一种治疗冠心病心绞痛以及介入手术后再狭窄的药物

摘要

本发明公开了一种治疗冠心病心绞痛以及介入手术后再狭窄的药物，其目的是提供一种可有效治疗冠心病心绞痛以及介入手术后再狭窄的药物。本发明所提供的治疗冠心病心绞痛以及介入手术后再狭窄的药物，它的活性成分为下述重量份数比的组分：川芎提取物10－90，丹参提取物10－90。动物试验表明，本发明的药物对犬、Wistar大白鼠心肌缺血模型及Wistar大白鼠心肌缺血再灌注损伤模型，皆有明显的抗心肌缺血作用；可明显抑制猪冠状动脉球囊损伤后内膜增厚和病理性血管重塑、减少管腔丧失、抑制再狭窄形成。本发明的药物将在冠心病心绞痛以及介入手术后再狭窄的治疗中起到重要作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种中药组合物，特别是涉及一种治疗冠心病心绞痛以及介入手术后再狭窄的药物。

背景技术

目前，国内冠心病心绞痛的中药制剂除针剂外，大多数属三类药品的中药片剂和胶囊制剂，大多为中药粗提物，有效部位入药的较少，已知的用于治疗冠心病的二类药品只有有效成分为葛根总黄酮的中药制剂，二味以上中药有效部位组成的中药制剂至今尚未见报道。

对冠心病患者施行介入性治疗是一项较为成熟的医疗技术，它包括经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)和支架植入术等。目前国外及国内已有越来越多的冠心病患者接受了介入性治疗。但是冠心病介入治疗后再狭窄(RS)是世界心血管病防治研究领域的焦点、难点，目前国际上尚缺乏真正有效的治疗、预防药物，往往病人需再次施行PTCA或支架植入。

国内在应用中药预防再狭窄方面已有一些研究，如已在临床应用的血府逐瘀制剂，研究较多的还有川芎嗪、水蛭素、大黄素、雷公藤红素、四逆汤及补阳还五汤等。但这些研究多局限于再狭窄的某一个环节，如平滑肌细胞增殖、血管肉膜增厚等，并且这些研究多是在家兔或大鼠球囊损伤模型上进行。

川芎为伞型植物川芎(Liqusticum Cnuan Xioq Hort)的干燥根茎。中医认为川芎辛温无毒，为血中气药，具有活血理气、通阳止痛之效。其主要有效部位为川芎酚酸类成分，即阿魏酸、咖啡酸、原儿茶酸、毖丹酸等。丹参为唇形科植物丹参(SalnaMiltiorrhiza Bunge)干燥根茎，是常用的活性化瘀中药，其重要活性成分为丹参酮类和丹参酚酸类。其中，丹参酚酸类成分可减轻肝细胞变性，坏死及炎症反应，抑制纤维组织增生。

发明创造内容

本发明的目的是提供一种可有效治疗冠心病心绞痛以及介入手术后再狭窄的药物。

本发明所提供的治疗冠心病心绞痛以及介入手术后再狭窄的药物，它的活性成分为下述重量份数比的组分：川芎提取物10-90，丹参提取物10-90。

其中，川芎提取物和丹参提取物均可采用常规方法制备。

该药物的活性成分优选为下述重量份数比的组分为丹参提取物90，川芎提取物27。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体，所述载体可为微晶纤维，微晶纤维与活性成分的重量份数比可为10-14∶12-14，优选为12∶13。所述载体还可为药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等；必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。

本发明的药物可以制成注射液、口服剂，如片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液等多种形式，优选为胶囊。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明采用犬、Wistar大白鼠心肌缺血模型及Wistar大白鼠心肌缺血再灌注损伤模型，进行了系统的药效学研究。对结扎冠状动脉犬心肌缺血的试验研究表明：本发明的药物可明显减轻结扎冠状动脉犬心肌缺血程度、范围，缩小其心肌梗死面积，增加冠状动脉血流量和心输出量，降低肌酸磷酸肌酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)和谷草转氨酶(GOT)的血清活性；对尾静脉注射垂体后叶素引起的大白鼠心肌缺血的试验研究证明，本发明的药物可明显减轻Wistar大白鼠心电图II导ST-T缺血改变，抑制血小板粘附聚集，减少心肌细胞损伤及心肌细胞酶CK、LDH和GOT的漏出；抗大白鼠心肌缺血再灌注损伤的试验研究证明，本发明的药物可减少Wistar大白鼠缺血再灌注后心肌梗死面积，降低心电图标II导联ST-T升高程度，提高抗氧化能力，减少过氧化脂质生成和心肌酶CK、LDH及GOT的漏出。由此可知，本发明的药物对上述三种心肌缺血模型，皆显示有明显的抗心肌缺血作用。

同时，本发明采用国际上公认的球囊扩张损伤猪冠状动脉造成(RS)的动物模型，观察本发明的药物预防猪冠状动脉介入治疗后RS的药效。并从血小板活化、SMC的增殖以及病理性血管重塑等方面研究了其作用机制。研究表明，本发明的药物可明显抑制猪冠状动脉球囊损伤后内膜增厚和病理性血管重塑、减少管腔丧失、抑制再狭窄形成。其机理涉及抑制球囊损伤引起的SMC增殖和表型转变，抑制术后早期的血小板活化等方面。

本发明药物将在冠心病心绞痛以及介入手术后再狭窄的治疗中起到重要作用。

具体实施方式

实施例1、川芎提取物的制备

药材产地为四川灌县，药材经挑选后，净药材粉碎成粗粉(20目筛)备用。根据川芎酚酸类的理化性质，采用乙醇提取，醋酸乙酯萃取，碱水萃取提取再醋酸乙酯萃取分离手段，制备川芎提取物。川芎提取物的制备工艺为：取川芎粗粉3350g(过20目筛)，用80％乙醇回流提取二次，第一次10倍量，第二次6倍量，每次1.5小时，合并提取液，过滤，合并滤液，减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.08(60℃)，放冷，用醋酸乙酯萃取三次(2∶2∶1)，合并醋酸乙酯萃取液；用2％的氢氧化钠萃取三次(2∶2∶1)，合并氢氧化钠萃取液；加10％盐酸溶液调节pH值4-5，用醋酸乙酯萃取三次(2∶2∶1)，合并醋酸乙酯萃取液；合并醋酸乙酯洗脱液，减压回收醋酸乙酯，浓缩至相对密度为1.30-1.35(50℃)的稠浸膏，80℃真空干燥，制成川芎提取物25g。

实施例2、丹参提取物的制备

药材产地为河南洛阳，药材经挑选后，将净药材切成薄片制成丹参饮片。根据丹参酚酸类成分的性质，选用水提明胶除鞣质，醋酸乙酯萃取分离提取丹参提取物。丹参提取物的制备工艺为：取5000g丹参饮片，水煎煮二次，第一次加水10倍量，第二次加水6倍量，每次1.5小时，过滤，合并滤液，浓缩至每毫升含生药1.0克，加5％明胶沉淀鞣质，放置12小时，过滤，滤液浓缩至每毫升含生药1.5克，用稀盐酸调PH2-3，用等体积醋酸乙酯萃取三次，合并醋酸乙酯，减压回收醋酸乙酯，80℃真空干燥制成丹参提取物100g。

实施例3、芎丹胶囊的制备

取川芎提取物15g，丹参提取物115g，粉碎为60目细粉，然后与120g微晶纤维混匀过60目筛，喷入80％乙醇适量，制成1000粒颗粒，干燥装入胶囊即可。

实施例4、芎丹胶囊的制备

取川芎提取物30g，丹参提取物100g，粉碎为60目细粉，然后与120g微晶纤维混匀过60目筛，喷入80％乙醇适量，制成1000粒颗粒，干燥装入胶囊即可。

实施例5、芎丹胶囊的制备

取川芎提取物115g，丹参提取物15g，粉碎为60目细粉，然后与120g微晶纤维混匀过60目筛，喷入80％乙醇适量，制成1000粒颗粒，干燥装入胶囊即可。

实施例6、芎丹胶囊对犬急性心肌缺血的药效作用

试验材料：实施例4制备的芎丹胶囊药粉，临用前用生理盐水配制成相应浓度；消心痛，10mg/片，批号：9501003，北京双桥制药公司生产，临用前用生理盐水配制成相应浓度；健康成年杂种犬，25只，18-25公斤，雌雄不限，中国医科院心血管病研究所提供。合格证号：京动管犬字(96)第003号。随机分为空白对照组(开胸冠状动脉下穿线)、模型对照组(结扎冠状动脉)、阳性药消心痛对照组、芎丹胶囊小剂量组和芎丹胶囊大剂量组，每组犬5只。

动物模型制作和心外膜心电图标记检测：动物按2.5％硫贵妥钠(30-50mg/kg)静脉诱导麻醉，以安定(1mg/kg)静脉辅助并适当追加硫贲妥钠以维持实验犬的麻醉深度。背位固定，气管插管并连接呼吸机行人工呼吸，胸骨正中线开胸，暴露心脏，剪开心包，做心包吊床。结扎冠状动脉左前降支中下1/3段，建立犬急性心肌缺血模型。缝制多点固定式心外膜电极，连接RM-6000型多道生理记录仪，由心外膜心电图监测心肌缺血情况。

分组和剂量设置：空白对照组，生理盐水3ml/kg；模型组，生理盐水3ml/kg；阳性药对照组，消心痛0.8mg/kg；芎丹胶囊小剂量组，9.25mg/kg；芎丹胶囊大剂量组，27.25mg/kg。经十二指肠给药，于结扎冠状动脉前30min一次给药。

1、对急性心肌梗死犬心肌缺血程度的影响

芎丹胶囊对对急性心肌梗死犬心肌缺血程度的影响如表1所示：

表1.各组犬心肌缺血程度(∑-ST，mv，X±S)

组    别   30min                60min                    120min                    180min

空 白 组   5.48±1.37^**△△    2.48±1.04^**△△▲▲    1.48±0.39^**△△▲▲     0.96±0.33^**△△▲▲

模 型 组   8.71±1.52           11.46±4.13              14.86±4.94▲             17.34±5.73▲

消心痛组   8.83±1.34           9.90±3.14               11.54±4.49               12.98±3.45▲

芎丹小量组 9.36±1.40           8.52±1.48               7.76±2.78                7.48±3.04^*

芎丹大量组 8.72±2.05           4.50±2.02^*△▲◇◇     4.10±2.15^**△◇▲       3.84±1.49^**△△◇▲▲

注：和同时间模型相比*P＜0.05，**P＜0.01；和同时间消心痛组相比△P＜0.05；△△P＜0.01；和同时间芎丹小量组相比◇P＜0.05，◇◇P＜0.01；和自身30min相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

表1表明，空白对照组开胸冠状动脉下穿线后30min，心电图ST-T段亦有升高，但60min-180min时ST段较30min即明显下降(P＜0.01)。模型组冠状动脉结扎后，心肌缺血程度逐渐加重，至结扎后180min，心电图ST-T段由30min的8.71±1.52mv增加到17.34±5.73mv(P＜0.05)，芎丹大小剂量组结扎后180min升高的ST-T段和模型组比较，皆有明显下降(P＜0.01和P＜0.05)。芎丹大剂量组结扎冠状动脉后180min升高的ST-T段和消心痛组比较，皆有明显下降(P＜0.01)。其中芎丹大剂量组结扎后60min、120min、180min和模型组、消心痛组芎丹小剂量组比较，皆有明显差异(P＜0.05和P＜0.01)。

