具有多倍体减数分裂稳定性基因的多倍体水稻选育及鉴测方法

摘要

本发明提出一种解决多倍体水稻结实率低问题的具有多倍体减数分裂稳定性(Polyploid Meiosis Stability，PMeS)基因的多倍体水稻选育及鉴测方法。其选育过程为：a.选择亲本；b.杂交或复合杂交；c.挑选杂种连续回交；d.染色体加倍；e.多倍体鉴定；f.结实性选择；g.减数分裂行为观察；h.自交稳定成品系；i.高结实性杂交测定。鉴测指标为：a.亚洲栽培稻中的籼稻或粳稻的多倍体品系；b.具有≥65％的结实率；c.减数分裂行为正常。d.花粉形态和生理活性正常，经0.1％I－KI染色，正常可染花粉≥95％；e.以PMeS多倍体水稻与其它多倍体水稻品种杂交的后代结实率在70％以上，与A基因组野生稻杂种的多倍体后代结实率在65％以上。本发明解决了多倍体水稻结实率低的问题，可应用于多倍体水稻育种。

说明书

                        技术领域

本发明涉及一种具有多倍体减数分裂稳定性(Polyploid MeiosisStability，PMeS)基因的多倍体水稻选育及鉴测方法，属于多倍体水稻育种的

技术领域。

                        背景技术

自然界高等植物70％左右都是多倍体，主要粮棉油作物如小麦、棉花、油菜等也都是多倍体，它们经历了二倍体向多倍体进化的过程，而且随着倍性的增加，它们的产量都成倍增长。

但是自从1933年日本学者Nakamori发现多倍体水稻以来(Nakamori，E.Onthe occurrence of the tetraploid plant of rice Oryza sativa L.，Proc，Imp.Acad.9，340-341，1933)，世界上有许多科学家从事水稻多倍体研究，虽然已经发现多倍体水稻具有茎杆粗壮、籽粒变大的优点，然而多倍体水稻育种进展缓慢。其主要原因是多倍体水稻的结实率低，一般都低于50％，达不到应用于生产的水平(宋文昌，张玉华，水稻四倍化及其对农艺性状和营养成分的影响，作物学报，18(2)：137-144，1992)。中国专利(ZL00114471.5)发明人蔡得田、袁隆平、卢兴桂从进化育种学的角度出发，提出利用远缘杂交和多倍体双重优势选育超级稻，它包括三个阶段即亚种间、种间和基因组间杂种优势利用，三种技术即拉大亲缘关系距离、利用广亲和基因和Ph基因(Pairinghomoeologous，部分同源染色体配对)。提出了多倍体育种的新思路和技术，扩大了多倍体育种的应用范围，但与多倍体水稻高结实率相关的基因和品系尚未选育出来，多倍体水稻的结实率仍然不理想。

                        发明内容

本发明的目的是选育出多倍体减数分裂稳定性(PMeS)基因的多倍体水稻，用以解决多倍体水稻结实率低的问题，并使其形成的PMeS品系应用于多倍体水稻育种。

本发明的技术方案为：a.选择亲本，b.杂交或复合杂交，c.挑选杂种连续回交，d.染色体加倍，e.多倍体鉴定，f.结实性选择，g.减数分裂行为观察，h.自交稳定成品系，i.高结实性杂交测定。

本发明的具体过程为

a.选择亲本

选择亲本包括亚洲栽培稻的籼稻、粳稻品种，具备株型紧凑，穗大粒多，着粒密的特征，或带有广亲和基因和特殊性状的籼稻或粳稻品种。具体是选育Sg99012(PMeS-1)时的亲本为卷叶稻(籼型)，高粱稻(粳型)，GC574(粳型)；选育HN2026(PMeS-2)时的亲本为HT99104(光壳稻/粳稻F₈的粳型品系)，蜀恢362。

b.杂交或复合杂交

在Sg99012选育中，以卷叶稻×高粱稻得到F₁-a，卷叶稻×GC574得到F₁-b，然后将F₁-a和F₁-b进行复合杂交。可以籼稻为母本，以粳稻为父本，或者以粳稻为母本，以籼稻为父本配制成不同的籼粳亚种间杂种，然后，将两个不同的杂种F₁进行复合杂交；在HN2026选育中，以HT99104×蜀恢362得到F₁杂种。

