF)受体家族控制代谢、生殖和生长(Nakae等，2001年)。已知有9种不同的胰岛素样肽、与之相互作用的3种已知受体和1个胰岛素受体(IR)相关受体孤儿成员，所述3种已知受体是IR、IGF-1R(IGF-1受体)和IGF-2R(IGF-2受体)。细胞表面的每个所述受体均以同源二聚体或异源二聚体形式存在。IR亚家族也与EGF-R家族相关。

由单一mRNA(信使核糖核酸)产生的IR经历切割和二聚化后转位至质膜。IR的每个单体组分包括一个跨膜结构域；完整的受体包括两个α亚单位和两个β亚单位，并由二硫键连接。β亚单位包括一个跨膜区和胞内区。所述受体是一种酪氨酸激酶，其能够催化几种胞内底物的磷酸化。

低密度脂蛋白(LDL)受体家族作为货物转运蛋白，能够调节脂蛋白和蛋白酶的水平(Strickland等，2002年)。所述家族识别出的9个成员均具有类似的结构，该结构包括一个胞外区、一个单一跨膜结构域和一个位于胞浆中的尾部。LDL受体在清除脂蛋白的过程中起重要作用，并且其遗传缺失会导致血流中LDL的积累。

第一个鉴定出的显示能够指导蛋白转运进入核的基序(motif)是例如氨基酸序列(PKKKRKV)，其包含在SV40大T抗原蛋白中。Importinα-β受体复合物能够识别核定位序列(NLS)基序，并结合于NLS(Gorlich等，1996年)。所述复合物是胞浆蛋白，其能够识别含有NLS的蛋白质，并转运这些蛋白质使其锚定在核孔上。然后整个复合物锚定在核孔复合物上(Weis等，1998年；Schlenstedt等，1996年)，而后者属于核膜。核膜是一种具有开孔的边界，所述开孔介导了核转运过程(Weis等，1998年)。

关于GPCR定位于核内的报道非常罕见。这样的一个例子是GPCR血管紧张素1型(AT₁)受体，其具有指导GPCR进入细胞核的内源性NLS(Lu等，1998年)，所述作用为NLS序列参与了将AT1受体定向至核的过程提供了佐证。上述作者和Chen等人(2000年)报道，在激动剂的作用下，核内AT1受体的量增加。甲状旁腺激素受体的细胞核定位已经有报道(Watson等，2000年)。然而，GPCR超家族的成员中很少含有介导所述受体转位至核的内源性NLS。

因此，仍然需要用于鉴定与跨膜蛋白相互作用的化合物的新的、更为简便的方法，所述跨膜蛋白例如GPCR、转运蛋白等。也需要用于检测跨膜蛋白寡聚化作用的改良的、更为明确的方法。

发明内容

本发明人指出，整合入跨膜蛋白(不含有内源性的功能性NLS)的核定位序列(NLS)能够以时间依赖和不依赖配体的方式，将所述蛋白从细胞表面运送入细胞核。为了使从细胞表面开始的运送跨膜蛋白的过程可见，这些跨膜蛋白上携带有可用各种方法检测到的成分。已经证明，在基础条件下，含有整合的合成NLS的各种蛋白家族的膜蛋白，以从细胞表面向细胞核转移的方式再分布。

通过确定候选化合物能否调节以不依赖配体的形式转运跨膜蛋白运离细胞膜，上述方法可被开发用于鉴定与跨膜蛋白相互作用的化合物。

目前，使用基于所述过程的方法来确定蛋白分子能否寡聚化也是可能的。

根据一个实施方案，本发明提供了一种用于筛选能与至少一种跨膜蛋白相互作用的候选化合物的方法，所述方法包括：

用至少一段编码包含跨膜蛋白的蛋白质的核苷酸序列转染细胞，并允许在该细胞中表达编码的蛋白，所述跨膜蛋白包括至少一个核定位序列和可检测成分；

将所述细胞与候选化合物接触；以及

通过检测细胞中可检测成分的分布情况，来确定该细胞中所述被表达的蛋白的分布情况；

其中，如果检测发现，相对于未接触候选化合物的对照细胞中的可检测成分的分布情况，所述细胞中可检测成分的分布情况发生改变，则表明所述化合物与跨膜蛋白相互作用。

根据采用所述方法的一个进一步的实施方案，在将细胞与候选化合物接触前，先将其与已知能够与至少一种跨膜蛋白相互作用的化合物接触。其中，如果检测发现相对于对照细胞中的可检测成分的分布情况，所述细胞中可检测成分的分布情况发生改变，则表明所述候选化合物与跨膜蛋白相互作用，所述对照细胞未接触候选化合物而接触已知能够与跨膜蛋白相互作用的化合物。

根据一个实施方案，本发明提供一种用于筛选能与至少一种跨膜蛋白相互作用的候选化合物的方法，所述方法包括：

用至少一段编码含有NLS的跨膜蛋白的核苷酸序列转染细胞，并在该细胞中表达编码的蛋白质；

将所述细胞与候选化合物接触；以及

通过分离所述细胞的细胞膜成分、将该跨膜蛋白的标记配体与该细胞膜成分接触和检测与该细胞膜成分结合的配体的水平，来确定存在于该细胞膜上的含有NLS的跨膜蛋白水平；

其中，如果检测发现，相对于未接触候选化合物的对照细胞的细胞膜中跨膜蛋白的水平，所述细胞膜中跨膜蛋白的水平发生改变，则表明所述化合物与跨膜蛋白相互作用。

根据一个进一步的实施方案，本发明提供了一种用至少一种核苷酸序列的转染的分离细胞，所述核苷酸序列编码包括跨膜蛋白的一种蛋白质，所述跨膜蛋白含有至少一个NLS和一个可检测成分。

根据一个进一步的实施方案，本发明提供了一种确定第一种蛋白质和第二种蛋白质能否寡聚化的方法，该方法包括：

用第一种核苷酸序列和第二种核苷酸序列转染细胞，前者编码含有一个NLS的第一种蛋白质，后者编码包括可检测成分的第二种蛋白质，并允许在该细胞中表达所述编码的第一种蛋白质和第二种蛋白质；以及

确定该细胞中所述可检测成分的分布情况；

其中，如果检测发现相对于对照细胞，所述可检测成分位于或邻近于细胞核，或者细胞表面所述可检测成分的水平降低，则表明第一种蛋白质和第二种蛋白质能够相互作用。

附图说明

该部分描述了本发明中的某些实施方案，并引用如下附图：

图1显示了作为典型GPCR的多巴胺D1受体的结构示意图，并对其进行修改以含有一个NLS。

图2显示了HEK细胞表面的荧光(相对荧光单位)强度，该细胞转染了含有NLS的多巴胺D1受体，并以各种浓度的丁克吗(butaclamol)处理该细胞。

图3显示了HEK细胞表面的荧光强度，该细胞转染了含有NLS的HA(血凝素)-多巴胺D1受体，并单独以各种浓度的SCH23390或者与SKF81279(100nM(纳摩尔每升))共同处理该细胞。

图4显示了HEK细胞表面的荧光强度，该细胞转染了含有NLS的HA-多巴胺D1受体，并单独以0.5μM(微摩尔每升)的SCH23390或者与各种浓度的SKF81297共同处理该细胞。

图5显示了HEK细胞的细胞膜成分上结合的³H-SCH23390的含量，该细胞转染了含有NLS的多巴胺D1受体，并以丁克吗(▲)处理该细胞，以未处理的细胞(■)为对照。

具体实施方式

在一个实施方案中本发明提供了一种新的和简便的方法，该方法用于筛选能够与跨膜蛋白相互作用的候选化合物。

本文所用的候选化合物与跨膜蛋白的“相互作用”一词是指，化合物作为跨膜蛋白的配体，能够与该蛋白结合，或能够调节该跨膜蛋白脱离细胞膜的转运过程。

鉴定与跨膜蛋白相互作用的化合物，是鉴定药物开发中先导的化合物的方法中的第一个重要步骤。

本发明人最初采用GPCR进行工作，发现当有核真核细胞转染了编码GPCR的核苷酸序列，并且该细胞允许表达该核苷酸序列之后，表达的GPCR首先被运送到细胞膜，而后转运至细胞核，所述GPCR含有合成的整合NLS或自然存在的NLS。所述过程不依赖于配体的激活却依赖于参与的跨膜蛋白，并发生在约6-72小时之间，平均为24-48小时。所述现象与在细胞中表达的不含NLS的GPCR不同的是，表达的GPCR主要定位在细胞表面，少量存在于胞浆中，而在细胞核中则无法检测到。

本发明人也发现，从细胞膜向核转运或运输表达的所述含有NLS的GPCR的过程，可被使用与GPCR相互作用的化合物来处理转染细胞的方式调节。因此，筛选具有与GPCR相互作用能力的候选化合物可以通过检测表达的GPCR从细胞膜向核转运的调节情况来实现。

本发明人进一步发现所述观察到的情况通常可以广泛地用于各种跨膜蛋白，并非只限于GPCR。

本文所用的“跨膜蛋白”一词是指具有至少一个跨膜结构域的细胞膜上的单链蛋白质。

本发明人指出，如果在有核细胞中表达各种跨膜蛋白，从而使其含有NLS，则表达的全部所述蛋白均首先聚集在细胞膜上，然后以不依赖于配体激活的形式离开细胞膜转运进入细胞核，所述各种跨膜蛋白来自于GPCR的几个家族、转运蛋白、细胞因子受体、酪氨酸激酶和低密度脂蛋白受体。

极多种类的跨膜蛋白结构表明本发明的方法具有广泛的适用性，所述结构以在所述方法中使用的示例性的跨膜蛋白为代表；在跨膜蛋白中插入NLS导致该蛋白从细胞表面向细胞核转位，该作用在具有1个、7个和12个跨膜结构域的膜蛋白中是有效的，所述膜蛋白的序列同源性很低或没有。

本发明的方法广泛适用于鉴定与跨膜蛋白相互作用的化合物。

与跨膜蛋白相互作用的化合物能够以不同方式调节所述蛋白从细胞膜向细胞核的转运，所述方式包括抑制转运、加速转运和干扰由其他化合物产生的调节作用。由于任何相互作用的化合物均为潜在的候选药物，因此所述化合物都是人们感兴趣的。

通过比较对照细胞和候选化合物处理的细胞中的跨膜蛋白分布情况，能够确定表达的跨膜蛋白转运的调节情况。

在一个实施方案中，所述方法提供了一个用于筛选候选化合物的简便工具，所述候选化合物具有与GPCR相互作用的能力和调节GPCR运输的能力。与GPCR特异性相互作用的化合物可能抑制或阻止GPCR从细胞表面向细胞核的转运，该化合物可能是GPCR的拮抗剂；而相对于对照细胞，其他化合物可能加速GPCR向细胞核的转运，该化合物可能是GPCR的激动剂。

为了在暴露于和非暴露于受试化合物的条件下确定细胞中表达的跨膜蛋白的分布情况，所述跨膜蛋白必需携带有可在细胞中被检测到的可检测成分。所述可检测成分可以是任何成分，其能够在细胞内的表达和运输过程中持续与跨膜蛋白相关联，并能够直接或间接地被检测到以确定其在细胞内的分布，并可被用于确定由暴露于候选化合物所导致的发生改变的分布情况。

在第一个实施方案中，将编码包括跨膜蛋白的融合蛋白的一段核苷酸序列转染入细胞中，该跨膜蛋白含有至少一个NLS，该NLS与含有一段可检测肽或多肽的可检测成分偶联。本文中的肽指2-20个氨基酸残基的序列，优选为约5-15个氨基酸残基的序列；多肽指超过20个氨基酸残基的序列，包括完整的任意长度的蛋白质。所述可检测肽或多肽是可直接检测的或是可反应的，从而产生可检测到的信号。例如，所述可检测肽可以是一段抗原肽或表位，其例如可以表达在跨膜蛋白的氨基端。使用所述表位的可检测的特异性抗体来检测该表位，以确定细胞中所述跨膜蛋白的分布情况。可从商业渠道获得许多合适的表位抗体系统。例如，HA(Roche Diagnostics)、FLAG(Sigma Chemical公司)、c-myc(Santa Cruz)、组氨酸六聚物(BD Biosciences Clontech)、GST(ABR AffinityBioReagents)、V5(Abcam)和Xpress(Invitrogen)的表位/抗体系统。

编码所述表位的核苷酸序列及其特异性抗体可以购买到。所述抗体可携带一个可检测标签(例如，异硫氰酸荧光素(FITC))，或者其自身可被携带一个可检测标签的二抗检测到，所述情况为本领域的技术人员所熟知。本发明的所述实施方案尤其适应于自动化或半自动化的方法，例如，通过在自动化的平板读数器中检测抗体处理后的细胞平板，可以实现高通量筛选。

所述可检测多肽可以是一种光学上可检测到的多肽，例如绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和/或青色荧光蛋白(CFP)，或者所述蛋白的任何修饰后的变异体，上述蛋白均可从商业途径获得。所述可检测多肽也可以是酶，例如荧光素酶或β-半乳糖苷酶，其能够反应而最终形成可检测到的终点如发光或颜色改变。编码所述多肽的核苷酸序列已经可以从例如Clontech公司等处获得，并被连接到编码含有NLS的跨膜蛋白的核苷酸序列上，其中优选连接在该跨膜蛋白的C(羧基)末端上。

在一个进一步的实施方案中，所述可检测成分是抗原肽，其包括跨膜蛋白自身氨基酸序列的一部分，优选跨膜蛋白的胞外区的一部分。如上所述，使用可检测的表位特异性的抗体可以确定细胞中跨膜蛋白的分布情况。可从商业渠道获得合适的抗体，例如，抗人D1多巴胺受体氨基端9-21个氨基酸的抗-D1抗体，或者以常规方法制备抗体。

在一个进一步的实施方案中，将已知配体施用于跨膜蛋白，将编码至少含有一个NLS的跨膜蛋白的一段核苷酸序列转染细胞。如上文所述，将细胞与候选化合物接触并温育。然后收获所述细胞并分离其细胞膜，将跨膜蛋白的可检测的标记配体与该细胞膜接触，所述标记配体是例如放射性标记的配体。相对于结合在未接触所述候选化合物的对照细胞的细胞膜部分的数量，确定在接触所述候选化合物的细胞膜上结合的标记配体的含量，能够定量测定保留在细胞表面上的跨膜蛋白，以及指示所述候选化合物与跨膜蛋白之间的相互作用。

编码跨膜蛋白的核苷酸序列可从公共数据库或商业数据库获得，所述公共数据库如GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez)。构建完成的合适序列可以通过常规方法合成获得，或者从商业渠道获得，所述常规方法将在本文的实施例中描述。

“一种含有NLS的跨膜蛋白”包括一种在其野生型序列中含有一个NLS的跨膜蛋白，和一种对其氨基酸序列进行修改而含有一个NLS的跨膜蛋白。

常规的NLS是短肽序列，其能够促进含有它们的蛋白质的核定位(参见例如表1以及Jans等，2000年，表1中列出了NLS)。NLS有3个主要类别；其中2个类别由碱性氨基酸残基组成，分别是单部分NLS和两部分NLS，前者例如SV40大肿瘤抗原PKKKRKV，其由单一一段碱性氨基酸组成，后者包括两段碱性氨基酸，由10-22个氨基酸(有时达数百个氨基酸)隔开。其他类型的NLS例如酵母蛋白Mata2 NLS或者原癌基因c-myc NLS，前者的非极性残基序列中含有带电荷/极性残基，后者的碱性残基两侧的脯氨酸和天冬氨酸是核靶向所必需的(PAAKRVKLD)。α-β-importin能够特异性识别全部类别的NLS。

在本发明的方法中可以使用任何NLS。如本文所述，编码选定的NLS的核苷酸序列可以来自于NLS的氨基酸序列，且使用常规方法合成所述NLS核苷酸序列，并将其整合入编码跨膜蛋白的核苷酸序列中。跨膜蛋白上的任何胞内环或胞内末端上的许多不同位置均适于插入NLS。优选在跨膜蛋白的胞内结构域中插入NLS。例如在GPCR中，NLS可被置于任意胞内环或胞内的羧基端尾部上。在12次跨膜的转运蛋白中，NLS可被置于胞内的氨基端或羧基端，或者任何胞内环上。

当在跨膜蛋白中插入NLS用于本发明的方法中时，以如下方法筛选所述插入的效率：确认在24-48小时内含有NLS的跨膜蛋白基本上从细胞膜转位至细胞核中，且所述跨膜蛋白的配体能够干扰所述转位。

通过常规方法，可以将编码含有NLS的跨膜蛋白的核苷酸序列与编码可检测肽或多肽的序列连接在一起。

用编码选定的含有NLS的跨膜蛋白的核苷酸序列转染有核细胞，所述跨膜蛋白含有或偶联于一种可检测成分，上述过程通过将所述序列克隆入含有合适启动子的载体系统而实现，并采用了在科学文献中描述的常规技术，所述科学文献例如《最新分子生物学实验方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(1987年)。合适的载体包括pEGF-N1(Clontech)和pcDNA，前者含有人巨细胞病毒(CMV)启动子。

可以使用任何能够表达所转染的核苷酸序列的细胞，并且在该细胞中，NLS能够促进跨膜蛋白脱离细胞膜的转运过程。合适的细胞包括原核细胞和真核细胞，前者包括细菌细胞。合适的真核细胞包括分离得到的哺乳动物细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、线虫细胞和真菌细胞。合适的哺乳动物细胞包括人细胞系、啮齿动物细胞系、仓鼠细胞系和非人灵长类动物细胞系。

在一个实施方案中，用许多核苷酸序列转染细胞，每个序列编码一个不同的含有NLS的跨膜蛋白和一个不同的可检测成分。通过鉴定可检测成分，其脱离细胞表面的运动被阻断的现象，可以将受试化合物干扰跨膜蛋白脱离细胞膜的转运的现象与所述化合物与特定跨膜蛋白之间的相互作用联系起来。

在一个进一步的实施方案中，为了实施高通量的初始筛选，用大量核苷酸序列转染细胞，每个序列编码一个不同的含有NLS的跨膜蛋白和一个可检测成分，其中，一些可检测成分在不止一个跨膜蛋白中是相同的。如果初始筛选表明一个候选化合物与一个或多个跨膜蛋白相互作用，则使用表达更少一些跨膜蛋白或仅表达一个跨膜蛋白的细胞再次筛选该化合物，直到鉴定出具有特异性相互作用的跨膜蛋白。

如本文所讨论的，在转染有不止一个跨膜蛋白的细胞中，跨膜蛋白对之间可能出现寡聚化现象，该现象可能影响对候选化合物作用的解释。随后使用只转染有一个跨膜蛋白的细胞对所述化合物进行的再筛选，能够明确所述化合物和特定跨膜蛋白之间的相互作用。

另外，在跨膜蛋白之间没有显示出寡聚化现象的多重转染细胞中，也可以选择出所述跨膜蛋白。

相互作用的化合物的鉴定

在本发明的一个实施方案中，用编码一个蛋白质的一段核苷酸序列转染有核细胞，所述蛋白质包括含有一个NLS的跨膜蛋白和一个可检测成分，然后将所述细胞温育一段合适的时间，以使NLS-跨膜蛋白表达和开始聚集在细胞膜上。例如，对于GPCR和转运蛋白而言，所述合适的温育时间是约6-24小时。通过观察细胞膜上蛋白质的聚集情况，本领域的技术人员可以容易地确定其他跨膜蛋白的合适温育时间。当加入候选化合物时，并不需要全部表达的跨膜蛋白均到达细胞膜上。随后将受试细胞与需要检测与跨膜蛋白之间相互作用的候选化合物接触一段时间，该时间是指，相对于未使用化合物处理的对照细胞，足够大部分NLS-跨膜蛋白转位脱离细胞膜并进入或朝向细胞核所需的时间，所述大部分NLS-跨膜蛋白的比例优选为至少20％，更优选为至少50％，更进一步优选为至少90％。

根据所用的跨膜蛋白的不同，所述温育时间可为约6-72小时；对于大部分待检测的跨膜蛋白，合适的温育时间是约24-48小时。通过观察对照细胞，本领域的技术人员可以容易地确定合适的温育时间。