2、对急性心肌梗死犬心肌缺血范围的影响

芎丹胶囊对急性心肌梗死犬心肌缺血范围的影响如表2所示：

表2.各组犬心肌缺血范围(N-ST，导联数，X±S)

组  别   30min               60min                     120min                    180min

空白组   5.80±1.10^*△◇    3.00±1.58^**△△◇◇▲   1.80±0.45u△△▲▲◇◇   1.40±0.89^**△△◇▲▲

模型组   9.20±2.59          9.80±1.48                11.80±2.39               12.60±2.61

消心痛组 9.20±2.05          9.40±2.97                10.60±2.19               9.20±1.30^*

芎丹小组 8.40±1.52          8.00±1.64                7.50±2.83^*              5.50±2.45^**△▲

芎丹大组 7.20±1.48          3.50±0.84^**△▲▲◇◇   3.60±1.58^**△△▲◇     3.00±1.10^**△△◇▲▲

注：和同时间模型组相比*P＜0.05，**P＜0.01；和同时间消心痛组相比△P＜0.05，△△P＜0.01；和同时间芎丹小量组相比◇P＜0.05，◇◇P＜0.01；和自身30min相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

表2表明，空白对照组开胸冠状动脉下穿线后30min，心电图ST-T段升高的阳性导联数亦有增加，但60min-180min ST-T升高阳性数较30min明显减少(P＜0.01)。模型组冠状动脉结扎后，心肌缺血范围逐渐增大，至结扎后180min，心电图缺血损伤ST-T改变导联数由30min的9.20±2.59增加到12.60±2.61；芎丹剂量组结扎后60min、120min、180min和模型组、消心痛组比较，皆有明显减少(P＜0.05和P＜0.01)，芎丹大剂量组结扎后60min、120min和芎丹小剂量组比较，亦有明显减少(P＜0.01)。

3、对急性心肌梗死犬心肌梗死范围(N-BT染色法测定)的影响

心肌梗死范围测定：采用定量组织学硝基四氮唑蓝(N-BT)染色法。结扎后180min记录完毕，立即取下心脏，称量全心重，在冠状动脉结扎线以下，平行于冠状沟均匀地将心室部分冠状切成5片，置于N-BT染液中，37℃染色10min。图象分析测量每片心肌的梗死区(N-RT非染色区)与非梗死区(N-BT染色区)面积，计算出每片心肌梗死面积占整个心肌面积的百分比和梗死心肌占整个心肌的重量百分比。

以定量组织学N-BT染色法显示心肌梗死面积占心肌总面积的百分比和梗死心肌重量占整个心脏重量的百分比，结果如表3和表4所示：

表3.各组犬心肌梗死面积(定量组织学测定N-BT染色X±S)

组    别    动物数    梗死区/心肌总面积(％)

模型组      5         13.51±2.96

消心痛组    5         8.43±2.56^*

芎丹小组    5         6.15±1.72^**

芎丹大组    5         4.84±1.96^**

注：与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

表4.各组犬梗死心肌占整个心脏的重量比(X±S，％)

组    别    动物数       梗死心肌/整个心脏

模 型 组    5            3.60±1.01

消心痛组    5            2.08±0.61^*

芎丹小组    5            1.44±0.42^**

芎丹大组    5            1.12±0.26^**

注：和模型组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01

表3和表4表明，模型组梗死区占心肌面积的13.51±2.96％；芎丹胶囊大小两个剂量组及消心痛组有明显缩小心肌梗死范围的作用，梗死区占心肌面积的百分比分别为4.84±1.96％、6.15±1.72％和8.43±2.56％，与模型组比较均有显著性差异(P＜0.05和P＜0.01)。梗死心肌重量占整个心脏重量百分比，各用药组和模型组相比，亦有显著差异(P＜0.01和P＜0.05)。

4、对急性心肌梗死犬冠状动脉循环动静脉血氧饱和度差值及血氧容积(O₂CT)差值的影响

动物麻醉后，气管插管，连接人工呼吸机。胸骨正中线开胸暴露心脏，分离颈总动脉，插管至冠状动脉入口处，抽取动脉血，经右心耳插管至冠状静脉窦，抽取静脉血。分别于结扎前、结扎后60min、120min和180min，抽血进行血气分析，以动静脉血氧饱和度和血氧容积的差值估计心肌的耗氧情况。

芎丹胶囊对急性心肌梗死犬冠状动脉循环动静脉血氧饱和度差值及血氧容积(O₂CT)差值的影响分别如表5和表6所示：

表5、治疗前后犬动静脉血氧饱和度(SAT％)差值(X±S)的变化

组别        结扎前            60min            120min           180min

空白组      59.90±20.40      53.64±28.95     48.74±23.05     40.64±22.92

模型组      55.86±24.32      69.08±16.85     57.28±17.27     50.64±18.25

消心痛组    65.36±5.91       60.70±31.92     55.96±26.78     55.22±25.58

芎丹小组    51.96±15.55      50.10±15.85     45.02±20.34     44.30±17.03

芎丹大组    46.12±23.02      51.52±33.39     44.04±24.48     50.42±27.02

注：各用药组和同时间模型组及空白对照组相比，皆无明显差异。

表6.治疗前后犬动静脉血氧容积(O₂CT)差值(X±S)的变化

组别          结扎前          60min           120min          180min

空白组        13.32±4.53     11.78±6.25     10.88±5.06     9.36±5.03

模型组        12..88±5.06    15.78±3.37     13.34±3.44     11.56±3.63

消心痛组      14.60±1.01     13.40±6.61     12.54±5.74     12.34±5.32

芎丹小组      12.08±3.71     11.48±3.42     10.44±4.42     10.36±3.70

芎丹大组      10.80±4.77     10.70±6.18     11.10±6.27     10.96±5.93

注：各用药组和同时间模型组及空白对照组相比，皆无明显差异。

表5表明，结扎冠状动脉后60min、120min和180min，芎丹胶囊大小剂量组和消心痛组动静脉血氧饱和度差值和同时间模型组相比，没有明显差异；和空白对照组相比，亦无明显变化。表6表明，结扎冠状动脉后60min、120min和180min，芎丹胶囊大小剂量组和消心痛组动静脉血氧容积差值和同时间模型组相比，没有明显差异；和空白对照组相比，亦无明显变化。

5、对急性心肌梗死犬心肌酶的影响

心肌酶检测参照体外临床诊断试剂盒介绍方法，在意大利公司生产的FT-1半自动化生化分析仪上测定。体外临床诊断试剂盒，由北京中生生物工程高科技公司提供，批号为990603。

(1)对急性心肌梗死犬血清肌酸磷酸激酶(CK)活性的影响

芎丹胶囊对急性心肌梗死犬血清肌酸磷酸激酶(CK)活性的影响结果如表7所示：

表7.各组血清CK活性的比较(IU/L，X±S)

组  别      10min          60min                 120min            180min

空白组      448.80±105.07 434.80±80.72^**△△  440.20±77.05^*△ 434.60±119.68^**

模型组      418.80±58.29  1742.20±412.70▲▲   2022.40±830.90▲ 2179.40±642.12▲▲

消心痛组  454.80±107.55  1415.60±165.06▲▲  878.60±287.55^*▲ 737.44±306.16^**

芎丹小组  504.80±186.13  704.40±581.25^*     687.40±552.58^*   622.80±452.10^**

芎丹大组  530.00±175.13  614.20±385.92^**△  541.60±211.08^*   534.00±210.81^**▲

注：和同时间模型组相比^*P＜0.05，^**P＜0.01；和同时间消心痛组相比△△P＜0.01。

和自身30min相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

表7表明，结扎冠状动脉后，模型组CK活性随着时间延长，上升非常明显，结扎冠状动脉后60min、120min、180min，和结扎后10min相比，皆有显著差异(P＜0.01和P＜0.05)；而各用药组上升较慢，结扎后60min和同时间模型组比较，芎丹大小剂量组CK活性明显降低(P＜0.01)；结扎后120min和同时间模型组比较，芎丹大剂量组和消心痛组CK活性明显降低(P＜0.05)；结扎后180min和同时间模型组比较，芎丹大小剂量组和消心痛组CK活性皆明显降低(P＜0.01)；芎丹胶囊大剂量组在结扎冠状动脉后60min，和消心痛组相比，CK活性亦有显著降低(P＜0.05)。

(2)对急性心肌梗死犬血清乳酸脱氢酶(LDH)活性的影响

芎丹胶囊对急性心肌梗死犬血清乳酸脱氢酶(LDH)活性的影响结果如表8所示：

表8.各组血清LDH活性的比较(IU/L，X±S)

组别    10min           60min            120min            180min

空白组  196.00±128.61  210.60±130.90^* 259.20±193.39    337.40±210.71

模型组  293.00±96.90   382.20±69.88    540.80±256.90    596.20±248.77▲

消心痛组261.60±119.63  268.80±111.05   304.00±87.08     325.80±66.41

芎丹小组245.60±143.17  265.00±133.65   292.80±174.42    318.20±173.44

芎丹大组251.60±140.62  296.80±155.19   302.00±136.44    319.00±131.79

注：和同时间模型组相比，^*P＜0.05；和自身30min相比，▲P＜0.05。

表8表明，冠状动脉结扎后，LDH活性模型组随着时间延长，上升逐渐明显，结扎后180min和结扎后10min相比，有显著差异(P＜0.05)。而各用药组上升较慢，与同时间模型组比较，LDH活性皆无明显差异。

(3)对急性心肌梗死犬血清GOT活性的影响

芎丹胶囊对急性心肌梗死犬血清GOT活性的影响结果如表9所示：

表9.各组血清GOT活性的比较(IU/L，X±S)

组  别  10min          60min                12min                18min

空白组  63.80±27.80   122.60±47.61^**▲   127.80±49.06^**▲   140.40±54.19^**▲

模型组  89.80±32.72   237.80±35.71▲▲    281.20±26.40▲▲    288.80±37.57▲▲

消心痛组80.40±27.48   202.00±73.15▲▲    160.20±38.00^**▲▲ 163.00±57.52^**▲

芎丹小组77.80±26.88   135.60±41.42^**▲   137.40±48.64^**▲   145.80±49.71^**▲

芎丹大组65.80±16.53   127.40±30.27^**▲▲ 129.40±37.29^**▲▲ 135.20±12.99^**▲▲

注：和同时间模型组相比^**P＜0.01；和自身10min相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

表9表明，冠状动脉结扎后，GOT活性模型组随着时间延长，上升非常明显。和自身10min相比，结扎冠状动脉后60min、120min和180min皆有明显升高(P＜0.05和P＜0.01)；各用药组上升较缓慢，结扎冠状动脉后60min，芎丹胶囊大小剂量GOT活性和模型组相比，明显降低(P＜0.01)；结扎冠状动脉后120min，用药组活性与模型组相比，明显降低(P＜0.01)；结扎冠状动脉后120min、180min和同时间模型组比较，各用药组和模型组相比，GOT活性皆明显降低(P＜0.01)。

