聚乙二醇氨基酸N－内环羰酐活性衍生物及其药物键合物和凝胶

摘要

通式I的聚乙二醇氨基酸N－内环羰酐活性衍生物，其中，n和m是1－6的整数；j是1－20的整数；X为连接基团，Y为PEG本身的一个羟基或者被C1－12烷氧基、环烷氧基或芳烷氧基封端。还提供了通式I的衍生物与含有自由氨基的物质，如蛋白、多肽、合成聚合物和治疗药剂形成的键合物，这种键合物具有提高的生物利用度、生理半衰期和水溶性。还提供了由该活性衍生物本身聚合、或者与其他聚合物前提或其他小分子氨基酸化合物共聚得到的凝胶。以及制备这种衍生物的方法和凝胶的医药用途。

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型的聚乙二醇氨基酸活性衍生物，尤其是涉及一种聚乙二醇氨基酸N-内环羰酐活性衍生物，其药物键合物，以及由该活性衍生物制备的凝胶。

背景技术

天然药物活性成分中的蛋白质、多肽、萜类、甾体、生物碱、黄酮、蒽醌、苯丙素酚类等在生理活性上都表现出各种有效的性能，在医药中得到了广泛的应用。它们的甙类、核苷类、多肽类衍生物也有相当的应用。作为天然活性成分，它们具有生物降解快，基本无残留，毒副作用小等优点。但同时也有相应的问题存在，例如生物利用率低、生理半衰期短、水溶性差、引发机体免疫等不利之处。

解决此问题，已广泛地使用聚乙二醇(PEG)衍生物，使其与蛋白质、肽或其他治疗药物结合，以降低生物降解作用，延长药物的生理半衰期、降低其免疫原性和毒性。在临床使用中，PEG及其衍生物作为制作药物制剂的载体已经在很多商业药品中得到了广泛的应用。而将PEG键合到药物分子的尝试在最近十年里也得到了长足的发展。如PEG-intron，一种α-干扰素与聚乙二醇的键合物就表现出了更长的循环半衰期和更好的治疗效果。紫杉醇与聚乙二醇的键合物也相应的降低了毒性和延长了生物活性。聚乙二醇在人体内的代谢过程已相当清楚，是一种安全的，无副作用的药物改性剂。

聚乙二醇可以用于和很多药物连接。在与药物结合时，常用到一种被称为聚乙二醇化(PEGylation)的工艺，即聚乙二醇两端的一个或二个端基被化学活化后具有一适当的官能团，此官能团对要结合的药物中的至少一个官能团具有活性，能与之形成化学键。形成的键合物可在体内适当的情况下释放出活性成分。

聚乙二醇(PEG)活性衍生物在很多文献中均有报道。第5672662号美国专利描述了制备线形PEG的丙酸和丁酸以及它们的N-羟基丁二酰亚胺酯。第5643575号美国专利描述了一种U形结构的PEG衍生物。在PEG的活性衍生物中，最常使用的官能团是N-羟基丁二酰亚胺(NHS)酯、N-羟基丁二酰亚胺碳酸酯以及马来酰亚胺等。

本发明的目的是提供一种新型的聚乙二醇氨基酸活性衍生物，所说的活性衍生物需要对蛋白、多肽或其他药物分子等具有更高的反应活性，并且，所说的活性衍生物与蛋白、多肽或其他药物分子的键合物具有更高的生物利用度、生理半衰期和水溶性。

为此，本发明中的聚乙二醇(PEG)活性官能团是一种特殊结构的氨基酸-N-内环羰酐。它是通过对氨基酸酸根和其氨基加以环化实现的。这种结构对含有自由氨基的物质具有很高的反应活性，比如蛋白质、多肽等，它们能够因此而反应形成稳定的共价键连接。在反应中，一个自由氨基引发了环状结构的开环生成酰胺键，同时形成一个新的氨基。反应时消失的正电荷得到保护。保护这种正电荷有时在保持蛋白质的生理活性、稳定性和膜渗透性方面是非常重要的。

这种聚乙二醇活性衍生物还能在适当的条件下形成凝胶。

发明内容

本发明提供了一种新型的聚乙二醇氨基酸活性衍生物，它在PEG的链端包含有至少一个氨基酸的N-内环羰酐，其中，聚乙二醇的分子量为150～60,000，所说的氨基酸可以是α或β氨基酸。

