用己烯雌酚产生超数同步成熟卵的方法

摘要

本发明提供了用己烯雌酚产生超数同步成熟卵的方法和用于产生超数同步成熟卵的组合物。本发明方法可简便有效地获得超数同步成熟卵。

说明书

技术领域

本发明涉及生物学领域，更具体地涉及用己烯雌酚产生超数同步成熟卵的方法。

背景技术

哺乳动物的卵巢含有大量的处于不同发育时期的卵泡，在其一生中大部分卵泡凋亡，只有极少部分卵泡长足，成熟并排卵。因而如何充分利用卵巢内的大量卵泡是目前科技工作者的一个热门研究课题。目前，研究者多选用从屠宰场回收卵巢并收集大卵泡中的卵母细胞进行体外成熟培养、受精等研究。为此，过去研究者的较多精力致力在培养系统的改进，以期提高受精率和发育率，充分利用所获取的有限卵子，却忽视卵巢内大量其它发育阶段卵泡的存在和利用。

1996年，Eppig虽首次成功地体外培养小鼠原始卵泡，获得成熟卵，但受精后进一步发育率极低，又190枚2细胞胚胎的移植只获得了一只新生鼠。然而这项实验结果却开辟了利用哺乳动物原始卵泡中卵的先河，使哺乳动物的体外受精获取大量卵子成为可能。

目前已建立了小鼠、大鼠、仓鼠、猫、猪、绵羊、山羊、牛和人卵巢内小卵泡的体外培养系统，但是大多数的研究报道仍是针对卵泡的发育而很少涉及卵的发育。最近虽有猪和牛早期卵泡内的卵子经体外培养和异种间移植培养后，可长足并获得发育的潜能的报道，但仍处在试验阶段，很多技术尚未成熟。

己烯雌酚(Diethylstilbestrolum，DES)是一种现成的药用和兽用化合物。它是人工合成雌激素，促进女性第二性征和性器官的发育和成熟；使子宫内膜增生；小剂量时能促进垂体前叶催乳激素分泌，促进泌乳，大剂量时，可以抑制促性腺激素分泌，抑制排卵；对抗雄激素的作用；。临床上用于月经失调，更年期综合症，子宫发育不全，回奶，老年女性骨质疏松症，也可用于治疗前列腺肥大症。然而，并没有将己烯雌酚用于产生超数同步成熟卵的报道。

综上所述，本领域缺乏有效地产生超数同步成熟卵的方法，因此，本领域迫切需要开发新的有效产生超数同步成熟卵的方法和相关试剂。

发明内容

本发明的目的就是提供一种有效地产生超数同步成熟卵的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种己烯雌酚的用途，它被用于制备产生超数同步成熟卵的组合物。

在另一优选例中，所述的组合物用于以下动物：小鼠、大鼠、仓鼠、猫、猪、绵羊、山羊、牛或人。

在本发明的第二方面，提供了一种用于产生超数同步成熟卵的组合物，它含有0.005-1重量百分比的己烯雌酚和生理上可接受的溶剂。

在另一优选例中，所述组合物含有0.01-0.5重量百分比的己烯雌酚。

在另一优选例中，所述的溶剂选自下组：

(a)乙醇；

(b)植物油；

(c)1∶100-100∶1的乙醇与植物油的混合溶剂，或者

(d)1重量份(a)-(c)中任一所述的溶剂与0.01-100重量份水所形成的混合溶剂。

在本发明的第三方面，提供了一种使非人哺乳动物产生超数同步成熟卵的方法，包括步骤：将己烯雌酚施用于雌性非人哺乳动物5-10天，施用量为0.01-10mg/kg体重，每天一次。

在另一优选例中，所述的非人哺乳动物是小鼠、大鼠、仓鼠、猫、猪、绵羊、山羊、或牛。

在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：在施用己烯雌酚结束后，从非人哺乳动物的卵巢中分离出成熟卵。