6、对急性心肌梗死犬血流动力学的影响

胸骨正中线开胸，充分暴露心脏，分离冠状动脉及主动脉根部，放置电磁流量计(MFV-1100，日本光电公司生产)探头，分别测冠状动脉血流量及心输出量，经股动脉插管(COOKTF猪尾导管，Australian)至左心室，测量左心室压。再经微分器处理计算左室内压上升最大速率(dp/dtmax)及下降最大速率(-dp/dtmax)。经另一侧股动脉插管，测量动脉血压。同时放置心电图肢体导联电极，描记心电图，测量心率。所有观测指标均记录于多导生理记录仪(RM-6000型，日本光电公司生产)。

(1)对急性心肌梗死犬收缩动脉血压的影响

芎丹胶囊对急性心肌梗死犬收缩动脉血压的影响结果如表10所示：

表10.各组急性心肌梗死犬收缩血压的变化(mmHg，X±S)

组  别    基础            30min              120min            180min

空白组    122.40±24.05   114.00±36.30      120.00±28.94△   102.00±19.24

模型组    127.20±20.80   107.40±14.29      91.00±27.41▲    80.40±23.79▲

消心痛组  116.00±15.67   82.40±15.58^*▲▲ 74.80±13.44▲▲  81.80±14.17▲▲

芎丹小组  117.00±8.37    93.00±33.28        86.00±35.60      85.00±25.00▲

芎丹大组  107.40±16.09   100.00±11.73       88.00±8.37▲     79.00±2.24▲

注：和同时间模型组相比^*P＜0.05，和自身基础值相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

表10表明，模型组在结扎冠状动脉后，收缩压由结扎前的127.20±20.80mmHg，逐渐下降，180min时降至80.40±23.79mmHg(P＜0.05)；各用药组，结扎冠状动脉后30min、120min和180min和自身基础值相比，亦有明显下降(P＜0.05和P＜0.01)。结扎冠状动脉30min，消心痛组和模型组相比，血压明显下降(P＜0.05)。

(2)对急性心肌梗死犬舒张动脉血压的影响

芎丹胶囊对急性心肌梗死犬舒张动脉血压的影响结果如表11所示：

表11.各组急性心肌梗死犬舒张血压的变化(mmHg，X±S)

组   别   基础          30min          120min           180min

空白组    86.60±23.41  81.00±2g.81   78.00±19.56△   72.00±14.83^*△

模型组    82.60±10.06  68.60±12.28   51.80±20.47▲   44.40±13.65▲▲

消心痛组  90.60±20.72  56.20±16.81▲ 46.60±12.93▲▲ 49.00±16.03▲▲

芎丹小组  88.00±8.37   66.00±26.79   60.00±26.22     52.00±19.24▲▲

芎丹大组  76.00±19.09  67.00±5.7     54.00±8.94▲    52.00±9.08▲  

注：和同时间模型组比较，^*P＜0.05，和同时间消心痛组相比△P＜0.05；△△P＜0.01；和自身基础值比较▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

表11表明，模型组在结扎冠状动脉后，舒张压由结扎前的82.60±10.06mmHg，逐渐下降，180min时降至44.40±13.65mmHg(P＜0.01)；各用药组，用药后舒张血压亦明显下降，结扎冠状动脉后30min、60in和180min和基础值相比，有明显差异(P＜0.05和P＜0.01)。结扎冠状动脉后各时间点各用药组和模型组相比，未表现出统计学差异。

(3)对急性心肌梗死犬心率(beats/min)的影响

芎丹胶囊对急性心肌梗死犬心率(beats/min)的影响结果如表12所示：

表12.各组急性心肌梗死犬心率(beats/min，X±S)

组  别    基础            30min          60min          180min

空白组    171.00±20.43   154.40±33.07  165.60±35.87  161.80±39.32

模型组    182.00±63.00   215.00±102.47 217.00±107.33 209.00±93.83

消心痛组  174.00±45.06   170.00±46.90  179.00±41.89  182.00±19.24

芎丹小组  152.00±32.13   144.00±30.70  148.60±32.55  149.00±24.60△

芎丹大组  155.00±24.24   165.00±25.00  169.00±25.10  158.00±18.23

注：和同时间消心痛组相比△P＜0.05；

表12表明，空白对照组于冠状动脉结扎后60、120和180min，心率有逐渐降低的趋势；模型组有逐渐增加趋势；芎丹胶囊大小剂量组，心率变化不太明显，而且还有下降趋向。结扎冠状动脉后180min，芎丹小剂量组和消心痛组比较，心率下降明显(P＜0.05)。

(4)对急性心肌梗死犬冠状动脉血流量(ml/min)的影响

芎丹胶囊对急性心肌梗死犬冠状动脉血流量的影响结果如表13所示：

表13.各组急性心肌梗死犬冠状动脉血流量(L/min，X±S)的变化

组  别  基础        30min          60min          120min          180min

空白组  0.46±0.07  0.43±0.16     0.40±0.38     0.38±0.07^*    0.39±0.08^**

模型组  0.44±0.08  0.39±0.09     0.31±0.05▲   0.28±0.05▲▲  0.22±0.03▲▲

消心痛组0.49±0.05  0.35±0.07▲▲ 0.33±0.06▲▲ 0.32±0.06▲▲  0.33±0.05^**▲▲

芎丹小组0.39±0.12  0.32±0.10     0.34±0.07     0.35±0.06      0.33±0.06^**

芎丹大组0.51±0.19  0.55±0.28     0.42±0.05^**△0.37±0.12      0.38±0.07^**

注：和同时间模型组相比^*P＜0.05，^**P＜0.01；和同时间消心痛组相比△P＜0.05；△△P＜0.01；和自身基础值相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

表13表明，模型组结扎冠状动脉后60min、120min和180min，冠状动脉的血流量逐渐下降，和自身基础值相比皆有显著差异(P＜0.05和P＜0.01)；各用药组下降程度不如模型组严重。消心痛组结扎冠状动脉后30min、60min、120min和180min，和自身基础值相比皆120min(P＜0.01)。180min时，消心痛组、芎丹胶囊大小剂量组冠状动脉血流量下降较模型组明显减轻，和模型组相比，冠状动脉血流量皆有明显升高(P＜0.01)；120min时，芎丹胶囊大剂量组冠状动脉血流量下降明显减轻，和模型组相比，有显著差异(P＜0.01)，和消心痛组相比，亦有显著差异(P＜0.05。

(5)对急性心肌梗死犬心输出量(ml/min)的影响

芎丹胶囊对急性心肌梗死犬心输出量的影响结果如表14所示：

表14.各组急性心肌梗死犬心输出量(L/min，X±S)的变化

组别    基础30min   60min         120min             180min

空白组  1.98±0.43  1.78±0.55    1.77±0.46^*△     1.57±0.46^*       1.52±0.44^*

模型组  1.68±0.39  1.41±0.38    1.14±0.21▲       1.00±0.17▲▲      0.78±0.13▲▲

消心痛组1.76±0.17  1.30±0.23▲▲1.20±0.19▲▲     1.16±0.18▲▲      1.20±0.15^**▲▲

芎丹小组1.92±0.43  1.72±0.37    1.69±0.34^*       1.65±0.44^*       1.54±0.45^*

芎丹大组2.11±0.28  1.86±0.39△  1.79±0.12^**△△▲1.68±0.20^**△△▲ 1.56±0.14^**△▲▲

注：和同时间模型组相比^*P＜0.05，^**P＜0.01；和同时间消心痛组相比△P＜0.05；△△P＜0.01；和自身基础值相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

表14表明，结扎冠状动脉后60min、120min和180min，与基础值比较，模型组、消心痛组、芎丹胶囊大剂量组皆有明显下降(P＜0.05和P＜0.01)；但180min时，消心痛组、芎丹胶囊大小剂量组心输出量下降较模型组明显减轻(P＜0.01和P＜0.05)；结扎冠状动脉后60min、120min，芎丹胶囊大小剂量组与模型组、消心痛组比较皆有明显减轻(P＜0.01和P＜0.05)。

(6)对急性心肌梗死犬左室收缩压峰值的影响

芎丹胶囊对急性心肌梗死犬左室收缩压峰值的影响结果如表15所示：

表15.各组急性心肌梗死犬左室收缩压峰值(mmHg，X±S)的变化

组  别  基础          30min           60min               120min            180min

空白组  128.00±26.60 118.00±42.07   125.00±24.75^*△   118.00±16.05^**△108.00±9.08^**△△

模型组  113.00±7.58  104.00±10.25   83.60±15.73▲▲    70.00±9.35▲▲    59.20±7.12▲▲

消心痛组114.80±9.12  92.00±18.23▲  85.00±18.37▲      83.00±17.89▲▲   78.00±12.55^*▲▲

芎丹小组110.00±22.36 98.00±33.65    128.00±18.23^**△△99.00±40.37       84.00±27.70

芎丹大组103.00±9.75  107.00±4.47    107.00±4.47^*      94.00±6.52^**     89.00±5.48^**▲

注：和同时间模型组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01；和同时间消心痛组相比△P＜0.05；△△P＜0.01；和自身基础值相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

表15表明，模型组冠状动脉结扎后60min、120min和180min与基础值比较，左室收缩压峰值皆明显下降(P＜0.01)；芎丹胶囊大小剂量组和消心痛组的左室收缩压峰值于冠状动脉结扎后亦有明显下降，但下降幅度不如模型组明显。结扎冠状动脉后60min、120min、180min，芎丹胶囊大剂量组和同时间模型组相比，左室收缩压峰值明显升高(P＜0.05和P＜0.01)；结扎冠状动脉后60min，芎丹胶囊小剂量组和模型组、消心痛组相比，有显著差异(P＜0.01)。

(7)对急性心肌梗死犬左室内压上升最大速率的影响

芎丹胶囊对急性心肌梗死犬左室内压上升最大速率的影响结果如表16所示：

表16.各组犬左室内压上升最大速率(dp/dtmax，mmHg/s，X±S)的变化

组  别    基础       30min        60min        120min         180min

空白组    2870±233  2600±474    2880±363^** 2950±783^*    2610±371^**

模型组    3120±719  2780±618    2100±265▲  1820±179▲    1580±228▲▲

消心痛组  3320±626  2732±658    2668±498    2468±498^*▲  2240±716▲

芎丹小组  2740±451  2610±926    2780±1188   2360±329^*    2570±460^**

芎丹大组  2820±449  2720±567    3020±832^*  2960±770^*    2500±752

注：和同时间模型组相比^*P＜0.05，^**P＜0.01；和自身基础值相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

表16表明，模型组结扎冠状动脉后，左室内压上升最大速率降低逐渐加重，60min、120min和180min时与基础值相比，皆明显降低(P＜0.05和P＜0.01)；各给药组冠状动脉结扎后下降不如模型组严重，结扎冠状动脉后120min，各用药组左室内压上升最大速率较模型组皆明显升高(P＜0.05)；结扎冠状动脉后180min，芎丹小剂量组和模型组相比，左室内压上升最大速率亦有明显升高(P＜0.01)；结扎冠状动脉后60min，芎丹大剂量组和模型组相比，左室内压上升最大速率亦有明显升高(P＜0.05)。

