1H－吲哚－2，3－二酮及其衍生物在制备治疗贫血的药物中的用途以及治疗贫血的药物

摘要

本发明公开了1H－吲哚－2，3－二酮和/或其衍生物在制备治疗贫血的药物中的用途以及含有1H－吲哚－2，3－二酮和/或其衍生物的药物。本发明的药物可以制成口服剂，便于给药。

说明书

技术领域

本发明涉及1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物在制备治疗贫血的药物中的用途。

本发明还涉及一种治疗贫血的、含有1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物的药物。

背景技术

胚胎的肝脏和成人的骨髓是生产红细胞的主要器官，而红细胞的产生受促红细胞生成素(EPO)的影响。没有EPO，就没有红细胞的生成。EPO与造血干细胞膜表面的受体结合，使受体双体化，激活细胞内信息传导通道，导致红细胞生命延长，分化加速。EPO是一种糖蛋白；在人体内，几乎90％的EPO是由肾脏产生的，其余的部份产生于肝脏。肾小管细胞对体内氧的含量十分敏感，体内含氧量的降低，可通过肾小管细胞把信号传导给分泌EPO的肾脏细胞，增加EPO的合成与分泌，进而引起骨髓造血的增加。这个反遗调节环路，保持体内红细胞量的稳定与平衡，确保血液带氧功能的完善。

当EPO与其受体结合后，最先被激活是EPO受体的磷酸化。磷酸化的EPO受体吸引其他信息传导蛋白(如STAT5、P13 P85和SHP.1)与其符合，激活一系列的信号传递和细胞生物变化。

造血干细胞的生存及凋亡的平衡对体内红细胞数量的稳定至关重要。没有象EPO这样的生长因子的支持，红细胞的凋亡就会加速。许多蛋白参与红细胞凋亡过程的调节，其中包括Bcl-2家族的一些主要蛋白。

EPO基因位于第7对染色体上。肾脏是体内主要合成EPO的器官。肾衰竭的病人，由于缺乏足够量的EPO，常会发生贫血，需要补充外源性的EPO。接受骨髓抑制治疗的肿瘤病人或者艾滋病人都会有贫血，需要EPO的治疗。

根据对EPO基因的了解，Amgen公司利用基因技术，人工合成Epoetin alfa蛋白，并于1983年在美国获FDA批准上市。Epoafinalfa可促激红细胞生成，其效果与其剂量成正比。在治疗初期每周可以提高红细胞2％。

虽然Epoetin alfa是一种非常有效的治疗贫血的药物，但其价格昂贵，使用不方便。Epoetin alfa作为一个蛋白试剂必须经皮下和静脉注射给药。为了防止粘附在输液管上，Epoetin alfa给药时，静脉皮管中必须有血。注射药物之后，管子还应该用生理水冲洗。Epoetin alfa的存放也不放便，必须放在2-8度的冰箱里，但不能冰冻；其在冰箱中储存时间约为20天。

由于EPO是蛋白试剂，口服会造成蛋白质被胃肠道的酶所水解，因而必须经皮下或静脉注射给药，同时蛋白质容易变性，容易滋生细菌，不易贮存。

为了发展新一代的促红细胞生成素，研究人员做了大量的工作，并取得可喜的进展。其中，最引人注目的是小分子药物的开发，这些小分子具有EPO类似的药理作用。在某些研究人员在筛选了许多克隆后，最近发展出一种小分子的多肽，这种多肽分子与EPO蛋白结构上并没有关连。但是这种多肽与EPO受体的结合相对较弱，作用也比较差。同时作为一种多肽，很难将其制成口服药品。因此，研制一种能口服的小分子化合物是研究治疗贫血药物的发展方向。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以用于制备治疗贫血的小分子药物，该药物可以制成多种剂型，尤其是可以制成口服药品，以方便给药。

