一种具有协同作用的治疗慢性粒细胞性白血病的组合药物

摘要

本发明涉及一种治疗慢性粒细胞性白血病(CML)的组合药物，该药物由As

说明书

技术领域

本发明涉及一种治疗癌症的药物，尤其涉及一种治疗慢性粒细胞性白血病的组合药物。

背景技术

慢性粒细胞性白血病(CML)的现有控制方法有：骨髓移植、羟脲(Hu)、α干扰素(IFN-α)、STI571等，国外实验中的新方法有阿糖胞苷(Ara-C)、IFN-α、As₂O₃等与STI571组合使用。其中同种异体骨髓移植是仅有的治愈CML的方法。Hu是核糖核苷酸还原酶抑制剂，口服制剂，可迅速诱导血液学缓解，费用低，毒性低。IFN-α一般认为具有抗细胞增殖作用，与羟脲比，它可提高患者存活率1-2年。STI571用于对IFN-α耐药的CML患者取得了良好效应。而Ara-C、IFN-α、As₂O₃等与STI571组合使用具有协同作用。

骨髓移植受患者年龄和供体来源的限制，Hu不能诱导细胞遗传学缓解，不能提高存活率。IFN-α长期使用不仅费用昂贵且副作用较大。STI571对静止期的BCR-ABL阳性细胞无作用，因而不能根除恶性克隆；费用太高；长期使用出现耐药。以上药物对加速期和急变期患者效果均不理想。IFN-α、Ara-C与STI571联合用药虽有协同作用，但血液学毒性比单用更大。与STI571组合的As₂O₃需每天静脉滴注1-4小时，使用不便。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有协同作用，可提高长期效果，克服耐药，延长生存期，降低费用，使用方便，易被接受的治疗CML的组合药物。

本发明治疗CML的组合药物由As₄S₄和STI571组成，且1-2μM As₄S₄：0.2-0.5μM STI571范围内，两药具有协同作用。

实验证明，通过使用本发明的组合药物，发挥两种药的协同作用，可以协同抑制CML细胞生长增殖，协同诱导CML细胞凋亡，协同抑制PTK活性。两药组合对正常对照的骨髓干细胞无明显毒副作用，并可大幅降低费用。

附图说明

图1单用不同剂量的As₄S₄或STI571对CML各期患者和非白血病对照作用的IC₅₀值的结果图。

图2为单用及合用AS₄S₄、STI571对CML各期患者和正常对照CD34⁺干细胞集落形成的抑制作用的结果图。

图3为As₄S₄联合STI571作用48小时诱导CML患者CD34⁺细胞凋亡的结果。

图4为一病例经0.2μM STI571、2μM As₄S₄单独及联合作用48小时线粒体跨膜电位的结果图。

图5为单用及合用AS₄S₄与STI571对CML CD34⁺细胞Caspase 3活性影响的结果图。

图6AS4S4与STI571合用降低CML粒红系急变细胞系K562的BCR-ABL蛋白含量结果图。

具体实施方式

CML发病的分子基础是BCR-ABL融合蛋白，As₄S₄可降低BCR-ABL的蛋白含量，相应地BCR-ABL的PTK活性也降低，而STI571主要通过选择性抑制BCR/ABL的PTK活性起作用，两药作用的靶点不同。本发明治疗慢性粒细胞性白血病的组合药物通过As₄S₄和STI571两药合用，可协同抑制CML细胞生长、增殖；协同促进CML细胞凋亡；协同促进BCR-ABL融合蛋白降解、抑制酪氨酸激酶(PTK)活性。根据实验结果，大多数患者在1-2μM As₄S₄和0.2-0.5μM STI571合用组范围内有协同作用，其中2μM As₄S₄和0.2μM STI571合用组效果最好。另外，两药组合对正常对照的骨髓干细胞无明显毒副作用，并可大幅降低费用。

为了找到本发明组合药物中两种药的协同范围，我们实验的步骤及结果如下：

采集CML患者和正常对照的骨髓单个核细胞，用免疫磁珠阳性筛选法分离出CD34⁺造血干细胞，通过分析生长曲线、造血干细胞集落形成试验观察As₄S₄、STI571单独及联合应用对CML CD34⁺细胞生长增殖的影响，计算单独应用As₄S₄或STI571抑制50％CD34⁺细胞存活的药物浓度(IC₅₀)，以及两者合用的协同指数(combination index，CI)。采用Chouand Talalay法分析剂量反应曲线，按照isobologram等式计算CI值：CI＝d1/D1+d2/D2。D1，D2代表单用药物1和2时产生x％效应时所需的药物剂量，d1，d2代表联合应用药物1和2时产生同等效应时的药物剂量。CI＞1表示拮抗，CI＝1表示相加，CI＜1表示协同。