c.挑选杂种连续回交

从杂交或复合杂交后代中挑选株型紧凑，穗大粒多，着粒密，具有30％以上结实率的水稻植株为亲本，以农艺性状良好的粳稻(向粳型方向培育品种)或籼稻(向籼型方向培育品种)为回交亲本进行3～5代回交，获得许多性状基本倾向回交亲本的粳型或籼型回交后代。

d.染色体加倍

用秋水仙素处理上一步得到的分蘖期的水稻苗；也可以用秋水仙素处理水稻幼穗组织培养形成的愈伤组织。

e.多倍体鉴定

从外部形态上观察鉴定，即多倍体表现出茎杆粗壮，叶片厚实，谷粒变大(比二倍体大1/3至一倍)，大多数谷粒有芒。检查它们的根尖染色体数目为2n＝4x＝48。

f.结实性选择

按育种学的考种方法对多倍体水稻植株进行考种，选择等于和高于65％的多倍体水稻植株。

g.减数分裂行为观察

对其细胞遗传学特征减数分裂行为观察。在减数分裂时期，对确定为多倍体，且结实率≥65％的多倍体水稻植株的花粉母细胞减数分裂行为进行观察，将那些减数分裂正常即前期I以二价体配对为主，有3～6个四价体，而没有或低于1.0％的单价体或高价体，中期I无落后染色体，后期I无染色体桥、无落后染色体，末期I无微核出现，减数分裂II正常，进而形成正常四分体，经0.1％I-KI染色，正常可染花粉≥95％的多倍体水稻单株挑选出来。

h.自交稳定成品系

将g过程中挑选的多倍体水稻单株自交，使其稳定成株系，由株系繁殖成表现整齐一致的PMeS品系。

i.高结实性杂交测定

以h过程中的PMeS稳定品系与多倍体籼稻、粳稻品种杂交，得到F₁杂种，即得到具有多倍体减数分裂稳定性(PMeS)基因的多倍体杂交水稻。考察F₁的结实率，一般结实率≥70％以上。

本发明确定多倍体减数分裂稳定性(PMeS)基因的多倍体水稻品系、品种及杂种的鉴测指标为：

a.本身是亚洲栽培稻(Oryza sativa)中的籼稻或粳稻的多倍体品系。

b.具有≥65％的结实率。

c.减数分裂行为正常。在前期I，染色体配对以二价体占优势，有3-6个四价体，但没有或仅有低于1.0％的单价体或高价体(四价体以上的配对染色体)；在中期I，后期I和末期I以及减数分裂II中没有或低于0.5％落后染色体或微核出现。

d.花粉形态和生理活性正常，经0.1％I-KI染色，正常可染花粉≥95％。

e.以PMeS多倍体水稻与其它多倍体水稻品种的多倍体后代结实率在70％以上，与A基因组野生稻杂种的多倍体后代结实率在65％以上。

本发明所产生的PMeS多倍体水稻具有以下积极效果：1、选育出一种本身具有较高结实率(≥65％)的多倍体水稻；2、利用PMeS多倍体水稻与其它多倍体水稻品种的多倍体后代结实率在70％以上，与A基因组野生稻物种杂交的后代结实率在65％以上，解决了长期未能解决的多倍体水稻结实率低的问题，使利用远缘杂交和多倍体双重优势选育超级稻成为可能；3、利用PMeS多倍体水稻与多倍体水稻不育系或多倍体水稻恢复系杂交，可以选育出具有PMeS品系高结实率特点的多倍体不育系和恢复系，为实现多倍体水稻杂种优势利用提供了条件。这样使水稻育种发生由二倍体水平向多倍体水平，品种间杂交向亚种间、种间甚至基因组间杂交的重大转变，可以充分利用远缘杂交和多倍体双重优势，有利于选育出大幅度增产(30％以上)的多倍体水稻品种或杂种。