本发明的发明人经过了对上千个化合物的筛选，最后得到了少数几个具有刺激红细胞生成的药理作用的化合物，它们是1H-吲哚-2，3-二酮(或叫靛红)和/或其衍生物。其中，1H-吲哚-2，3-二酮(其英文名称是Isatin或1H-Indole-2，3-dione或2，3-Indolinedione或Indole-2，3-dione)的分子式为C₈H₅NO₂，其化学结构：

1H-吲哚-2，3-二酮的分子量为147.133，融化温度为203℃，水溶性为1.53E+004。

本发明中，1H-吲哚-2，3-二酮的衍生物优选采用一种或几种具有如下结构式的化合物：

与EPO蛋白试剂相比，1H-吲哚-2，3-二酮及其衍生物具有分子量小、耐酸、耐碱、可制成口服制剂、成本低、便于使用和贮存的优点。

本发明中，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物的治疗贫血作用是指1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物的红细胞生成促激作用。我们通过快速筛选方法(RAA法)对化合物进行筛选，从而得到了具有红细胞生成促激作用的化合物1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物，并通过RAA法、MTT法、CALCEIN法、DNA降解方法和活细胞计数法(trypan兰染色法)对1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物的红细胞生成的促激作用进行了检验。实验证明：(1)1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物具有与EPO相同的刺激红细胞生成的作用，这种作用是通过抑制UT7/EPO细胞的凋亡而实现的；(2)1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物同EPO有很强的协同作用，当1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物与EPO同时使用时，即使EPO的用量大大减少，仍可以达到同样的效果；(3)1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物促进红细胞生成的作用是专一的，它对其它类的细胞的生长和增殖没有明显的不利影响。

由于1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物是小分子的化合物，因而在本发明中，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物可以制成口服液、片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、注射用无菌粉末、喷雾剂、栓剂或其它任何方便的制剂形式。

优选地，可以将1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物制成口服液、片剂、胶囊剂、颗粒剂等口服制剂。

更优选地，可以将1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物制成口服液。

将1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物制成口服制剂的原因在于：口服制剂具有使用方便、安全、有效、适宜常温下长期贮存的优点。而口服液是各种口服制剂中最容易被机体吸收利用的，不像片剂等口服剂型，受崩解度和溶出度的限制。作为一种小分子的化合物，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物具有优良的耐酸耐碱性质，不易受胃肠道PH值条件的影响。因此，1H-引哚-2，3-二酮和/或其衍生物可以制成口服制剂。此外，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物的水溶性为1.53E+004，具有良好的水溶性，口服后可以迅速被机体所吸收利用，可以制成口服液。

本发明的口服液中，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物可以溶于蒸馏水、去离子水和/或生理盐水中，或者制成其乳化液。该口服液中还可以含矫味剂、抗氧剂和/或抑菌剂。如果口服液配方中含有易氧化的成份，优选加入抗氧剂。其中，抗氧剂可以选自亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、硫脲和维生素C中的一种或几种；矫味剂可以是蔗糖、蜜糖、山梨醇、甘露醇等甜味剂，也可以是薄荷挥发油等芳香剂；抑菌剂可以是尼泊金类、苯甲酸、山梨酸等。在使用尼泊金类时，尼泊金乙酯与尼泊金丙酯或丁酯合用效果较好，其比例和用量优选为：乙丙混合物(1∶1)或乙丁混合物(1∶1)，其用量优选为0.01％-0.25％。

本发明口服液中还可以含有着色剂等其他药用物质。加入着色剂的目的是为了改变口服液的颜色，使病人乐于接受。所加入的着色剂必须是可作内服制剂的着色剂，可以是天然色素和/或合成色素。

本发明中1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物的各种剂型的配方中除了含有1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物外，还可以加入对治疗贫血起辅助作用的药用动植物成分，组成复方制剂。这些药用动植物成分可以是阿胶、红枣、大枣、党参、当归、人参、白术、白芍、熟地黄、何首乌、紫河车、茯苓、黄芪、鹿角胶、龟板胶、半夏、枸杞子、炙鸡内金、六曲、木香、砂仁、白术、陈皮、炒枣仁、炙甘草、甘草、附子、大腹皮、厚朴、补骨脂、菟丝子、肉桂中的一种或几种。优选为加入阿胶、红枣、当归、党参、熟地黄、黄芪、白术、枸杞子中的一种或几种，或者是其中一种或几种成分的提取物。其中，阿胶具有补血滋阴、润燥、止血的功效，其药理作用优于铁剂，是最常用的补血药物之一。