因此，根据本发明的一个方面，提供了一种通式I的聚乙二醇氨基酸N-内环羰酐活性衍生物：

其中：

PEG是直链、支链、星形或者树形结构的聚乙二醇聚合物；

n和m是1-6的整数；

j是1-20的整数；

X为连接基团，优选为酰胺基、羰基、酰肼基、酯基、醚基或硫醚基；

Y为PEG本身的一个羟基或一个活性官能团F。

在本发明的优选实施方案中，所述聚乙二醇的分子量为150～60,000。

当Y为PEG本身的一个羟基时，所述的衍生物为如下通式Ia的化合物：

而当Y为活性基团F时，所述的衍生物为如下通式Ib的化合物，

其中，F为一个活性官能团，选自由C₁-C₁₂烷氧基、环烷氧基和芳烷氧基组成的组的基团，优选是甲氧基、乙氧基或苄基。

在本发明的优选实施方案中，本发明所述的衍生物是：

聚乙二醇酰胺基谷氨酸N-环内酸酐(1)；

甲氧基聚乙二醇酰胺基谷氨酸N-环内酸酐(2)；

聚乙二醇酯基谷氨酸N-环内酸酐(3)；

聚乙二醇酰基赖氨酸N-环内酸酐(4)；或

甲氧基聚乙二醇酰基赖氨酸N-环内酸酐(5)。

按照本发明的另一个方面，提供了通式I的聚乙二醇氨基酸N-内环羰酐活性衍生物与含有自由基氨基的物质形成的键合物，如通式II所示：

其中，PEG、n、m、j、X和Y与通式(I)有相同的定义，SUB是一类含有自由氨基的物质，选自由蛋白质、酶、多肽、核苷、糖类、有机酸、甙类、黄酮类、醌类、萜类、苯丙素酚类、甾体及其甙类、生物碱组成的基团；并且，在优选的实施方案中，所述的蛋白质是EPO或干扰素。

在一个优选的实施方案中，本发明的键合物是甲氧基聚乙二醇酰基赖氨酸N-环内酸酐与α-干扰素的键合物。

研究表明，所说的活性衍生物与蛋白、多肽或其他药物分子的键合物具有更高的生物利用度、生理半衰期和水溶性。

根据本发明的再一个方面，本发明的这种聚乙二醇活性衍生物在适当的条件下形成凝胶。

所述的凝胶是通过聚合所述的聚乙二醇氨基酸N-内环羰酐活性衍生物本身所得到的，如由聚乙二醇酰胺基谷氨酸N-环内酸酐(1)、聚乙二醇酯基谷氨酸N-环内酸酐(3)或者聚乙二醇酰基赖氨酸N-环内酸酐(4)本身聚合制备的凝胶。

所述的凝胶也可以通过将所述的聚乙二醇氨基酸N-内环羰酐活性衍生物与其他聚合物前体共聚所得到，如由聚乙二醇酰胺基谷氨酸N-环内酸酐(1)、聚乙二醇酯基谷氨酸N-环内酸酐(3)或者聚乙二醇酰基赖氨酸N-环内酸酐(4)分别与聚乙二醇胺共聚制备的凝胶。

所述的凝胶还可以通过将所述的聚乙二醇氨基酸N-内环羰酐活性衍生物与其他小分子氨基化合物共聚所得到的，如由聚乙二醇酰胺基谷氨酸N-环内酸酐(1)、聚乙二醇酯基谷氨酸N-环内酸酐(3)或者聚乙二醇酰基赖氨酸N-环内酸酐(4)分别与赖氨酸共聚制备的凝胶。

所述凝胶能够应用在生物医药中。根据本发明的凝胶在制备药物组合物时，能够改善药物吸收，延长作用时间，增强疗效，降低给药剂量及避免某些毒副作用。

所述凝胶能够应用在外科手术方面，作用手术后缝合凝胶或预防手术后粘连的制剂，因此，本发明也提供含有上述凝胶的药物载体，手术后缝合凝胶或预防手术后粘连的制剂。

根据本发明的又一个方面，提供了一种制备本发明的聚乙二醇氨基酸N-内环羰酐活性衍生物的方法，该方法包括将PEG和氨基酸反应，然后通过光气或者光气类似物进行结构环化，其中，所述的光气类似物为三光气或双光气。