(8)对急性心肌梗死犬左室内压下降最大速率的影响

芎丹胶囊对急性心肌梗死犬左室内压下降最大速率的影响结果如表17所示：

表17.各组犬左室内压下降最大速率(-dp/dtmax，mmHg/s，X±S)的变化

组  别    基础       30min       60min          120min          180min

模型组    3340±871  2500±656   1740±385▲▲  1420±148▲▲   1060±167▲▲

消心痛组  3140±498  2340±555▲ 1920±228▲▲  1760±261*▲▲  1660±564▲▲

芎丹小组  2840±280  2460±493   2010±613▲    1620±650▲▲   1460±416▲▲

芎丹大组  2980±327  2560±297   2340±288^*△▲1750±1 87*▲▲ 1620±179^**▲▲

注：和同时间模型相比^*P＜0.05，^**P＜0.01；和同时间消心痛组相比△P＜0.05；△△P＜0.01；和自身基础值相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

表17表明，模型组结扎冠状动脉后，左室内压下降最大速率逐渐下降，且随时间延长逐渐加重(60min、120min和180min与基础值相比，P值皆小于＜0.01)；消心痛组和芎丹胶囊大小剂量组，结扎冠状动脉后左室内压下降最大速率亦较自身基础值逐渐降低(P＜0.05和P＜0.01)，但下降不如模型组严重。结扎冠状动脉后60min、120min、180min，芎丹胶囊大剂量组左室内压下降最大速率较模型组明显升高(P＜0.05和P＜0.01)。

本实施例表明芎丹胶囊可明显减轻结扎冠状动脉犬的心肌缺血程度、范围；可明显缩小结扎冠状动脉犬的心肌梗死范围；可扩张冠状动脉、增加冠状动脉血流量；降低肌酸磷酸肌酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)和谷草转氨酶(GOT)的血清活性；芎丹胶囊有一定的保护心肌收缩和舒张功能的作用。

实施例7、芎丹胶囊对垂体后叶素注射引起Wistar大鼠心肌缺血的药效作用

试验材料：实施例4制备的芎丹胶囊药粉，临用前用生理盐水配制成相应浓度；消心痛，10mg/片，批号：9501003，北京双桥制药公司生产，临用前用生理盐水配制成相应浓度；血府逐瘀胶囊，0.46g/粒，每日两次，每次6粒。批号：津药卫字：ZZ-2914(1992)0748号，天津第五中药厂生产，临用前用生理盐水配制成相应浓度；Wistar大鼠，70只，200-250克，雌雄各半，北京医科大学实验动物中心提供。合格号：北京市实验动物管理委员会，医动字第01-1073号。随机分为空白对照组(尾静脉注射生理盐水)、模型组(尾静脉注射垂体后叶素)、阳性药消心痛对照组、中药血府逐瘀胶囊对照组和芎丹胶囊大、中、小剂量组，每组鼠10只。

分组和剂量设置：空白对照组，生理盐水9ml/kg；模型组，生理盐水9ml/kg；西药对照组，消心痛2.7mg/kg；中药血府逐瘀胶囊对照组0.52g/kg；芎丹胶囊小剂量组，30.8mg/kg；芎丹胶囊中剂量组，61.6mg/kg；芎丹胶囊大剂量组，123.2mg/kg。插管灌胃给药，造模前连续给药3天，每天1次，最后给药后30min进行实验。

1、对心肌缺血大白鼠心电图的影响

大白鼠心肌缺血模型和心电图描记：3％戊巴比妥钠，20ml/kg腹腔注射麻醉，背部固定，连接6511型心电图机，描记基础II导联心电图。而后尾静脉注射垂体后叶素1.5^u/kg，在注射后即刻、1min、2min、5min、10min、15min、30min 45min和60分种标记II导心电图，以观察心电图ST-T的改变。以ST-T上升1mv者定为缺血阳性改变。

芎丹胶囊对心肌缺血大白鼠心电图的影响如表18和表19所示：

表18、芎丹胶囊对大鼠心肌缺血损伤程度的影响(mv，X±S)

组  别                       Δ∑ST

空白组

模型组                       9.03±2.16

消心痛组                     8.86±3.41

血府组                       6.59±1.80^*

芎丹小组                     7.93±2.07

芎丹中组                     5.85±2.03^**

芎丹大组                     5.11±1.50^**△

注：与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与消心痛组比较，△P＜0.05。

表19.各组心电图缺血阳性改变次数的比较(60min，X±S)

组  别                         阳性个数

空白组

模型组                       5.7±1.42

消心痛组                     5.0±2.71

血府组                       3.6±1.07^**△△

芎丹小组                     3.1±0.85^**

芎丹中组                     2.4±2.51^*

芎丹大组                     1.7±1.25^**△△##

注：与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与消心痛组比较，△△P＜0.01。

和血府组相比，##P＜0.01。

表18和表19表明造模组注射垂体后叶素后，在观察60min内，II导心电图ST-T升高非常明显；空白组大白鼠II导心电图在标记过程中变化不明显；芎丹胶囊大、中剂量组和血府逐瘀胶囊组(简称血府组)与模型组相比，II导心电图ST-T升高幅度明显下降(P＜0.05和P＜0.01)，其中以芎丹大剂量组效果最佳。芎丹胶囊大剂量组ST-T升高值，亦较消心痛组明显降低(P＜0.05)。II导心电图ST-T升高的阳性个数，芎丹胶囊大、中、小剂量组及血府组与模型组相比，皆明显降低(P＜0.05和P＜0.01)；芎丹胶囊大II导心电图ST-T升高的阳性个数和消心痛组及血府组相比，亦明显降低(P＜0.01)。

2、对心肌缺血大鼠血小板膜糖蛋白GMP-140的影响

血浆血小板颗粒膜糖蛋白(GMP-140)的测定：术后第三天收集血液标本，加入含2％EDTA-Na₂抗凝剂的试管，4℃，3,000×g离心10min。将血浆移至另一干净试管，-20℃贮存。按试剂盒说明书在自动免疫γ计数仪上进行放免分析。

芎丹胶囊对心肌缺血大鼠血小板膜糖蛋白GMP-140的影响结果如表20所示：

表20、芎丹胶囊对心肌缺血大鼠血小板膜糖蛋白(X±S)的影响

                 GMP-140                    GMP-140

组  别           (分子数/每个血小板)        (血浆mg/L)

空白组           797.68±148.91^**△△##    66.20±11.70^**##

模型组           1181.15±180.46            88.80±10.35

消心痛组         995.54±128.17^*           72.43±11.16^**

血府组    1038.02±132.73        84.13±14.21

芎丹小组  1044.24±180.01        78.07±17.81△

芎丹中组  854.36±152.98         55.36±11.06^**##

芎丹大组  719.58±167.60^**△#   57.07±12.20^**##

注：与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；和血府组相比，#P＜0.05.

与消心痛组比较，△△P＜0.01，△P＜0.05

表20表明，注射垂体后叶素后60min，模型组大鼠血小板膜糖蛋白GMP-140血浆浓度和GMP-140的分子数皆较空白组明显升高(P＜0.01)；芎丹胶囊大剂量组大鼠血小板膜糖蛋白GMP-140分子数和大中剂量组大鼠GMP-140血浆浓度皆较模型组明显降低(P＜0.01)；消心痛组大鼠血小板膜糖蛋白GMP-140血浆浓度和GMP-140分子数亦较模型组明显降低(P＜0.01和P＜0.05)；芎丹胶囊大中剂量组大鼠血小板膜糖蛋白GMP-140血浆浓度较血府组亦有明显降低(P＜0.01)；芎丹胶囊大剂量组大鼠血小板膜糖蛋白GMP-140的分子数较血府组、模型组相比有明显降低(P＜0.05)；芎丹胶囊小剂量组大鼠血小板膜糖蛋白GMP-140的血浆浓度较消心痛组相比有明显降低(P＜0.05)。

3、对心肌缺血大白鼠血液粘度的影响

按照常规方法测定了芎丹胶囊对心肌缺血大白鼠血液粘度的影响，结果如表21所示：

表21、芎丹胶囊对心肌缺血大鼠血液粘度(X±S)的影响

                     血液粘度(mpa·s)

组  别    5s^-1            10s^-1           35s^-1         120s^-1

空白组    16.89±4.58^**#  13.31±1.55^*    7.55±1.77^*   5.52±1.21

模型组    23.03±4.62      16.74±4.06      9.70±2.11     6.39±1.15

消心痛组  21.15±7.19      14.85±4.63      8.76±2.02     5.98±1.04

血府组    21.85±3.62      15.85±3.39      7.95±1.75     6.21±0.82

芎丹小组  24.86±5.16      18.57±5.27      10.54±3.30#   6.41±1.75

芎丹中组  16.88±3.80^**## 11.72±2.42^**## 7.04±1.45^**△5.04±0.96^*##

芎丹大组  19.01±2.59^*    12.60±3.95#     6.43±2.50#    5.53±1.59#

注：与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；和血府组相比，#P＜0.05.

表21表明，注射垂体后叶素后60min，模型组腹主动脉血液5秒、10秒和35秒的粘度皆较空白组明显升高(P＜0.05和P＜0.01)；芎丹颗粒胶囊中剂量组5秒、10秒和35秒的血液粘度则较模型组显著降低(P＜0.05和P＜0.01)，和血府组5秒、10秒、120秒的血液粘度相比，亦有明显降低(P＜0.01)，和消心痛组35秒的血液粘度相比，亦有明显降低(P＜0.05)；芎丹颗粒胶囊大剂量组5秒的血液粘度则较模型组显著降低(P＜0.05)，芎丹颗粒胶囊大剂量组10秒、35秒的血液粘度则较血府组显著降低(P＜0.05)；芎丹胶囊小剂量组35秒的血液粘度较血府组显著升高(P＜0.05)。

4、对心肌缺血大白鼠红细胞聚集指数和红细胞变形能力的影响

按照常规方法测定了芎丹胶囊对心肌缺血大白鼠红细胞聚集指数和红细胞变形能力的影响，结果如表22所示：

表22、芎丹胶囊对红细胞聚集指数、变形指数(X±S)的影响

组  别    红细胞聚集指数       红细胞变形指数

空白组    13.90±2.04^**△△## 31.10±4.00^**△△#

模型组    28.78±6.91          24.75±4.23

消心痛组  22.13±6.02^*        25.18±2.97

血府组    21.90±3.58^*        27.24±4.06

芎丹小组  33.71±4.54△△##    28.84±1.81

芎丹中组  33.24±2.75△△##    32.87±1.94^**#△△

芎丹大组  25.38±3.60^**       35.46±4.29^**△△##

注：与模型组比较，^*P＜0.05，**P＜0.01；与消心痛组比较，△△P＜0.01；与血府组相比，#P＜0.05.