在另一优选例中，对于体重小于10kg的动物，施用量为0.1-2mg己烯雌酚/只动物；对于体重为10-100kg的动物，施用量为1-5mg己烯雌酚/只动物。

在另一优选例中，在施用时，前1-3天的施用剂量大于第4-10天的施用剂量。

具体实施方式

本发明人经过深入而广泛的研究，通过在离体条件下，卵母细胞与未分化颗粒细胞、垂体前叶联合培养，建立离体垂体-颗粒细胞培养系统，从众多化合物中首次筛选出一种能够有效地促进动物产生超数同步成熟卵的化合物，即己烯雌酚。已经证实，经己烯雌酚刺激后，卵巢内大量卵的发育趋于同步化。收集这些趋于同步成熟的卵经反复证明在垂体-颗粒细胞培养系统培养成熟后，能完成正常受精和发育，并成为完整的健康个体。卵巢内大量卵经离体培养，获得符合正常生理标准的超数同步成熟卵。在此基础上完成了本发明。

如本文所用，术语“超数”指数目大于2，例如为2-10000个，较佳地5-5000个，更佳地10-1000个，最佳地为50-500个。

如本文所用，术语“超数同步成熟卵”指同时处于成熟阶段的卵的数目大于2，例如为2-10000个，较佳地5-5000个，更佳地10-1000，最佳地为50-500个。

活性化合物

本发明用产生超数同步成熟卵的活性化合物是己烯雌酚(Diethylstilbestrolum，DES)。己烯雌酚是一种现成的药用和兽用化合物。它是人工合成雌激素，促进女性第二性征和性器官的发育和成熟；使子宫内膜增生；小剂量时能促进垂体前叶催乳激素分泌，促进泌乳，大剂量时，可以抑制促性腺激素分泌，抑制排卵；对抗雄激素的作用；。临床上用于月经失调，更年期综合症，子宫发育不全，回奶，老年女性骨质疏松症，也可用于治疗前列腺肥大症。

己烯雌酚可用常规方法合成或购得。

己烯雌酚可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、以及与有机酸形成的盐，而有机酸则指乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸和马来酸。其他盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式(当以这种形式给药时，在体内可转化成活性部分)。

给药途径和剂量

己烯雌酚可以各种途径给药，如口服、非肠道给药或直肠给药。以非肠道给药为宜，如静脉内、肌肉内或皮下注射。以静脉注射为最好。

己烯雌酚的剂量可以根据给药方式、制剂类型而有很大的变化。通常，己烯雌酚的典型剂量范围为0.01-10mg/kg，较佳的剂量范围为0.05-5mg/kg，更佳的剂量范围为0.1-1mg/kg。本领域技术人员也可以通过实验确定合适的剂量。

剂型

己烯雌酚可与药学上可接受的载体或兽医学上可接受的载体混合，从而形成本发明的用于产生超数同步成熟卵的组合物。合适的固态载体包括：淀粉、乳糖、磷酸二钙、微晶纤维素、蔗糖和白陶土，而液态载体包括：无菌水、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，只要适合活性成分的特性和所需的特定给药方式。在Remington’s PharmaceuticalSciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体(赋形剂)的充分讨论。

从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是液态组合物，如针剂。化合物的口服给药也是优选的。

这些活性化合物也可肠胃外或腹腔内给药。也可在适当混合有表面活性剂(如羟丙基纤维素)的水中制备这些活性化合物(作为游离碱或药学上可接受的盐)的溶液或悬浮液。还可在甘油、液体、聚乙二醇及其在油中的混合物中制备分散液。在常规储存和使用条件下，这些制剂中含有防腐剂以防止微生物生长。

适应于注射的药物形式包括：无菌水溶液或分散液和无菌粉(用于临时制备无菌注射溶液或分散液)。在所有情况中，这些形式必须是无菌的且必须是流体以易于注射器排出流体。在制造和储存条件下必须是稳定的，且必须能防止微生物(如细菌和真菌)的污染影响。载体可以是溶剂或分散介质，其中含有如水、醇(如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇)、它们的适当混合物和植物油。