用于检测的受试化合物的初始浓度通常为约1-10微摩尔。

然后，通过检测受试细胞和对照细胞来确定可检测成分的分布情况，因而进一步确定NLS-跨膜蛋白的分布情况。可以采用各种方法确定可检测成分的分布情况。例如，当可检测成分是光学上可检测到的蛋白质时，可以直接通过显微镜来检测细胞，比较受试细胞和对照细胞核内所述蛋白的含量。在另一个实施方案中，对留在对照细胞和受试细胞膜上的可检测蛋白或肽的含量进行比较。在每个视野中含有30-100个细胞的数个显微镜视野(5-10个)中，确定这些细胞中可检测成分的位置，并对每个位置进行计数。在受处理的细胞和对照细胞中，计算具有细胞表面标记或核标记的细胞的百分数和全部视野中的细胞总数。

如上文所述，在一个进一步的实施例中，当可检测成分是一种抗原表位时，将细胞与一种含有针对所述表位的特异性抗体的可检测抗体系统接触。例如，可以使用针对表位的特异性一抗，然后使用特异针对一抗的荧光素标记的二抗，所述荧光信号可使用荧光计进行定量。

如果对照细胞中大量跨膜蛋白转位脱离细胞膜，所述比例优选为至少50％，并且相对于对照细胞，受试细胞中的跨膜蛋白保留在细胞膜上，则表明受试化合物与跨膜蛋白之间存在相互作用。在优选的实施方案中，受试细胞的细胞膜上的蛋白水平比对照细胞膜上的高至少10％，优选至少15％，更优选至少20％时，则表明存在相互作用。

将细胞暴露于与其具有相互作用的化合物后，停留在细胞膜上的可检测成分的比例与所述化合物的浓度和效能相关。例如，使用微摩尔浓度的一种已知的强效GPCR拮抗剂后，通常导致约50-100％的跨膜蛋白保留在细胞表面，0-15％在细胞核中，而剩余部分则存在于胞浆中。使用浓度更低的纳摩尔级的相同拮抗剂后，导致20-40％的跨膜蛋白保留在细胞表面，剩余部分存在于胞浆和细胞核中。在未处理的对照细胞中，在细胞表面可检测到0-15％的跨膜蛋白，剩余部分在胞浆和细胞核中。

如上文中所讨论的，在另一种形式的所述方法中，所用的跨膜蛋白具有已知的配体，表达的含有NLS的跨膜蛋白不含可检测成分，通过分离细胞膜成分并使用可检测的标记配体分析膜成分上的跨膜蛋白组分，来确定受试化合物处理后的细胞中的跨膜蛋白的分布情况。

在本发明的一个进一步的实施方案中，一种相似的方法被用于鉴定与NLS-跨膜蛋白相互作用的化合物，所述相互作用促进该跨膜蛋白脱离细胞表面，运向或运入细胞核。转染细胞并温育之，使NLS-跨膜蛋白被表达并聚集在细胞表面上。在优选的情况下，对所述细胞进行温育，直至约70-90％的被表达的跨膜蛋白聚集在细胞表面。对许多跨膜蛋白而言，在转染后温育12-24小时是合适的。

然后将受试细胞与候选化合物接触，并立即对单个检测和对照细胞进行多至4小时的实时观察，以观察可检测成分的分布情况。与对照细胞相比，受试细胞核中可检测成分聚集的增加，表明受试化合物能够促进跨膜蛋白的转位。在一个优选的实施方案中，受试细胞核中可检测成分聚集增加的比例至少为5％，优选为至少10％，更优选为至少20％时表明存在相互作用。

在本发明的一个进一步的实施方案中，在一个鉴定化合物的方法中，虽然所述化合物自身并不能阻断含有NLS的跨膜蛋白脱离细胞膜的转位过程，但是却可以干扰跨膜蛋白和能够与之相互作用的化合物之间的相互作用。

在上述第一种筛选方法中证明为阴性的化合物，可以在所述进一步的方法中检测出具有与某种化合物竞争的能力，所述某种化合物已知能够与跨膜蛋白相互作用。

在所述方法中，以如上文所述的方式转染细胞，并温育一段合适的时间，使跨膜蛋白被表达并聚集在细胞表面上，所述合适的时间约为24-48小时。

而后将受试细胞和对照细胞与下列物质接触约24-48小时：已知能够与跨膜蛋白相互作用的化合物、已知配体或者通过上述方法鉴定得到的相互作用化合物。然后将受试细胞和候选化合物接触，之后1-24小时内以一个或多个时间点观察受试细胞和对照细胞，以上文所述的方式确定细胞中NLS-跨膜蛋白的分布情况。在对照细胞中，已知能够相互作用的化合物使跨膜蛋白保留在细胞膜上。如果所述候选化合物能够与具有相互作用能力的化合物竞争，则受试细胞中保留在细胞表面上的跨膜蛋白减少，而转位脱离细胞表面的增加。在优选的实施方案中，表明所述相互作用的受试细胞膜上跨膜蛋白减少的比例至少为10％，优选为至少15％，更优选为至少20％。

在一个进一步的实施方案中，可以使用内源性表达含有NLS的跨膜蛋白的细胞，并将其与第一种化合物共同使用，所述化合物已经证明能够和所述蛋白相互作用并抑制该蛋白离开细胞膜，从而使之保留在细胞膜上。当所述系统与候选化合物接触时，如果该化合物能够与跨膜蛋白相互作用并与第一种化合物竞争，则可以观察到细胞膜上所述跨膜蛋白离开细胞膜的转运增强。

使用其他蛋白质鉴定跨膜蛋白的相互作用

许多跨膜蛋白都能够形成同源寡聚体和异源寡聚体，所述跨膜蛋白包括GPCR、转运蛋白、酪氨酸激酶受体、胰岛素和胰岛素样生长因子、表皮生长因子和血管内皮生长的细胞因子受体(例如可参见George等的GPCR综述，2002年)。本文中所用的蛋白质“寡聚化”一词指两个或更多蛋白分子的结合。

对于假设的受体A和B而言，细胞表面可含有二聚体AA、BB和AB，并相信其可代表三种不同的功能复合物，即三种不同的药物靶点。因此，鉴定哪些跨膜蛋白能通过寡聚化在相互之间或与其他蛋白质之间相互作用是十分重要的。

在进一步的实施方案中，本发明提供了一些方法，这些方法用于确定两种跨膜蛋白是否能够寡聚化，或者一种跨膜蛋白和一种非跨膜蛋白是否能够寡聚化。

在一个实施方案中，将第一种核苷酸序列和第二种核苷酸序列转染有核细胞，前者编码含有一个NLS的第一种跨膜蛋白，后者编码无NLS但携带有或偶联有可检测成分的第二种跨膜蛋白。制备所述核苷酸序列的方法如上所述。在经过用于表达所述蛋白的一段合适时间间隔后，跨膜蛋白聚集在细胞膜上，而后含有NLS的跨膜蛋白离开细胞膜运入或运向细胞核，细胞中可检测成分的分布情况得到确定，所述确定方法例如检测细胞核中可检测成分的增加或细胞表面可检测成分的减少。

使用两种核苷酸序列同时转染细胞，除了第一种跨膜蛋白含有插入的NLS而另一种不含有NLS之外，所述第一种和第二种跨膜蛋白是相同的，此时发现与只转染含有NLS的跨膜蛋白的核苷酸序列的细胞相比，所述转染两种核苷酸序列的细胞中的含有NLS的跨膜蛋白向细胞核转位的速度减慢。现已知跨膜蛋白向核转位的过程可能需要约24-48小时。因此在所述方法中，在温育细胞大约24-48小时后检测细胞中跨膜蛋白的分布情况。

可检测成分从细胞表面的转位或向细胞核的转位表明，第一种跨膜蛋白携带第二种跨膜蛋白离开细胞表面，这表明第一种和第二种跨膜蛋白发生了寡聚化。可检测成分保留在细胞表面表明所述两种跨膜蛋白不存在相互作用。

当第一种和第二种跨膜蛋白相同时，所述方法可用于鉴定所述蛋白形成同源二聚体的能力。当第一种和第二种跨膜蛋白不同时，所述方法可用于鉴定所述两种不同蛋白形成异源二聚体的能力，也可用于确定所述两种跨膜蛋白间相互作用的特异性。

在缺乏配体激活或存在两种蛋白中的任意一种的配体时，可施行所述方法。

使用所述方法可以证明，寡聚化作用存在于不同GPCR类别之间或内部，也存在于跨膜蛋白的其他类别之间或内部。

此外，在GPCR和非GPCR跨膜蛋白之间、跨膜蛋白和非跨膜蛋白之间均检测到相互作用，前者例如D5多巴胺受体和GABA-A受体。

因此，通过上述方法，本发明大体上提供了用于检测两种蛋白质之间寡聚化作用的方法，其中，细胞共转染了一个含有NLS的蛋白质和另一个携带有可检测信号的蛋白质。

将含有NLS的第一种跨膜蛋白和由可检测成分标记的第二种蛋白共转染细胞，该细胞可用于筛选与第一种或第二种跨膜蛋白相互作用的候选化合物，所述第二种跨膜蛋白例如来自不同类别的跨膜蛋白，并由本发明中的方法确定为可以与第一种蛋白寡聚化。与所述两种蛋白中的任意一种相互作用的化合物将会影响其寡聚化，或影响寡聚化的蛋白离开细胞膜的转位过程。采用所述方法可以鉴定以下现象：与跨膜蛋白对中的一种或寡聚物相互作用的化合物，是导致可检测蛋白保留在细胞表面上，还是导致可检测蛋白加速离开细胞表面的转位过程。

在一个进一步的实施方案中，将编码第二种跨膜蛋白的核苷酸序列转染内源性表达含有NLS的跨膜蛋白的细胞，所述第二种跨膜蛋白携带有可检测成分而缺乏NLS。可检测成分从细胞膜运入或运向细胞核的运输过程，显示了所述两种蛋白的寡聚化作用。

在一个进一步的实施方案中，含有NLS的膜蛋白可用于鉴定新的相互作用蛋白。在该方法中，在细胞中表达含有NLS的跨膜蛋白，并允许其向细胞核转位。然后收集细胞核，通过考马斯染色或银染来确定新出现的蛋白条带，再用质谱进行鉴定。对照是表达不含NLS的膜蛋白的细胞的核。

采用FRET检测核转位

在本发明的另一方面，包括了荧光共振能量转移(FRET)(Hailey等，2002年)，将编码含有NLS的第一种跨膜蛋白的第一种核苷酸序列和编码不含NLS的第二种跨膜蛋白的第二种核苷酸序列共转染有核细胞，所述第一种跨膜蛋白偶联于第一种光学上可检测的蛋白质，所述第二种跨膜蛋白偶联于第二种光学上可检测的蛋白质，其中，当两种跨膜蛋白非常接近时，所述第二种光学上可检测的蛋白质上的荧光素被第一种光学上可检测的蛋白质的发射光激活。例如，第一种蛋白偶联的GFP可出现激光激发的发射光谱，该发射光谱激活了第二种任何其他光学上可检测的成分。GFP激活所述第二种光学可检测成分后，该成分以不同的波长发光。当两种跨膜蛋白之间形成寡聚物时，两种标签非常接近，则可以检测到它们之间的FRET的相互作用。采用FRET方法或其改变的方法，通过供体的选择性荧光素激活和受体的发光检测来检测蛋白间的物理相互作用，所述FRET方法的改变方法例如光漂白FRET、FRAP或FLIM。缺乏FRET相互作用表明不存在寡聚化作用。

在两个荧光分子的FRET中进行共聚焦显微镜观察(例如，GFP和DsRed2(海葵红色荧光蛋白2)的光谱对，或者CFP和YFP的光谱对)以获得可定量的信号，该信号显示细胞核转位。FRET需要供体和受体分子的发射和激发光谱之间存在重叠，及距离小于100埃(10-100埃)，这使FRET成为分析细胞中接近的特异性蛋白-蛋白相互作用的非常合适的系统。上文中列出的荧光蛋白是具有上佳光谱范围的参与反应的分子。当标记有第二种荧光团的跨膜蛋白转位至细胞核时，核内自有的荧光团将会引起FRET。使用FRET平板读数器有助于简便地读取数据。所述方法对于检测两个跨膜蛋白之间或一个跨膜蛋白和另一个蛋白之间的相互作用是有用的，并提供了更易于自动化的信号读取方式。

所述方法也可用于GPCR激动剂和拮抗剂的筛选过程中。在筛选所述拮抗剂的方法中，与未处理的细胞相比，受处理细胞中运输至细胞核的GPCR-NLS-GFP蛋白与细胞核中的荧光团之间的FRET信号的减弱，表明拮抗剂效应。在筛选所述激动剂的方法中，与未处理的细胞相比，受处理细胞中运输至细胞核的GPCR-NLS-GFP蛋白与细胞核中的荧光团之间的FRET信号的增强，表明激动剂效应。在一个进一步的实施方案中，由于用激动剂处理细胞可能增强寡聚化作用，因此在检测寡聚化作用之前先用激动剂处理经共转染的细胞。在检测受体：受体相互作用的方法中，GPCR-NLS-GFP蛋白与第二个GPCR-DsRED蛋白共表达。如果所述受体彼此相互作用并共同运输至细胞核，则可以检测到核FRET信号。如果所述受体不发生相互作用，则在核中无法检测到FRET信号。FRET也可用于检测结合有荧光团的两种抗体间的相互作用，所述抗体识别GPCR上整合的或天然的表位。

实施例

下列实施例起到阐明本发明的目的，而非用于限制本发明的范围。

本说明书和实施例中提到了化学、分子生物学、蛋白质和肽生物化学及免疫学的方法，但是对所述方法没有进行详细描述，这些方法在科学文献中有报道，这是本领域的技术人员所熟知的。

材料和方法

绿色荧光蛋白：编码海洋生物水母绿色荧光蛋白(Prasher等，1992年)的DNA(脱氧核糖核酸)序列来自于美国的Clontech。

红色荧光蛋白：编码红色荧光蛋白(Matz等，1999年)pDsRed2和pDsRed2-nuc的DNA序列来自于美国的Clontech。这种构建体编码源自于海葵的蛋白质。

COS细胞和HEK细胞，来自于哥伦比亚特区华盛顿的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)。细胞培养基由多伦多大学(University of Toronto)实验室制备。

拮抗剂和激动剂化合物，来自于各种商业途径，例如美国Sigma化学公司(Sigma Chemical Company)。

用于表位标签的免疫检测的抗体，其来源如下：抗HA单克隆抗体来自于美国Roche Diagnostics；抗FLAG单克隆抗体来自于美国SigmaChemical Company；抗c-myc单克隆抗体来自于美国Santa Cruz。

用于受体结合检测的放射性配体3H-SCH 23390，来自于美国的NENPerkin Elmer。

DNA构建体的制备

编码GPCR或转运蛋白的核苷酸序列来自于Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez)网站，该网址由美国国家科学图书馆(National Library of Science)建立。将编码选定的跨膜蛋白的核苷酸序列与编码选定的可检测的信号蛋白的核苷酸序列连接在一起。所述构建体克隆入pEGFP(Clontech)或pDsRed2-N1载体或载体pcDNA3的载体系统中。

1a.将含有NLS的人D1多巴胺受体构建在羧基尾部的近端(螺旋8)，并将其与GFP融合(D1-GFP和D1-NLS-GFP)。

使用如下实验条件的PCR(聚合酶链反应)方法，对pcDNA3载体中编码人D1多巴胺受体的DNA序列进行扩增。PCR反应混合物含有水(32微升)、10×Pfu缓冲液(Stratagene)(5微升)、dNTP(2’-脱氧核苷5’-三磷酸，10mM(毫摩尔每升))、DMSO(5微升)、寡核苷酸引物(100ng(纳克))(每种1微升)、DNA模板(100ng)和Pfu酶(5个单位)。总体积为50微升。使用下列PCR反应条件：第一个循环以94℃维持2分钟，之后的30-35个循环中以94℃维持30秒、55℃维持30秒和72℃维持1分钟为每个循环的条件，最后再以72℃维持5分钟。

用于扩增编码D1多巴胺受体DNA的引物对如下：

HD1-P1：5’GAGGACTCTGAACACCGAATTCGCCGCCATGGA

CGGGACTGGGCTGGTG 3’

HD1-P2：5’GTGTGGCAGGATTCATCTGGGTACCGCGGTTGGGT

GCTGACCGTT 3’

引物HD1-P1上整合有限制性内切酶EcoR1的酶切位点，引物HD1-P2上整合有限制性内切酶Kpn1的酶切位点。不含终止密码子的PCR产物以单一方向亚克隆入pEGFP载体(来自Clontech)的EcoR1和Kpn1酶切位点上，并符合GFP蛋白起始密码子的读框。

以PCR的方法，将来自于人AT1受体的NLS序列KKFKR插入到编码D1多巴胺受体的TM7(螺旋8)碱基的DNA中，替代了编码DFRKA的天然序列。

用于构建编码D1-NLS的DNA的引物对如下：

HD1-NLSF：5’CCTAAGAGGGTTGAAAATCTTTTAAATTTTTT

AGCATTAAAGGCATAAATG 3’

HD1-NLSR：5’GCCTTTAATGCTAAAAAATTTAAAAGATTTT

CAACCCTCTTAGGATGC 3’

以编码D1-GFP的DNA为模板、HD1-P1和HD1-NLSF为引物的PCR反应，可以得到1000bp(碱基对)的产物(PCR#1)。以编码D1-GFP的DNA为模板、HD1-P2和HD1-NLSR为引物的PCR反应，可以得到300bp的产物(PCR#2)。随后进行以PCR#1和PCR#2的产物为模板、HD1-P1和HD1-P2为引物的PCR反应，得到1300bp的产物。将得到的编码D1-NLS的DNA亚克隆入pEGFP载体中的EcoR1和Kpn1限制性酶切位点处。

除了下文所述的特异性引物之外，使用与上述相同的PCR方法和实验条件制备下文所述的D1多巴胺受体的全部其他构建体。

1b.构建含有NLS的人多巴胺D1受体，并将其与RFP融合(D1-NLS-RFP)。

使用如下PCR方法，将NLS序列KKFKR插入人D1受体胞内羧基尾部的螺旋8片段。以pcDNA3载体中编码人D1的DNA为模板、HD1-P1和HD1-NLSR为引物的第一次PCR反应，可以得到1kb(千碱基对)的产物。以HD1-P2和HD1-NLSF为引物的第二次PCR反应得到了300bp的产物。以PCR#1和PCR#2的产物为模板、HD1-P1和HD1-P2为引物的最终PCR反应，得到了1.3kb的产物。

得到的D1NLS亚克隆入pDsRed载体(Clontech)的EcoR1和Kpn1酶切位点处，并与RFP融合。

引物序列如下：

HD1-P1：5’GAGGACTCTGAACACCGAATTCGCCGCCATGGAC

GGGACTGGGCTGGTG 3’

HD1-P2：5’GTGTGGCAGGATTCATCTGGGTACCGCGGTTGGGT

GCTGACCGTT 3’

HD1-NLSF：5’GCCTTTAATGCTAAAA TTTAAAAGATTTTCAA

CCCTCTTAGGATGC 3’

HD1-NLSR：5’CCTAAGAGGGTTGAAAATCTTTTAAATTTTTTAG

CATTAAAGGCATAAATG 3’

D1-野生型：NPIIYAFNADFRKAFSTLL

D1NLS-螺旋8：NPIIYAFNAKKFKRFSTLL

1c.将具有红细胞凝集素(HA)表位标签的多巴胺D1受体构建在氨基末端。

HA标签如下：

核苷酸序列：TACCCTTACGACGTGCCGGATTACGCC，

氨基酸序列：YPYDVPDYA。

将HA表位标签插入人D1受体氨基末端时，使用D1-pcDNA3为模板和以下序列为引物：

P1HA-BamH：5’ggatccactagtaacggccgccagaccaccATGGGATACCCGT

ACGACGTCCCCGACTACGCAAGGACTCTGAACACCTCTGCC 3’

P2-Not1：5’ggccgccagctgcgagTTCAGGTTGGGTGCTGACCG 3’