表22表明，模型组大鼠红在注射垂体后叶素后60min，较空白组大鼠红细胞聚集指数明显升高(P＜0.01)，红细胞变形指数明显降低(P＜0.01)；芎丹胶囊大剂量组、消心痛组和血府组大鼠红细胞聚集指数较模型组明显降低(P＜0.05和P＜0.01)；红细胞变形指数芎丹胶囊大、中剂量组较模型组和消心痛组明显升高(P＜0.01)；芎丹大剂量组红细胞变形指数与血府组相比，亦有明显升高(P＜0.01)；芎丹胶囊中小剂量组红细胞聚集指数较消心痛组和血府组相比，亦有明显升高(P＜0.01)。

5、对心肌缺血大白鼠心肌酶的影响

心肌酶检测参照体外临床诊断试剂盒介绍方法，在意大利公司生产的FT-1半自动化生化分析仪上测定。体外临床诊断试剂盒，由北京中生生物工程高科技公司提供，批号为990603。

芎丹胶囊对心肌缺血大白鼠心肌酶的影响结果如表23所示：

表23、芎丹胶囊对心肌缺血大鼠血清心肌酶的影响(X±S)

组  别    CK(IU/L)              LDH(IU/L)            GOT(IU/L)

空白组    802.3±220.98^**△△# 761.1±126.29^**△△ 136.6±18.45^*△

模型组    1602.1±247.66        1239.7±262.80       169.7±32.29

消心痛组  1183.5±251.92^**     1136.2±240.28       166.5±27.79

血 府 组  1154.6±368.94^**     828.7±203.52^**△△ 144.2±26.22

芎丹小组  1215.9±328.34^**     956.10±261.50^*     160.5±42.00

芎丹中组  1095.5±219.05^**     869.8±150.98^**△△ 147.1±32.29

芎丹大组  911.0±233.79^**△    799.0±196.72^**△△ 140.3±37.42

注：与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；和血府组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与消心痛组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

表23表明，造模组大白鼠心肌细胞CK、LDH和GOT的血清活性，较空白组皆明显升高(P＜0.05和P＜0.01)；芎丹胶囊大中小剂量组、消心痛组、血府组与造模组相比，CK活性皆明显降低(P＜0.01)；芎丹大剂量组CK血清活性和消心痛组相比，也有明显降低(P＜0.05)。LDH活性芎丹大中小剂量组和血府组与模型组相比，皆有明显降低(P＜0.05和P＜0.01)；芎丹大中小剂量组和血府组与消心痛组相比，LDH活性明显降低(P＜0.05和P＜0.01)；GOT活性，各用药组较模型组相比，皆有降低，但无统计学意义。

6、对大白鼠血小板功能的影响

血小板表面活性和聚集性采用改良Schatz法，在日本SONY显微电视录象系统下，观察聚集率(％)。

芎丹胶囊对大白鼠血小板功能的影响结果如表24所示：

表24.芎丹胶囊对大白鼠血小板聚集率的影响(X±S)

组  别  PAG(2s)                 PAG(5s)                MPAG

空白组  62.37±6.30             54.53±10.60           56.74±11.09^**#

模型组  71.63±12.29            60.43±11.93           76.55±10.09

消心痛组56.99±5.31^**          47.68±2.85^**         57.07±8.82^**

血府组  68.60±9.47△△         56.94±7.45△△        68.15±9.64△

芎丹小组40.20±18.50^**△△##   40.69±16.57^*#        50.20±15.22^**##

芎丹中组30.59±28.00^**△##     38.19±26.13^*         45.42±26.94^**#

芎丹大组27.56±11.04^**△△##   30.40±14.87^**△△##  33.50±13.90^**△△##

注：与造模组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；和消心痛组相比，△P＜0.05；

与血府组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

表24表明，注射垂体后叶素后60min，空白组最大血小板聚集率较造模组大白鼠明显降低(P＜0.01)。2s血小板聚集率，芎丹大中小剂量组和消心痛组皆较模型组明显降低(P＜0.01)；芎丹大中小剂量组、血府组和消心痛组相比，亦有显著降低(P＜0.01)。芎丹大中小剂量组和血府组相比，亦有显著降低(P＜0.01)。5s最大血小板聚集率，芎丹大中小剂量组、消心痛组较模型组明显降低(P＜0.01和P＜0.05)；芎丹大剂量组、血府组和消心痛组相比，亦有显著降低(P＜0.01)；芎丹大小剂量组和血府组相比，亦有显著降低(P＜0.05和P＜0.01)。最大血小板聚集率，芎丹大、中、小剂量组和消心痛组皆较模型组明显降低(P＜0.01)，芎丹大中小剂量组的血小板最大聚集率还明显低于血府组(P＜0.05和P＜0.01)，芎丹大剂量组和血府组的血小板最大聚集率和消心痛组相比，亦有显著降低(P＜0.05和P＜0.01)。

本实施例表明芎丹胶囊可明显降低大鼠尾静脉注射垂体后叶素引起的II导心电图ST-T缺血改变；可明显降低心肌缺血大鼠血小板膜糖蛋白GMP-140的血浆浓度和分子个数，抗血小板粘附聚集；可明显降低心肌缺血大鼠血液粘度的影响；可明显降低大鼠红细胞聚集指数，提高其变形能力；可减少缺血大鼠心肌细胞酶的漏出。

实施例8、芎丹胶囊对Wistar大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

试验材料：实施例4制备的芎丹胶囊药粉，临用前用生理盐水配制成相应浓度；消心痛，10mg/片，批号：9501003，北京双桥制药公司生产，临用前用生理盐水配制成相应浓度；血府逐瘀胶囊，0.46g/粒，每日两次，每次6粒。批号：津药卫字：ZZ-2914(1992)0748号，天津第五中药厂生产，临用前用生理盐水配制成相应浓度；Wistar大鼠，70只，200-250克，雌雄各半，北京医科大学实验动物中心提供。合格号：北京市实验动物管理委员会，医动字第01-1073号。随机分为空白对照组(开胸，冠状动脉下穿线，不结扎，灌胃给等体积的生理盐水)、模型组(结扎冠状动脉，灌胃给等体积的生理盐水)、阳性药消心痛对照组、中药血府逐瘀胶囊对照组和芎丹胶囊大中小剂量组，共7组，每组鼠10只。

大白鼠心肌缺血再灌注损伤模型的建立：20％乌拉坦0.5ml/100g体重腹腔注射麻醉，背位固定，气管插管进行人工呼吸(潮气量2ml/100g体重，50次/min)。胸部去毛、消毒，在胸骨左侧开一平行于胸骨约2cm的纵向切口，切开皮肤，钝性分离第4，5肋间的肌层，打开胸腔，剪开心包，轻轻挤压大鼠胸腔右侧壁，将心脏挤出。于肺动脉圆锥与左心耳之间，以冠状静脉主干为标志，在左心耳根部下方2-3mm处结扎左冠状动脉。空白组只穿线不结扎(假手术)。结扎冠状动脉60min后，剪开结扎线，给缺血心肌再灌注60min。整个实验过程中，分别于结扎冠状动脉前(穿线不结扎时)、10min、20min、30min、40min、60min及剪开结扎线再灌注60min的标记II导心电图。而后腹主动脉取血，制备血清，测定肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶LDH、谷草转氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮合成酶(NOS)和总抗氧化能力。取出心脏，除去心房，冠状切成将心肌组织分成5片，生理盐水洗净，置入pH7.4的0.25％NBT磷酸缓冲液中37℃染色10min。以落点求积方法计算梗死心肌与正常心肌的百分比。

分组和剂量设置：空白对照组，生理盐水9ml/kg；模型组，生理盐水9ml/kg；西药对照组，消心痛2.7mg/kg；中药血府逐瘀胶囊对照组0.52g/kg；芎丹胶囊小剂量组，30.8mg/kg；芎丹胶囊中剂量组，61.6mg/kg；芎丹胶囊大剂量组，123.2mg/kg。插管灌胃给药，造模前连续给药3天，每天1次，最后给药后30min进行实验。试验观察时间为结扎冠状动脉后60min和再灌注60min。

1、对结扎和松解冠状动脉心肌缺血大白鼠II导心电图ST-T的影响

连接6511型心电图机，描记结扎冠状动脉前(只穿线不结扎)、10min、20min、30min、40min、60min及剪开结扎线再灌注60min的II导心电图，以观察心电图ST-T的改变。以ST-T上升1mv者定为缺血阳性改变。

芎丹胶囊对结扎和松解冠状动脉心肌缺血大白鼠II导心电图ST-T的影响结果如表25和表26所示：

表25.各组大鼠心肌缺血心电图ST-T(mv，X±S)

组    别            Δ∑ST

空白组                   0.02±0.02^**

模型组                   7.47±1.86

消心痛组                 2.77±1.30^**

血府组                   1.70±0.99^**

芎丹小组                 1.58±1.45^**

芎丹中组                 1.50±0.98^**△

芎丹大组                 1.39±0.72^**△

注：与模型组比较，^**P＜0.01；与消心痛组比较，△P＜0.05。

表26.  各组心电图缺血阳性改变次数的比较(X±S)

组  别                   阳性个数

模型组                   5.80±0.42

消心痛组                 3.20±1.75^**

血府组                   2.20±1.62^**

芎丹小组                 2.20±2.07^**

芎丹中组                 2.00±1.72^**

芎丹大组                 1.60±1.75^**

注：与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

表25和表26表明，造模组在结扎冠状动脉60min及再灌注60min，II导心电图ST-T升高值和空白对照组相比，明显增加(P＜0.01)；空白组大白鼠在II导心电图标记过程中变化不明显；消心痛组、血府逐瘀胶囊组(简称血府组)、芎丹胶囊大、中、小剂量组和模型组相比，II导心电图ST-T升高幅度明显下降(P＜0.01)；芎丹大中剂量组和血府组与消心痛组比较，II导心电图ST-T升高幅度亦有明显下降(P＜0.05)；II导心电图ST-T的阳性改变数，各用药组皆较模型组明显降低(P＜0.01)。

2、对松解结扎的冠状动脉后大白鼠II导心电图ST-T的影响

实验方法同步骤1。芎丹胶囊对松解结扎的冠状动脉后大白鼠II导心电图ST-T的影响结果如表27所示：

表27.各组大鼠缺血心肌再灌注60min心电图ST-T变化((mv，X±S)

组  别                   Δ∑ST

模型组                   1.19±0.3

消心痛组                 0.38±0.02^**

血府组                   0.24±0.02^**△△

芎丹小组                 0.24±0.01^**△△

芎丹中组                 0.17±0.02^**△△##

芎丹大组                 0.14±0.01^**△△##

注：与模型组比较，^**P＜0.01；与消心痛组比较，△△P＜0.01。

与血府组比较，##P＜0.01。

表27表明，造模组在松解结扎的冠状动脉后再灌注60min，II导心电图ST-T的升高值和空白对照组相比，增加明显(P＜0.01)；消心痛组、血府组、芎丹胶囊大、中、小剂量组和模型组相比，II导心电图ST-T升高幅度明显下降(P＜0.01)；各中药组与消心痛组比较，II导心电图ST-T升高幅度亦有明显下降(P＜0.01)；芎丹大中剂量组和血府组相比，II导心电图ST-T升高幅度亦有明显下降(P＜0.01)。

3、对心肌缺血再灌注后大鼠心肌酶的影响

心肌酶检测参照体外临床诊断试剂盒介绍方法，在意大利公司生产的FT-1半自动化生化分析仪上测定。体外临床诊断试剂盒，由北京中生生物工程高科技公司提供，批号为990603。

芎丹胶囊对心肌缺血再灌注后大鼠心肌酶的影响如表28所示：

表28、各组大鼠心肌缺血再灌注后血清心肌酶的含量比较(X±S)

组    别   CK(IU/L)                LDH(IU/L)             GOT(IU/L)

空白组     2011.0±309.1^**△△##  1909.5±488.2^**△△  209.1±56.1^**△△##

模型组     5479.2±1430.0          3616.8±801.0         481.7±120.3

消心痛组   4674.0±2068.9          2601.6±530.4^**      442.1±48.97

血府组     4437.6±325.7^*         2136.3±635.7^**      430.7±112.2

芎丹小组   4589.2±357.3           2236.6±428.1^**      394.5±23.8^*△

芎丹中组   4114.5±1022.1^*        2005.2±850.2^**      306.8±47.59^**△△##

芎丹大组   2522.9±180.1^**△△##  1684.5±520.4^**△△  322.2±43.54^**△△#

注：与模型组比较，^**P＜0.01，^*P＜0.05；与消心痛组比较，△△P＜0.01.