在既含1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物又含药用动植物成分的剂型中优选为口服液。原因是药用动植物的成分复杂，注射易产生不良反应。因此通常不宜制成注射液，而制成口服剂型。在各种口服剂型中，将1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物和药用动植物成分制成复方口服液，更有利于药物的吸收利用。

本发明中，制备1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物的口服液的方法主要包括以下的步骤：药物的称量、溶解和过滤。配方中的附加剂或溶解度小的药物，应事先将其溶解于溶剂中，再加入其它药物使之溶解。如果在制剂中加入了溶解缓慢的药物，则在溶解前需要采取粉碎、搅拌、加热等措施。制备的溶液应过滤，并通过滤器加溶剂至全量，过滤可用普通滤器、垂熔玻璃滤器以及沙滤棒等。

对于含药用动植物成分的复方口服液的制备，优选先对药用动植物成分进行提取和过滤。提取的方法有水提醇沉法、乙醇提水沉法、煎煮法、浸渍法与渗漉法等。过滤常需加入助滤剂，常用的助滤剂有滑石粉、纸浆、活性炭。滤器有垂熔玻璃滤器和沙滤棒等。

与Epoetin alfa相比，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物更容易被病人接受。1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物作为一种口服药，治疗过程简单，特别是对轻型的贫血病人更易被接受。因而，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物在植被治疗贫血药物方面，具有非常具大的潜在市场。1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物作为EPO的协同剂，也具有潜在市场，特别对一些严重贫血反复使用Epoetin alfa或者反复输血的贫血病人，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物可以帮助病人维持一定的红细胞水平，减少Epoetin用量或输血量。

本发明的1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物将是第一个用于治疗贫血的口服药物。目前，所有接受EPO注射治疗的贫血病人基本上都可以使用口服1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物。另外许多轻度贫血的病人并不需要EPO注射治疗，可使用口服1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物。由于这些病人体内有内源性的EPO激素，而1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物与EPO之间的有协同作用，他们只要口服1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物，就能保持正常的红细胞数量。

适用于1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物治疗的病人有如下几种：

a.慢性肾功能衰竭的贫血病人

美国有100万慢性肾功能衰竭的病人，其中三分之一病人患有贫血。在没有Epoetin alfa以前，这些病人依赖输血。这些病人非常疲乏，虚弱，甚至影响到普通生活起居和正常脑思维。随着时间的推移，病人也会出现心血管病状。然而1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物作为一种口服的促红细胞生成素进入市场，将对这些贫血病人的治疗产生第二次革命性的变化，给他们带来福音，改善他们的生活质量。

b.接受化疗的肿瘤病人

在美国每年有超过100万肿瘤病人，而世界上每年有800万人被诊断为肿瘤病人。不管是化疗或者放疗，许多肿瘤病人都会因疾病本身或是治疗的副作用而贫血。现在大多数病人都接受Epoetin alfa治疗贫血。一旦1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物进入市场，作为一种口服药物，更方便于病人，而且对Epoetin有很强的协同作用。

c.艾滋病的病人(AIDS)

艾滋病人也会出现贫血。抗病毒药物也会导致贫血，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物将会帮助这类病人改善贫血症状。

d.由其他原因造成的贫血。

以下结合实施例，来进一步说明本发明，但本发明并不局限于这些实施例，任何在本发明基本精神上的改进或替代，仍属于本发明权利要求书中所要求的保护范围。

附图说明

图1显示了EPO对UT7/EPO细胞凋亡的抑制，图中：A为RAA法测量细胞凋亡；B为DNA降解法测量细胞凋亡。

图2显示了1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物对UT7/EPO细胞凋亡的抑制，图中：A为RAA法；B为Calcein法。