扩增得到的cDNA(互补DNA)(1.3kb)亚克隆入pcDNA3载体中BamH1和Not1酶切位点处。

D1野生型：MRTLNTSAMDGTGLVV

D1-HA标签：MGYPYDVPDYARTLNTSAMDGTGLVV

1d.将含有HA表位和NLS的人多巴胺D1受体(D1HA-NLS)构建在羧基尾部(螺旋8)的近端。

使用引物对和编码D1-HA的DNA为模板扩增编码D1-NLS(螺旋8)的DNA。以DNA D1-HA为模板、T7和HD1-NLSR为引物扩增出1000bp的DNA产物(PCR#1)。以DNA D1-HA为模板、Sp6和HD1-NLSR为引物扩增出300bp的DNA产物(PCR#2)。以T7和Sp6为引物、PCR#1和PCR#2的产物为模板扩增出1300bp的产物(PCR#3)。

HD1-NLSR：5’CCTAAGAGGGTTGAAAATCTTTTAAATTTTTTAGCATTAAAGGCATAAATG 3’

HD1-NLSF：5’GCCTTTAATGCTAAAAAATTTAAAAGATTTTCAACCCTCTTAGGATGC 3’

D1HA-NLS(螺旋8)的PCR产物为平末端，插入pcDNA3中的EcorV酶切位点处。对插入方向正确的克隆测序。

D1-HA野生型：NPIIYAFNADFRKAFSTLL

D1HA-NLS(螺旋8)：NPIIYAFNAKKFKRFSTLL

1e.将具有NLS的多巴胺D1受体构建在胞内环3上，并将其与GFP融合(D1-NLS-IC3-GFP)。

用于构建D1-NLS-IC3-GFP的引物对如下：

D1NLSF-IC3：5’GGAAAGTTCTTTTAAGAAGAAGTTCAAAAGAGAAAC 3’

D1-NLSR-IC3：5’GTTTCTCTTTTGAACTTCTTCTTAAAAGAACTTTCC 3’

使用D1 pcDNA3作为模板：

PCR#1：引物HD1-P1和D1NLSR-IC3；

PCR#2：引物HD1-P2和D1NLSF-IC3(500bp)：

PCR#3：引物HD1-P1和HD1-P2，使用PCR#1和PCR#2为模板(1.3kb)。

将得到的编码D1-NLS-IC3的DNA片段亚克隆入pEGFP载体的EcoR1和Kpn1酶切位点处。

D1野生型：QPESSFKMSFKRETKVL

D1-NLS-IC3：QPESSFKKKFKRETKVL

以D1 pcDNA3为模板，将NLS序列KKFKR插入D1受体胞内环3的片段上，替代了序列MFSKR。

以pcDNA3上编码D1的DNA为模板、HD1-P1和D1-NLSR-IC3为引物的PCR反应，得到800bp的产物(PCR#1)。以pcDNA3上编码D1的DNA为模板、HD1-P2和HD1-NLSF-IC3为引物的PCR反应，得到500bp的产物(PCR#2)。以PCR#1和PCR#2的产物为模板、HD1-P1和HD1-P2为引物进行的后续PCR反应，得到1300bp的产物(PCR#1)。将得到的编码D1-NLS的构建体亚克隆入pEGFP载体中的EcoR1和Kpn1限制性位点处。

1f.在胞内环2上构建具有NLS的人D1多巴胺受体，并将其与GFP融合(D1-NLS-IC2-GFP)。

用于构建编码D1NLS-IC2的引物对如下：

D1NLSF-IC2：5’CCGGTATGAGAAAAAGTTTAAACGCAAGGCAGCCTTC 3’

D1-NLSR-IC2：5’GGCTGCCTTGCGTTTAAACTTTTTCTCATACCGGAAAGG 3’

以pcDNA3上编码D1多巴胺受体的DNA为模板、HD1-P1和D1NLSR-IC2为引物进行PCR扩增(PCR#1)，得到500bp的产物。以pcDNA3上编码D1多巴胺受体的DNA为模板、HD1-P2和D1NLSF-IC2为引物进行PCR扩增(PCR#2)，得到800bp的产物。以HD1-P1和HD1-P2为引物、PCR#1和PCR#2为模板进行后续PCR扩增，得到1300bp的产物。

将PCR得到的编码D1NLS-IC2的DNA亚克隆入pEGFP载体中的EcoR1和Kpn1酶切位点处。

D1-野生型：NPFRYERKMTPKAAFILI

D1-NLS-IC2：NPFRYEKKFKRKAAFILI

1g.在胞内环1上构建具有NLS的人D1多巴胺受体，并将其与GFP融合(D1-NLS-IC1-GFP)。

用于构建编码D1-NLS-IC1的DNA的引物对如下：

D1-NLSF-IC1：5’GTGCTGCCGTTAAAAAGTTCAAACGCCTGCGGTCCAAGG 3’

D1-NLSR-IC1：5’GGACCGCAGGCGTTTGAACTTTTTAACGGCAGCACAGACC 3’

以pcDNA3上编码D1多巴胺受体的DNA为模板、HD1-P1和D1-NLSR-IC1为引物进行PCR扩增(PCR#1)，得到300bp的产物。以pcDNA3上编码D1多巴胺受体的DNA为模板、HD1-P2和D1NLSF-IC1为引物进行PCR扩增(PCR#2)，得到1000bp的产物。以HD1-P1和HD1-P2为引物、PCR#1和PCR#2为模板进行后续PCR扩增，得到1300bp的产物。

将PCR得到的编码D1-NLS-IC1的DNA亚克隆入pEGFP载体中的EcoR1和Kpn1酶切位点处。

D1-野生型：LVCAAVIRFRHLRSKVTN

D1-NLS-IC1：LVCAAVKKFKRLRSKVTN

1h.在羧基尾部的近端构建具有另外的NLS的人多巴胺D1受体，并将其与GFP融合(D1-NLS2-GFP)。

使用PCR方法用NLS序列PKKKRKV替代D1受体中的天然序列ADFRKAF。以pcDNA3上编码D1多巴胺受体的DNA为模板、HD1-P1和HD1-NLS2R为引物进行PCR扩增，得到1kb的产物(PCR#1)。以pcDNA3上的D1为模板、HD1-P2和HD1-NLS2F为引物进行另一个PCR扩增，得到300bp的产物(PCR#2)。以HD1-P1和HD1-P2为引物、PCR#1和PCR#2为模板进行第三次PCR扩增，得到1.3kb的产物，并将此产物亚克隆入pEGFP载体中的EcoR1和Kpn1酶切位点处。

HD1-NLS2F：5’GCCTTTAATCCTAAAAAAAAAAGAAAGGTTTCAACCCTCTTAGG 3’

HD1-NLS2R：5’CCTAAGAGGGTTGAAACCTTTCTTTTTTTTTTAGGATTAAAGGC 3’

D1-野生型：NPIIYAFNADFRKAFSTLL

D1-NLS2：NPIIYAFNPKKKRKVSTLL

2.构建与GFP融合的多巴胺D2受体和与GFP融合的D2-NLS多巴胺受体(D2-GFP和D2-NLS-GFP)。

用于扩增pcDNA3上编码D2-多巴胺受体的DNA的引物对如下：

HD2-P1：5’GGCCGTGGCTCCACCGAATTCGCCGCCATGGATCCACTGAATCTG 3’

HD2-P2：5’CTGTGCGGGCAGGCAGGGTACCGCGCAGTGGAGGATCTTCAGG 3’

引物HD2-P1上整合有限制性位点EcoR1，引物HD2-P2上整合有限制性位点Kpn1。将不含有终止密码子的D2-PCR产物单方向地亚克隆入pEGFP载体(Clontech)中的限制性位点EcoR1和Kpn1处，且符合GFP蛋白起始密码子的读码框。

用于构建D2-NLS-GFP的引物对如下：

HD2-NLSF：5’CACCACCTTCAACAAAAAATTCAAAAGAGCCTTCCTGAAGATCC 3’

HD2-NLSR：5’GGATCTTCAGGAAGGCTCTTTTGAATTTTTTGTTGAAGGTGGTG 3’

使用D2-GFP DNA构建体为模板，将NLS序列KKFKR插入到D2受体TM7片段的碱基中，替代序列IEFRK。

以编码D2-GFP的DNA为模板、HD2-P1和HD2-NLSR为引物进行PCR扩增，得到1300bp的产物(PCR#1)。以编码D2-GFP的DNA为模板、HD2-P2和HD1-NLSF为引物进行PCR扩增，得到100bp的产物(PCR#2)。以HD2-P1和HD2-P2为引物、PCR#1和PCR#2的产物为模板进行后续PCR扩增，得到1400bp的产物。将得到的编码D2-NLS的构建体亚克隆入pEGFP载体中的EcoR1和Kpn1酶切位点处。

3.构建编码与GFP融合的D3和D5多巴胺受体的DNA(D3-GFP和D5-GFP)。

用于扩增pcDNA3上编码D3-多巴胺受体的DNA的引物对如下：

HD3-Hind：5’GGCATCACGCACCTCAAGCTTGCCGCCATGGCATCTCTGAGTCAGC 3’

HD3-Kpn：5’GAGTGTTCCCTCTTCTGCGGTACCGCGCAAGACAGGATCTTGAGG3’

引物HD3-Hind上整合有限制性位点HindIII，引物HD3-Kpn上整合有限制性位点Kpn1。将不含终止密码子的D3-PCR产物单方向亚克隆入pEGFP载体中的限制性位点HindIII和Kpn1处，并符合GFP蛋白起始密码子的读码框。

用于扩增pcDNA3上编码D5多巴胺受体的DNA的引物对如下：

T7：5’AATACGACTCACTATAG 3’

HD5-Kpn：5’CGCCAGTGTGATGGATAATGGTACCGCATGGAATCCATTCGGGGTG 3’

引物HD5-Kpn上整合有限制性位点Kpn1。将不含终止密码子的D5-PCR产物单方向亚克隆入pEGFP载体中的限制性位点EcoR1和Kpn1处，并符合GFP蛋白起始密码子的读码框。

4.构建与GFP融合的组胺1受体和与GFP融合的组胺1-NLS受体(H1-GFP和H1-NLS-GFP)。

用于从人基因组DNA中扩增编码H1组胺受体的DNA的引物对如下：

H1-MET：5’GCGCCAATGAGCCTCCCCAATTCC 3’

H1-STOP：5’GAGCCTCCCTTAGGAGCGAATATGC 3’

所述的H1-PCR产物在后续PCR实验中用作模板。

用于扩增编码H1-GFP构建体的DNA的引物对如下：

H1-PST：5’CGCCTGCAGGCCGCCATGAGCCTCCCCAATTCCTC C 3’

H1-APA：5’CCGGTGGATCCCGGGCCCCGGAGCGAATATGCAG 3’

引物H1-PST上整合有限制性位点PstI，引物H1-APA上整合有限制性位点ApaI。将不含终止密码子的H1-PCR产物单方向亚克隆入pEGFP载体中的限制性位点PstI和ApaI处，并符合GFP蛋白起始密码子的读码框。

用于扩增编码H1-NLS-GFP的DNA的引物H1-NLSR为：5’GGGCCCCGGAGCGAATATGCAGAATTCTCTTGAATGTCCTCTTGAATTTTTTATTGCACAAGG 3’。

使用以H1-GFP为模板的PCR方法，将NLS序列KKFKR插入到编码H1受体的TM7片段的DNA中，替代序列ENFKK。以H1-PST和H1-NLSR为引物的PCR反应的产物长1500bp。将得到的编码H1-NLS的片段亚克隆入pEGFP载体中的限制性位点PstI和ApaI处。

5.构建融合有GFP的半胱氨酰白三烯受体1和融合有GFP的CysLT1-NLS(CysLT1-GFP和CysLT1-NLS-GFP)。

用于扩增pcDNA3上编码CysLT1受体的DNA的引物对如下：

LT1-EcoR1：5’AAGAATTCGCCACCATGGATGAAACAGGAAATCT G 3’

LT1-Kpn1：5’GGGTACCGCTACTTTACATATTTCTTCTCC 3’

引物LT1-EcoR1上整合有限制性位点EcoR1，引物LT1-Kpn1上整合有限制性位点Kpn1。将不含终止密码子的CysLT1-PCR DNA产物定向亚克隆入pEGFP载体中的限制性位点EcoR1和Kpn1处，并符合GFP蛋白起始密码子的读码框。

用于扩增编码CysLT1-NLS-GFP的DNA的引物对如下：

LT1-NLSF：5’TTCTTTTCTGGGAAAAAATTTAAGAGAAGGCTGTCTAC 3’

LT1-NLSR：5’TGTAGACAGCCTTCTCTTAAATTTTTTCCCAGAAAAG 3’

使用以编码CysLT1-GFP的DNA为模板的PCR方法，将NLS序列KKFKR插入到编码CysLT1的TM7片段的DNA中，代替序列GNFRK。以编码CysLT1-GFP的DNA为模板、LT1-EcoR1和LT1-NLSR为引物进行PCR扩增，得到900bp的产物(PCR#1)。以编码CysLT1-GFP的DNA为模板、LT1-Kpn1和LT1-NLSF为引物进行PCR扩增，得到100bp的产物(PCR#2)。以LT1-EcoR1和LT1-Kpn1为引物、PCR#1和PCR#2的产物为模板进行后续PCR扩增，得到1000bp的产物。将得到的编码CysLT1-NLS的DNA亚克隆入pEGFP载体中的EcoR1和Kpn1酶切位点处。

6.构建融合有GFP的半胱氨酰白三烯受体2和融合有GFP的CysLT2-NLS(CysLT2-GFP和CysLT2-NLS-GFP)。

用于扩增pcDNA上编码CysLT2的DNA的引物对如下：

LT2-EcoR1：5’CTTTTTGTGTCTGTTTCTGAATTCGCCACCATGGAGAGAAAATTTATG 3’

LT2-Kpn1：5’GAACAGGTCTCATCTAAGAGGTACCGCTACTCTTGTTTCCTTTCTC 3’

引物LT2-EcoR1上整合有限制性位点EcoR1，引物LT2-Kpn1上整合有限制性位点Kpn1。将不含终止密码子的CysLT2产物定向亚克隆入pEGFP载体中的限制性位点EcoR1和Kpn1处，并符合GFP蛋白起始密码子的读码框。

用于扩增CysLT2-NLS-GFP的引物对如下：

LT2-NLSF：5’GCTGGGAAAAAATTTAAAAGAAGACTAAAGTCTGCAC 3’

LT2-NLSR：5’GTCTTCTTTTAAATTTTTTCCCAGCAAAGTAATAGAGC 3’

使用PCR方法，将NLS序列KKFKR插入到CysLT2的TM7片段中，代替序列ENFKD。以编码CysLT2-EGFP的DNA为模板、LT2-EcoR1和LT2-NLSR为引物进行PCR扩增，得到900bp的产物(PCR#1)。以编码引物LT2-Kpn1和LT2-NLSF的DNA进行PCR扩增，得到200bp的片段(PCR#2)。以LT2-EcoR1和LT2-Kpn1为引物、PCR#1和PCR#2的产物为模板进行后续PCR扩增，得到1100bp的产物。将得到的编码CysLT2-NLS的DNA亚克隆入pEGFP载体中的EcoR1和Kpn1酶切位点处。

7.构建融合有GFP的M1毒蕈碱受体和融合有GFP的M1毒蕈碱NLS受体(M1-GFP和M1-NLS-GFP)。

用于从人基因组DNA上扩增编码毒蕈碱受体(M1)的DNA的引物对如下：

M1-MET：5’CCCCACCTAGCCACCATGAACACTTC 3’

M1-STOP：5’GGGGACTATCAGCATTGGCGGGAGG 3’

用于MR1-EGFP的引物对如下：

M1-PST：5’CCCCACCTGCAGCCACCATGAACACTTCAGCC 3’

M1-BAMH：5’GGGGAGGATCCGCGCATTGGCGGGAGGGAGT GC3’

引物M1-PST上整合有限制性位点PstI，引物M1-BAMH上整合有限制性位点BamHI。将不含终止密码子的M1 PCR产物定向亚克隆入pEGFP载体中的限制性位点PstI和BamHI处，并符合EGFP蛋白起始密码子的读码框。

用于M1-NLS EGFP的引物对如下：

M1-NLSF：5’CGCACTCTGCAACAAAAAATTCAAACGCACCTTTCGCC 3’

M1-NLSR：5’GGCGAAAGGTGCGTTTGAATTTTTTGTTGCAGAGTGCG 3’

使用MR1为模板的PCR方法，将NLS序列KKFKR插入到M1的TM7片段中，代替序列KAFRD。以编码MR1的DNA为模板、M1-PST和M1-NLSR为引物进行PCR扩增，得到1200bp的产物(PCR#1)。以编码MR1的DNA为模板、M1-BAMH和M1-NLSF为引物进行PCR扩增，得到100bp的产物(PCR#2)。以M1-PST和M1-BAMH为引物、PCR#1和PCR#2的产物为模板进行后续PCR扩增，得到1300bp的产物。将得到的编码MR1-NLS的片段亚克隆入pEGFP载体中的PstI和BamHI酶切位点处。

8.构建融合有GFP的5-羟色胺受体(5HT1B)和融合有GFP的5-羟色胺NLS受体(5HT1B-GFP和5HT1B-NLS-GFP)。

用于从编码5HT1B受体的质粒pcDNA3上扩增编码5HT1B受体的DNA的引物对如下：

5HT1B-E1：5’GGGGCGAATTCGCCGCCATGGAGGAACCGGGTGC 3’

5HT1B-KPN：5’GCAAACGGTACCGCACTTGTGCACTTAAAACGTA 3’

引物5HT1B-E1上整合有限制性位点EcoR1，引物5HT1B-KPN上整合有限制性位点Kpn1。将不含终止密码子的5HT1B PCR产物定向亚克隆入pEGFP载体中的限制性位点EcoR1和Kpn1处，并符合GFP蛋白起始密码子的读码框。

用于5HT1B-NLS EGFP的引物对如下：

5HT1B-NLSE：5’ATGTCCAATAAAAAATTTAAAAGAGCATTCCATAAACTG 3’

5HT1B-NLSR：5’GGAATGCTCTTTTAAATTTTTFATTGGACATGGTATAG 3’

使用以5HT1B-EGFP为模板的PCR方法，将NLS序列KKFKR插入到5HT1B的TM7片段中，代替序列EDFKQ。以编码5HT1B-EGFP的DNA为模板、5HT1B-E1和HD1-NLSF为引物进行PCR扩增，得到1100bp的产物(PCR#1)。以编码5HT1B-EGFP的DNA为模板、5HT1B-KPN和HD1-NLSR为引物进行PCR扩增，得到100bp的产物(PCR#2)。以5HT1B-E1和5HT1B-KPN为引物、PCR#1和PCR#2的产物为模板进行后续PCR扩增，得到1200bp的产物。将得到的编码5HT1B-NLS的DNA亚克隆入pEGFP载体中的EcoR1和Kpn1酶切位点处。

9.构建融合有GFP的β2-肾上腺素能受体(β2-AR)和融合有GFP的β2-AR-NLS1受体(β2-AR-GFP和β2AR-NLS1-GFP)。

用于从pcDNA3上扩增编码β2-AR受体的DNA的引物对如下：

T7：5’AATACGACTCACTATAG 3’

β2-Kpn：5’GCCGCCAGTGTGATGGATACTGGTACCGCTAGCAGTGAGTCATTTGTAC 3’

引物β2-Kpn上整合有限制性位点Kpn1。将不含终止密码子的β2-AR产物定向亚克隆入pEGFP载体中的限制性位点EcoR1和Kpn1处，并符合GFP蛋白起始密码子的读码框。

使用以β2-AR-EGFP为模板的PCR方法，将NLS序列KKFKR插入到β2-AR的TM7片段中，代替序列PDFRI。以编码β2-AR-EGFP的DNA为模板、T7和B2-NLSR为引物进行PCR扩增，得到1100bp的产物(PCR#1)。以编码β2-AR-EGFP的DNA为模板、β2-Kpn和B2-NLSF为引物进行PCR扩增，得到300bp的产物(PCR#2)。以T7和β2-Kpn为引物、PCR#1和PCR#2的产物为模板进行后续PCR扩增，得到1300bp的产物。将得到的编码β2-NLS的DNA亚克隆入pEGFP载体中的EcoR1和Kpn1酶切位点处。