表28表明，造模组大白鼠心肌CK、LDH、GOT活性，心肌缺血再灌注后60min，较空白组明显升高(P＜0.01)。除消心痛组和芎丹小剂量组外，各用药组和造模组相比，CK活性明显降低(P＜0.05和P＜0.01)。芎丹胶囊大剂量组和消心痛组相比，CK活性明显低(P＜0.01)。芎丹大剂量组和血府组相比，CK活性亦显著降低(P＜0.01)；各用药组和造模组相比，LDH活性明显降低(P＜0.01)。芎丹大剂量组和消心痛组相比，亦明显下降(P＜0.05)；芎丹胶囊大中小剂量组和造模组及消心痛组相比，GOT活性皆明显降低(P＜0.05和P＜0.01)。芎丹大中剂量组和血府组相比，亦有明显下降(P＜0.05和P＜0.01)。

4、对大鼠心肌缺血再灌注后抗氧化能力的影响

超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮合成酶(NOS)和总抗氧化能力的测定，利用光电比色原理，采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒(批号为990405)，按说明书在CL-720型微流量分光光度计上进行检测。

芎丹胶囊对大鼠心肌缺血再灌注后抗氧化能力的影响结果如表29所示：

表29.各组大鼠心肌缺血再灌注后总抗氧力、SOD、MDA的含量(X±S)比较

组    别    SOD(nu/ml)        MDA(nmol/ml)   总抗氧力(u/ml)

空白组      268.15±38.42^**  5.72±0.52^**  13.90±2.78^**

模型组      116.82±51.97     7.37±0.87     6.86±1.46

消心痛组    314.14±81.13^**# 6.13±1.49^*   17.90±5.68^**#

血府组      234.21±60.79^**  5.91±1.04^**  12.73±2.87^**

芎丹小组    276.33±37.11^**  7.22±0.81     15.62±7.95^**

芎丹中组    265.57±36.52^**  6.37±1.14^*   17.33±6.16^**

芎丹大组    210.16±45.75^**  5.30±0.99^**  20.87±5.91^**##

注：与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；△△P＜0.01；

和血府组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

表29表明，造模组大白鼠心肌MDA含量较空白组明显升高(P＜0.01)；SOD活性和总抗氧化能力明显降低(P＜0.01)；各用药组和造模组相比，SOD活性明显升高(P＜0.01)。消心痛组和血府组相比，SOD活性明显升高(P＜0.05)。消心痛组、血府组、芎丹胶囊大中剂量组和造模组相比，MDA含量明显降低(P＜0.05和P＜0.01)；各用药组和造模组相比，总抗氧力活性皆明显升高(P＜0.01)。和血府组相比，芎丹大剂量组和消心痛组的总抗氧化能力亦有明显升高(P＜0.05和P＜0.01)。

5、对各组大鼠心肌缺血再灌注后心肌梗死范围(N-BT染色法测定)的影响

以定量组织学N-BT染色法显示心肌梗死范围，芎丹胶囊对各组大鼠心肌缺血再灌注后心肌梗死范围(N-BT染色法测定)的影响结果如表30所示：

表30.各组大鼠心肌梗死面积(定量组织学测定N-BT染色)

组    别      动物数    梗死区/心肌总面积(％)

模 型 组      10        17.51±0.91

消心痛组      10        7.81±5.09^**

血管通组      10        7.55±4.31^**

芎丹小剂量组  10        6.85±1.73^**

芎丹中剂量组  10        5.72±2.15^**

芎丹大剂量组  10        2.35±1.49^**△△##

注：与模型组比较，^**P＜0.01；和血府组比较，##P＜0.01；和消心痛组比较，△△P＜0.01。

表30表明，模型组梗死区占心肌面积的17.51±0.91％。芎丹胶囊大中小剂量组、血府组和消心痛组皆有显著缩小心肌梗死范围的作用，梗死区占心肌面积的百分比分别为2.35±1.49％、5.72±2.15％、6.85±1.73％、7.55±4.31％和7.81±5.09％，与模型组比较均有显著差异(P＜0.01)。其中，芎丹大剂量组和消心痛及血府比较，亦有显著减少(P＜0.01)。

本实施例表明芎丹胶囊明显减小结扎冠状动脉大鼠心肌缺血程度，缩小其心肌梗死面积；明显减少大鼠再灌注心肌酶的漏出；显著增加缺血再灌注大鼠血清SOD活性和总抗氧化能力，降低血清MDA含量。

实施例9、芎丹提取物预防猪冠状动脉球囊扩张后再狭窄(RS)的研究

试验材料：芎丹提取物(丹参提取物50，川芎提取物45)；普罗布考：批号：990302，由承德市普宁制药厂提供。

24只中国小型猪，雌雄兼用，体重28-36kg，中国农业大学提供。随机分为4组，对照组(只造模不给药)7只，不给予特殊药物治疗，冠状动脉球囊扩张术中死亡2只。阳性药普罗布考对照组、芎丹提取物小剂量、芎丹提取物大剂量组则于术前2天开始给药，持续至术后4周。其中普罗布考组6只，每日予普罗布考2000mg，手术中死亡1只；芎丹提取物小剂量组6只(手术中死亡1只)、大剂量组5只，每日分别给予芎丹提取物0.025g/kg及0.05g/kg。药物混于饲料中，每次给药均由专人观察证实动物服用。动物造模成功后，进入正式实验的小型猪每组各5只。

试验观察时间为：至猪冠状动脉球囊损伤后4周。

球囊扩张致猪冠状动脉再狭窄模型：所有动物术前一天均给予阿斯匹林325mg及心痛定60mg，混入饲料中给药。采用氯胺酮(25mg/kg)及安定(1mg/kg)肌注麻醉，建立静脉通道。背位固定，间断给予阿托品0.5mg肌注以抑制粘液分泌，并采用硫贲妥钠2-3ml/次维持麻醉。动物给予气管插管，但仅在呼吸抑制时应用机械通气。整个实验过程中监测ECG和动脉内血压。常规穿刺技术于右侧股动脉安放8F引导鞘管后，给予肝素(200U/kg)。然后在荧光透视下，将一7F-8F引导导管置于左冠状动脉口，冠状动脉内推注硝酸甘油0.2mg，于左前斜(LAO)45°行冠状动脉造影，并记录在电影胶片上以备分析。根据造影结果估测冠状动脉直径，选择球囊大小以扩张后的球囊与动脉直径比约为1.4∶1为标准。将球囊送入LAD前，静脉予溴苄胺2.5mg/kg，冠状动脉内给予硝酸甘油200μg，通过一0.356mm引导钢丝，将一长20mm的球囊置于左前降支的中段，进行3次30s、10atm的扩张，每次之间间隔1min以使冠状动脉重新得到灌注。尽量避免累及大的侧支。最后一次扩张结束后，退出球囊并冠状动脉内推注硝酸甘油0.2mg。然后于相同的LAO位进行冠状动脉造影，以观察血管通畅情况及损伤后的扩张情况，并记录在电影胶片上。退出引导导管和鞘管，缝合伤口。术后28天，于相同的LAO位重复冠状动脉造影，并做胶片记录以备分析。

1、各组基础值及组织病理学分析结果比较

处死动物前给予肝素(200U/kg)，随后推注致死量的戊巴比妥钠(100mg/kg)。行左侧胸廓切开术，左主干插管接灌注装置，以4％多聚甲醛-PBS于100mmHg下持续灌注15min。根据冠状动脉造影上解剖学标志，快速小心地从心脏上剥离LAD相应损伤节段和LCx中段(未进行手术的LCx中段作为正常对照)，每个动脉分为2部分，一部分用于组织学检测，于4％多聚甲醛-PBS中固定2-4小时。常规石蜡包埋，间断均匀切片，切片厚度约5μm，分别作HE染色、弹力纤维(VG，Verhoeff-van Gieson)染色和Masson染色，普通光镜观察形态学改变(包括内膜增生、管腔狭窄、IEL及外弹力板(EEL)的断裂)情况。对内膜增生最明显的部位按表31的标准进行病变分级。另一部分用于透射电镜观察，组织样品于4℃下2.5％戊二醛中固定，1％锇酸后固定，系列酒精脱水，Epon 812包埋。半薄定位(内膜下)，LEICA超薄切片机切片，铅铀双染，透射电镜下观察。电镜下鉴别SMC的标准：基底膜的存在，肌丝及相关的致密体。

表31.组织病理学分级系统

分级             标准

0                没有损伤

1                IEL断裂，中膜压缩但未撕裂

2                IEL断裂，中膜亦可见撕裂

3                 EEL断裂

各组动物术前、术中及术后相关基础值比较结果如表32。在球囊扩张时各组动物体重无明显差异。29只接受球囊损伤的动物中，4只在24小时内死亡，死亡原因包括室颤(n＝3，对照组、普罗布考组及芎丹提取物小剂量组各一只)及血栓引起的急性心肌梗死(n＝1，对照组)。没有证据表明动物死亡与所应用的药物有关。除死亡动物外，不同程度的内弹力板(IEL)断裂见于所有动物。因此，共有25只猪(每组各5只)进行了相关检测和最后的统计学分析。损伤后4周动脉在IEL断裂情况下，形成了明显的新生内膜并取代了断裂的中膜。光镜观察表明，新生内膜主要由SMC及胶原纤维等成分组成。电镜结果证实，新生内膜中的细胞成分主要为SMC及少量的成纤维细胞和巨噬细胞。动脉损伤(IEL断裂)见于各组动物，组织病理学分级组间对比无显著性差异。

