秋石斛兰优质种苗组织培养快速繁殖方法

摘要

本发明涉及秋石斛兰的优质种苗快速繁殖方法和所使用的培养基。秋石斛兰又称蝴蝶石斛，作为一种新型的高档切花品种，市场需求量较大。我国大陆近年来引进了不少秋石斛兰品种，但种苗生产主要靠分株，繁殖速度慢。已生产出的优质的秋石斛兰种苗，市场十分看好。本发明提供多种秋石斛兰原种和杂种的组织培养繁殖方法和所使用的培养基。通过丛生芽途径进行秋石斛兰优良品种的织培养获得大量性状稳定的试管苗，本发明提供的方法生产出的秋石斛兰种苗具有遗传稳定性高，出苗快，苗壮，种苗品质好、抗性强、生长良好等优势。

说明书

技术领域

本发明涉及秋石斛兰的优质种苗快速繁殖方法和所使用的培养基。

背景技术

秋石斛兰又称蝴蝶石斛，多是以原产于新几内亚的热带原生种蝴蝶石斛(Dendrobiumphalaenopsis)为亲本育成的杂交品种。新几内亚、澳大利亚是秋石斛类原种的故乡，杂交品种栽培最多的是以泰国为主产地的“熊猫1号”，其它较流行的品种有“仙绨”、“玛丽”、诺曼等。

秋石斛无明显的休眠期，叶片可维持数年不脱落；每年秋天可见花序从假鳞茎的顶部及附近的节上抽出。花茎比较长，每茎有十多朵花，有时一个假鳞茎可开出多枝花并连续开花数年，可作切花也可作盆花栽培。秋石斛根据其花的大小把它分成二类：一类是大花型秋石斛，其花形及花在花序上的着生方式极像蝴蝶兰，只是唇瓣较蝴蝶兰的唇瓣简单得多，如杂种蝴蝶石斛，可作盆花或切花之用；另一类是小花型秋石斛，主要特点是萼片细长，向上斜立，有反卷状。花朵厚实，花期特别长，也特别适宜作盆花切花之用。

秋石斛在我国花卉市场出现比较早，这类石斛兰最大的特点是在高温高湿和短日照的环境下，才能形成花芽，适合于热带和高温温室栽培。一般花期在秋季，但常常只要条件许可，在其它季节也可能开花。秋石斛(Dendrobium)的原种主要分布于大洋洲的澳大利亚和巴布亚新几内亚的热带丛林中，常附生于低地雨林的大树上或石壁上，它们的共同特点是花期局限于秋季，但目前，经过人工杂交培育，已经出现了许多花色不同，花期全年开放的流行品种。现在秋石斛切花产量最大的地区为泰国、马来西亚和夏威夷等热带地区，我国栽培量还较少，作为一种新型的高档切花品种，市场需求量较大。

我国大陆近年来引进了不少秋石斛兰品种，但种苗生产主要靠分株，繁殖速度慢。已生产出的优质的秋石斛兰种苗，市场十分看好。目前，国内还未见秋石斛兰种苗组织培养快速繁殖成功的报道，也未有秋石斛兰种苗快速繁殖的专利。

发明内容

本发明提供了多种秋石斛兰原种和杂种的组织培养繁殖方法和所使用的培养。对外植体的选择，培养条件和培养基成分进行了系统阐述，应用价值高。通过丛生芽途径进行秋石斛兰优良品种的组织培养获得大量性状稳定的试管苗，为满足秋石斛兰优质种苗市场的需要提供一条有效的途径。

本发明所述的秋石斛兰优质种苗快速繁殖方法包括以下步骤：

1.材料：此发明已实验的材料有蝴蝶石斛(Dendrobium phalaenepsis)、羊角石斛(Dendrobium stratiotes)、熊猫1号(Dendrobium Ekapol Pandal’)、熊猫2号(Dendrobium  Ekapol Panda 2’)、泰国白(Dendrobium Thailand White)、庄富(Dendrobium Joam Ku)、紫蝶(Dendrobium Isumi Kiyoshi)、花脸(Dendrobium Kelrme)等，材料均取自华南植物园。

2.外植体的消毒：取秋石斛兰当年生具5-6个节的嫩芽，去除叶片后，用自来水冲洗干净后剪成两段，在超净工作台上用70％的酒精浸泡1分钟，再用0.1％升汞溶液灭菌10分钟，无菌水冲洗5次后，用无菌吸水纸吸干，剪取2-3厘米带节的茎段和茎尖，接种到原球茎和丛生芽诱导培养基上。

