精子形态学快速染色试剂及快速染色精子的方法

摘要

本发明公开一种精子形态学快速染色试剂，包括溶液A，所述溶液A是含有尼罗蓝的组织固定液，用于染色精子顶体区。快速染色精子的方法，包括如下步骤：1)制备精子悬液涂片，晾干；2)再将溶液A覆盖所述精子悬液涂片，直至将所述精子悬液涂片中精子顶体区染色，所述溶液A是尼罗蓝含量为0.05~0.5％的组织固定液。由于上述技术方案，本发明突出的技术效果在于：配方简单，原料成本低且易得，操作快捷，整个染色过程一分钟即可完成，适于样本即时检测；染色鲜艳，精子各部分区分效果良好，易于临床的广泛应用；采用防腐剂，试剂稳定性更好，贮存期长，有效期长达二年。

说明书

技术领域

本发明涉及一种体外诊断试剂，具体适用于精子形态学快速染色。

背景技术

精子形态学检测对于评价男性生育能力、辅助生殖方法的选择起很重要的作用。

目前，精子形态学检测的方法主要有苏木素-伊红染色法、改良巴氏染色法和Diff-Quik法，苏木素-伊红染色法与改良巴氏染色法的精子染色鲜艳，各部分较易区分效果良好，但其配方组成复杂，操作时间长，难以在临床广泛推广；Diff-Quik法精子染色良好，操作简便快捷，但其原料昂贵且难以购买。

由于现有检测方法的限制，精子形态学检测难以作为常规项目开展。

发明内容

本发明意在克服现有技术的不足，提供一种临床操作简便、染色良好、成本低的精子形态学快速染色试剂及检测精子形态的方法。

实现上述目的的技术方案：

一种精子形态学快速染色试剂，包括溶液A，所述溶液A是含有尼罗蓝的组织固定液，用于染色精子顶体区。所述组织固定液中尼罗蓝的含量为0.05~0.5％。

进一步地，还包括溶液B，所述溶液B是含有焦宁Y或者曙红的磷酸盐缓冲液，用于染色精子体部及尾区。所述组织固定液中尼罗蓝的含量为0.05~0.5％，所述磷酸盐缓冲液中焦宁Y或者曙红的含量为0.01~0.05％。

还包括溶液C，所述溶液C是含有碱性美蓝、亚甲基蓝的磷酸盐缓冲液，用于染色精子顶体后区。所述组织固定液中尼罗蓝的含量为0.05~0.5％，所述磷酸盐缓冲液中焦宁Y或者曙红的含量为0.01~0.05％，所述磷酸盐缓冲液中碱性美蓝的含量为0.1~0.5％，亚甲基蓝的含量为0.1~0.5％。

所述磷酸盐缓冲液PH为7.0~8.0，其中磷酸盐的含量不大于0.5mol/L。

所述磷酸盐缓冲液还包括防腐剂，所述防腐剂的含量为0.1~0.2％。

一种快速染色精子的方法，包括如下步骤：1)制备精子悬液涂片，晾干；2)再将溶液A覆盖所述精子悬液涂片，直至将所述精子悬液涂片中精子顶体区染色，所述溶液A是尼罗蓝含量为0.05~0.5％的组织固定液。

进一步地，还包括如下步骤：再将溶液B覆盖所述精子悬液涂片，直至将所述精子悬液涂片中精子体部及尾区染色，所述溶液B是焦宁Y或者曙红的含量为0.01~0.05％的PH为7.0~8.0的磷酸盐缓冲液。

还包括如下步骤：再将溶液C覆盖所述精子悬液涂片，直至将所述精子悬液涂片中精子顶体后区染色，所述溶液C是碱性美蓝的含量为0.1~0.5％、亚甲基蓝的含量为0.1~0.5％的PH为7.0~8.0的磷酸盐缓冲液。