2、各组形态学分析结果比较

形态学分析采用BHEC型显微镜-微机彩色图象处理系统在内膜增生最明显的切片上进行。测量内容包括：最大内膜厚度(MIT，mm)、IEL周长(IELc，mm)、IEL断裂长度(IELf，mm)、管腔面积(LA，mm2)、IEL围绕面积(IELa，mm2)、EEL围绕面积(EELa，mm2)。其余相关指标按以下公式换算而得：损伤积分(IS，代表血管损伤程度)＝IELf/IELc；内膜面积(IA)＝IELa-LA；中膜面积(MA)＝EELa-IELa；管腔狭窄百分比(LS)＝IA/IELa；残余管腔百分比(RL)＝1-LS；增殖指数(PI)＝IA/EELa；RS损伤指数(RII)＝PI/IS。

各组之间的最大内膜厚度(MIT)、损伤积分(IS)、管腔面积(LA)、内弹力板围绕面积(IELa)、外弹力板围绕面积(EELa)、中膜面积(MA)、内膜面积(IA)、管腔狭窄百分比(LS)、残余管腔百分比(RL)、增殖指数(PI)及再狭窄损伤指数(RII)比较结果如表32所示，表明IELa、EELa及MA各组之间无明显差异。各药物组在减小MIT、IA和LS、增加LA和RL、降低PI及RII方面均有一定趋势，但除芎丹大剂量组在减小MIT及降低RII方面与对照组相比有显著性差异(P＜0.05)外，其余组间对比无显著性差异(P＞0.05)。由于血管损伤程度对内膜增生反应具有潜在的影响，在证实PI、LA、LS及RL与IS明显相关(相关系数分别为0.66，-0.54，0.59，-0.59，P＜0.01)，IS在组间差异不明显的基础上，采用协方差方法进行统计，证实各药物组在降低PI方面较对照组均有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)，芎丹提取物大剂量组还在增加LA方面较对照组有显著性差异(P＜0.05)。在减小LS及增加RL方面，普罗布考组及芎丹提取物大、小剂量组均较对照组有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)。

表32.各组形态学分析结果比较 

                    对照组        普罗布考组    芎丹小剂量      芎丹大剂量

最大内膜厚度(mm)    0.88±0.40    0.55±0.15    0.49±0.08      0.34±0.05*

官腔面积(mm²)      0.91±1.18    1.36±0.83    1.88±0.91      2.00±0.88△

IEL围绕面积(mm²)   2.21±0.65    2.15±0.64    2.62±1.03      2.52±0.76

EEL围绕面积(mm²)   3.22±0.63    3.34±0.62    3.68±1.18      3.40±0.64

中膜面积(mm²)      1.03±0.11    1.18±0.43    1.06±0.47      0.88±0.30

新生内膜面积(mm²)  1.31±0.68    0.81±0.68    0.74±0.14      0.51±0.27

残余管腔百分比(％)  35±37        62±24△      70±7△△       77±14△△

管腔狭窄百分比(％)  65±37        35±24△      30±7△△       22±14△△

增殖指数            0.44±0.23    0.24±0.18△  0.22±0.04△△  0.16±0.09△△

RS损伤指数          1.15±0.51    0.69±0.26    0.72±0.14      0.37±0.07*

注：与对照组相比，*P＜0.05；与对照组相比，△P＜0.05，△△P＜0.01，以损伤积分为协变量进行协方差分析。

3、各组冠状动脉造影分析结果比较

造影分析在实验时获得的造影片上进行，包括损伤部位在球囊扩张前、后及随访时的动脉直径，以及球囊动脉比。急性管腔获得及后期管腔丧失可分别通过扩张后减扩张前动脉直径及扩张后减随访时动脉直径而得。实际动脉直径需由造影血管直径校正放大因素而得。放大因子可通过体外测量球囊直径除以造影片球囊直径而得。

对冠状动脉造影片上的球囊损伤前、后及随访时的动脉直径和球囊动脉比进行分析，急性管腔获得及后期管腔丧失可通过计算而得。结果如表33所示，表明球囊损伤前、后的动脉直径，球囊动脉比，冠状动脉扩张以及急性管腔获得各组之间无显著性差异(P＞0.05)。各药物组与对照组相比，在减少后期管腔丧失及增加随访时动脉直径方面均有一定趋势，但组间对比无显著性差异(P＞0.05)。由于血管扩张程度对后期管腔丧失具有潜在的影响，在证实后期管腔丧失、随访时动脉直径与急性管腔获得明显相关，且急性管腔获得在组间差异不明显的基础上，以急性管腔获得为协方差，采用协方差方法进行统计。结果表明，普罗布考组(0.74±0.39)、芎丹提取物小剂量组(0.78±0.33)及芎丹提取物大剂量组(0.59±0.28)在减少后期管腔丧失方面较对照组(1.32±0.71)均有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)，芎丹提取物小剂量组(1.97±0.51)、大剂量组(2.03±0.30)还在增加随访时动脉直径方面较对照组(1.34±0.82)有显著性差异(P＜0.05)。结合病理分析结果，提示芎丹提取物确实具有减少猪冠状动脉球囊扩张后管腔丧失和预防RS形成的作用。

表33.各组冠状动脉造影结果对比

                    对照组        普罗布考组    芎丹小剂量     芎丹大剂量

动脉直径(前，mm)    2.22±0.33    2.00±0.33    2.23±0.49     2.11±0.34

动脉直径(后，mm)    2.66±0.34    2.49±0.30    2.75±0.47     2.63±0.45

动脉直径(随访，mm)  1.34±0.82    1.75±0.47    1.96±0.51*    2.03±0.30*

急性管腔获得(mm)    0.43±0.17    0.55±0.10    0.58±0.03     0.55±0.11

后期管腔丧失(mm)    1.32±0.71    0.74±0.39**  0.77±0.33**   0.59±0.28**

注：各组数据之间经统计学分析无显著性差异(P＞0.05)。

与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，以急性管腔获得为协方差进行分析。

4、各组对内膜增生及血管重塑所致后期管腔丧失的影响

为了定量地分析血管重塑在造影所示后期管腔丧失中所起的作用，参考有关文献对以下值作了规定：潜在管腔面积：在假定血管为圆形的基础上由IELc计算而得。实际管腔面积：由潜在管腔面积减去IA而得。新生内膜平均厚度：潜在管腔面积及实际管腔面积换算而得半径的差值。血管重塑：后期管腔丧失减去新生内膜平均厚度(×2)而得。新生内膜厚度及血管重塑在后期管腔丧失中所占比重：由新生内膜厚度(×2)或血管重塑的值除以后期管腔丧失而得。

以急性管腔获得为协方差进行统计的结果如表34所示，表34表明各用药组在减少由内膜增厚所致后期管腔丧失方面较对照组均有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)，与前面的病理分析结果一致。在减少由血管重塑所致后期管腔丧失方面，芎丹提取物小剂量组(0.50±0.31)和芎丹提取物大剂量组(0.37±0.23)较对照组(0.60±0.39)有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)。综合各组结果，由内膜增厚可解释41±20％的后期管腔丧失，而血管重塑可解释59±20％的后期管腔丧失。

表34各组对内膜增生及血管重塑所致后期管腔丧失的影响

                     对照组        普罗布考组    芎丹小剂量     芎丹大剂量

急性管腔获得(mm)     0.43±0.17    0.51±0.10    0.58±0.03     0.54±0.11

后期管腔丧失(mm)     1.33±0.71    0.75±0.39**  0.78±0.33**   0.58±0.28**

平均内膜厚度×2(mm)  0.72±0.42    0.35±0.29*   0.28±0.03**   0.23±0.12**

血管重塑(mm)         0.60±0.39    0.40±0.22    0.50±0.31*    0.37±0.23**

注：各组数据之间经统计学分析无显著性差异(P＞0.05)。与对照组相比，*P＜0.05，

**P＜0.01，以急性管腔获得为协方差进行分析。

5、各组术后早期血浆GMP-140水平比较

血浆血小板颗粒膜糖蛋白(GMP-140)的测定：术后第三天收集血液标本，加入含2％EDTA-Na2抗凝剂的试管，4℃，3,000×g离心10min。将血浆移至另一干净试管，-20℃贮存。按试剂盒说明书在自动免疫γ计数仪上进行放免分析。

GMP-140(又称P选择素)，是迄今所知最具特异性的血小板活化的分子标志物，其在未激活的血小板中主要分布于α-颗粒膜上，只有当血小板活化时，才大量表达于血小板膜表面并释放入血浆。因此，测定血浆GMP-140水平可特异地反映出血小板活化及破坏的程度。术后第3天，取血检测血浆GMP-140水平，结果如表35所示，表明对照组(101.8±12.35)与普罗布考组(98.14±13.51)之间无显著性差异(P＞0.05)。芎丹提取物小剂量组(75.65±14.97)显示有降低血浆GMP-140的趋势，芎丹大剂量组(63.24±4.42)与对照组相比有统计学差异(P＝0.006)，芎丹提取物大剂量组与普罗布考组对比亦有统计学差异(P＝0.031)。

表35猪冠状动脉球囊损伤后3天各组血浆GMP-140含量比较

组      别            例数    血浆GMP-140含量(mg/L)

对照组                5       101.8±12.35

普罗布考组            5       98.14±13.51

芎丹提取物小剂量组    5       75.65±14.97

芎丹提取物大剂量组    5       63.24±4.42*▲

注：*与对照组相比，P＜0.01；σ与普罗布考组比较，P＜0.05

6、各组电镜观察结果比较

SMC增殖活性的分析采用增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化的方法。HistostainTM-Plus Kits免疫组化染色试剂盒、小鼠抗大鼠PCNA单克隆抗体为Santa Cruz公司产品，均购自北京中山生物技术公司。5μm石蜡切片，二甲苯脱蜡，各级乙醇至水，置于枸橼酸缓冲液中92-95℃加热15min，PBS洗3min，3％H₂O₂孵育10min，蒸馏水冲洗，PBS洗5min，10％正常山羊血清室温孵育10min，去血清，加入一抗4℃孵育过夜。PBS冲洗5min，3次，生物素标记的二抗37℃孵育30min，PBS冲洗3min，3次，辣根过氧化物酶标记的链白霉素37℃孵育30min，PBS冲洗3min，3次，DAB显色3min。用水充分冲洗，中性树胶封片。用PBS取代一抗作空白对照。PCNA阳性反应细胞为棕黄色。计数新生内膜中细胞总数及PCNA阳性反应细胞数，增殖活性由PCNA染色阳性细胞数除以细胞总数而得。

透射电镜观察结果显示，正常猪冠状动脉内弹力膜完整，中膜SMC以收缩型为主，表现为胞质内充满大量肌丝，仅在核周围有少量粗面内质网、线粒体和游离核糖体。对照组扩张部位动脉内弹力膜断裂，中膜SMC向内膜移行。损伤血管新生内膜中多数为增生的SMC，其次为成纤维细胞及少量的巨噬细胞。其中对照组损伤血管新生内膜中以合成型SMC居多，表现为胞体肥大，核浆比例增大，胞浆内高尔基复合体发育良好，粗面内质网增多、扩张，线粒体数目增加且富含嵴，游离核糖体增多，细胞内肌丝较少。各用药组损伤血管新生内膜中合成型SMC较对照组少，核浆比例及胞浆内与生物合成有关的细胞器增加亦不如对照组变化明显，肌丝较多。这种改善作用尤以芎丹大剂量组为著。