3.原球茎和丛生芽的诱导：诱导培养基为MS+6-苄基嘌呤1-5毫克/升+萘乙酸0.2-0.5毫克/升+15％椰子水培养基上，在培养温度(26±2)℃条件下，10天左右茎尖开始生长，20天左右茎段节上有新芽形成并生长，当6-苄基嘌呤为4-5时新芽基部有原球茎产生。培养基含蔗糖30克/升，pH 5.5-5.8，琼脂0.7％。光照度1500～2000lx，光照12小时/天。

4.丛生芽增殖：将利用茎段和茎尖培养得到的丛生芽，剪去部分叶片转移到丛生芽增殖培养基：MS+6-苄基嘌呤1-5毫克/升+萘乙酸0.2-0.5毫克/升+15％椰子水，能诱导原球茎和丛生芽形成；原球茎能在较高的6-苄基嘌呤浓度培养基上增殖，原球茎转入较低6-苄基嘌呤浓度的培养基时会分化出丛生芽，丛生芽在较低6-苄基嘌呤浓度的培养基上能增殖。光照度1500～2000lx，光照12小时/天。

5.生根壮苗培养：丛生芽增殖多代后，可将丛生芽切割成单个芽，接种在1/2MS培养基+萘乙酸0.5-1.0毫克/升+香蕉汁100克/升+活性碳0.5克/升的生根壮苗培养基上进行生根壮苗培养。40天左右能形成株高3-4厘米的完整植株。光照度1500～2000lx，光照12小时/天。

6.试管苗移栽：春季为移栽的适宜季节。试管苗移栽时，在自然光照下炼苗5-10天，将秋石斛兰小苗从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，在0.1％的高锰酸钾溶液中浸泡5分钟后凉干，以小塑料盆为栽培容器，以浸泡过的泥炭藓为栽培基质，保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达95％-100％。冬季时采用温室种植，温度维持在15℃以上，否则易引起落叶甚至死亡。

本发明提供的方法生产出的秋石斛兰种苗具有遗传稳定性高，出苗快，苗壮，种苗品质好、抗性强、生长良好等优势。本发明所述的方法能成功地进行优良品种的秋石斛兰优质种苗的组织培养和快速繁殖，由于是采用无性繁殖，实施该方法只需有简单的植物组织培养设备即可进行，是利用植物组织细胞的全能性和植物组织培养等生物技术进行植物优质种苗的规模化生产，具有投入少，产出高的优势。

具体实施方式

实施例1

1、取材：蝴蝶石斛。

2、外植体的消毒：取蝴蝶石斛当年生具5-6个节的嫩芽，去除叶片后，用自来水冲洗干净后剪成两段，在超净工作台上用70％的酒精浸泡1分钟，再用0.1％升汞溶液灭菌10分钟，无菌水冲洗5次后，用无菌吸水纸吸干，剪取2-3厘米带节的茎段和茎尖，接种到原球茎和丛生芽诱导培养基上。

3、原球茎和丛生芽的诱导：诱导培养基为MS+6-苄基嘌呤2-5毫克/升+萘乙酸0.2-0.5毫克/升+15％椰子水培养基上，在培养温度(26±2)℃条件下，10天左右茎尖开始生长，20天左右茎段节上有新芽形成并生长，当6-苄基嘌呤为4-5时新芽基部有原球茎产生。培养基含蔗糖30克/升，pH 5.5-5.8，琼脂0.7％。光照度1500～2000lx，光照12小时/天。

4、丛生芽增殖：将利用茎段和茎尖培养得到的丛生芽，剪去部分叶片转移到丛生芽增殖培养基：MS+6-苄基嘌呤1-5毫克/升+萘乙酸0.2-0.5毫克/升+15％椰子水，能诱导原球茎和丛生芽形成。当6-苄基嘌呤浓度为1-2毫克/升时只有丛生芽，无原球茎，当6-苄基嘌呤浓度为3-4毫克/升时既有丛生芽，又有原球茎，当6-苄基嘌呤浓度为5毫克/升以上时，生成的原球茎多，诱导出的丛生芽数量少。原球茎能在较高的6-苄基嘌呤浓度培养基上增殖，原球茎转入较低6-苄基嘌呤浓度的培养基时会分化出丛生芽，丛生芽在较低6-苄基嘌呤浓度的培养基上能增殖。

5、生根壮苗培养：丛生芽增殖多代后，可将丛生芽切割成单个芽，接种在1/2MS培养基+萘乙酸0.5-1.0毫克/升+香蕉汁100克/升+活性碳0.5克/升的生根壮苗培养基上进行生根壮苗培养。40天左右能形成株高3-4厘米的完整植株。

6、试管苗移栽：春季为移栽的适宜季节。试管苗移栽时，在自然光照下炼苗5-10天，将蝴蝶石斛小苗从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，在0.1％的高锰酸钾溶液中浸泡5分钟后凉干，以小塑料盆为栽培容器，以浸泡过的泥炭藓为栽培基质，温度维持在15℃以上，保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达90％。