10.构建融合有GFP的、具有另外一个NLS的β2-肾上腺素能受体(β2-NLS2-GFP)。

用于从pcDNA3上扩增编码β2-NLS2受体的DNA的引物对如下：

B2D1NLSF：5’CCCCTTATCTACGCCTTTAGCGCAAAGAAGTTCAAGCGC 3’

B2D1NLSR：5’GCGCTTGAACTTCTTTGCGCTAAAGGCGTAGATAAGGGG 3’

以编码β2-AR-GFP的DNA为模板、T7和B2D1NLSR为引物进行PCR扩增，得到1000bp的产物(PCR#1)。以编码β2-AR-GFP的DNA为模板、β2-Kpn和B2D1NLSF为引物进行PCR扩增，得到300bp的产物(PCR#2)。以T7和β2-Kpn为引物、PCR#1和PCR#2为模板进行后续PCR扩增，得到1300bp的产物。将得到的编码β2-NLS2的DNA亚克隆入pEGFP载体中的EcoR1和Kpn1酶切位点处。

使用以β2-GFP为模板的PCR方法，将NLS序列AFSAKKFKR插入到β2-AR的TM7片段中，代替序列CRSPDFRIA。

将得到的编码β2-NLS2的DNA亚克隆入pEGFP载体中的EcoR1和Kpn1酶切位点处。

11.构建融合有GFP的、具有一个另外的NLS的β2-肾上腺素能受体(β2-NLS3-GFP)。

将NLS序列KKFKR插入到β2-AR羧基尾部的近端片段的另一个位置上。以编码pcDNA3上的β2AR的DNA为模板、T7和rB2-NLS3R为引物进行PCR扩增，得到1000bp的产物。以β2-Kpn和B2-NLS3F为引物进行PCR扩增，得到300bp的产物。以T7和β2-Kpn为引物、PCR#1和PCR#2的产物为模板进行PCR扩增，得到1300bp的产物(β2AR-NLS3)，并将该产物亚克隆入pEGFP载体中的EcoR1和Kpn1酶切位点处。

用于β2-NLS3-GFP的引物对如下：

B2-NLS3F：5’CTGCCGGAGCAAAAAATTCAAAAGAGCCTTCCAGGAGC 3’

B2-NLS3R：5’CCTGGAAGGCTCTTTTGAATTTTTTGCTCCGGCAGTAG 3’

野生型β2：NPLIYCRSPDFIRAFQELL

β2AR-NLS3：NPLIYCRSKKFKRAFQELL

12.构建融合有GFP的多巴胺转运蛋白(DAT-GFP)。

采用PCR方法扩增编码人多巴胺转运蛋白(hDAT)的全长cDNA，该PCR方法以pcDNA3上的DAT为模板，使用引物T7和DT-1(5’CGTCTCTGCTCCCTGGTACCGCCACCTTGAGCCAGTGG 3’)。将不含终止密码子的所述PCR产物定向亚克隆入pEGFP载体(来自于Clontech)中的限制性位点EcoR1和Kpn1处，并符合GFP蛋白起始密码子的读码框。

13a.构建融合有RFP的、含有NLS的人多巴胺转运蛋白(DAT-NLS-RFP)。

以1718和hDAT-NLSF为引物，用PCR扩增编码人多巴胺转运蛋白(hDAT)的cDNA，得到100bp的片段。以T7和hDAT-NLSR为引物再次PCR扩增编码人多巴胺转运蛋白(hDAT)的cDNA，得到1.7kb的片段。以所述两个PCR片段为模板、T7和1718为引物进行PCR扩增，得到1.8kb的片段。

引物T7：5’TAATACGACTCACTATAGGG 3’

引物1718：5’CGTCTCTGCTCCCTGGTACCGCCACCTTGAGCCAGTGG 3’

hDAT-NLSF：5’CTATGCGGCCAAAAAGTTCAAAAGACTGCCTGGGTCC 3’

hDAT-NLSR：5’CAGGCAGTCTTTTGAACTTTTTGGCCGCATAGATGGGC 3’

将所述PCR产物定向亚克隆入pRFP载体中的限制性位点EcoR1和Kpn1处，并符合RFP蛋白起始密码子的读码框。

得到的编码TM12后的NLS序列KKFKR的PCR片段如下：

DAT野生型：SSMAMVPIYAAYKFCSLPGSFREK

DAT-NLS：SSMAMVPIYAAKKFKRLPGSFREK

13b.构建融合有GFP的、含有NLS的人多巴胺转运蛋白(DAT-NLS-GFP)。

将NLS序列KKFKR插入到人DAT的跨膜12片段后的近端羧基尾部中。以pcDNA3上编码人DAT-cDNA的DNA为模板、T7和hDAT-NLSR为引物进行第一次PCR扩增，得到1.7kb的产物。以1718和hDAT-NLSF为引物进行第二次PCR扩增，得到100bp的产物，然后以T7和1718为引物、PCR#1和PCR#2的产物为模板进行最终的PCR扩增，得到1.8kb的产物(DAT-NLS)，并将该产物亚克隆入pEGFP载体(Clontech)中的EcoR1和Kpn1酶切位点处，且与GFP融合。

引物序列如下：

hDAT-NLSF：5’CTATGCGGCCAAAAAGTTCAAAAGACTGCCTGGGTCC 3’

hDAT-NLSR：5’CAGGCAGTCTTTTGAACTTTTTGGCCGCATAGATGGGC 3’

人DAT野生型：SSMAMVPIYAAYKFCSLPGSFREK

人DAT-NLS：SSMAMVPIYAAKKFKRLPGSFREK

14.构建融合有GFP的人5-羟色胺转运蛋白(SERT-GFP)。

采用PCR方法从含有SERT cDNA的pcDNA3中得到全长的人SERTcDNA，该PCR方法中使用的两条引物如下：

SERT-HIND：5’GTCATTTACTAAGCTTGCCACCATGGAGACGACGCCCTTG 3’

SERT-KPN：5’CCTCTCGGTGAGTGGTACCGCCACAGCATTCAAGCGG 3’

将不含终止密码子的所述PCR产物定向亚克隆入pEGFP载体(Clontech)中的限制性位点HindIII和Kpn1处，并符合GFP蛋白起始密码子的读码框。

15.构建融合有GFP的人低密度脂蛋白受体(LDL-R-GFP)。

采用PCR方法扩增编码LDL(低密度脂蛋白)的全长cDNA，该PCR方法中所用的LDLR-HIND和LDLR-KPN引物序列如下：

LDLR-HIND：5’GGACACTGCCTGGCAAAGCTTGCGAGCATGGGGCCCTGG 3’

LDLR-KPN：5’GGCGGGACTCCAGGCAGGTACCGCCGCCACGTCATCCTCC 3’

将不含终止密码子的所述PCR产物(2600bp)定向亚克隆入pEGFP载体(Clontech)中的限制性位点HindIII和Kpn1处，并符合GFP蛋白起始密码子的读码框。

16.构建融合有GFP的、含有NLS的人低密度脂蛋白受体(LDLR-NLS-GFP)。

采用PCR方法将NLS序列KKFKR插入到编码LDL受体的DNA中，替代编码RLKNI的天然序列。

用于构建编码LDL-NLS的DNA的引物对如下：

LDL-NLSF：5’CTATGGAAGAACTGGAAAAAATTTAAAAGAAACAGCATCAAC 3’

LDL-NLSR：5’CAAAGTTGATGCTGTTTCTTTTAAATTTTTTCCAGTTCTTCC 3’

以pcDV1上的编码LDL cDNA的人DNA为模板、LDLR-HIND和LDL-NLSR为引物进行PCR扩增，得到2450bp的产物(PCR#1)。以编码LDL的DNA为模板、LDLR-KPN和LDL-NLSF为引物进行PCR扩增，得到150bp的产物(PCR#2)。以LDLR-HIND和LDLR-KPN为引物、PCR#1和PCR#2的产物为模板进行后续PCR扩增，得到2600bp的产物。

得到的含有NLS序列KKFKR突变的PCR产物如下：

人LDL-R野生型：FLLWKNWRLKNINSINFDNP

人LDL-R：FLLWKNWKKFKRNSINFDNP

将不含终止密码子的所述PCR产物定向亚克隆入pEGFP载体(Clontech)中的限制性位点HindIII和Kpn1处，并符合GFP蛋白起始密码子的读码框。

17.构建融合有GFP的表皮生长因子受体(EGFR-GFP)。

采用PCR方法得到Prkf载体上的全长人EGFR cDNA，在所述PCR方法中使用以下两条引物：

HER-XHO：5’GCTCTTCGGGCTCGAGCAGCGATGCGACCCTCCGGGACGG 3’

HER-KPN：5’CTATCCTCCGTGGTACCGCTGCTCCAATAAATTCACTGC 3’

将不含终止密码子的所述PCR产物(3600bp)定向亚克隆入pEGFP载体(Clontech)中的限制性位点XhoI和Kpn1处，并符合GFP蛋白起始密码子的读码框。

18.构建融合有GFP的、含有NLS的人5-羟色胺转运蛋白(SERT-NLS-GFP)。

采用PCR方法将NLS序列KKFKR插入编码SERT的DNA中，替代编码GTFKE的天然序列。

用于扩增编码SERT-NLS的DNA的引物对如下：

SERT-NLSF：5’GATCATCACTCCAAAGAAATTTAAAAGACGTATTATT 3’

SERT-NLSR：5’TAATACGTCTTTTAAATTTCTTTGGAGTGATGATCAACCG 3’

以pcDNA3上的人SERT-cDNA为模板、SERT-HIND和SERT-NLSR为引物进行PCR扩增，得到1800bp的产物(PCR#1)。以编码SERT(5-羟色胺)的DNA为模板、SERT-KPN和SERT-NLSF为引物进行PCR扩增，得到100bp的产物(PCR#2)。以SERT-HIND和SERT-KPN为引物、PCR#1和PCR#2的产物为模板进行后续PCR扩增，得到1900bp的产物。

得到的SERT的TM12后的编码NLS序列KKFKR突变的PCR产物如下：

人SERT野生型：RLIITPGTFKERIIKSIT

人SERT：RLIITPKKFKRRIIKSIT

将不含终止密码子的所述PCR产物定向亚克隆入pEGFP载体(Clontech)中的限制性位点HindIII和Kpn1处，并符合GFP蛋白起始密码子的读码框。

19.构建融合有GFP的、含有和不含有NLS的促代谢型谷氨酸-4-受体(mGluR4-GFP和mGluR4-NLS-GFP)。

从大鼠cDNA中得到编码mGluR4(促代谢型谷氨酸-4-受体)的DNA时所用的引物对如下：

GLUR4-HIND：5’GGGTCTCTAAGCTTGCCGCCATGTCCGGGAAGGG 3’

GLUR4-ECOR1：5’CCGCGGCCCGGAATTCGGATGGCATGGTTGGTG 3’

引物GLUR4-HIND上整合有限制性位点HindIII，引物GLUR4-ECOR1上整合有限制性位点EcoR1。将不含终止密码子的mGluR4的PCR产物定向亚克隆入pEGFP载体(Clontech)中的限制性位点HindIII和EcoR1处，并符合GFP蛋白起始密码子的读码框。

将NLS序列KKFKR引入编码mGluR4的DNA中，替代天然序列KRKRS。

用于扩增将NLS引入大鼠mGluR4-EGFP中的DNA的引物对如下：

GLUR4-NLSF：5’CGTGCCCAAGAAATTCAAGCGCCTCAAAGCCGTGGTC 3’

GLUR4-NLSR：5’CGGCTTTGAGGCGCTTGAATTTCTTGGGCACGTTCTGC 3’

以编码GluR4(谷氨酸-4-受体)的大鼠DNA为模板、GLUR4-HIND和GLUR4-NLSR为引物进行PCR扩增，得到2600bp的产物(PCR#1)。以编码GluR4的DNA为模板、GLUR4-ECOR1和GLUR4-NLSF为引物进行PCR扩增，得到160bp的产物(PCR#2)。以GLUR4-HIND和GLUR4-ECOR1为引物、PCR#1和PCR#2的产物为模板进行后续PCR扩增，得到2760bp的产物。

得到的含有NLS序列KKFKR突变的PCR产物如下：

大鼠mGluR4野生型：FHPEQNVPKRKRSLKAVVTAAT

大鼠mGluR4：FHPEQNVPKKFKRLKAVVTAAT

将所述PCR产物定向亚克隆入pEGFP载体(Clontech)中的限制性位点HindIII和EcoR1处，并符合GFP蛋白起始密码子的读码框。

20.构建融合有GFP的人胰岛素受体(IR-GFP)。

从质粒pRK5中获得全长IR(胰岛素受体)cDNA时所用的两条PCR引物如下：

HIR-HIND：5’GGAGACCCCAAGCTTCCGCAGCCATGGGCACCGGGGGCC 3’

HIR-APA：5’CCCCGCCACGGGCCCCGGAAGGATTGGACCGAGGCAAGG 3’

将不含终止密码子的所述PCR产物(4.2kb)定向亚克隆入pEGFP载体(Clontech)中的限制性位点HindIII和ApaI处，并与GFP蛋白融合。

21.构建融合有GFP的、含有NLS的人胰岛素受体(IR-NLS-GFP)。

将NLS序列KKFKR引入人胰岛素受体中，以替代序列LYASS。

以pRK5载体中的人胰岛素受体cDNA为模板、HIR-HIND和HIR-NLSR为引物进行第一次PCR扩增(PCR#1)，得到2.9kb的产物；然后以HIR-APA和HIR-NLSF为引物进行第二次PCR扩增(PCR#2)，得到1.3kb的产物；再以HIR-HIND和HIR-APA为引物、PCR#1和PCR#2的产物为模板进行第三次PCR扩增(PCR#3)，得到4.2kb的片段。将不含终止密码子的所述PCR产物定向亚克隆入pEGFP载体中的限制性位点HindIII和ApaI处，并由此与GFP蛋白融合。

用于HIR-NLS的引物如下：

HIR-NLSF：5’CCGCTGGGACCGAAAAAATTTAAGAGAAACCCTGAGTATCTC 3’

HIR-NLSR：5’GATACTCAGGGTTTCTCTTAAATTTTTTCGGTCCCAGCGGCCC 3’

22.构建融合有GFP的人红细胞生成素受体(EPO-GFP)。

以pc3.1载体上的编码人红细胞生成素(EPO)受体的cDNA为模板的PCR方法来获得全长cDNA，该方法中采用如下引物：

T7：5’TAATACGACTCACTATAGGG 3’

EPO-KPN：5’GACTGCAGCCTGGTGGTACCGCAGAGCAAGCCACATAGCTGGGG 3’

将不含终止密码子的所述PCR产物(1.6kb)定向亚克隆入pEGFP载体中的限制性位点HindIII和Kpn1处，并与GFP蛋白融合。

23.构建融合有GFP的、含有NLS的人红细胞生成素受体(EPO-NLS-GFP)。

采用PCR方法将NLS序列KKFKR插入编码EPO受体的DNA中，替代天然序列RRALK。

以pc3.1中的人EPO-cDNA为模板、T7和EPO-NLSR为引物进行第一次PCR扩增(PCR#1)，得到900bp的产物；以EPO-KPN和EPO-NLSF为引物进行第二次PCR扩增(PCR#2)，得到700bp的产物；然后以T7和EPO-KPN为引物、PCR#1和PCR#2的产物为模板进行第三次PCR扩增，得到1.6kb的片段。将不含终止密码子的所述PCR产物(1.6kb)定向亚克隆入pEGFP载体中的限制性位点HindIII和Kpn1处，并由此与GFP蛋白融合。

引物序列如下：

T7：5’TAATACGACTCACTATAGGG 3’

EPO-KPN：5’GACTGCAGCCTGGTGGTACCGCAGAGCAAGCCACATAGCTGGGG 3’

EPO-NLSF：5’GCTGCTCTCCCACAAAAAGTTTAAGCGGCAGAAGATCTGG 3’

EPO-NLSR：5’CCAGATCTTCTGCCGCTTAAACTTTTTGTGGGAGAGCAGC 3’

人EPO野生型：TVLALLSHRRALKOKIWPGIP

人EPO NLS：TVLALLSHKKFKROKIWPGIP

24.构建融合有GFP的人表皮生长因子受体(EGFR-GFP)。

采用PCR方法以Prk5载体上的人表皮生长因子受体的cDNA为模板，扩增其全长cDNA，该PCR方法中使用以下引物：

HER-XHO(5’GCTCTTCGGGCTCGAGCAGCGATGCGACCCTCCGGGACGG 3’)和

HER-KPN(5’CTATCCTCCGTGGTACCGCTGCFCCAATAAATTCACTGC 3’)。

将不含终止密码子的所述PCR产物(3.6kb)定向亚克隆入pEGFP载体(Clontech)中的限制性位点XhoI和Kpn1处，并与GFP蛋白融合。

25.构建融合有GFP的、含有NLS的人表皮生长因子受体(EGFR-NLS-GFP)。

使用如下PCR方法将NLS序列KKFKR插入到人表皮生长因子受体的序列中。以Prk5载体上的人EGFR(表皮生长因子受体)cDNA为模板、HER-XHO和EGF-NLSR为引物进行第一次PCR扩增，得到2.1kb的产物。以HER-KPN和EGF-NLSF为引物进行第二次PCR扩增，得到1.5kb的产物；再以HER-XHO和HER-KPN为引物、PCR#1和PCR#2的产物为模板进行最终的PCR扩增，将得到的不含终止密码子的3.6kb的PCR产物(EGFR-NLS)亚克隆入pEGFP载体(Clontech)中的限制性位点XhoI和Kpn1处，并与GFP蛋白融合。

引物下列如下：

EGF-NLSF：5’CACATCGTTCGGAAGAAGTTTAAGCGGAGGCTGCTGC 3’

EGF-NLSR：5’CCTGCAGCAGCCTCCGCTTAAACTTCTTCCGAACGATGTG 3’

人EGFR野生型：RRRHIVRKRTLRRLLQERE

人EGFR-NLS：RRRHIVRKKFKRRLLQERE

26.构建融合有RFP的、含有2个NLS的人D1多巴胺受体(D1-NLS(螺旋8和羧基尾部)-RFP)。

使用如下PCR方法将第二个NLS序列KKKRK插入到人D1-NLS-Helix 8(螺旋8)的羧基尾部片段中。以pDsRed载体中的编码人D1-NLS-Helix 8的DNA为模板、HD1-P1和HD1-NLSCR为引物进行第一次PCR扩增，得到1.2kb的产物；以HD1-P2和HD1-NLSCF为引物进行第二次PCR扩增，得到100bp的产物。然后以HD1-P1和HD1-P2为引物、PCR#1和PCR#2的产物为模板进行最终的PCR扩增，将得到的1.3kb的PCR产物(D1-NLS-Helix 8和羧基尾部)亚克隆入pDsRed载体中的限制性位点EcoR1和Kpn1处，并与DsRed蛋白融合。

引物下列如下：

HD1-P1：5’GAGGACTCTGAACACCGAATTCGCCGCCATGGACGGGACTGGGCTGGTG 3’

HD1-P2：5’GTGTGGCAGGATTCATCTGGGTACCGCGGTTGGGTGCTGACCGTT 3’

HD1-NLSCF：5’CCTCTGAGGACCTGAAAAAGAAGAGAAAGGCTGGCATCGCC 3’

HD1-NLSCR：5’GGCGATGCCAGCCTTTCTCTTCTTTTTCAGGTCCTCAGAGG 3’

D1-野生型：

NPIIYAFNADFRKAFSTLL…………SSEDLKKEEAAGIA

D1-NLS(螺旋8和羧基尾部)：

NPIIYAFNAKKFKRFSTLL…………SSEDLKKKRKAGIA

27.构建融合有GFP的μ阿片受体(Mu-GFP)

使用PCR以pcDNA3上编码μ阿片受体的DNA为模板的PCR方法，该方法中使用以下引物：

RATMU1：5’CCTAGTCCGCAGCAGGCCGAATTCGCCACCATGGACAGCAGCACC 3’