7、各组I型胶原免疫组化分析结果比较

I型胶原的免疫组化分析：HistostainTM-Plus Kits免疫组化染色试剂盒、鼠抗人I型胶原单克隆抗体为ZYMED公司产品，均购自北京中山生物技术公司。

胶原I型免疫组化结果如表36所示，表明对照组新生内膜中I型胶原较多，普罗布考组与对照组相比胶原减少不明显，芎丹提取物大、小剂量组新生内膜中I型胶原较对照组有不同程度减少，其中芎丹提取物大剂量组与对照组比较有显著差异(P分别＜0.05和＜0.01)明显。

表36.各组免疫组化染色胶原I型阳性表达面积的比较(μm²)

组  别                胶原I型阳性表达面积

对照组                8389.18±2073.22

普罗布考组            7716.88±1934.07

芎丹提取物小剂量组    5969.40±1533.97

芎丹提取物大剂量组    3940.42±1204.76**

注：与对照组比，*P＜0.05， **P＜0.01

本实施例采用国际上公认的球囊扩张损伤猪冠状动脉造成RS的动物模型，观察芎丹提取物预防猪冠状动脉介入治疗后RS的药效。并从血小板活化、SMC的增殖以及病理性血管重塑等方面研究了其作用机制。结果表明：芎丹提取物可明显减少猪冠状动脉球囊损伤后的内膜增生，减少管腔丧失；可明显抑制猪冠状动脉球囊损伤后的病理性血管重塑，减少管腔丧失；可明显抑制猪冠状动脉球囊损伤后SMC的增殖和表型转变；可明显抑制猪冠状动脉球囊损伤后早期血小板的活化，减少后期的内膜增生；可明显减少猪PTCA术后新生内膜中的I型胶原沉积。

实施例10、芎丹提取物对内皮素(ET)致培养兔胸主动脉平滑肌细胞(SMC)增殖的影响

损伤血管处的SMC增生被公认RS形成的主要环节之一。内皮素(ET)为SMC促有丝分裂原，它可诱导体外培养SMC的增殖。本实施例采用血清药理学方法，观察了芎丹提取物对ET诱导的培养兔主动脉SMC增殖凋亡的影响。

试验材料

受试药物：芎丹提取物，每g提取物相当于生药70g(丹参42g，川芎28g)

动物：日本大耳白家兔，雌雄不限，体重2-3kg，由中国中医研究院西苑医院动物中心提供。

试验分组和剂量设置

选择纯种雄性日本大耳白家兔8只，每日分别给予芎丹提取物大、中、小剂量分别为0.031g/kg、0.062g/kg和0.124g/kg及蒸馏水连续10天后，于最后1次灌药后1h(灌药前禁食不禁水12h)，腹主动脉采血，无菌分离血清，经56℃，30min灭活处理后，-20℃保存备用。在进行MTT和流式细胞仪检测时，空白组血清和各药物组血清添加量为25％。

含药血清的制备

选择纯种雄性日本大耳白家兔8只，每日分别给予不同药物及蒸馏水连续10天后，于最后1次灌药后1h(灌药前禁食不禁水12h)，腹主动脉采血，无菌分离血清，经56℃，30min灭活处理后，-20℃保存备用。

1、芎丹提取物对ET诱导的血管SMC增殖的影响(MTT比色法)

动脉SMC培养及鉴定：健康日本大耳白家兔，无菌条件下取出胸主动脉，分离动脉中膜层，剪成1mm2的小块，组织贴块法接种于培养瓶内，培养液为含20％胎牛血清，25mM HEPES，100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素的DMEM培养液。每3-4天更换一次培养液，待细胞生长成致密单层时，用胰蛋白酶消化液进行消化、传代。SMC成梭形或长梭形，可多层生长，呈现典型的“峰”与“谷”生长特征。取第3代细胞用于实验。

MTT法检测血管SMC增殖：取培养第3代SMC，应用前用含10％胎牛血清的DMEM培养液调整SMC浓度，按每孔1×10⁴个细胞接种在96孔细胞培养板内，5％CO₂孵箱37℃培养24h后，换无血清的DMEM培养液继续培养24h，使细胞同步进入G₀期，然后更换为含2％胎牛血清的DMEM培养液，分为以下几组：(1)正常对照组：不加ET及血清。(2)ET组：加含ET0.1μmol/L及2％胎牛血清的DMEM培养液。(3)空白血清组：加含ET 0.1μmol/L、2％胎牛血清的DMEM培养液及空白血清(喂蒸馏水兔血清)。(4)含药血清组：在加含ET 0.1μmol/L及2％胎牛血清的DMEM培养液基础上，加芎丹提取物组血清，血清添加量为25％。每组均设8个平行孔，37℃CO₂培养箱中培养20h后加入MTT(5mg/ml)溶液50μl/孔，继续培养4h，去上清，仅留下极少量的残液，每孔加0.2ml二甲基亚砜(DMSO)，在振摇器上摇动5min混匀，在酶标仪上测OD₅₇₀。抑制率＝Odc-Ode/Odc，Odc为加ET对照组光密度值，Ode为各实验用药组光密度值。

芎丹提取物对ET诱导的血管SMC增殖的影响结果如表所示37，表明加ET组OD值为0.62±0.03，明显高于正常对照组0.32±0.01(P＜0.01)，说明ET可诱导血管SMC增殖。加入正常血清后对ET诱导的SMC增殖无显著影响。芎丹提取物各剂量组均可显著抑制ET诱导的SMC增殖，较ET组及正常血清组有明显差异(P＜0.01)，其中芎丹提取物组的作用呈剂量依赖性，小、中、大剂量的抑制率分别为17.74％，33.87％和40.32％。

表37.芎丹提取物对ET诱导的血管SMC增殖的影响(MTT比色法)

组      别    孔数    OD值           抑制率(％)

正常对照组    8       0.32±0.01

ET      组    8       0.62±0.03▲

正常血清组    8       0.65±0.02▲    1.61

芎丹小组    8    0.55±0.02*△    17.74

芎丹中组    8    0.45±0.01*△    33.87

芎丹大组    8    0.39±0.01*△    40.32

注：与ET组相比，*P＜0.01：与正常血清组相比，△P＜0.01；与正常对照组相比，▲P＜0.01

2、芎丹提取物对ET诱导的SMC细胞周期的影响

流式细胞仪检测细胞周期：培养细胞加入各组血清后，于37℃CO₂培养箱中培养24-48h，胰蛋白酶消化并离心(2000rpm，5-10min)收集细胞，调整每管细胞浓度不小于10⁶/ml。PBS洗2次，加0.5ml PBS重悬细胞。加入5ml 70％乙醇迅速混匀，于4℃下固定过夜。离心收集细胞，并以PBS洗2次。用含100μ/ml Rnase A、10μg/ml TritonX-100和50μg/ml PI的染液处理，室温避光30分钟，上机检测。使用PHOENIX MultiCycle 3.11软件分析细胞周期。

流式细胞仪检测结果如表38所示，表明ET组SMC的G₁期细胞百分比较正常对照组明显降低，G₂+S期细胞百分比则明显高于正常对照组(P＜0.01)；加入正常血清后对此无明显影响，芎丹提取物各剂量组则均可显著增加G₁期细胞百分比，减少G₂+S期细胞百分比，较ET组有明显差异(P＜0.05，P＜0.01)，其中芎丹提取物组的作用呈剂量依赖性，芎丹提取物大剂量组较正常血清组亦有明显差异(P＜0.05)。

表38.芎丹提取物对ET诱导的SMC细胞周期的影响

组    别    瓶数    细胞周期百分比

            G₁  S               G₂                              G₂+S

正常对照组  8    81.54±3.74     3.81±5.26     15.64±4.83

19.46±3.74

ET组        8    53.66±6.67▲▲ 21.12±12.10   27.22±11.19      47.34±6.67▲▲

正常血清组  8    59.46±4.76▲▲ 14.06±9.78    26.70±8.27       41.76±4.65▲▲

芎丹小组    8    70.02±4.94*    6.58±7.34     21.72±8.77       29.10±5.02*

芎丹中组    8    71.78±3.10**   8.84±8.20     18.56±10.02      26.80±3.10**

芎丹大组    8    72.46±5.35**   8.60±8.24     15.92±10.17      23.72±5.17**△

注：与ET组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常血清组相比，△P＜0.05，△△P＜0.01；

与正常对照组相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

本实施例表明芎丹提取物含药血清可明显抑制ET所致培养兔胸主动脉SMC的增殖；芎丹提取物含药血清尚具有一定诱导ET促增殖的培养兔胸主动脉SMC凋亡的作用。

实施例11、芎丹药粉大鼠长期毒性试验

试验材料及试验环境

(1)芎丹药粉含有下述重量份数比的组分：川芎提取物15，丹参提取物50。

(2)5-6周龄wistar大鼠80只，每组20只，雌雄各半。购自中国中医研究院动物中心，合格证号：医动字第01-3067号。

连续给大鼠灌胃给药12周，观察芎丹药粉对大鼠所产生的毒性反应、毒性程度及毒性反应的靶器官和损害的可逆性，确定无毒反应剂量，为拟定临床剂量提供参考。

(3)中国中医研究院西苑医院实验动物中心为医学实验动物环境二级标准，合格证号：医动字第01-4010。

将供试大鼠分为大、中、小三个剂量组及一个对照组，3个给药组剂量分别为3696mg/kg体重、1848mg/kg体重、924mg/kg体重，分别为临床用量的60倍、30倍、15倍。对照组给予等量水。灌胃给药12周，部分动物停药后观察2周。12周的长期毒性试验及停药后2周的观查结果如下：

(1)通过12周的长期毒性试验及停药后2周的观查，芎丹药粉对各组大鼠外观、活动、精神状态、饮水、皮毛色泽未见明显差异，呼吸频率正常，未见呕吐、流涎等耳鼻眼口异常分泌物，大便为成形褐色便；摄食量、体重均无明显影响。

(2)对血常规的影响：

给药12周后发现芎丹药粉对红细胞具有一定的升高作用，小剂量组及大剂量组与对照组相比有显著差异，P＜0.05。但停药2周后未见有明显差异。给药12周后及停药2周后，血常规各项指标均未见有明显病理意义的毒性反应。

(3)对心率的影响：

给药12周后及停药2周后芎丹药粉各剂量组与对照组相比，对大鼠心率的影响均未见有明显差异。

(4)对血生化指标的影响：

血生化学检查发现，给药12周后，除对血清胆红素具有降低降低作用外，其它指标均与对照组无显著差异。停药2周后各剂量组指标与对照组相比，均无显著差异。结果表明芎丹药粉对肝功能、肾功能、血脂没有明显毒性影响，

(5)对脏器重量的影响：

给药12周后及停药2周均未发现对主要脏器重量有明显影响。

(6)病理检查主要脏器未提示中毒性反应。给药后大剂量组有一例睾丸发育不好，不能排除本身发育不良，且停药后未发现异常。

综上所述，芎丹药粉大鼠长期毒性试验结果表明，按人临床用量的60倍、30倍、15倍的用量灌胃给予大鼠12周，未发现明显的毒副作用，证明芎丹药粉用于临床是安全的。