通过测量单用不同剂量的As₄S₄或STI571对CML各期患者与非白血病对照作用的IC₅₀值，图1所示为单用不同剂量的AS₄S₄或STI571对CML慢性期(CP，均值±SD，n＝8)、进展期(AP，均值±SD，n＝7)患者和非白血病对照(均值±SD，n＝3)作用的IC₅₀值，横坐标表示药物作用的时间，纵坐标表示IC₅₀值。可以发现单用As₄S₄或STI571的IC₅₀值随着作用时间的延长迅速下降，对CML患者细胞的作用与非白血病对照的作用相比有显著性差异。

分离的CD34⁺细胞分别经不同浓度的As₄S₄(0、0.5、1、2μM，分别以A0、A0.5、A1、A2表示，下同)和STI571(0、0.1、0.2、0.5μM，分别以S0、S0.1、S0.2、S0.5表示，下同)，联合处理1-4天。合用不同剂量As₄S₄或STI571对CML CP期患者CD34⁺细胞的抑制作用见表1，As₄S₄联合STI571用药后1天，除0.5、1μM As₄S₄+0.1μM STI合用组、0.5μM As₄S₄+0.5μM STI合用组外，其余合用组均有协同或相加作用。联合用药后2天，除0.5、1μM As₄S₄+0.5μM STI合用组外，其余合用组均有协同或相加作用。用药后第3、4天，除0.5μM As₄S₄+0.5μM STI合用组外，其余合用组均有协同作用。合用不同剂量As₄S₄或STI571对CMLAP期患者CD34⁺细胞的抑制作用见表2，结果可见联合用药后4天内，除0.5μM As₄S₄+0.1μM STI合用组、0.5μM As₄S₄+0.5μM STI合用组(第3天)外，其余各合用组都有协同作用。而合用不同剂量As₄S₄或STI571对非白血病对照的CD34⁺细胞作用1-4天无明显抑制作用。

表1  AS₄S₄与STI571合用对CML-CP期患者CD34⁺细胞的抑制率(％，均值±SD，^*为CI＜1，Δ为CI＝1)

处理天数             S0.1(n＝3)        S0.2(n＝8)         S0.5(n＝4)

           A0.5      9.2±3.9          18.8±7.7Δ                  21.6±9.8

1          A1        16.6±6.5         24.6±10.2^*       27.2±10.9Δ

           A2        27.4±2.6^*       30.7±11.5^*       32.2±10.4^*

           A0.5      23.5±10.3Δ              27.6±13.9Δ                32.0±17.0

2          A1        33.4±9.8^*       34.8±16.1^*       35.2±16.5

           A2        47.2±11.7^*      43.6±15.9^*       43.6±13.2^*

           A0.5      31.1±14.6^*      37.2±16.1^*       41.9±13.1

3          A1        46.8±18.5^*      42.0±14.9^*       47.1±9.9^*

           A2        57.4±12.2^*      53.4±14.8^*       55.5±11.4^*

           A0.5      43.5±13.7^*      45.2±15.6^*       50.9±14.0

4          A1        57.5±15.5^*      53.1±16.2^*       57.5±17.9^*

           A2        65.0±9.0^*       64.0±13.0^*       64.4±15.8^*

表2  合用不同剂量AS₄S₄或STI571对CML进展期患者CD34⁺细胞的抑制率(％，均值±SD，^*为CI＜1，Δ为CI＝1，下同)

处理天数             S0.1(n＝4)        S0.2(n＝7)       S0.5(n＝7)       S1(n＝3)