RATMU-2：5’GATGGTGTGAGACCGGTACCGCGGGCAATGGAGCAGTTTCTGCC 3’

引物RATMU-1上整合有限制性位点EcoR1。引物RATMU-2上整合有限制性位点Kpn1。

将不含终止密码子的PCR产物(1.2kb)定向亚克隆入pEGFP载体(Clontech)中的限制性位点EcoR1和Kpn1处，并由此与GFP蛋白融合。

28.构建融合有GFP的、含有NLS的μ阿片受体(Mu-NLS-GFP)。

使用如下PCR方法将NLS序列KKFKR插入到μ阿片受体的近端羧基尾部片段(螺旋8)中。以pcDNA3载体中编码大鼠μ阿片受体的DNA为模板、RATMU1和MU-NLSR为引物进行第一次PCR扩增，得到1000bp的产物；以RATMU-2和MU-NLSF为引物进行第二次PCR扩增，得到200bp的产物。然后以RATMU1和RATMU2为引物、PCR#1和PCR#2的产物为模板进行最终的PCR扩增，将得到的1200bp的PCR产物(Mu-NLS)亚克隆入pEGFP载体中的限制性位点EcoR1和Kpn1处，并与GFP蛋白融合。

引物序列如下：

RATMU-1：5’CCTAGTCCGCAGCAGGCCGAATTCGCCACCATGGACAGCAGCACC 3’

RATMU-2：5’GGATGGTGTGAGACCGGTACCGCGGGCAATGGAGCAGTTTCTGCC 3’

MU-NLSF：5’GCCTTCCTGGATAAAAAATTCAAGCGATGC 3’

MU-NLSR：5’GCATCGCTTGAATTTTTTATCCAGGAAGGCG 3’

细胞培养和转染

在37℃和5％CO₂的条件下、以单层培养的方式培养COS-7猴肾细胞和HEK293T人胚胎肾细胞(美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)，Manassa，VA)，使用加有10％胎牛血清和抗生素的最低必需培养基。为了收集细胞膜，使用lipofectamine试剂(LifeTechnologies，Rockville，MD)在70-80％融合时瞬时转染100mm(毫米)平板中的细胞。为了进行激光共聚焦显微镜研究，使用lipofectamine试剂在10-20％融合时瞬时转染60mm平板中的细胞。转染后6个小时，弃除溶液并加入新鲜培养基，转染后24小时再次用新鲜培养基替换原有溶液。

通过在14ml(毫升)的管子里混合120微升不含抗生素和/或胎牛血清(FBS)的培养基和15微升lipofectamine来制备转染培养基。将2微克编码所需融合蛋白的DNA构建体和120微升培养基混合后加入上述14ml管中，并将所述混合物轻柔混匀，在室温下温育25分钟。再加入4ml培养基并混匀。如果转染多种跨膜蛋白，则将其cDNA混合并一同转染。弃除细胞平板中的生长培养基，用从14ml管子中来的转染混合物代替。细胞在转染混合物中温育细胞5-6小时后，弃除所述混合物并以常规的含有FBS和抗生素的培养基代替。继续培养细胞，并在第二天使用常规培养基换液一次。

使用受试化合物进行处理

确定离开细胞表面延迟转位发生的试验方法

受试化合物存储液的浓度为1毫摩尔每升，当加入细胞平板时，使用生长培养基将其稀释成10纳摩尔每升至10微摩尔每升的最终浓度。在转染后6小时、22小时、30小时和42小时，加入所述新鲜制备的、含有受试化合物的培养基。

确定离开细胞表面的促进转位发生的试验方法

受试化合物存储液的浓度为1毫摩尔每升，当加入细胞时，在37℃的条件下使用生长培养基将其稀释成10微摩尔每升的最终浓度。以聚焦于单个细胞的形式对细胞培养物进行显微镜观察，检测细胞表面表达的可检测的标记蛋白。为了观察可检测成分分布情况的改变，在加入受试化合物5、10、15、20、30和35分钟后，用含有受试化合物的培养基替换生长培养基，并实时进行显微镜观察细胞。

显微镜观察

使用LSM510蔡司(Zeiss)共聚焦激光显微镜观察细胞。使用488nm(纳米)激发波长的氩激光激发后，能观察到GFP；使用543nm激发波长的氦氖激光激发后，能观察到DsRed。获取的共聚焦图象存储在磁盘上，用于后续分析。在每个实验中，计数多个视野中的细胞(n＝6-8，每个视野中有30-90个细胞)，并分析细胞表面、细胞质和细胞核中的信号蛋白定位情况。

流式细胞术

用多聚-L-鸟氨酸(1/10溶于PBS(磷酸盐缓冲液)中)包被96孔板，并温育1小时。在每个孔里加入50,000个细胞，使用Lipofectamine(Invitrogen，U.S.A.)转染编码有表位标记的受体的cDNA。每12小时更换培养基(MEM(最低必需培养液))，该培养基中含有不同浓度的受试药物或赋形剂。48小时后，清洗细胞并用4％多聚甲醛固定，然后冰浴30分钟。再将细胞与针对所述表位的一抗温育，随后与偶联有FITC(异硫氰酸荧光素)的二抗温育，并避免光照。清洗去除多余抗体，在Cytofluor4000(PerSpective Biosystems，U.S.A.)中读数检测96孔板上的信号。以488nm波长的光激发FITC，在其530nm的发射波长处读取信号。

放射性配体结合

将转染了编码D1-NLS的DNA的细胞用不同浓度的拮抗剂处理或不处理。48小时后，对所述细胞进行清洗、收集、裂解，并用Polytron匀浆。通过离心收集细胞膜成分，然后将其置于35％蔗糖溶液上，以30,000rpm(转每分钟)、4℃的条件下离心90分钟，以收集重的膜成分。将上述离心后的上清以35,000rpm和4℃的条件再次离心60分钟，以收集轻的膜成分。使用[³H]-SCH23390和用于确定特异性结合的10微摩尔的(+)丁克吗对所述膜成分进行放射性配体结合实验。在室温下温育2小时，随后通过闪烁计数进行快速过滤和定量。

从培养的细胞中分离细胞核

用PBS漂洗细胞三次，然后在存在10ml液体的条件下将所述细胞从培养皿上轻柔地刮下。汇集细胞，并在4℃将其以500g(相对离心力)离心5分钟。以每毫升液体5千万个细胞的浓度将成团块的细胞重悬在裂解缓冲液(Tris HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液)10mM(毫摩尔每升)pH7.4，NaCl(氯化钠)10mM，MgCl₂(氯化镁)3mM)和抑制物混合物(0.5％亮抑蛋白酶肽、1％大豆胰蛋白酶、1％苄脒)中。使用无菌的玻璃Teflon杵B(密封间距为20-50mm；Bellco Glass)进行上下100次的匀浆。

将上述产物以4℃、700g的条件离心10分钟，然后将得到的上清按顺序以4℃、10,000g的条件离心15分钟(去除线粒体)和以4℃、120,000g的条件离心60分钟(去除质膜)。

将得到的细胞核沉淀物用裂解缓冲液(含有抑制物)和0.1％ NP-40重悬，冰浴5分钟，然后以4℃、700g离心10分钟。弃上清，每次用15ml裂解缓冲液清洗三次沉淀物。细胞核沉淀物用2ml裂解缓冲液重悬后上样至不连续蔗糖梯度的顶部，以4℃、100,000g的条件离心60分钟，所述不连续蔗糖梯度由含有1mM MgCl₂的4.5ml的2.0M和1.6M蔗糖连续平铺而成。收集管底部的沉淀物，其含有纯的细胞核。

实施例1：融合有红色荧光蛋白的多巴胺D1受体(D1-RFP)或融合有红色荧光蛋白的、含有NLS的多巴胺D1受体(D1-NLS-RFP)。

如上述方法中所描述的(见图1)，将不含有NLS的多巴胺D1受体的序列进行修改，用NLS序列KKFKR(其相应于人AT1受体的NLS)替代TM7结构域的近膜部分的氨基酸DFRKA。构建了编码D1多巴胺受体融合蛋白D1-RFP和D1-NLS-RFP的DNA。用编码D1-NLS-RFP或D1-RFP的DNA(2微克)转染COS细胞，并温育24和48小时。用共聚焦显微镜以100倍放大系数检查所述细胞。在8-10个显微镜视野中人工计数细胞，并计算不同亚细胞腔室中标记物的比例。

在24和48小时，转染了D1-RFP的细胞中的大部分在细胞表面表达所述受体，而转染了D1-NLS-RFP的细胞几乎没有在细胞表面表达所述受体，但是在24和48小时，所述受体在转染了D1-NLS-RFP的细胞中核定位的比例分别为60％和80％。

实施例2：使用拮抗剂处理含有NLS的多巴胺D1受体融合蛋白(D1-NLS-RFP)。

用编码D1-NLS-RFP和野生型D1的构建体(2微克)转染COS细胞48小时。在转染后6、22、30和42小时，用多巴胺D1受体拮抗剂SCH23390(终浓度为10μM)处理所述细胞。也在转染后6、22、30和42小时，用拮抗剂(+)丁克吗(终浓度为10μM)处理细胞。对照细胞不用拮抗剂处理。

在48小时，大部分对照细胞的细胞核中可检测到D1-NLS-RFP。与此形成对比的是，大部分拮抗剂处理的细胞仅在细胞表面存在荧光，而其中42％的细胞在细胞表面和细胞核均存在荧光。

实施例3：多巴胺D1受体(D1-GFP)和含有NLS的D1受体(D1-NLS)共表达。

使用编码D1-NLS(3微克)和/或D1-GFP(1.5微克)的DNA构建体转染HEK细胞，并温育48小时。所述细胞也转染了编码DsRed-NUC的质粒(1微克)，以确认核定位。

也使用编码D1-GFP的DNA(2微克)转染细胞，温育48小时并用共聚焦显微镜检测。

仅表达D1-GFP的细胞中的90％出现细胞表面标记，10％同时出现细胞核与细胞表面标记。在转染了编码GPCR的任何DNA的细胞中，多至10％的细胞可观察到核定位。

在表达D1-GFP和D1-NLS的细胞中，35％的细胞同时具有细胞核与细胞表面标记，70％的细胞仅在细胞表面有所述受体表达。该实验显示，D1-NLS和D1-GFP的寡聚化作用导致D1-GFP与D1-NLS的共转位。

实施例4：在剂量反应研究中，用拮抗剂处理含有NLS的多巴胺D1受体(D1-NLS-GFP)。

使用编码D1-NLS-GFP(2微克)和D1-WT(野生型)(6微克)的DNA转染HEK细胞48小时。在转染后6小时，用SCH-23390(10μM)或(+)丁克吗(10μM)处理所述细胞。在转染后6、22、30和42小时，更换含有拮抗剂的培养基。对照细胞不用拮抗剂处理。

在SCH-23390处理48小时后，58％细胞的细胞表面表达D1-NLS-GFP，不到10％细胞的细胞核中表达所述受体，32％细胞的细胞表面和细胞核中同时有所述受体表达。

在(+)丁克吗处理48小时后，62％细胞的细胞表面表达D1-NLS-GFP受体，10％细胞的细胞核中表达所述受体，28％细胞的细胞表面和细胞核中同时有所述受体表达。

在48小时，对照细胞中的大约65％在细胞核表达D1-NLS-GFP受体，35％在胞浆包括所述受体。未发现在对照细胞的细胞表面有D1-NLS-GFP受体的表达。

在所述受体序列中整合入NLS，能够非常有效地将D1-NLS-GFP受体从细胞表面移去并定位于细胞核。

以各种剂量的SCH-23390或(+)丁克吗进行了类似研究。所述研究的结果显示在表2和表3中。其中，32-35％对照细胞的胞浆中存在所述受体。

表2

  SCH-23390浓度                           细胞百分比细胞表面上的受体细胞表面上和细胞  核中的受体  细胞核中的受体    10μM    5μM    1μM    0.5μM    0.2μM    0.0μM    58％    46％    39％    36％    32％    0    32％    42％    46％    44％    49％    ＜10％    12％    15％    20％    19％    62-70％

表3

 (+)丁克吗浓度                          细胞百分比细胞表面上的受体细胞表面上和细胞  核中的受体  细胞核中的受体    10μM    5μM    1μM    0.5μM    0.2μM    0.0μM    62％    47％    41％    40％    39％    0    28％    43％    43％    41％    21％    10％    10％    16％    19％    40％    62-70％

在所述受体序列中整合NLS，能使D1多巴胺受体非常有效地从细胞表面移去，而定位至细胞核。D1选择性的拮抗剂能以剂量反应的方式阻止所述转位过程。

实施例4a：表达并用激动剂处理含有插入的NLS的多巴胺D1受体(D1-NLS-GFP)。

使用编码D1-NLS-GFP的DNA构建体(1.5微克)转染HEK细胞，并与D1激动剂SKF-81297(10微摩尔)温育48小时。在转染6、22、30和42小时后，用含有SKF-81297(终浓度为10μM)的新鲜培养基处理细胞。使用共聚焦显微镜检查所述细胞。

使用编码D1-NLS-GFP的DNA构建体(1.5微克DNA)转染HEK细胞，并与D1激动剂培高利特(pergolide)(10微摩尔)温育48小时。在转染6、22、30和42小时后，用含有SKF-81297(终浓度为10μM)的新鲜培养基处理细胞。使用共聚焦显微镜检查所述细胞。

对照HEK细胞用编码D1-NLS-GFP的DNA构建体(1.5微克DNA)转染，但不作处理。

48小时后，在未处理细胞的表面没有检测到所述受体。在用SKF-81297处理的细胞中，59％的细胞表面有所述受体表达。在用培高利特处理的细胞中，59％的细胞表面有所述受体表达。因此，长时间的激动剂处理能够阻止修改后的D1受体向细胞核的运送。

实施例5：含有整合的NLS的多巴胺D1受体(D1-NLS-RFP)与野生型D1受体共表达。

用编码D1-NLS-RFP的DNA构建体(1微克)和编码天然多巴胺D1受体的DNA序列(D1-WT，7微克)共转染COS细胞，并温育24或48小时。

在24小时，仅在细胞表面能够检测到D1-NLS-RFP，而在48小时，80％细胞中的D1-NLS-RFP在细胞核中。由于同源寡聚化作用，野生型受体延缓了D1-NLS-RFP向细胞核的移动。

实施例6：含有整合的NLS的D1多巴胺受体(D1-NLS-RFP)与D1-GFP共表达。

将编码D1-NLS-RFP(4微克)和多巴胺D1-GFP(4微克)的构建体转染COS细胞，并温育48小时。使用共聚焦显微镜检查所述细胞。

在细胞表面上检测到D1-GFP，而在细胞核内检测到黄色荧光，后者表明D1-NLS-RFP和D1-GFP共定位在细胞核内，并确认D1-NLS-RFP和D1-GFP的寡聚化，从而导致D1-GFP转运入细胞核。

实施例6a：在第三个胞内胞浆环中插入NLS的D1多巴胺受体(D1-IC3-NLS-GFP)的表达。

用编码D1-IC3-NLS-GFP的DNA构建体(2微克)转染HEK细胞，并温育48小时。用DsRED-NUC(2微克)显示细胞核。使用共聚焦显微镜检查所述细胞。

在转染了D1-IC3-NLS-GFP的细胞中，85％细胞的细胞核中可以检测到所述受体。因此，在所述受体第三个胞内环插入NLS，能够使其转位至细胞核。

实施例6b：在第一个胞内胞浆环中插入NLS的D1多巴胺受体(D1-IC1-NLS-GFP)的表达。

用编码D1-IC1-NLS-GFP的DNA构建体(2微克)转染HEK细胞，并温育48小时。用DsRED-NUC(2微克)显示细胞核。使用共聚焦显微镜检查所述细胞。

在转染了D1-IC1-NLS-GFP的细胞中，85％细胞的细胞核中可以检测到所述受体。因此，在所述受体第一个胞内环插入NLS，能够使其转位至细胞核。

实施例6c：拮抗剂丁克吗或SCH-23390对在第一个胞浆环中插入NLS的D1多巴胺受体(D1-IC1-NLS-GFP)转运的影响。

将编码D1-IC1-NLS-GFP的DNA构建体(2微克)转染HEK细胞，并用丁克吗(终浓度为1μM)或SCH-23390(1μM)处理所述细胞48小时。用DsRED-NUC(2微克)显示细胞核。使用共聚焦显微镜检查所述细胞。

在丁克吗处理的细胞中，82％细胞中的所述受体在细胞表面上或胞浆里，18％细胞中的所述受体在细胞核里。因此，用丁克吗处理细胞能减少D1-IC1-NLS-GFP向细胞核的转运。

在SCH-23390处理的细胞中，77％细胞中的所述受体在细胞表面上或胞浆里，23％细胞中的所述受体在细胞核里。因此，用SCH-23390处理细胞能减少所述受体向细胞核的转运。

在未处理的细胞中，76％细胞中的所述受体表达在细胞核与胞浆中。

实施例6d：拮抗剂SCH-23390对在第三个胞浆环中插入NLS的D1多巴胺受体(D1-IC3-NLS-GFP)转运的影响。

用编码D1-IC3-NLS-GFP的DNA构建体(2微克)转染HEK细胞，并用4种不同浓度的SCH-23390(10μM、1μM、500nM和100nM)处理48小时。用DsRED-NUC(2微克)显示细胞核。使用共聚焦显微镜检查所述细胞。

在转染了D1-IC3-NLS-GFP的细胞中，86％细胞中的所述受体在细胞核里，0％细胞中的所述受体在细胞表面上。在SCH-23390处理的细胞中，84％细胞中的所述受体在细胞核里，15％细胞中的所述受体在细胞表面上。在GPCR的所述位点中插入NLS能够有效地使所述受体转位至细胞核，而对所述药物没有反应。

实施例6e：在第二个胞内胞浆环中插入NLS的D1多巴胺受体(D1-IC2-NLS-GFP)的表达。

用编码D1-IC2-NLS-GFP的DNA构建体(2微克)转染HEK细胞，并温育48小时。用DsRED-NUC(2微克)显示细胞核。使用共聚焦显微镜检查所述细胞。

在转染了D1-IC2-NLS-GFP的细胞中，51％细胞的细胞核中可以检测到所述受体。

实施例6f：当先后转染细胞时，多巴胺D1受体形成同源二聚体的能力。

用编码D1-RFP的DNA构建体(2微克)转染HEK细胞并温育24小时，然后用另一种编码D1-NLS-GFP的DNA构建体(2微克)再次转染所述细胞。对照细胞仅转染D1-RFP构建体(2微克)。第二次转染后温育48小时，用共聚焦显微镜检查所述细胞。

90％仅转染了D1-RFP的细胞在细胞表面表达所述受体，而6％细胞在细胞核表达所述受体。与此形成对比的是，97％转染了两种形式所述受体的细胞在细胞核中同时表达所述两种受体(红色和绿色荧光之和等于黄色荧光)。因此，不含NLS的D1受体能够与含有NLS的D1受体相互作用，并转运至细胞核。

实施例7：多巴胺D5受体(D5-GFP)

制备编码多巴胺D5受体(D5-GFP)的构建体，并用其转染COS细胞(4微克)。

用多巴胺D5-GFP转染细胞48小时后，所述受体主要定位于胞浆，仅一小部分定位于细胞表面，无一定位于细胞核。

实施例8：整合有NLS的多巴胺D1(D1-NLS)与D5多巴胺受体(D5-GFP)的共表达。

用两种DNA构建体转染HEK细胞，一种编码D1-NLS(7微克)而另一种编码D5-GFP(1.5微克)，并温育48小时。

在转染了D1-NLS和D5-GFP的细胞中，大约70％在细胞表面表达D5-GFP，20％在细胞表面和胞浆中均有D5-GFP表达，10％在细胞核有D5-GFP表达。与D1-NLS共表达的D5多巴胺受体没有出现核定位，该现象表明D1和D5受体没有发生寡聚化。