制备本发明的组合物的方法没有特别限制，可以采用制药领域常规的各种方法。

本发明的主要优点在于，

(a)可以有效地获得大量同步成熟卵。

(b)方法简便。

本发明不仅为深入探讨哺乳动物卵母细胞成熟及发育机制奠定基础，且在实际应用方面具有较高的经济价值，尤其适用于以下方面：

1、为家畜繁殖和改良提供大量可供移植的正常胚胎。

2、名贵宠物的繁殖和遗传资源的保存。

3、提供大量卵母细胞及胚胎用作转基因、克隆和治疗性克隆之用。

4、濒危动物的大量繁殖，可用于挽救濒危动物。

5、应用于哺乳动物卵母细胞成熟及早期胚胎发育相关机制等基础研究，包括满足建立各发育阶段胚胎基因组文库和cDNA文库所需的胚胎数。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

用己烯雌酚使鼠产生超数同步成熟卵

1材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1实验动物

Sprague-Dawley(S.D)大鼠(购自上海市计划生育科学研究所必凯实验动物中心)，新西兰兔。根据实验需要，选择不同鼠龄幼鼠，分批使用。

1.1.2试剂

TCM-199培养基、Mccoy’s-5A、胎牛血清(FBS)、D-PBS(无钙、镁离子PBS)、丙酮酸钠、谷氨酰胺、非必需氨基酸、青链霉素等购自GIBCO/BRL公司；water、雄烯二酮、己烯雌酚、dcAMP及相关培养试剂均为细胞培养级或胚胎培养级，购自Sigma公司

1.2方法

1.2.1未分化颗粒细胞及其条件培养液的制备

选用体重约50-100克左右S.D雌性幼鼠，手术切除脑下垂体。手术后休息5天，然后，每天腹部皮下注射己烯雌酚(方案为第1-2天0.2-1mg/只大鼠；第3-7天0.1-1mg/只大鼠)，连续注射五天后。解剖取其卵巢，用温热的D-PBS冲洗干净，去除卵巢包膜，刺破卵泡膜，挤出颗粒细胞。用Mccoy’s-5A漂洗未分化颗粒细胞数两次后，每个35mm培养皿(Falcon)接种10⁷个颗粒细胞，37℃，5％CO₂培养箱内培养，每皿另加雄烯二酮(终浓度为2×10^-7mol/L)和半只动情前期大鼠脑下垂体前叶。培养24h，取其上清液，5000rpm，4℃离心15分钟，0.22um过滤，得到所需的条件培养液，分装冷冻保存。

1.2.2脑下垂体前叶

选用动情前期大鼠，取其脑下垂体，并在解剖镜下，剔除中后叶，保留前叶，供卵母细胞离体共培养之用。

1.2.3兔输卵管上皮细胞的获取及其条件培养液的制备

选择健康、体重3kg左右雌性新西兰大白兔，用雌激素和孕酮调节其动情周期和黄体期。麻醉后，取其双侧输卵管。用温热的D-PBS漂洗输卵管，管腔内注入0.25％胰蛋白酶37℃，消化孵育5分钟后，用含10％FBS的TCM-199培养液冲洗输卵管，并用镊子挤压输卵管，使输卵管腔中的粘膜表层上皮细胞外逸。收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃上清，重新加入TCM-199培养液悬浮细胞，每个35mm培养皿(Falcon)接种5×10⁶个细胞，37℃，5％CO₂培养箱内培养。48h后上皮细胞均匀贴壁，更换全部培养液，重新加入2ml新鲜TCM-199培养液，培养48h。取其上清液，5000rpm，4℃离心15分钟，0.22um过滤，得到所需的条件培养液，分装冷冻保存。