具体实施方式

在本发明的聚乙二醇氨基酸活性衍生物中所用的聚乙二醇可以是其它亲水性聚合物，如聚丙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯吗啉或者它们与聚乙二醇的共聚物。此等亲水性聚合物通过对游离端羟基的修饰，将氨基酸等酸性基团结合到该聚合物的母体上，使该聚合物能够提供与药物分子的连接点，由此与蛋白质、多肽或者其他天然药物活性成分中的游离氨基、羟基等连接在一起。

聚乙二醇(PEG)，其结构通式如III所示：

其中：

R为H或C_1-12烷基，

l为任何整数，表征其聚合度。

当R为低级烷基时，R可以是含有1-6个碳原子的任何低级烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、正戊基或正己基。当R为环烷基时，R优选为含3-7个碳原子的环烷基，如环丙基、环丁基和环己基。优选的环烷基为环己基。其典型的化合物是甲氧基聚乙二醇(mPEG)。其他聚乙二醇类似物基团聚乙二醇共聚物也可用于此发明应用，如聚丙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯吗啉等。

对聚乙二醇而言，一般采用分子量予以表示，只要使形成结合物的聚乙二醇的分子量为300～60000道尔顿，这相当于l为大约6～1300。更优选的是，l为28、112和450，这分别相应于分子量为1325、5000和20000。由于通常由其平均分子量而非自重复单元限定的起始PEG化合物的潜在不均一性，优选用分子量表征聚乙二醇聚合物，而不是用整数l表示PEG聚合物中的自重复单元。各种分子量的起始PEG化合物可以通过本领域中的已知方法制备或者可以从商业来源得到。

在目前使用许多药物、尤其是天然药物成分中都含有氨基、羧基、羟基等官能团，它们在生物体内通常都与单糖、多糖、核苷、多聚核苷、磷酰基等成分结合，以形成在生物体中有活性的药理结构。

亲水性聚合物上如果有游离羟基，则该游离羟基可用C_1-12烷氧基、环烷氧基或芳烷氧基封端，优选是甲氧基、乙氧基、异丙氧基、环丙氧基、环丁氧基、环己氧基以及苄氧基。

另外，在该亲水性聚合物上还可连接靶向分子，如抗体等，以便定向转运本发明的键合物。

本发明的键合物中可使用合适的药物分子构成其中的药物部分，其包括氨基酸、蛋白质、酶、核苷、糖类、有机酸、甙类、黄酮类、醌类、萜类、苯丙素酚类、甾体及其甙类、生物碱等，以及它们的含有氨基的衍生物等。

本发明的键合物可以纯化合物形式或适宜的药物组合物进行给药，可采用任何可接受的给药方式或用于类似的用途的试剂进行。组合物可包含常规药用载体或赋形剂和作为活性成分(一种或多种)的本发明的键合物，此外，还可包含其它药剂、载体、辅剂等。

研究表明，本发明的键合物具有很好的水溶性和较长的生理半衰期，降低的毒副作用。

本发明的聚乙二醇活性衍生物在适当的条件下形成凝胶。所述的凝胶在生物医药中的用途广泛，可以用作药物载体，改善药物吸收，延长作用时间，增强疗效，降低给药剂量及避免某些毒副作用。此外，本发明的凝胶还可用在外科手术上，作手术后缝合凝胶及预防手术后粘连的制剂。

下面结合实例描述本发明的聚乙二醇氨基酸活性衍生物及其制备方法，它不限制本发明，本发明的范围由权利要求限定。

实施例1-5

为了说明本发明的详细的实施例的情况，用图表表示如下：

表1

                            实施例1

            聚乙二醇酰胺基谷氨酸N-环内酸酐(1)的制备

10克聚乙二醇二胺(分子量为5000)和1.5克N-叔丁氧羰基谷氨酸叔丁醇酯，溶解在100毫升无水二氯甲烷中，加入1.15克二环己基碳二亚胺和1克二甲基氨基吡啶，室温下搅拌过夜。过滤除去反应产生的固体，减压浓缩溶液，加入100毫升异丙醇。过滤收集沉淀真空干燥，产率：9.6克(96％)。