实施例9：含有2个NLS基序的D1多巴胺受体(D1-2NLS-RFP)，并以拮抗剂处理该受体。

通过更改编码D1-NLS-RFP的构建体，制备了在多巴胺D1受体羧基尾部引入第二个NLS的DNA构建体(D1-2NLS-RFP)，其中，野生型D1多巴胺受体的KKEEA序列被NLS序列KKKRK代替。

如上所述，用编码所述构建体(D1-2NLS-RFP)的DNA转染HEK细胞，并用拮抗剂SCH-23390(10μM)以一定时间间隔处理该细胞。在转染后6、22、30和42小时，更换含有拮抗剂的培养基。对照细胞未用拮抗剂处理。

在转染了D1-2NLS-RFP的COS细胞和HEK细胞中，100％的细胞中所述受体均在转染后24小时定位于细胞核，该现象表明当存在第二个NLS时，核转位作用得到加强。

在48小时，90％未用拮抗剂处理的细胞显示出核内荧光，0％细胞显示出细胞表面荧光。在拮抗剂处理的细胞中，51％具有细胞表面标记而49％具有核标记。

整合第二个NLS导致所述受体更为有效地转运至细胞核，且该转运事件仍然被拮抗剂处理所延迟。

实施例10：D2多巴胺受体(D2-GFP)

用编码D2-GFP(2微克)和DsRed-NUC(1微克)的DNA构建体转染HEK细胞，并温育48小时。通共聚焦显微镜检查所述细胞。

大约90％表达D2-GFP的细胞为细胞表面表达，10％为细胞核或胞浆表达。不含内源性NLS的D2多巴胺受体主要表达在细胞表面。

实施例11a：整合了NLS的多巴胺D1受体(D1-NLS)和多巴胺D2(D2-GFP)。

用编码D1-NLS(7微克)和D2-GFP(1.5微克)的DNA构建体转染HEK细胞，并温育48小时。所述细胞也用Ds-Red-NUC(1微克)转染，以检测核定位。用共聚焦显微镜检查所述细胞。

在转染了D1-NLS和D2-GFP的细胞中，33％细胞的细胞核中有D2-GFP表达，该现象表明由于D1和D2受体的寡聚化，D1-NLS和D2-GFP均转运至细胞核，67％细胞仅在细胞表面或在细胞表面和胞浆中有D2-GFP表达。

实施例11b：短的D2多巴胺受体(D2S)和长的D2多巴胺受体(D2L)二聚化的能力。

用编码D2S-GFP(2微克)和D2L-NLS(2微克)的DNA构建体转染HEK细胞，并温育48小时。用DsRED-NUC(2微克)显示细胞核。使用共聚焦显微镜检查所述细胞。

在29％细胞中，D2S-GFP受体显示于细胞核中。该现象表明D2S与D2L二聚化，并转运至细胞核中。

实施例11c：多巴胺受体D2S和多巴胺受体D2L二聚化的能力。

用编码D2S-RFP(2微克)和D2L-NLS-GFP(2微克)的DNA构建体转染HEK细胞，并温育48小时。使用共聚焦显微镜检查所述细胞。

40％所述细胞的细胞核内显示黄色(红色和绿色叠加的结果)，表明D2L-NLS与D2S-RFP二聚化，并转运至细胞核内。

实施例12：用拮抗剂处理含有整合的NLS的D2多巴胺受体(D2-NLS-GFP)。

用编码D2-NLS-GFP的DNA转染HEK细胞，并用D2多巴胺受体拮抗剂(+)丁克吗(10μM)或奎丙灵(raclopride)(10μM)处理所述细胞。在转染后6、22、30和42小时，用所述拮抗剂处理所述细胞。药物处理后温育48小时，再用共聚焦显微镜检查。

在未用拮抗剂处理时，表达D2-NLS-GFP的细胞中70％显示出细胞核标记，20％显示出胞浆标记，10％显示出胞浆和细胞表面标记。在(+)丁克吗处理后，细胞核标记只出现在5％细胞中，5％细胞具有胞浆标记，而90％细胞具有细胞表面标记。在奎丙灵处理后，细胞核标记出现在5％细胞中，15％细胞具有胞浆标记，而80％细胞具有细胞表面标记。两种D2受体的拮抗剂均能够阻止D2受体离开细胞表面向细胞核转位。

实施例13：β2-肾上腺素能受体-GFP(β2-AR-GFP)。

制备编码包括人β2-肾上腺素能受体和GFP的融合蛋白的DNA构建体(β2-AR-GFP)。用编码β2-AR-GFP(2微克)的DNA构建体转染细胞，并温育24小时，以共聚焦显微镜检查之。

在表达β2-AR-GFP的细胞中，42％细胞仅在胞浆中表达所述受体，58％细胞在胞浆和细胞表面具有所述受体的表达。未观察到所述受体定位在细胞核中。

实施例14：整合有NLS的β2-肾上腺素能受体(β2-AR-NLS3-GFP)

制备编码包括人β2-AR-NLS3-GFP的融合蛋白的DNA构建体。用编码β2-AR-NLS3-GFP(2微克)的DNA构建体和Ds-Red-NUC(1微克)转染HEK细胞，并温育48小时。

在表达β2-AR-NLS3-GFP的细胞中，45％细胞的所述受体定位在细胞核中，55％细胞的所述受体在胞浆中和细胞表面表达。在β2-AR中整合NLS，能诱导所述受体向细胞核转位。

实施例15：用拮抗剂处理整合有NLS的β2-肾上腺素能受体(β2-AR-NLS3-GFP)。

用编码β2-AR-NLS3-GFP(1微克)的DNA构建体和Ds-Red-NUC(1微克)转染HEK细胞，并温育48小时。用一种肾上腺素能受体拮抗剂阿替洛尔(10μM)以一定时间间隔处理细胞。在转染后6、22、30和42小时，更换含有所述拮抗剂的培养基。

对照细胞不用拮抗剂处理。在对照细胞中，60％细胞的所述受体表达在细胞核内，21％细胞的所述受体表达在细胞表面，19％细胞的所述受体表达在胞浆中。

在拮抗剂阿替洛尔处理的细胞中，70％细胞的所述受体表达在细胞表面，14％细胞的所述受体表达在细胞核内，16％细胞的所述受体表达在胞浆中。用拮抗剂阿替洛尔处理能够阻止β2-AR-NLS3-GFP向细胞核转位，并将所述受体保留在细胞表面。

实施例16：β2肾上腺素能受体(β2-AR-GFP)与整合有NLS的多巴胺D1受体(D1-NLS)的共表达。

用编码β2-AR-GFP(1.5微克)的DNA构建体和D1-NLS(3微克)转染HEK细胞48小时。

大约40％所述细胞的β2-AR-GFP受体在细胞核中表达，该现象证明不含NLS的β2-AR转运至细胞核。所述现象表明β2-AR受体和含有NLS的D1多巴胺受体之间存在寡聚化作用，45％所述细胞的β2-AR-GFP存在于胞浆中，15％存在于胞浆中和细胞表面。

实施例17：用拮抗剂处理β2肾上腺素能受体(β2-AR-GFP)和整合有NLS的多巴胺D1受体(D1-NLS)。

用编码β2-AR-GFP的DNA构建体(1.5微克)和编码D1-NLS的DNA构建体(3微克)转染HEK细胞，并温育48小时。用肾上腺素能拮抗剂普萘洛尔(5μM)处理所述细胞。在转染后6、22、30和42小时，更换含有所述拮抗剂的培养基。对照细胞不用拮抗剂处理。使用共聚焦显微镜检查所述细胞。

25％对照细胞的β2-AR-GFP在细胞核内表达，75％对照细胞在胞浆和细胞表面显示出标记。

在普萘洛尔处理的细胞中，10％细胞的β2-AR-GFP表达在细胞核中，90％细胞在胞浆和细胞表面显示出标记。β2-AR-GFP和D1-NLS之间异源寡聚物的形成导致β2-AR-GFP向细胞核运输。所述肾上腺素能受体的拮抗剂的存在能够减弱所述运输。

实施例18：含有整合的NLS的β2-肾上腺素能受体(β2-AR-NLS3-GFP)。

用编码含有NLS的β2-AR-NLS3-GFP(8微克)的DNA构建体转染HEK细胞48小时。所述细胞也转染了Ds-Red-NUC(1微克)，以鉴定细胞核定位。

80％所述细胞的β2-AR-NLS3-GFP受体在细胞核中。由于NLS的效能被加强，导致所述受体更为显著的细胞核定位。

实施例19：用拮抗剂处理整合有NLS的5-羟色胺1B受体(5HT1B-NLS-GFP)。

用编码5-羟色胺5HT1B-NLS-GFP(2微克)的DNA构建体转染HEK细胞。也用Ds-Red-NUC(1微克)转染所述细胞，以鉴定细胞核定位。用5-羟色胺受体拮抗剂二甲麦角新碱(10μM)处理所述细胞。在转染后6、22、30和42小时，更换含有拮抗剂的培养基。对照细胞不用拮抗剂处理。使用共聚焦显微镜检查所述细胞。

在未用拮抗剂处理的对照细胞中，55％细胞的所述受体定位在细胞核内，20％细胞的所述受体定位在细胞表面。在48小时，在二甲麦角新碱处理的细胞中，25％细胞的所述受体在细胞核内，62％细胞的所述受体定位在细胞表面。

通过插入NLS，5-羟色胺5HT1B受体能够有效地从细胞表面向细胞核转位。用5-羟色胺受体拮抗剂二甲麦角新碱处理能够阻止所述受体的转位。

实施例20：整合有NLS的半胱氨酰白三烯受体2(CysLT2-NLS-GFP)。

用编码CysLT2-NLS-GFP(8微克)的DNA构建体转染HEK细胞48小时。所述细胞也转染了Ds-RED-NUC(1微克)，以鉴定细胞核定位。使用共聚焦显微镜检查所述细胞。

在表达CysLT2-NLS-GFP的细胞中，83％细胞的所述受体表达在细胞核内，0％细胞的所述受体表达在细胞表面，该现象表明CysLT2-NLS-GFP受体定位在细胞核内。

实施例21：用拮抗剂处理整合有NLS的半胱氨酰白三烯受体2(Cys-LT2-NLS-GFP)。

用编码Cys-LT2-NLS-GFP的DNA(3微克)转染HEK细胞。用半胱氨酰白三烯受体拮抗剂montelukast(10μM)处理所述细胞。在转染后6、22、30和42小时，更换含有拮抗剂的培养基。对照细胞不用拮抗剂处理。使用共聚焦显微镜检查所述细胞。

在未用拮抗剂处理的、表达Cys-LT2-NLS-GFP的细胞中，70％细胞的所述受体定位在细胞核内，30％定位在胞浆，0％定位在细胞表面。在拮抗剂处理的细胞中，只有10％细胞的所述受体定位在细胞核内，而90％细胞的所述受体在细胞表面表达。因此，所述半胱氨酰白三烯受体拮抗剂montelukast能够阻止Cys-LT2-NLS-GFP受体离开细胞表面向细胞核的转运。

实施例22：整合有NLS的μ阿片受体(μ阿片-NLS-GFP)。

用编码μ阿片-NLS-GFP的DNA构建体(2微克)转染HEK细胞48小时。所述细胞也转染了Ds-Red-NUC(1微克)，以检测细胞核定位。使用共聚焦显微镜检查所述细胞。

在转染了μ阿片-NLS-GFP的细胞中，65％细胞的所述受体表达在细胞核内，15％细胞的所述受体定位在细胞表面，20％细胞的所述受体具有胞浆标记。因此，插入NLS允许μ阿片受体向细胞核转运。

实施例23：用拮抗剂处理整合有NLS的μ阿片受体(μ-NLS-GFP)。

用编码μ阿片-NLS-GFP的DNA构建体(2微克)转染HEK细胞。用μ阿片拮抗剂钠洛酮(10μM)或纳曲酮(10μM)处理所述细胞。在转染后6、22、30和42小时，更换含有拮抗剂的培养基。对照细胞不用拮抗剂处理。使用共聚焦显微镜检查所述细胞。

在未处理的细胞中，62％细胞的μ-NLS-GFP在细胞核内，20％细胞的所述受体可在细胞表面上检测到。在钠洛酮处理的细胞中，21％细胞的所述受体表达在细胞核内，66％细胞的所述受体在细胞表面。在纳曲酮处理的细胞中，22％细胞的所述受体表达在细胞核内，58％细胞的所述受体在细胞表面。因此，μ阿片拮抗剂钠洛酮和纳曲酮能够减弱所述受体离开细胞表面向细胞核的转运。

实施例24：用拮抗剂处理整合有NLS的毒蕈碱M1受体(M1-NLS-GFP)。

用编码M1-NLS-GFP的DNA(1微克)和Ds-Red-NUC(1微克)转染HEK细胞48小时。用异丙托溴铵(ipratropium bromide)(10μM)处理所述细胞。在转染后6、22、30和42小时，更换含有拮抗剂的培养基。对照细胞不用拮抗剂处理。使用共聚焦显微镜检查所述细胞。

在异丙托溴铵处理的细胞中，72％细胞的所述受体表达在细胞表面，17％细胞的所述受体仅表达在胞浆中，11％细胞的所述受体表达在细胞核内。

在对照细胞中，64％细胞的所述受体表达在细胞核内，23％细胞的所述受体表达在细胞表面，13％细胞的所述受体表达在胞浆中。

用毒蕈碱拮抗剂处理能够阻止M1-NLS-GFP离开细胞表面向细胞核的转运。

实施例25：整合有NLS的组胺H1受体(H1-NLS-GFP)。

用编码组胺H1-NLS-GFP受体的DNA构建体(2微克)和编码Ds-Red-NUC的构建体(1微克)转染HEK细胞，并温育48小时。

大约65％所述细胞的所述受体表达在细胞核内，35％同时表达在细胞表面和胞浆中。在H1组胺受体中插入NLS导致所述受体离开细胞表面向细胞核的转位。

实施例26：拮抗剂异丙嗪对插入NLS的组胺H1受体(H1-NLS-GFP)的运输的影响。

用H1-NLS-GFP(2微克)和DsRED-Nuc(2微克)转染HEK细胞，并温育48小时。用异丙嗪(10μM)处理所述细胞48小时。用DsRED-Nuc显示细胞核。使用共聚焦显微镜检查所述细胞。

在异丙嗪处理的细胞中，88％细胞的所述受体在细胞表面，10％细胞的所述受体在细胞核内。在未处理的细胞中，85％细胞的所述受体表达在细胞核内与胞浆中。因此，用异丙嗪处理能够减少H1-NLS-GFP向细胞核的运输。

实施例26：血管紧张素AT1受体(AT1R)。

构建编码融合蛋白的DNA构建体(AT1R-RFP)，所述融合蛋白包括含有NLS的人血管紧张素AT1受体和DsREd2(RFP)。

用DNA构建体AT1R-RFP(4微克)转染COS细胞，并在37℃温育48小时。

使用共聚焦显微镜检查所述细胞，发现所述受体完全定位于所述细胞的细胞核内，该现象表明AT1R向细胞核的转位是基础性的激动剂非依赖性转位。

实施例27：用激动剂短时间处理多巴胺受体(D1-NLS-GFP)。

用编码D1-NLS-GFP(2微克)和D1-WT(4微克)的DNA构建体转染HEK细胞，并温育所述细胞24小时。用多巴胺D1激动剂SKF81297(10μM)处理所述细胞35分钟。用共聚焦显微镜实时观察单组细胞。

结果证明了细胞核内所述受体的表达量增加，且所述增加在20分钟时达到最大，该现象表明短时间激动剂效应。

实施例28：融合有GFP和RFP的、含有NLS的多巴胺转运蛋白(DAT-NLS-GFP和DAT-NLS-RFP)。

用编码DAT-GFP的DNA构建体(2微克)转染HEK细胞48小时。使用共聚焦显微镜以DsRED-nuc(2微克)观察细胞核。

在48小时，在86％细胞中的细胞表面或胞浆中检测到DAT-GFP。在14％所述细胞中，所述转运蛋白在细胞核内。

用编码DAT-NLS-RFP的构建体(2微克)转染HEK细胞，并在48小时用共聚焦显微镜观察。85％细胞的DAT-NLS-RFP在细胞核内检测到，18％细胞的所述转运蛋白在细胞表面或在胞浆中。

然后用编码DAT-NLS-GFP的DNA(2微克)转染HEK细胞，并在48小时用共聚焦显微镜观察。用DsRED-nuc(2微克)显示细胞核。在77％细胞的细胞核内检测到DAT-NLS-GFP。

实施例29：DAT-GFP与DAT-NLS-RFP的共运输。

用编码DAT-NLS-RFP(2微克)和DAT-GFP(2微克)的DNA构建体转染HEK细胞，并温育48小时。使用共聚焦显微镜检查所述细胞。

在56％所述细胞中的细胞核内检测到黄色荧光，该现象表明DAT-NLS-RFP和DAT-GFP共定位在细胞核内，确证了DAT-NLS-RFP和DAT-GFP之间的寡聚化作用。

实施例30：可卡因对DAT-NLS-RFP向细胞核运输的影响。

用编码DAT-NLS-RFP的DNA构建体(2微克)转染HEK细胞，并温育48小时。在转染后6、22、30和42小时，所述细胞用可卡因或苯丙胺(终浓度为10μM)处理，或不处理。使用共聚焦显微镜检查所述细胞。

在未处理的HEK细胞中，77％细胞中的DAT-NLS-RFP在细胞核内表达。

可卡因处理后，75％细胞的细胞表面或胞浆中表达DAT-NLS-RFP，而25％细胞的细胞核内与胞浆中表达所述转运蛋白。可卡因处理能够减少DAT-NLS-RFP向细胞核的运输。

苯丙胺处理后，34％细胞的细胞表面/胞浆有表达，而66％细胞的细胞核/胞浆有所述转运蛋白表达。苯丙胺(该物质并不靶向DAT，而靶向囊泡单胺转运蛋白即VMAT)处理对DAT-NLS-RFP向细胞核运输没有抑制作用。

实施例31：表达并用拮抗剂处理含有NLS的多巴胺转运蛋白(DAT-NLS-GFP)。

用编码DAT-NLS-GFP的DNA构建体(2微克)转染HEK细胞，并温育48小时。在转染后6、22、30和42小时，用GBR-12909(终浓度1μM)处理所述细胞。使用共聚焦显微镜检查所述细胞。

用编码DAT-NLS-GFP的构建体(2微克)转染HEK细胞，并温育48小时。在转染后6、22、30和42小时，用吗吲哚(mazindol)(终浓度1μM)处理所述细胞。使用共聚焦显微镜检查所述细胞。

对照HEK细胞用DAT-NLS-GFP转染并温育48小时，不用药物处理。

在转染有DAT-NLS-GFP的未处理HEK细胞中，77％细胞的所述转运蛋白表达在细胞核内与胞浆中，23％仅在胞浆中，0％在细胞表面。

在GBR-12909处理后，62％细胞的细胞表面和胞浆中有所述转运蛋白表达，38％细胞的细胞核内与胞浆中有所述转运蛋白表达。GBR-12909处理能减少DAT-NLS-GFP离开细胞表面向细胞核的运输。

在吗吲哚处理后，61％细胞的细胞表面和胞浆中有所述转运蛋白表达，39％细胞的细胞核内与胞浆中有所述转运蛋白表达。吗吲哚处理能减少DAT-NLS-GFP离开细胞表面向细胞核的转位。实施例32：交错表达DAT-GFP和DAT-NLS-RFP时，多巴胺转运蛋白形成同源寡聚体的能力。

用编码DAT-GFP的DNA构建体(2微克)转染HEK细胞，24小时后用编码DAT-NLS-RFP的DNA构建体(0.5、1和2微克)再次转染所述细胞，并温育48小时。用DAT-GFP单独转染的细胞作为对照。在第二次转染后温育细胞48小时。总的温育时间为72小时。

在仅转染了DAT-GFP的细胞中，85％细胞的所述转运蛋白在胞浆中，7％在细胞核内。在交错转染实验(比例为1∶0.5)中，97％细胞的黄色荧光(是红色和绿色荧光叠加的结果)在细胞核内。在交错转染实验(比例为1∶1)中，94％细胞的黄色荧光在细胞核内。在交错转染实验(比例为1∶2)中，94％细胞的黄色荧光在细胞核内。因此，DAT-GFP能够与DAT-NLs-GFP相互作用并形成二聚体，以运输至细胞核。