                         具体实施方式

下面以实施例对本发明进一步说明。

实施例1：PMeS-1(Sg99012)的选育

a.选择亲本

以卷叶稻(籼型)，高粱稻(粳型)，GC574(粳型)为亲本，各选10株。

b.杂交和复合杂交

卷叶稻×高粱稻得到F₁-a，卷叶稻×GC574得到F₁-b，然后将F₁-a和F₁-b进行复合杂交。选出50粒杂种。

c.挑选杂种连续回交

挑选出倾粳型，株型紧凑，剑叶挺，穗子大，着粒密的杂种单株10株，作为母本用GC574回交得到BC₁F₁(47株)，从中挑选倾粳型，株型紧凑，剑叶挺，穗子大，着粒较密的杂种株(30株)与GC574回交得到BC₂F₁(15株)，连续回交3～4次得到BC₄F₁(选出20株)。

d.染色体加倍

用秋水仙素处理上一步得到的分蘖期的水稻苗。取带1-2个分蘖的BC₄F₁杂种秧苗(20株)，用刀片在基部横切一刀，深达基部的一半，然后将秧苗浸泡在0.2～0.3％秋水仙素水溶液中，在1500～2000LX光照、20～25℃条件下处理48～56h，待秧苗根尖出现肿大形状时，将秧苗取出，置于流水中冲洗4小时以上，然后将秧苗移栽在泥土钵中，于1500～2000LX光照、20℃条件下缓苗10～15天，待秧苗的叶腋中新生出分蘖，挑选那些呈现出叶片增厚、叶色变浓特征的秧苗，让其自然生长10～15天后，将它们转入到室外栽培，这些秧苗可能发育成多倍体水稻。

e.多倍体鉴定

从外部形态上观察鉴定，即多倍体表现出茎杆粗壮，叶片厚实，谷粒变大(比二倍体大1/3至一倍)，大多数谷粒有芒。检查它们的根尖染色体数目为2n＝4x＝48。

f.结实性选择

按育种学的考种方法对多倍体水稻植株进行考种，选择等于和高于65％的多倍体水稻植株。

g.对其细胞遗传学特征减数分裂行为观察

在减数分裂时期，对确定为多倍体，且结实率≥65％的多倍体水稻植株的花粉母细胞减数分裂行为进行观察，将那些减数分裂正常即前期I以二价体配对为主，有3～6个四价体，而没有或低于1.0％的单价体或高价体，中期I无落后染色体，后期I无染色体桥、无落后染色体，末期I无微核出现，减数分裂Ⅱ正常，进而形成正常四分体，经0.1％I-KI染色，正常可染花粉≥95％的多倍体水稻单株挑选出来(7株)。

h.自交稳定成品系

将g过程中挑选的多倍体水稻单株自交，使其稳定成株系，由株系繁殖成表现整齐一致的PMeS品系，定名为Sg99012。

i.高结实性杂交测定

用PMeS稳定品系Sg99012与多倍体Dure(籼)、PA64s(籼)品种杂交，得到F₁杂种PSR120(Dure/sg99012)、PSR012(PA64_s/Sg99012)，考察F₁的结实率分别为73.87％、78.82％，株系单株产量都超过100克。

实施例2：PMeS-2(HN2026)的选育

a.选择亲本

以HT99104(粳型)，蜀恢362(籼型)为亲本，各选10株。

b.杂交或复合杂交

HT99104×蜀恢362，获得12株F₁。

c.挑选杂种连续回交

基本与实施例1同，仅以HT99104为回交亲本不同，回交四次后得到BC₄F₁杂种15株。

d.染色体加倍

采用的是幼穗愈伤组织，在添加有500mg/l秋水仙素的N6液体培养基中诱导加倍，而后分化成多倍体水稻苗。

e、f、g过程与实施例1基本相同。

h.自交稳定成品系

将g过程中挑选的多倍体水稻单株自交，使其稳定成株系，由株系繁殖成表现整齐一致的PMeS品系，定名为HN2026。

i.高结实性杂交测定

用PMeS稳定品系HN2026与多倍体HT99128(籼)、PA64s(籼)、HT99133(籼)品种杂交，得到F₁杂种PSR026(PA64s/HN2026)、PSR073(HT99128/HN2026)、PSR183(HT99133/HN2026)，考察F₁的结实率分别为79.88％、77.78％、87.75％，株系单株产量都超过100克。