图3显示了1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物与EPO对UT7/EPO细胞凋亡抑制的协同作用，图中：A为RAA法；B为Calcein法。

图4显示了EA-4和EA-5对MO7细胞的凋亡的抑制作用。

图5显示了1H-吲哚-2，3-二酮衍生物4(EA-4)与EPO对JAK2磷酸化的影响，图中：A为EA-4引起与JAK2有关的EPO受体的磷酸化；B为EA-4引起与JAK2有关的EPO受体的磷酸化发生在5分钟以后。

图6显示了1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物与EPO对EPO受体与STAT5磷酸化的影响。

图7显示了EA-5与EPO对Caspase蛋白表达的影响(Westernblot)。

图8显示了1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物与EPO对BCL-2家族蛋白表达的影响(Western blot)。

具体实施方式

       实施例1  1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物

                对红细胞生成的促激作用

为了能够在短期时间内筛选上千个化合物，必须拥有一种快速筛选的实验方法(RAA法)。由于没有现存的酶学法或化学方法可借使用，因此我们采用了生物方法。选用UT7/EPO细胞。UT7/EPO细胞起源于UT7细胞，细胞内表达EPO受体。其生存与生长必须依赖外源性的EPO支持。如果没有EPO支持，UT7/EPO细胞就会死亡，细胞的凋亡就会增加(见图1)。利用UT7/EPO细胞的这一特点，我们发展出一种快速测定细胞凋亡的方法(RAA)。如果筛选的化合物具有红细胞生成的促激作用，UT7/EPO细胞的凋亡率就会减少。

试验中，我们采用了如下方法来检验1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物红对细胞生成的促激作用：

A、RAA：一种本发明开发的测量细胞调亡的新方法

B、MTT：一种常用的测量细胞生存和增生的方法

C、CALCEIN检测法：用来检测细胞生长

D、DNA降解方法(DNA Ladder Assay)：用来测试细胞调亡

E、活细胞计数法(trypan兰染色法)：用来测量细胞增生。

试验显示：

(1)增高1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物的浓度，可以逐步提高对UT7/EPO细胞凋亡的抑制作用(见图2中A和B)；

(2)如果1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物与EPO合用，只需要较低的EPO浓度就能取得高浓度EPO的效果(见图3)，显示EPO与1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物对红细胞生成的刺激作用具有协同作用。

上述实验说明，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物具有刺激UT7/EPO细胞增长的生物活性。1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物的作用的似乎比EPO弱。其IC50各个1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物化合物不同。药效最强的1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物，IC50在10uM左右。1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物与EPO对刺激EPO受体具有协同作用。

实验还证明，采用低浓度的1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物同EPO一起来诱导红细胞生成，可达高浓度EPO同样的刺激作用。绝大多数贫血病人，体内仍有EPO，仅仅口服1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物，就足够诱导病人红细胞生成，改善贫血。对那严重缺乏EPO而贫血的病人，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物可提高促红细胞生成素的作用，减少Epoetin的用量。更重要的是，大多数的贫血病人也许仅需用口服1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物即可维持体内红细胞的水平，而减少对输血或注射Epoetin的需求。

         实施例2  1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物

                  刺激红细胞生成的特异性研究

试验表明，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物只对UT7/EPO细胞的调亡具有抑制作用(见表1)，而对以下的其它细胞的凋亡没有抑制作用(见图4)：

A、由melphalan引起RPMI 8266细胞的凋亡；

B、由melphalan引起新鲜分离的外周单核细胞的凋亡；

C、由GM-CSF撕离后引起的MO7细胞的凋亡。

因此，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物对EPO受体的作用是十分特异的，它对其他类细胞的生长和增殖没有任何影响。它只是对EPO受体起作用，促使细胞生长。它对其它cytokine和生长因子的受体无效。在这一点上，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物的生物作用与EPO很像。

表1：1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物(EA)对EPO撤除后引起的UT7/EPO细胞凋亡和GM-CSF撤除引起的MO7E细胞凋亡的作用的比较：

                                                GM-CSF-撤除后

                           EPO-撤除后

EA处                                            MO7E细胞

                           UT7/EPO细胞

RAA                        ↓                   -

MTT                        ↑                   -

Calcein                    ↑                   N.D.