1.2.4卵母细胞的体外成熟

出身后27日龄的S.D雌性幼鼠，连续两天腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG)15iu，第三天适量1％戊巴比妥钠麻醉后，取其单侧卵巢，用温热的D-PBS冲洗干净，用外科镊剥除卵巢膜后，用解剖针刺破大的卵泡，收集带卵丘细胞的卵母细胞；或选用21日龄S.D雌性幼鼠，连续八天腹部皮下注射己烯雌酚(方案为第1-3天0.2-1.5mg/只鼠；第4-8天0.1-1mg/只鼠)，第九天按上述方法收集卵母细胞。将所收集的卵母细胞用温热的Mccoy’s-5A轻轻漂洗两次后，每40-50枚卵母细胞移入含250ul未分化颗粒细胞的条件培养液和250ul Mccoy’s-5A培养液的四孔细胞培养板内(Nunc)，37.5℃，5％CO₂培养箱内培养。24小时后观察颗粒细胞与卵母细胞偶联情况，并统计排出第一极体的卵母细胞数。

1.2.5体外授精法与胚胎的体外培养

取一小段已被证实是可育的S.D雄性大鼠的附睾尾部输精管，用D-PBS漂洗干净，置于精子获能液中，20分钟后吸取游出的精子于4ml含0.1％dcAMP的获能液中，于37.5℃，5％CO₂培养箱内进行获能培养3小时。按精子的终浓度为5×10⁵/ml加入受精液中进行授精。

体外培养成熟的卵用温热的受精液轻轻漂洗两次后，每50枚成熟卵移入含500ul受精液的四孔细胞培养板内(Nunc)，进行体外授精，24小时后观察、统计受精情况。受精的判断标准：大鼠卵母细胞与精子离体培养16-24小时后，从各实验组随机吸取10枚胚胎，固定(乙醇24h)、染色(甘油∶PBS＝3∶1，含Hoechst 33342 10ug/ml，10min)、荧光显微镜镜检，以雌、雄原核形成判断为受精。

受精24小时后的胚胎用温热的含10％FBS的TCM-199培养液轻轻漂洗2次，每40-50枚胚胎移入含250ul含10％FBS的TCM-199培养液和250ul兔输卵管上皮细胞条件培养液的四孔细胞培养板(Nucn)内，37.5℃，5％CO₂培养箱中培养1-4天，每天观察受精卵发育情况。

1.2.6囊胚的细胞数测定

将体内、外发育至囊胚阶段的胚胎置于0.2％的柠檬酸钠低渗液中5min，然后转移至固定液(醋酸∶甲醇∶水＝3∶2∶1)中，37℃固定1小时，10％Giemsa染色5min，显微镜下统计细胞数。

1.2.7超数同步受精胚胎的体内移植

在动情期(day1)的上午8:00-9:00以按摩振荡器(塑料头)插入雌性S.D大鼠阴道中刺激子宫颈，导致假孕。于第二天(day2)11:00-13:00，将假孕大鼠用1％戊巴比妥钠0.8ml腹腔注射麻醉，并作背部切口，于卵巢包囊系膜对侧作一小切口，牵出卵巢，使输卵管伞部暴露，将20枚2-细胞胚胎注入输卵管伞部，每天阴道涂片核实怀孕情况。

2结果

2.1超数同步成熟卵的获取

断奶仔鼠经己烯雌酚多天刺激后，近卵园形的卵巢体积增大，由(4.8mm±0.6mm×3.9mm±0.5mm，n＝6)增至(11.4mm±1.46mm×9.1mm±01.07mm，n＝14)，重量由(8.32±1.63mg，n＝12)增至(11±1.55mg，n＝12)，质地均匀透亮，卵巢卵泡充分生长，大小均匀，明显不同于PMSG刺激后卵泡发育大小不均的形状；卵巢石蜡切片显示仔鼠注射己烯雌酚三天后，卵泡内颗粒细胞增殖，卵母细胞迅速生长，大量原始和初级卵泡发育；注射己烯雌酚五至八天后卵巢内三级卵泡和早期成熟卵泡占卵泡总数的大部(＞80％)，此时刺破卵泡可获得大量趋向同步成熟的卵，这些卵(407±32um，n＝17)经体外适合的培养系统可以离体培养成熟、正常受精及卵裂(见表1)。经过多次实验，我们发现采用21天S.D雌性幼鼠注射己烯雌酚可以获取较多同步成熟卵(189±28枚/只卵巢)，而常规PMSG超数排卵法，每只大鼠只能获取(24±9枚/只卵巢)枚。