9克聚乙二醇氨基N-叔丁氧羰基谷氨酸叔丁醇酯(分子量为5000，由上步制得)溶解在30毫升氯仿中，添加30毫升三氟乙酸，室温下搅拌5小时。减压浓缩溶液，加入100毫升异丙醇。过滤收集沉淀真空干燥，产率：8.1克(90％)。

8克聚乙二醇氨基谷氨酸(分子量为5000，由上步制得)，溶解在100毫升甲苯中，加热蒸出70毫升，溶液冷却到35℃加入30毫升无水四氢呋喃，再加入1克固体三光气，60℃下搅拌过夜。减压浓缩溶液，加入100毫升乙醚。过滤收集沉淀，乙醚洗涤真空干燥，产率：7.0克(88％)。

                            实施例2

        甲氧基聚乙二醇酰胺基谷氨酸N-环内酸酐(2)的制备

20克甲氧基聚乙二醇胺(CH₃O-PEG-OCH₂CH₂-NH₂，分子量为10000)和0.8克N-叔丁氧羰基谷氨酸叔丁醇酯，溶解在100毫升无水二氯甲烷中，加入0.6克二环己基碳二亚胺和0.5克二甲基氨基吡啶，室温下搅拌过夜过滤除去反应产生的固体，减压浓缩溶液，加入100毫升异丙醇。过滤收集沉淀真空干燥，产率：19克(95％)。

18克甲氧基聚乙二醇氨基N-叔丁氧羰基谷氨酸叔丁醇酯(分子量为10000，由上步制得)溶解在40毫升氯仿中，添加30毫升三氟乙酸，室温搅拌5小时。减压浓缩溶液，加入100毫升异丙醇。过滤收集沉淀真空干燥，产率：16.5克(91％)。

15克甲氧基聚乙二醇氨基谷氨酸(分子量为5000，由上步制得)，溶解在100毫升甲苯中，加热蒸出70毫升，溶液冷却到35℃加入30毫升无水四氢呋喃，再加入0.45克固体三光气，60℃下搅拌过夜。减压浓缩溶液，加入100毫升乙醚。过滤收集沉淀，乙醚洗涤真空干燥，产率：13.5克(90％)。

                            实施例3

            聚乙二醇酯基谷氨酸N-环内酸酐(3)的制备

10克聚乙二醇(HO-PEG-OH，分子量为5000)和.1.5克N-叔丁氧羰基谷氨酸叔丁醇酯，溶解在100毫升无水二氯甲烷中，加入1.15克二环己基碳二亚胺和1克二甲基氨基吡啶，室温下搅拌过夜，过滤除去反应产生的固体，减压浓缩溶液，加入100毫升异丙醇。过滤收集沉淀真空干燥，产率：9克(90％)。

8克N-叔丁氧羰基-r-叔丁醇酯谷氨酸聚乙二醇酯(分子量为5000，由上步制得)溶解在30毫升氯仿中，添加30毫升三氟乙酸，室温搅拌5小时。减压浓缩溶液，加入100毫升异丙醇。过滤收集沉淀真空干燥，产率：7.5克(92％)。

7克谷氨酸聚乙二醇酯(分子量为5000，由上步制得)，溶解在100毫升甲苯中，加热蒸出70毫升，溶液冷却到35℃加入30毫升无水四氢呋喃，再加入0.5克固体三光气，60℃下搅拌过夜。减压浓缩溶液，加入100毫升乙醚。过滤收集沉淀，乙醚洗涤真空干燥，产率：6克(87％)。

                             实施例4

             聚乙二醇酰基赖氨酸N-环内酸酐(4)的制备

10克聚乙二醇乙酸N-羟基丁二酰亚胺酯(NHS-OC-CH₂O-PEG-OCH₂CO-NHS，分子量为5000)和1.2克N-叔丁氧羰基赖氨酸叔丁醇酯，溶解在100毫升无水二氯甲烷中，加入1毫升三乙胺，室温下搅拌过夜，过滤除去反应产生的固体，减压浓缩溶液，加入100毫升异丙醇。过滤收集沉淀真空干燥，产率：9.6克(96％)。