实施例33：促代谢型谷氨酸-4-受体(mGluR4-GFP)的表达。

用编码mGluR4-GFP的DNA构建体(2微克)转染HEK细胞，并温育48小时。用DsRED-NUC(2微克)显示细胞核。使用共聚焦显微镜检查所述细胞。

89％所述受体表达在细胞表面。因此，mGluR4受体大部分定位在细胞表面。

实施例34：插入NLS的促代谢型谷氨酸-4-受体(mGluR4-NLS-GFP)的表达。

用编码mGluR4-NLS-GFP的DNA构建体(2微克)转染HEK细胞，并温育48小时。所述细胞也转染了Ds-RED-NUC(2微克)，以检测细胞核定位。使用共聚焦显微镜检查所述细胞。

60％表达mGluR4-NLS-GFP的细胞在其细胞核内表达所述受体。

因此，在mGluR4受体中插入NLS能够增加所述受体在细胞核内的定位。

实施例35：含有或不含有整合的NLS的毒蕈碱M1受体(M1-GFP和M1-NLS-GFP)的表达。

用编码M1-GFP的DNA构建体(2微克)或者编码M1-NLS-GFP的构建体(2微克)转染HEK细胞，并温育48小时。用DsRED-NUC(2微克)显示细胞核。使用共聚焦显微镜检查所述细胞。

在转染了M1-GFP后，67％所述细胞的细胞表面或胞浆内有所述受体表达。

转染M1-NLS-GFP细胞中的92％显示其细胞核内有所述受体表达，该现象表明NLS指导所述受体向细胞核转位。

实施例36：H1组胺受体(H1-GFP)的表达。

用编码H1-GFP的DNA构建体(1.5微克)转染HEK细胞，并温育48小时。用DsRED-NUC(2微克)显示细胞核。使用共聚焦显微镜检查所述细胞。

97％所述细胞在其细胞表面表达所述受体。因此，未修改的受体不会被转运至细胞核内。

实施例37：插入了NLS的半胱氨酰白三烯受体(CysLT1-NLS-GFP)的表达。

用编码CysLT1-NLS-GFP的DNA构建体(2微克)转染HEK细胞，并温育48小时。用DsRED-NUC(2微克)显示细胞核。使用共聚焦显微镜检查所述细胞。

在作为对照的未处理细胞中，0％细胞的所述受体表达在细胞表面，100％细胞具有细胞核内表达，该现象表明所述受体从细胞表面被完全清除。

实施例38：表达融合有GFP的5-羟色胺转运蛋白(SERT-GFP)。

用编码SERT-GFP的DNA构建体(2微克)转染HEK细胞，并温育48小时。91％所述细胞在细胞表面和胞浆中表达所述转运蛋白。

实施例39：表达并用氟西汀处理插入NLS的5-羟色胺转运蛋白(SERT-NLS-GFP)。

用编码SERT-NLS-GFP的DNA(2微克DNA)转染HEK细胞，并用氟西汀(终浓度为1μM)处理48小时。在转染6、22、30和42小时后，用氟西汀(终浓度为1μM)处理所述细胞。使用共聚焦显微镜检查所述细胞。

在表达SERT-NLS-GFP的未处理细胞中，0％细胞的所述转运蛋白表达在细胞表面，26％细胞的所述转运蛋白表达在胞浆中，60％细胞的所述转运蛋白表达在细胞核内与胞浆中。

在氟西汀处理后，68％细胞的SERT-NLS-GFP转运蛋白表达在细胞表面和胞浆中，27％细胞的所述转运蛋白表达在细胞核内与胞浆中。因此，用氟西汀处理能够抑制SERT-NLS-GFP离开细胞表面向细胞核的运输。

实施例40：对两种不同细胞表面膜蛋白(D2-GFP和DAT-NLS-RFP)相互作用能力的评价。

用编码D2-GFP(2微克)和DAT-NLS-RFP(2微克)的DNA构建体共转染HEK细胞，并温育48小时。将分别单独转染D2-GFP和DAT-NLS-RFP的细胞作为对照。使用共聚焦显微镜检查所述细胞。

在转染有DAT-NLS-RFP的细胞中，85％细胞的所述转运蛋白在细胞核内。在转染有D2-GFP的细胞中，97％细胞的所述受体在细胞表面，4％细胞的所述受体在细胞核内。在共转染的细胞中，86％细胞的细胞核内有黄色荧光(红色和绿色荧光的叠加)，该现象显示D2和DAT蛋白均在细胞核内存在，确证共转染的所述蛋白能够二聚化。

实施例41：对膜蛋白和另一非膜蛋白形成复合物(D1-NLS和β-视紫红质抑制蛋白1-GFP)并相互作用的能力的评价。

用编码D1-NLS(2微克)和β-视紫红质抑制蛋白1-GFP(2微克)的DNA构建体转染HEK细胞，并温育48小时。也用β-视紫红质抑制蛋白1-GFP单独转染细胞。使用共聚焦显微镜检测所述细胞。

在单独转染β-视紫红质抑制蛋白1-GFP的细胞中，100％细胞的胞浆中表达荧光蛋白。在所述细胞中，15％细胞的细胞核内也有荧光素。在用两种蛋白共转染的细胞中，89％细胞的细胞核内有荧光蛋白表达，16％细胞的胞浆中有荧光蛋白表达。因此，GPCR与非膜蛋白之间的相互作用能使不含NLS的β-视紫红质抑制蛋白蛋白转运至细胞核内。

实施例42：表达并用拮抗剂处理插入NLS的多巴胺D1受体(HA-D1-NLS)，用荧光计进行检测。

用多聚-L-鸟氨酸包被多孔板中的孔，然后在每个孔里放入50,000个细胞。用编码HA表位标记的D1-NLS受体的DNA转染所述细胞，并用(+)丁克吗(10nM-10μM)处理超过48小时。之后用多聚甲醛固定所述细胞，用大鼠抗HA抗体检测细胞表面的所述受体，然后用结合有FITC的山羊抗大鼠抗体与上述抗体结合。使用荧光计(Cytofluor)检测荧光信号。实验结果是每个实验条件的5个孔的平均值，并显示在图2中。丁克吗对所述受体保留在细胞表面具有剂量依赖效应，该现象表明所述拮抗剂减少所述受体离开细胞表面的转位。因此，荧光计可用于检测留在细胞表面的受体。

实施例43：表达插入NLS的多巴胺D1受体(HA-D1-NLS)，使用激动剂阻断拮抗剂的剂量反应效应并用荧光计检测。

用多聚-L-鸟氨酸包被多孔板中的孔，然后在每个孔里放入50,000个细胞。用编码HA表位标记的D1-NLS受体的DNA转染所述细胞，并用合用或不合用激动剂SKF81297(1μM)的拮抗剂SCH23390(1nM-1μM)处理超过48小时。之后用多聚甲醛固定所述细胞，用大鼠抗HA抗体检测细胞表面的所述受体，然后用结合有FITC的山羊抗大鼠抗体与上述抗体结合。使用荧光计(Cytofluor)检测荧光信号。实验结果是每个实验条件的5个孔的平均值。SCH23390对所述受体保留在细胞表面具有剂量依赖效应，该现象表明所述拮抗剂减少所述受体离开细胞表面的转位。伴随加入的激动剂减少了拮抗剂效应(图3)。因此，可以通过阻断拮抗剂效应来检测激动剂作用，且荧光计可用于定量测定激动剂效应。

实施例43b：表达插入NLS的多巴胺D1受体(HA-D1-NLS)，使用激动剂的剂量反应来阻断拮抗剂效应并用荧光计检测。

用HA-D1-NLS转染用多聚-L-鸟氨酸包被的多孔板中的HEK细胞，每个孔里的细胞的浓度为50,000个。用拮抗剂SCH23390(0.5μM)处理所述细胞48小时。在温育的最后一个小时，将激动剂SKF81297(100nM-1μM)与SCH23390一起加入到所述细胞中。之后用多聚甲醛固定所述细胞，用大鼠抗HA抗体检测细胞表面的所述受体，然后用结合有FITC的山羊抗大鼠抗体与上述抗体结合。使用荧光计(Cytofluor)检测荧光信号。实验结果是每个实验条件的5个孔的平均值。

用SCH23390处理将使HA-D1-NLS留在细胞表面(图4，条1和条6相比)。短时间加入激动剂导致剂量依赖性的阻断SCH23390的效用。在温育的最后一个小时从细胞中移去SCH23390(且无激动剂)，导致33％的HA-D1-NLS受体从细胞表面上消失(图4，条5和条6相比)，而在持续存在SCH23390的细胞中加入100nM激动剂SKF81297，导致66％所述受体从细胞表面上消失(图4，条4和条6相比)，在加入1μM SKF81297后导致多达78％的所述受体从细胞表面消失(图4，条2和条6相比)。

拮抗剂SCH23390的效应导致所述受体保留在细胞表面上，这表明所述拮抗剂减少了受体从细胞表面的运输。伴随加入的激动剂降低了拮抗剂效应，并以剂量反应方式加速了受体从细胞表面移去的过程。因此，通过阻断将含有NLS的受体保留在细胞表面的化合物的效应，可以检测相互作用的化合物，且荧光计可用于定量分析所述效应。

实施例44：表达插入一个NLS的多巴胺D1受体(D1-NLS)，用10μM(+)丁克吗处理并检测放射性配体结合。

用编码D1-NLS的DNA转染HEK细胞，然后所述细胞用(+)丁克吗(10μM)处理，或者不处理。48小时后，对所述细胞进行漂洗、收集、裂解，并用Polytron匀浆。通过离心收集膜成分，并将其置于35％蔗糖溶液之上，以4℃、30,000rpm的条件离心90分钟，从而收集重膜成分。

将[³H]-SCH23390和(+)丁克吗(10μM)用于所述膜成分的放射性配体结合分析，该方法用于确定特异性结合。在室温下温育2小时，然后通过闪烁计数进行快速过滤和定量。

D1-NLS的拮抗剂处理防止了其离开细胞表面向细胞核的转位，且通过放射性配体结合分析来定量保留在细胞表面上的所述受体(图5)。

实施例45：表达插入有一个NLS的多巴胺D1受体(D1-NLS)，用500nM(+)丁克吗处理并检测放射性配体结合。

用编码D1-NLS的DNA转染HEK细胞，然后所述细胞用500nM(+)丁克吗处理，或者不处理。48小时后，对所述细胞进行漂洗、收集、裂解，并用Polytron匀浆。通过离心收集膜成分，并将其置于35％蔗糖溶液之上，以4℃、30,000rpm的条件离心90分钟，从而收集重膜成分。

将[³H]-SCH23390和(+)丁克吗(10μM)用于所述膜成分的放射性配体结合分析，该方法用于确定特异性结合。在室温下温育2小时，然后通过闪烁计数进行快速过滤和定量。结果显示在表4和表5中。

表4.对照质膜成分

样品1样品2平均数NSB SBpmol/mg(皮摩尔每毫克)蛋白质2739359631671077 20901.42

表5.丁克吗处理的质膜成分

样品1 样品2 平均数 NSB SBpmol/mg(皮摩尔每毫克)蛋白质16419 15362 15890 471 1541913.15

          NSB：非特异性结合                                             SB：特异性结合

用D1-NLS的拮抗剂(+)丁克吗处理能够防止其转位至细胞核，且通过放射性配体结合分析来定量保留在细胞表面上的所述受体。

实施例46：表达插入有一个NLS的多巴胺D1受体(D1-NLS)，用100nM(+)丁克吗处理并用放射性配体结合分析进行检测。

用编码D1-NLS的DNA转染HEK细胞，然后所述细胞用100nM(+)丁克吗处理，或者不处理。48小时后，对所述细胞进行漂洗、收集、裂解，并用Polytron匀浆。通过离心收集膜成分，并将其置于35％蔗糖溶液之上，以4℃、30,000rpm的条件离心90分钟，从而收集重膜成分。

将[³H]-SCH23390和(+)丁克吗(10μM)用于所述膜成分的放射性配体结合分析，该方法用于确定特异性结合。在室温下温育2小时，然后通过闪烁计数进行快速过滤和定量。

用拮抗剂(+)丁克吗(100nM)处理能够防止D1-NLS转位至细胞核，且通过放射性配体结合分析来定量保留在细胞表面上的所述受体。在未用(+)丁克吗处理的情况下，在细胞表面的膜上检测到0.03pmol/mg(皮摩尔每毫克)受体蛋白；但在丁克吗处理的情况下，在细胞表面的膜上检测到0.09pmol/mg受体蛋白。

实施例47：表达表皮生长因子受体(酪氨酸激酶受体)EGFR-GFP和EGFR-NLS-GFP。

用编码EGFR-NLS-GFP的DNA(2微克)转染HEK细胞。HEK细胞也转染了编码EGFR-GFP的DNA(2微克)，并温育24小时。

EGFR-GFP表达在73％所述细胞的细胞表面上和12％所述细胞的细胞核内。EGFR-NLS-GFP表达在91％所述细胞的细胞核内和0％所述细胞的细胞表面上。将NLS整合入EGF受体的序列诱导了离开细胞表面向细胞核的显著转位效应。

实施例48：表达低密度脂蛋白受体(LDL-GFP)。

用编码LDL-GFP的DNA(2微克)转染HEK细胞，并温育24小时。所述受体表达在67％所述细胞的细胞表面上和8％所述细胞的细胞核内。

LDL受体表达在大部分细胞的细胞表面上，而只在不多的细胞中表达在细胞核内。

实施例49：表达含有一个NLS的LDL受体(LDL-NLS-GFP)。

用编码LDL-NLS-GFP的DNA(2微克)和DsRED-NUC(2微克)转染HEK细胞，并温育48小时。使用共聚焦显微镜检测所述细胞。

LDL-NLS-GFP表达在22％所述细胞的细胞核内和67％所述细胞的所述细胞的细胞表面上。在LDL受体中整合入一个NLS能够诱导所述受体转位至细胞核。

实施例50：表达红细胞生成素受体(细胞因子受体)EPO-GFP和EPO-NLS-GFP。

用编码EPO-NLS-GFP的DNA(2微克)转染HEK。用EPO-GFP(2微克)转染HEK细胞。所述细胞也转染了DsRED-NUC(2微克)。所述细胞温育48小时，并用共聚焦显微镜检测之。

EPO-NLS-GFP定位在72％所述细胞的细胞核内和0％所述细胞的细胞表面上。EPO-GFP定位在79％所述细胞的细胞表面上和28％所述细胞的细胞核内。在EPO受体序列中整合一NLS，能够诱导受体离开细胞表面向细胞核的转位。

实施例51：表达含有一个NLS的5-羟色胺转运蛋白(SERT-NLS-GFP)并用曲舍林处理之。

用编码SERT-NLS-GFP的DNA(2微克DNA)转染HEK细胞，并用曲舍林(终浓度未500nM)处理48小时。在转染后6、22、30和42小时，用曲舍林处理所述细胞。使用共聚焦显微镜检测所述细胞。

在表达SERT-NLS-GFP的未处理细胞中，0％细胞的所述转运蛋白表达在细胞表面上，75％细胞的所述转运蛋白表达在细胞核内与胞浆中。

在曲舍林处理后，69％受处理细胞的SERT-NLS-GFP转运蛋白表达在细胞表面上和胞浆中，21％受处理细胞的所述转运蛋白表达在细胞核内与胞浆中。因此，用曲舍林处理能够抑制SERT-NLS-GFP离开细胞表面向细胞核的运输。

实施例52：表达含有一个替代NLS的D1多巴胺受体(D1-NLS2-GFP)，并用拮抗剂处理之。

用编码D1-NLS2-GFP的DNA(2微克)转染HEK细胞，并用(+)丁克吗或SCH23390(1μM)处理48小时。用DsRED-NUC(2微克)显示细胞核。使用共聚焦显微镜检测所述细胞。

在丁克吗处理的细胞中，81％细胞的所述受体位于细胞表面上或胞浆中，19％细胞的所述受体表达在细胞核内。在SCH23390处理的细胞中，78％细胞的所述受体位于细胞表面上或胞浆中，22％细胞的所述受体表达在细胞核内。

在未处理的细胞中，89％细胞的所述受体表达在细胞核内与胞浆中。

因此，用多巴胺D1拮抗剂处理能够防止D1-NLS2-GFP受体离开细胞表面向细胞核的运输。

本发明并不限于本文描述的上述实施方案的特征，并包括权利要求范围中的全部变化和修改。

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表1.核定位序列示例(根据Jans等2002年的数据改编)

蛋白                               核定位序列

人a1 T-ag                          PKKKRKV

CBP80                              RRR-(11个氨基酸)-KRRK

DNA解螺旋酶Q1                      KK-(15个氨基酸)-KKRK

BRCA1                              KRKRRP，PKKNRLRRK

分裂激素                           KRQR-(20个氨基酸)-KKSKK

Myc                                PAAKRVKLD

NF-κB p50                         QRKRQK

NF-κB p65                         HRIEEKRKRTYETFKSI

HIV1422                            KKKYKLK

HIV1423                            KSKKKAQ

人a2 T-ag                          PKKKRKV

NF-κB p50                         QRKRQK

DNA解螺旋酶Q1                  KK-(15个氨基酸)-KKRK

LEF-1                          KKKKRKREK

EBNA1                          LKRPRSPSS

HIV-1 IN                       KRK-(22个氨基酸)-KELQKQITK

HIV-1 MA                       GKKKYKLKH

HIV 1422                       KKKYKLK

HIV 1423                       KSKKKAQ

RCP 4.1R                       EED-(350个氨基酸)-KKKRERLD

人a3 T-ag                      PKKKRKV

DNA解螺旋酶Q1                  CYFQKKAANMLQQSGSKNTGAK

                               KRK

tTS                            DILRR-(323个氨基酸)-PKQKRK

人a4 T-ag                      PKKKRKV

小鼠a1 LEF-1                   KKKKRKREK

小鼠a2 T-agáCK2位点            SSDDEATADSQHSTPPKKKRKV

Impa-P1)T-ag                   PKKKRKV

N1N2                           RKKRK-(9个氨基酸)-KAKKSK

RB                             KR-(11个氨基酸)-KKLR

Dorsal áPK A位点               RRPS-(22个氨基酸)-RRKRQK

CBP80                          RRR-(11个氨基酸)-KRRK

DNA解螺旋酶Q1                  KK-(15个氨基酸)-KKRK

LEF-1                          KKKKRKREK

小鼠a2 T-agáCK2                SSDDEATADSQHSTPPKKKRKV

Impa-P1)T-ag                   PKKKRKV

N1N2                           RKKRK-(9个氨基酸)-KAKKSK

RB                             KR-(11个氨基酸)-KKLR

Dorsal áPK A                   RRPS-(22个氨基酸)-RRKRQK

CBP80                          RRR-(11个氨基酸)-KRRK

DNA解螺旋酶Q1                  KK-(15个氨基酸)-KKRK

LEF-1                       KKKKRKREK

非洲蟾蜍a1 T-ag             PKKKRKV

核质蛋白                    KR-(10个氨基酸)-KKKL

酵母a1 T-ag                 PKKKRKV

(SRP1，Kap60)T-agáCK2       SSDDEATADSQHSTPPKKKRKV

N1N2                        RKKRK-(9个氨基酸)-KAKKSK

HIV-1IN                     KRK-(22个氨基酸)-KELQKQITK

植物a1 T-ag                 PKKKRKV

T-agáCK2                    SSDDEATADSQHSTPPKKKRKV

不透明二号                  RKRK-(7个氨基酸)-RRSRYRK

R蛋白(玉米)                 MISEALRKA

N1N2                        RKKRK-(9个氨基酸)-KAKKSK

RAG-1，重组激活蛋白1；RCP，红细胞蛋白；RB，成视网膜细胞瘤蛋白；STAT，转录(TF)的信号传导物与激活物；CBP80，帽结合蛋白；LEF，淋巴细胞增强子因子；EBNA，Epstein-Barr病毒核抗原；IN，HIV-1整合酶；tTG，组织型谷氨酰胺转移酶；ICP，感染细胞蛋白。