                 表1：卵母细胞的体外成熟、受精和离体发育

实验组

                成熟率(％)     受精率(％)    卵裂率(％)    桑椹/囊胚率(％)

(6只鼠的总卵数)

DES组(1744)     1354(77.6％)^a 1189(87.8％)  1103(93％)^a  693(59％)

PMSG组(197)     45％(89/197)^b 80(89.9％)    64(80％)^b    53(67％)

注：a：b p＜0.01

2.2超数同步受精胚胎的体外发育潜能分析

仔鼠经己烯雌酚刺激后，获取的超数卵中77.6％(1354/1744)排出第一极体达到成熟，这些成熟的卵母细胞中87.8％(1189/1354)均可正常受精，93％(1103/1189)卵裂，经体外培养96h，有59％(693/1189)的受精胚胎可发育到桑椹或囊胚。与PMSG组相比，两组并无太大差别(受精率87.8％Vs89.9％)、及囊胚率(59％Vs67％)，这充分说明超数同步成熟卵的发育潜能与常规PMSG超排法获取的卵子发育能力相似。

从表2可以发现受精胚胎移入发情期兔输卵管，经72小时离体培养，桑椹和囊胚的发育率从体外与兔输卵管上皮细胞条件培养共培养囊胚的形成率的40％提高到67％，且受精胚胎几乎全部通过2细胞阻断，进行正常的卵裂，直至桑椹/囊胚期。

表2：超数同步受精胚胎体外共培养与移入离体兔输卵管中

                 培养72小时的发育结果

实验组(共2次)                            培  养  情  况 未卵裂卵  (n) 2-细胞胚胎    (n) 4-16细胞胚胎    (％)  桑椹胚  (％)    囊胚    (％)体外共培养(165枚)  21    31    62    (37.6％)  27  (16.4％)    24    (14.5％)移植入兔输卵管，离体培养(200枚)  27    17    22    (11％)  61  (30.5％)    73    (36.5％)

大鼠体内正常发育的囊胚，其细胞数为(58±2，n＝16)，与超数同步成熟法获取的卵母细胞经体外培养至囊胚阶级的细胞数(56±2，n＝14)无明显差异，这说明仔鼠经己烯雌酚刺激后，获取的大量同步受精卵已经具备了进一步发育的潜能，可以进行着床前的正常发育。

共进行了三次超数同步受精胚胎的体内移植实验，结果见表3。

             表3：超数同步受精胚胎的体内移植

胚胎植入时期移植受体数    (只)怀孕母鼠数    (只)  出生情况    (只)胎儿平均体重量    (g)2-细胞期    5    2    17    6.4±0.65

这些移植出生的大鼠目前健康状况良好，性成熟后均可正常产仔。

实施例2

用己烯雌酚使山羊产生超数同步成熟卵

重复实施例1中的试验，不同点在于用山羊替代大鼠，同时施用剂量改为方案为第1-3天1-5mg/只山羊；第4-8天1-2.5mg/只山羊。

结果，同样获得了大量的超数同步成熟卵(50-150枚)。

实施例3

制备用于产生超数同步成熟卵的组合物

配方A(见表4)：10mg己烯雌酚先用200微升95％乙醇助溶后加入10ml植物油，混匀后配成1mg/ml的注射液(己烯雌酚含量约为0.1wt％)。

                    表4注射液的各种配方

 配方  己烯雌酚    (mg)    乙醇    (ml)  植物油    (ml)    水    (ml)  终浓度  (wt％)  A    10    0.2    10    0    0.1％  B    100    0.5    9.5    0.5    1％  C    1    0.2    10    0    0.01％  D    10    0.5    0    9.5    0.1％  E    20    0    9.5    0.5    0.2％  F    10    10    0.1    0.5    0.1％

此外，用相同方法制得表4中配方B-F的各种注射液。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。