8克聚乙二醇乙酸N-叔丁氧羰基赖氨酸酰胺(分子量为5000，由上步制得)溶解在30毫升氯仿中，添加15毫升三氟乙酸，室温搅拌5小时。减压浓缩溶液，加入100毫升异丙醇。过滤收集沉淀真空干燥，产率：8.5克(95％)。

8克聚乙二醇乙酸赖氨酸酰胺(分子量为5000，由上步制得)(分子量为5000，由上步制得)，溶解在100毫升甲苯中，加热蒸出70毫升，溶液冷却到35℃加入30毫升无水四氢呋喃，再加入0.5克固体三光气，60℃下搅拌过夜。减压浓缩溶液，加入100毫升乙醚。过滤收集沉淀，乙醚洗涤真空干燥，产率：7.2克(90％)。

                             实施例5

          甲氧基聚乙二醇酰基赖氨酸N-环内酸酐(5)的制备

40克甲氧基聚乙二醇乙酸N-羟基丁二酰亚胺酯(CH₃O-PEG-OCH₂CO-NHS，分子量为10000)和1.2克N-叔丁氧羰基赖氨酸叔丁醇酯，溶解在150毫升无水二氯甲烷中，加入1毫升三乙胺，室温下搅拌过夜，过滤除去反应产生的固体，减压浓缩溶液，加入200毫升异丙醇。过滤收集沉淀真空干燥，产率：38克(95％)。

35克甲氧基聚乙二醇乙酸N-叔丁氧羰基赖氨酸酰胺(分子量为10000，由上步制得)溶解在80毫升氯仿中，添加40毫升三氟乙酸，室温搅拌5小时。减压浓缩溶液，加入100毫升异丙醇。过滤收集沉淀真空干燥，产率：33克(95％)。

20克甲氧基聚乙二醇乙酸赖氨酸酰胺(分子量为10000，由上步制得)，溶解在150毫升甲苯中，加热蒸出110毫升，溶液冷却到35℃加入40毫升无水四氢呋喃，再加入0.6克固体三光气，60℃下搅拌过夜。减压浓缩溶液，加入150毫升乙醚。过滤收集沉淀，乙醚洗涤真空干燥，产率：18克(90％)。

                             实施例6

      甲氧基聚乙二醇酰基赖氨酸N-环内酸酐(5)和IL-2的键合物

10毫克甲氧基聚乙二醇酰基赖氨酸N-环内酸酐(分子量为10000，由实施例5制备)，溶解在1毫升(pH＝7)的PBS缓冲盐溶液中，其中含有1毫克/毫升IL-2。在室温缓慢震摇6小时。加入0.2毫升的Tris碱缓冲溶液(pH 7.0，0.1M)，通过sepherose凝胶离子交换树脂纯化，收集单取代、双取代的成分。最终产物用SDS-PAGE显示其中没有游离的α-干扰素，GPC显示没有游离的PEG分子。

                           实施例7

             通过调节pH值由N-环内酸酐聚合制备凝胶

200毫克聚乙二醇酯基氨基酸N-环内酸酐(分子量为5000，由实施例1，3和4制备)，溶解在1毫升的乙酸盐缓冲溶液(10mM，pH 5.0)中，加入0.5毫升磷酸盐缓冲溶液(0.2M，pH 7.4)，溶液轻轻震摇直至形成凝胶。

                           实施例8

             由N-环内酸酐和聚乙二醇胺共聚制备凝胶

200毫克聚乙二醇酯基氨基酸N-环内酸酐(分子量为5000，由实施例1，3和4制备)，溶解在1毫升的乙酸盐缓冲溶液(10mM，pH 5.0)中，加入1毫升磷酸盐缓冲溶液(0.2M，pH 7.4)，其中含50毫克聚乙二醇胺，溶液轻轻震摇直至形成凝胶。

                           实施例9

               由N-环内酸酐和小分子胺共聚制备凝胶

200毫克聚乙二醇酯基氨基酸N-环内酸酐(分子量为5000，由实施例1，3和4制备)，溶解在1毫升(10mM，pH 5.0)的乙酸盐缓冲溶液中，加入1毫升磷酸盐缓冲溶液(0.2M，pH 7.4)，其中含5毫克赖氨酸，溶液轻轻震摇直至形成凝胶。