所述磷酸盐缓冲液还包括防腐剂，所述防腐剂的含量为0.1~0.2％。

由于上述技术方案，结合下面将要详述的实施例，本发明突出的技术效果在于：配方简单，原料成本低且易得，操作快捷，整个染色过程一分钟即可完成，适于样本即时检测；染色鲜艳，精子各部分区分效果良好，易于临床的广泛应用；采用防腐剂，试剂稳定性更好，贮存期长，有效期长达二年。

具体实施方式

实施例一，一种精子形态学快速染色试剂，包括溶液A、溶液B和溶液C，其中溶液A是含有尼罗蓝0.1％的丙酮、甲醇、40％甲醛的混合液，用于染色精子顶体区；溶液B是含有焦宁Y0.019％、叠氮钠0.1％、磷酸盐(PB)含量为0.4mol/L、PH为7.4的PB缓冲液，用于染色精子体部及尾区；溶液C是含有碱性美蓝0.1625％、亚甲基蓝0.1625％、叠氮钠0.1％、PB含量为0.4mol/L、PH为7.4的PB缓冲液，用于染色精子顶体后区。

上述精子形态学快速染色试剂的制备方法，包括如下步骤：

A、PB缓冲液的制作工艺方法

配制1000毫升0.2M磷酸二氢钾、1000毫升0.2M磷酸氢二钠，在pH计的监测下将上述二种溶液混合，调整pH至7.4。将上述pH 7.4的PB缓冲液1∶10稀释后加入0.1％叠氮钠。

B、溶液A的制作工艺方法

用量筒量取丙酮95ml、甲醇95ml、40％甲醛10ml，混匀。称取尼罗蓝0.2g，溶于上述溶液中，过滤后置室温保存。

C、溶液B的制作工艺方法

取焦宁Y 0.190g，加PB缓冲液至1000ml，充分溶解，过滤后置室温保存。

D、溶液C的制作工艺方法

称取碱性美蓝1.625g，亚甲基蓝(methylene blue)1.625g，加PB缓冲液至1000ml，充分溶解，过滤后置室温保存。

实施例二，一种精子形态学快速染色试剂，包括溶液A、溶液B和溶液C，其中溶液A是含有尼罗蓝0.05~0.5％的丙酮、甲醇、40％甲醛的混合液，用于染色精子顶体区；溶液B是含有焦宁Y0.01~0.05％、叠氮钠0.1~0.2％、PB含量为0.5mol/L、PH为7.4的PB缓冲液，用于染色精子体部及尾区；溶液C是含有碱性美蓝0.1~0.5％、亚甲基蓝0.1~0.5％、叠氮钠0.1~0.2％、PB含量为0.5mol/L、PH为7.4的PB缓冲液，用于染色精子顶体后区。

上述精子形态学快速染色试剂的制备方法，包括如下步骤：

A、PB缓冲液的制作工艺方法

配制1000毫升0.15~0.25M磷酸二氢钾、1000毫升0.15~0.25M磷酸氢二钠，在pH计的监测下将上述二种溶液混合，调整pH至7.4。将上述pH 7.4的PB缓冲液1∶10稀释后加入0.1~0.2％叠氮钠。

B、溶液A的制作工艺方法

用量筒量取丙酮95ml、甲醇95ml、40％甲醛10ml，混匀。称取尼罗蓝0.1~1.0g，溶于上述混合液中，过滤后置室温保存。

C、溶液B的制作工艺方法

取焦宁Y 0.1~0.5g，加PB缓冲液至1000ml，充分溶解，过滤后室温保存。

D、溶液C的制作工艺方法

称取碱性美蓝1~5g，亚甲基蓝1~5g，加PB缓冲液至1000ml，充分溶解，过滤后置室温保存。

以上实施例中，优选丙酮、甲醇、40％甲醛的混合液作为组织固定液，丙酮、甲醇、40％甲醛的混合液还可以用其他的组织固定液替换；优选叠氮钠为防腐剂，叠氮钠还可以用其他的防腐剂替换；PB缓冲液中防腐剂的含量为0.1~0.2％；PB缓冲液中尼罗蓝的含量为0.05~0.5％；焦宁Y还可以用曙红替换，PB缓冲液中焦宁Y或者曙红的含量为0.01~0.05％；PB缓冲液中碱性美蓝的含量为0.1~0.5％、亚甲基蓝的含量为0.1~0.5％；PB缓冲液的PH在7.0~8.0之间，PB的含量不大于0.5mol/L，当PB缓冲液的PH小于7.0或者PH大于8.0时，会造成染色偏淡，甚至于不上色的后果。