                              序列表

<110>布赖恩·F·奥当德

     苏珊·R·乔治

<120>鉴定与跨膜蛋白相互作用的化合物的方法

<130>P04CA094470

<140>PCT/CA03/00542

<141>2003-04-11

<150>60/371,704

<151>2002-04-12

<150>60/442,556

<151>2003-01-27

<150>60/422,891

<151>2002-11-01

<150>60/387,570

<151>2002-06-12

<150>60/379,419

<151>2002-05-13

<160>158

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>1

gaggactctg aacaccgaat tcgccgccat ggacgggact gggctggtg                 49

<210>2

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

gtgtggcagg attcatctgg gtaccgcggt tgggtgctga ccgtt                     45

<210>3

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

cctaagaggg ttgaaaatct tttaaatttt ttagcattaa aggcataaat g              51

<210>4

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

gcctttaatg ctaaaaaatt taaaagattt tcaaccctct taggatgc                  48

<210>5

<211>19

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>5

Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Asn Ala Asp Phe Arg Lys Ala Phe Ser

1               5                   10                  15

Thr Leu Leu

<210>6

<211>19

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>6

Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Asn Ala Lys Lys Phe Lys Arg Phe Ser

1               5                   10                  15

Thr Leu Leu

<210>7

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>7

tacccttacg acgtgccgga ttacgcc                                         27

<210>8

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>8

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

1               5

<210>9

<211>84

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>9

ggatccacta gtaacggccg ccagaccacc atgggatacc cgtacgacgt ccccgactac     60

gcaaggactc tgaacacctc tgcc                                            84

<210>10

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>10

ggccgccagc tgcgagttca ggttgggtgc tgaccg                               36

<210>11

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>11

Met Arg Thr Leu Asn Thr Ser Ala Met Asp Gly Thr Gly Leu Val Val

1               5                   10                  15

<210>12

<211>26

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>12

Met Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Arg Thr Leu Asn Thr

1               5                   10                  15

Ser Ala Met Asp Gly Thr Gly Leu Val Val

            20                  25

<210>13

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>13

ggaaagttct tttaagaaga agttcaaaag agaaac                               36

<210>14

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>14

gtttctcttt tgaacttctt cttaaaagaa ctttcc                               36

<210>15

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>15

Gln Pro Glu Ser Ser Phe Lys Met Ser Phe Lys Arg Glu Thr Lys Val

1               5                   10                  15

Leu

<210>16

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>16

Gln Pro Glu Ser Ser Phe Lys Lys Lys Phe Lys Arg Glu Thr Lys Val

1               5                   10                  15

Leu

<210>17

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>17

ccggtatgag aaaaagttta aacgcaaggc agccttc                              37

<210>18

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>18

ggctgccttg cgtttaaact ttttctcata ccggaaagg                            39

<210>19

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>19

Asn Pro Phe Arg Tyr Glu Arg Lys Met Thr Pro Lys Ala Ala Phe Ile

1               5                   10                  15

Leu Ile

<210>20

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>20

Asn Pro Phe Arg Tyr Glu Lys Lys Phe Lys Arg Lys Ala Ala Phe Ile

1               5                   10                  15

Leu Ile

<210>21

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>21

gtgctgccgt taaaaagttc aaacgcctgc ggtccaagg                            39

<210>22

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>22

ggaccgcagg cgtttgaact ttttaacggc agcacagacc                           40

<210>23

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>23

Leu Val Cys Ala Ala Val Ile Arg Phe Arg His Leu Arg Ser Lys Val

1               5                   10                  15

Thr Asn

<210>24

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>24

Leu Val Cys Ala Ala Val Lys Lys Phe Lys Arg Leu Arg Ser Lys Val

1               5                   10                  15

Thr Asn

<210>25

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>25

gcctttaatc ctaaaaaaaa aagaaaggtt tcaaccctct tagg                      44

<210>26

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>26

cctaagaggg ttgaaacctt tctttttttt ttaggattaa aggc                      44

<210>27

<211>19

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>27

Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Asn Ala Asp Phe Arg Lys Ala Phe Ser

1               5                   10                  15

Thr Leu Leu

<210>28

<211>19

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>28

Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Asn Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ser

1               5                   10                  15

Thr Leu Leu

<210>29

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>29

ggccgtggct ccaccgaatt cgccgccatg gatccactga atctg                     45

<210>30

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>30

ctgtgcgggc aggcagggta ccgcgcagtg gaggatcttc agg                       43

<210>31

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>31

caccaccttc aacaaaaaat tcaaaagagc cttcctgaag atcc                      44

<210>32

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>32

ggatcttcag gaaggctctt ttgaattttt tgttgaaggt ggtg                      44

<210>33

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>33

ggcatcacgc acctcaagct tgccgccatg gcatctctga gtcagc                    46

<210>34

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>34

gagtgttccc tcttctgcgg taccgcgcaa gacaggatct tgagg                     45

<210>35

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>35

aatacgactc actatag                                                    17

<210>36

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>36

cgccagtgtg atggataatg gtaccgcatg gaatccattc ggggtg                    46

<210>37

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>37

gcgccaatga gcctccccaa ttcc                                            24

<210>38

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>38

gagcctccct taggagcgaa tatgc                                           25

<210>39

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>39

cgcctgcagg ccgccatgag cctccccaat tcctcc                               36

<210>40

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>40

ccggtggatc ccgggccccg gagcgaatat gcag                                 34

<210>41

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>41

gggccccgga gcgaatatgc agaattctct tgaatgtcct cttgaatttt ttattgcaca     60

agg                                                                   63

<210>42

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>42

aagaattcgc caccatggat gaaacaggaa atctg                                35

<210>43

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>43

gggtaccgct actttacata tttcttctcc                                      30

<210>44

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>44

ttcttttctg ggaaaaaatt taagagaagg ctgtctac                             38

<210>45

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>45

tgtagacagc cttctcttaa attttttccc agaaaag                              37

<210>46

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>46

ctttttgtgt ctgtttctga attcgccacc atggagagaa aatttatg                  48

<210>47

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>47

gaacaggtct catctaagag gtaccgctac tcttgtttcc tttctc                    46

<210>48

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>48

gctgggaaaa aatttaaaag aagactaaag tctgcac                              37

<210>49

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>49

gtcttctttt aaattttttc ccagcaaagt aatagagc                             38

<210>50

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>50

ccccacctag ccaccatgaa cacttc                                          26

<210>51

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>51

ggggactatc agcattggcg ggagg                                           25

<210>52

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>52

ccccacctgc agccaccatg aacacttcag cc                                   32

<210>53

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>53

ggggaggatc cgcgcattgg cgggagggag tgc                                  33

<210>54

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>54

cgcactctgc aacaaaaaat tcaaacgcac ctttcgcc                             38

<210>55

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>55

ggcgaaaggt gcgtttgaat tttttgttgc agagtgcg                             38

<210>56

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>56

ggggcgaatt cgccgccatg gaggaaccgg gtgc                                 34

<210>57

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>57

gcaaacggta ccgcacttgt gcacttaaaa cgta                                 34

<210>58

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>58

atgtccaata aaaaatttaa aagagcattc cataaactg                            39

<210>59

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>59

ggaatgctct tttaaatttt ttattggaca tggtatag                             38

<210>60

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>60

aatacgactc actatag                                                    17

<210>61

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>61

gccgccagtg tgatggatac tggtaccgct agcagtgagt catttgtac                 49

<210>62

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>62

ccccttatct acgcctttag cgcaaagaag ttcaagcgc                            39

<210>63

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>63

gcgcttgaac ttctttgcgc taaaggcgta gataagggg                            39

<210>64

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>64

ctgccggagc aaaaaattca aaagagcctt ccaggagc                             38

<210>65

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>65

cctggaaggc tcttttgaat tttttgctcc ggcagtag                             38

<210>66

<211>19

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>66

Asn Pro Leu Ile Tyr Cys Arg Ser Pro Asp Phe Ile Arg Ala Phe Gln

1               5                   10                  15

Glu Leu Leu

<210>67

<211>19

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>67

Asn Pro Leu Ile Tyr Cys Arg Ser Lys Lys Phe Lys Arg Ala Phe Gln

1               5                   10                  15

Glu Leu Leu

<210>68

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>68

cgtctctgct ccctggtacc gccaccttga gccagtgg                             38

<210>69

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>69

taatacgact cactataggg                                                 20

<210>70

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>70

cgtctctgct ccctggtacc gccaccttga gccagtgg                             38

<210>71

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>71

ctatgcggcc aaaaagttca aaagactgcc tgggtcc                              37

<210>72

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>72

caggcagtct tttgaacttt ttggccgcat agatgggc                             38

<210>73

<211>24

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>73

Ser Ser Met Ala Met Val Pro Ile Tyr Ala Ala Tyr Lys Phe Cys Ser

1               5                   10                  15

Leu Pro Gly Ser Phe Arg Glu Lys

            20

<210>74

<211>24

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>74

Ser Ser Met Ala Met Val Pro Ile Tyr Ala Ala Lys Lys Phe Lys Arg

1               5                   10                  15

Leu Pro Gly Ser Phe Arg Glu Lys

            20

<210>75

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>75

ctatgcggcc aaaaagttca aaagactgcc tgggtcc                              37

<210>76

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>76

caggcagtct tttgaacttt ttggccgcat agatgggc                             38

<210>77

<211>24

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>77

Ser Ser Met Ala Met Val Pro Ile Tyr Ala Ala Tyr Lys Phe Cys Ser

1               5                   10                  15

Leu Pro Gly Ser Phe Arg Glu Lys

            20

<210>78

<211>24

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>78

Ser Ser Met Ala Met Val Pro Ile Tyr Ala Ala Lys Lys Phe Lys Arg

1               5                   10                  15

Leu Pro Gly Ser Phe Arg Glu Lys

            20

<210>79

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>79

gtcatttact aagcttgcca ccatggagac gacgcccttg                           40

<210>80

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>80

cctctcggtg agtggtaccg ccacagcatt caagcgg                              37

<210>81

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>81

ggacactgcc tggcaaagct tgcgagcatg gggccctgg                            39

<210>82

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>82

ggcgggactc caggcaggta ccgccgccac gtcatcctcc                           40

<210>83

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>83

ctatggaaga actggaaaaa atttaaaaga aacagcatca ac                        42

<210>84

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>84

caaagttgat gctgtttctt ttaaattttt tccagttctt cc                        42

<210>85

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>85

Phe Leu Leu Trp Lys Asn Trp Arg Leu Lys Asn Ile Asn Ser Ile Asn

1               5                   10                  15

Phe Asp Asn Pro

            20

<210>86

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>86

Phe Leu Leu Trp Lys Asn Trp Lys Lys Phe Lys Arg Asn Ser Ile Asn

1               5                   10                  15

Phe Asp Asn Pro

            20

<210>87

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>87

gctcttcggg ctcgagcagc gatgcgaccc tccgggacgg                           40

<210>88

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>88

ctatcctccg tggtaccgct gctccaataa attcactgc                            39

<210>89

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>89

gatcatcact ccaaagaaat ttaaaagacg tattatt                              37

<210>90

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>90

taatacgtct tttaaatttc tttggagtga tgatcaaccg                           40

<210>91

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>91

Arg Leu Ile Ile Thr Pro Gly Thr Phe Lys Glu Arg Ile Ile Lys Ser

1               5                   10                  15

Ile Thr

<210>92

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>92

Arg Leu Ile Ile Thr Pro Lys Lys Phe Lys Arg Arg Ile Ile Lys Ser

1               5                   10                  15

Ile Thr

<210>93

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>93

gggtctctaa gcttgccgcc atgtccggga aggg                                 34

<210>94

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>94

ccgcggcccg gaattcggat ggcatggttg gtg                                  33

<210>95

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>95

cgtgcccaag aaattcaagc gcctcaaagc cgtggtc                              37

<210>96

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>96

cggctttgag gcgcttgaat ttcttgggca cgttctgc                             38

<210>97

<211>22

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>97

Phe His Pro Glu Gln Asn Val Pro Lys Arg Lys Arg Ser Leu Lys Ala

1               5                   10                  15

Val Val Thr Ala Ala Thr

            20

<210>98

<211>22

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>98

Phe His Pro Glu Gln Asn Val Pro Lys Lys Phe Lys Arg Leu Lys Ala

1               5                   10                  15

Val Val Thr Ala Ala Thr

            20

<210>99

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>99

ggagacccca agcttccgca gccatgggca ccgggggcc                            39

<210>100

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>100

ccccgccacg ggccccggaa ggattggacc gaggcaagg                            39

<210>101

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>101

ccgctgggac cgaaaaaatt taagagaaac cctgagtatc tc                        42

<210>102

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>102

gatactcagg gtttctctta aattttttcg gtcccagcgg ccc                       43

<210>103

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>103

taatacgact cactataggg                                                 20

<210>104

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>104

gactgcagcc tggtggtacc gcagagcaag ccacatagct gggg                      44

<210>105

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>105

taatacgact cactataggg                                                 20

<210>106

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>106

gactgcagcc tggtggtacc gcagagcaag ccacatagct gggg                      44

<210>107

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>107

gctgctctcc cacaaaaagt ttaagcggca gaagatctgg                           40

<210>108

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>108

ccagatcttc tgccgcttaa actttttgtg ggagagcagc                           40

<210>109

<211>21

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(14)..(14)

<223>Xaa＝鸟氨酸

<400>109

Thr Val Leu Ala Leu Leu Ser His Arg Arg Ala Leu Lys Xaa Lys Ile

1               5                   10                  15

Trp Pro Gly Ile Pro

            20

<210>110

<211>21

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(14)..(14)

<223>Xaa＝鸟氨酸<400>110

Thr Val Leu Ala Leu Leu Ser His Lys Lys Phe Lys Arg Xaa Lys Ile

1               5                   10                  15

Trp Pro Gly Ile Pro

            20

<210>111

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>111

gctcttcggg ctcgagcagc gatgcgaccc tccgggacgg                           40

<210>112

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>112

ctatcctccg tggtaccgct gctccaataa attcactgc                            39

<210>113

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>113

cacatcgttc ggaagaagtt taagcggagg ctgctgc                              37

<210>114

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>114

cctgcagcag cctccgctta aacttcttcc gaacgatgtg                           40

<210>115

<211>19

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>115

Arg Arg Arg His Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln

1               5                   10                  15

Glu Arg Glu

<210>116

<211>19

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>116

Arg Arg Arg His Ile Val Arg Lys Lys Phe Lys Arg Arg Leu Leu Gln

1               5                   10                  15

Glu Arg Glu

<210>117

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>117

gaggactctg aacaccgaat tcgccgccat ggacgggact gggctggtg                 49

<210>118

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>118

gtgtggcagg attcatctgg gtaccgcggt tgggtgctga ccgtt                     45

<210>119

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>119

cctctgagga cctgaaaaag aagagaaagg ctggcatcgc c                         41

<210>120

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>120

ggcgatgcca gcctttctct tctttttcag gtcctcagag g                         41

<210>121

<211>33

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>121

Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Asn Ala Asp Phe Arg Lys Ala Phe Ser

1               5                   10                  15

Thr Leu Leu Ser Ser Glu Asp Leu Lys Lys Glu Glu Ala Ala Gly Ile

            20                  25                  30

Ala

<210>122

<211>33

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>122

Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Asn Ala Lys Lys Phe Lys Arg Phe Ser

1               5                   10                  15

Thr Leu Leu Ser Ser Glu Asp Leu Lys Lys Lys Arg Lys Ala Gly Ile

            20                  25                  30

Ala

<210>123

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>123

cctagtccgc agcaggccga attcgccacc atggacagca gcacc                     45

<210>124

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>124

gatggtgtga gaccggtacc gcgggcaatg gagcagtttc tgcc                      44

<210>125

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>125

cctagtccgc agcaggccga attcgccacc atggacagca gcacc                     45

<210>126

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>126

ggatggtgtg agaccggtac cgcgggcaat ggagcagttt ctgcc                     45

<210>127

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>127

gccttcctgg ataaaaaatt caagcgatgc                                      30

<210>128

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>128

gcatcgcttg aattttttat ccaggaaggc g                                   31

<210>129

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>129

Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

1               5

<210>130

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(4)..(14)

<223>Xaa为任何11个氨基酸的序列

<400>130

Arg Arg Arg Xaa Lys Arg Arg Lys

1               5

<210>131

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(3)..(17)

<223>Xaa为任何15个氨基酸的序列

<400>131

Lys Lys Xaa Lys Lys Arg Lys

1               5

<210>132

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>132

Lys Arg Lys Arg Arg Pro

1               5

<210>133

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>133

Pro Lys Lys Asn Arg Leu Arg Arg Lys

1               5

<210>134

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(5)..(24)

<223>Xaa为任何20个氨基酸的序列

<400>134

Lys Arg Gln Arg Xaa Lys Lys Ser Lys Lys

1               5                   10

<210>135

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>135

Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp

1               5

<210>136

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>136

Gln Arg Lys Arg Gln Lys

1               5

<210>137

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>137

His Arg Ile Glu Glu Lys Arg Lys Arg Thr Tyr Glu Thr Phe Lys Ser

1               5                   10                  15

Ile

<210>138

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>138

Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys

1               5

<210>139

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>139

Lys Ser Lys Lys Lys Ala Gln

1               5

<210>140

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>140

Lys Lys Lys Lys Arg Lys Arg Glu Lys

1               5

<210>141

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>141

Leu Lys Arg Pro Arg Ser Pro Ser Ser

1               5

<210>142

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(4)..(25)

<223>Xaa为任何22个氨基酸的序列

<400>142

Lys Arg Lys Xaa Lys Glu Leu Gln Lys Gln Ile Thr Lys

1               5                   10

<210>143

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>143

Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys His

1               5

<210>144

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>144

Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys

1               5

<210>145

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>145

Lys Ser Lys Lys Lys Ala Gln

1               5

<210>146

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(4)..(353)

<223>Xaa任何350个氨基酸的序列

<400>146

Glu Glu Asp Xaa Lys Lys Lys Arg Glu Arg Leu Asp

1               5                   10

<210>147

<211>25

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>147

Cys Tyr Phe Gln Lys Lys Ala Ala Asn Met Leu Gln Gln Ser Gly Ser

1               5                   10                  15

Lys Asn Thr Gly Ala Lys Lys Arg Lys

            20                  25

<210>148

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(6)..(328)

<223>Xaa为任何323个氨基酸的序列

<400>148

Asp Ile Leu Arg Arg Xaa Pro Lys Gln Lys Arg Lys

1               5                   10

<210>149

<211>22

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>149

Ser Ser Asp Asp Glu Ala Thr Ala Asp Ser Gln His Ser Thr Pro Pro

1               5                   10                  15

Lys Lys Lys Arg Lys Val

            20

<210>150

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(6)..(14)

<223>Xaa为任何9个氨基酸的序列

<400>150

Arg Lys Lys Arg Lys Xaa Lys Ala Lys Lys Ser Lys

1               5                   10

<210>151

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(3)..(13)

<223>Xaa为任何11个氨基酸的序列

<400>151

Lys Arg Xaa Lys Lys Leu Arg

1               5

<210>152

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(5)..(27)

<223>Xaa为任何22个氨基酸的序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(5)..(26)

<223>Xaa为任何氨基酸

<400>152

Arg Arg Pro Ser Xaa Arg Arg Lys Arg Gln Lys

1               5                   10

<210>153

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(4)..(14)

<223>Xaa为任何11个氨基酸的序列

<400>153

Arg Arg Arg Xaa Lys Arg Arg Lys

1               5

<210>154

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(3)..(12)

<223>Xaa为任何10个氨基酸的序列

<400>154

Lys Arg Xaa Lys Lys Lys Leu

1               5

<210>155

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(5)..(11)

<223>Xaa为任何7个氨基酸的序列

<400>155

Arg Lys Arg Lys Xaa Arg Arg Ser Arg Tyr Arg Lys

1               5                   10

<210>156

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>156

Met Ile Ser Glu Ala Leu Arg Lys Ala

1               5

<210>157

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>157

Lys Lys Phe Lys Arg

1               5

<210>158

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>肽

<400>158

Ala Phe Ser Ala Lys Lys Phe Lys Arg

1               5