           A.5       12.7±8.7         24.7±15.5^*     33.4±18.3^*     40.5±11.7^*

1          A1        23.8±11.8^*      29.1±14.2^*     37.6±17.3^*     47.1±11.2^*

           A2        29.5±10.4^*      33.9±11.7^*     43.9±12.1^*     54.5±5.1^*

           A.5       12.4±6.1         31.8±15.8^*     39.7±15.4^*     51.1±10.2^*

2          A1        26.6±6.2^*       37.4±15.8^*     46.6±14.5^*     55.5±12.9^*

           A2        36.5±4.5^*       45.1±11.6^*     52.3±10.9^*     61.3±10.8^*

           A.5       25.0±12.8        40.7±19.6^*     48.3±19.1        64.5±5.3^*

3          A1        40.9±9.5^*       52.9±15.9^*     61.9±14.3^*     71.8±9.1^*

           A2        53.6±4.9^*       61.3±14.1^*     67.6±12.3^*     77.6±12.6^*

           A.5       33.6±14.7        48.3±19.6^*     59.0±15.4^*     75.8±11.0^*

4          A1        48.6±13.3^*      60.1±13.1^*     68.5±14.1^*     81.5±9.9^*

           A2        59.8±8.3^*       69.4±10.6^*     73.4±11.5^*     85.2±10.3^*

图2所示为单用及合用STI571、As₄S₄对CML各期患者和正常对照CD34⁺干细胞集落形成的抑制率(％，均值±SD，CP期n＝12；AP期n＝8，非白血病对照n＝8)，横坐标表示STI571的药物浓度，纵坐标表示抑制率。可以发现As₄S₄和STI571合用对各期CML患者CD34⁺干细胞集落形成的抑制作用比两种药单用更强，对CP期患者可在0.5-2μM As₄S₄和0.1-0.5μM STI571合用范围内观察到协同作用；对AP期患者可在1-2μM As₄S₄和0.1-0.5μM STI571合用范围内观察到协同作用，0.5μM As₄S₄和0.1μM STI571合用组观察到相加作用。药物合用对CFU-total形成的抑制是慢性组高于进展组，各患者组高于对照组，0.5或2μM As₄S₄合并0.1μM STI571对CFU-total形成的抑制进展组差于慢性组，两者有显著性差异，而2μM As₄S₄合并0.2μM STI571对CFU-total形成的抑制，在进展组亦取得了与慢性组类似的结果。并且2μM As₄S₄合并0.2μM STI571组的效应比单用1μM STI571效果更强，而2μM As₄S₄合并0.2μM STI571组对非白血病对照的CD34⁺细胞无显著抑制作用。

用流式细胞仪检测单用及合用药后CML细胞的凋亡(Annexin V和PI双染法)、线粒体跨膜电位(Δψm)，并检测Caspase 3活性。结果分别如下：

请参阅图3，对于CML-CP期患者CD34⁺的细胞，0.2μM STI571和2μM As₄S₄联合使用的促凋亡作用与0.2μM STI571或2μM As₄S₄单独使用相比有显著性差异(P＜0.05，n＝8)；0.1μM STI571和2μM As₄S₄联合使用的促凋亡作用与0.1μM STI571或2μM As₄S₄单独使用相比有显著性差异(P＜0.05，n＝5)；0.2μM STI571和1μM As₄S₄联合使用的促凋亡作用与0.2μM STI571单用比无显著性差异(P＞0.05)，但与1μM As₄S₄单独使用相比有显著性差异(P＜0.05，n＝8)。对于CML进展期(AP)患者的CD34⁺细胞，0.2μM STI571和2μM As₄S₄联合使用的促凋亡作用与0.2μM STI571单用比有显著性差异(P＜0.01，n＝7)，与2μM As₄S₄单独使用相比有显著性差异(P＝0.01，n＝7)；0.1μM STI571和2μM As₄S₄联合使用的促凋亡作用与0.1μM STI571或2μM As₄S₄单独使用相比有显著性差异(P＜0.05，n＝4)；0.2μM STI571和1μM As₄S₄联合使用的促凋亡作用与0.2μM STI571或1μM As₄S₄单独使用相比有显著性差异(P＜0.05，n＝6)。慢性期与进展期患者的CD34⁺细胞对STI571及As₄S₄合用所诱导的凋亡率与对照组相比有显著性差异(P＜0.05)。

用亲脂阴离子染料Rh123和PI双染检测单个细胞可获得线粒体跨膜电位(ΔΨm)和细胞膜的完整性，前者由于线粒体摄取量与线粒体ΔΨm成正比，摄取量减少表示ΔΨm下降；PI不能通过完整的细胞膜，细胞发生凋亡早期细胞膜仍保持完整，PI不能进入细胞，反之，坏死细胞膜破坏早期即发生PI染色增加。请参阅图4，经STI571和As₄S₄合用48小时后出现了线粒体跨膜电位(ΔΨm)的下降。

通过检测As₄S₄与STI571作用后CML CD34⁺细胞Caspase 3活性的改变，请参阅图5，结果显示As₄S₄、STI571作用后2天，Caspase 3活性增加，随着剂量增加，其活性进一步增加。与单用相比，As₄S₄和STI571联合应用后，Caspase 3活性明显增加，与单用As₄S₄或STI571相比有显著性差异(P＜0.05，n＝3)。

通过检测As₄S₄与STI571对CML粒红系急变细胞系K562的作用发现合用可协同降低BCR-ABL的蛋白含量，请参阅图6，其中1、2、3、4分别为对照组Con，单独应用3μM As₄S₄，单独应用于0.3μM STI，应用本发明组合药物3μM As₄S₄+0.3μM STI时的结果，β-actin为内参。