上述组织固定液、PB缓冲液中，尼罗蓝的浓度低于0.05％将会使精子顶体区着色偏浅，尼罗蓝的浓度高于0.5％将会使精子体部及尾区与精子顶体后区染色过深而掩盖了其他染料的着色；焦宁Y的浓度低于0.01％会使精子体部及尾区着色偏浅，焦宁Y的浓度高于0.05％会使精子顶体区与精子顶体后区染色过深而掩盖了其他染料的着色；碱性美蓝的浓度低于0.1％、亚甲基蓝的浓度低于0.1％会使精子顶体后区着色偏浅，碱性美蓝的浓度高于0.5％、亚甲基蓝的浓度高于0.5％会使精子顶体区与精子体部及尾区染色过深而掩盖了其他染料的着色。

实验例，快速染色精子的具体步骤如下：

一、样本制备

滴一小滴(5~10ul)新鲜液化精液于清洁载玻片上，用第二张载玻片的边缘在载玻片表面成夹角向前推动，制成适当厚度涂片。

二、染色步骤

1、精子悬液涂片制备完成后，水平放置，空气中自然干燥；

2、加A液覆盖涂片室温反应15秒，将玻片直立于吸水纸上以除去多余的染剂，用于精子悬液涂片中精子顶体区染色；

3、加B液覆盖涂片室温反应10秒，将玻片直立于吸水纸上以除去多余的染剂，用于精子悬液涂片中精子体部及尾区染色；

4、加C液覆盖涂片室温反应15秒，将玻片直立于吸水纸上以除去多余的染剂，用于精子悬液涂片中精子顶体后区染色；

5、在流水中浸洗10~15次以除去多余的染剂；

6、将玻片垂直竖立以去除水分，待完全干燥；

7、油镜下，以便观察精子形态。

步骤2中加A液覆盖涂片在室温下的反应时间为10~20秒，或者持续反应直至将精子悬液涂片中的精子顶体区染色；步骤2中加B液覆盖涂片在室温下的反应时间为5~15秒，或者持续反应直至将精子悬液涂片中的精子体部及尾区染色；步骤4中加C液覆盖涂片在室温下的反应时间为10~20秒，或者持续反应直至将精子悬液涂片中的精子顶体后区染色。

三、结果观察

精子顶体区染淡紫色，顶体后区染深紫色，精子体部及尾区染成淡红色。

四、多重精子缺陷指数的计算

计数方法：染色标本结果观察时，分别记录“正常”、“头部(精子顶体区)缺陷”、“中段(精子顶体后区)缺陷”和“尾部(精子体部及精子尾区)缺陷”精子数。如果一个精子同时有头、中段及尾部缺陷，应同时记录这三种缺陷，这三种缺陷分别记录在相应的分类中，而这个精子只作为一个细胞被计数。

根据以上统计数据，即可按照WHO推荐的方法对精子形态进行分析判断：

畸形精子指数(TZI)＝缺陷总数÷畸形精子数目

精子畸形指数(SDI)＝缺陷总数÷精子总数

五、正常参考值

正常精子形态＞30％；

TZI＞1.6表示未经治疗不育夫妇的低生育率；

SDI＞1.6是体外受精失败的阈值。

四、临床适用性

1、正常精子形态可作为评价男性生育能力指标。

2、TZI、SDI可作为辅助生殖方法选择的参考值。