DNA降解法                  ↓                   N.D.

活细胞数量

(trypan blue stainiag)     ↑                   -

           实施例3  1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物

                    刺激红细胞生成机理的研究

为了进一步探索1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物促进红细胞生成的作用机理，我们从以下几方面进行了研究：

(1)如前所述，红细胞生成素(EPO)与EPO受体结合使受体磷酸化，从而激活红细胞生成途径。1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物对UT7/EPO细胞的调亡有抑制作用。1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物促进红细胞生成可能是通过激活EPO受体而取得的。随后，我们通过检测EPO受体磷酸化实验，证实1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物能增加EPO受体的磷酸化而激活EPO受体。该激活作用与JAK-2有关(见图5A和B)。然而，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物磷酸化EPO受体与EPO激活EPO受体有所不同。EPO能刺激游离的和结合的JAK-2磷酸化，而1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物只刺激结合的JAK-2磷酸化。从时间上分析，二者也有所不同。EPO诱导EPO受体磷酸化起始于第1分钟、5分钟达到高峰，60分钟即消失。而1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物诱导EPO受体磷酸化的作用开始比较慢，但持续时间长，维持1小时以上(见图5B)。值得注意的是，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物具有增加EPO的磷酸化作用(图5B)，这一协同作用提示，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物作用于EPO受体可能有另外途径。

(2)由于1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物延长了EPO受体的磷酸化过程，有一种可能性是1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物具有降低或抑制磷酸酶的作用，但我们的实验提示，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物对磷酸酶没有任何作用。

(3)如前所述，由EPO诱导EPO受体磷酸化是通过JAK-2信号传递系统，启动STAT5信号，从而促使红细胞生成。细胞经过1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物诱导后，我们检测了STAT5磷酸化。结果完全出乎我们预料，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物并没有引起STAT5磷酸化发生改变(见图6)。从另一个角度考量，这一结果进一步提示，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物促进红细胞生成具有同EPO不一样的机理。

(4)最近研究提示，EPO诱导EPO受体，部分通过MAPK信号传递系统。可是，在我们的实验中，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物并不能激活MAPK信号传递系统。

(5)Caspase代表着导致细胞凋亡的最后一步。我们做了一系列Caspase2-8的表达试验，发现1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物并不能抑制Caspase的表达(见图7)。

(6)BCL2在细胞调亡过程中起了关键的作用。BCL-2根据其作用分为二类，一类为促进细胞凋亡，另一类则抑制细胞凋亡。为了进一步探讨1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物的作用机理，我们也检测了BCL2、BAX、BCLX1在UT7/EPO细胞内的表达。结果显示，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物对BCL都没有作用(图8)。

(7)为了深入研究1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物的红细胞生成的促激作用机理，我们检测了一些细胞生长有关的蛋白，我们发现1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物可以提高C1P29、SET、STATHMIN这类蛋白量的活性，但这些蛋白并不是EPO受体有关的专一蛋白。这一结果再次提示，1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物促进红细胞生成的机理可能与EPO不同。

实施例4  1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物口服液的制备

取处方总量3/4量的溶剂(如蒸馏水)，加入称好的1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物和蔗糖，搅拌使其溶解或乳化，加入尼泊金乙酯，搅拌使其溶解。然后用垂熔玻璃滤器过滤，并通过滤器加溶剂至全量。对滤液进行质量检查。最后，分装、密封、贴标签及进行外包装。

       实施例5  含1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物

                与药用动植物成分的复方口服液

取处方总量3/4量的溶剂，加入称好的1H-吲哚-2，3-二酮和/或其衍生物、阿胶、蜂蜜，搅拌使其溶解，加入苯甲酸搅拌使其溶解。然后用垂熔玻璃滤器过滤，并通过滤器加蒸馏水至全量。对滤液进行质量检查。最后，分装、密封、贴标签及进行外包装。