具有长寿命M态的化学修饰野生型细菌视紫红质－聚乙烯醇薄膜的制备方法

摘要

本发明属于薄膜制备领域，特别涉及利用diaza－15－crown－5作为化学添加剂制备具有长寿命M态的BR

说明书

                         技术领域

本发明属于薄膜制备领域，特别涉及利用diaza-15-crown-5作为化学添加剂制备具有长寿命M态的野生型细菌视紫红质-聚乙烯醇(BR_WT-PVA)薄膜的方法。

                          背景技术

细菌视紫红质(bacteriorhodopsin，BR)是一种存在于嗜盐菌紫膜中的蛋白质，它具有光致变色的特性，这使得它在新型光学信息存储材料方面有很大的应用前景。选择合适的载体，制备分散均匀的BR光学薄膜，可以实现二维信息存储，但对薄膜的质量有很高的要求，主要指标包括薄膜的厚度、均匀性、光密度等，这是因为BR薄膜的质量将会直接影响所获信息的效果，如光散射、清晰度、分辨率等。除了BR原材料因素之外，其它条件如各种添加材料、膜保护材料及采用的制膜方式等都会对薄膜的质量产生很大的影响，如1.Wu，S.；Ellerby，L.M.；Cohan，J.S.et al.Bacteriorhodopsinencapsulated in transparent sol-gel glass-a new biomaterial，Chem.Mater.1993，5，115-120；2.Birge，R.R.；Gillespie，N.B.；Izaguirre，E.W.et al.Biomolecular Electronics：Protein-Based AssociativeProcessors and Volumetric Memories，J.Phys.Chem.B 1999，103，10746-10766；3.Hampp，N.Bacteriorhodopsin as a Photochromic RetinalProtein for Optical Memories，Chem.Rrev.2000，100，1755-1776.所报道的。

本发明人曾利用1，4，10-trioxa-7，13-diazacyclopentadecane(diaza-15-crown-5)等作为化学添加剂，将BR_WT中间态M态的寿命从10ms延长到568s，延长超过4个数量级，如Bing Liang，Baofang Li，Long Jiang，Study on Long Lifetime of M-state in Chemically ModifiedBacteriorhodopsin Film，Chem.Mater.2001，13，2746-2748所报道的，这从理论上极大的拓宽了BR材料的应用范围。

                         发明内容

本发明的目的是提供一种具有长寿命M态的化学修饰BR_WT-PVA薄膜的制备方法，利用PVA作为聚合物载体制备得到具有长寿命M态的化学修饰BR_WT薄膜，这种薄膜的表面平整、BR分散均匀，使它可以应用在空间光调制器、全息记录、模式识别和信息存储等领域，极大的拓宽了BR材料的应用范围。

本发明的技术方案是这样实现的：

选用分子量为22,000～26,000，醇解度为98％的分析纯聚乙烯醇(poly(vinyl alcohol)，PVA)作为载体，将它溶解在三羟甲基氨基甲烷(tris(hydroxylmethyl)-aminomethane，tris)缓冲液中，然后与BR_WT悬浮液以及diaza-15-crown-5溶液充分混合得到一混合悬浮液，在一定的温度和湿度条件下，将混合悬浮液在亲水性的石英片或K9玻璃片表面干燥成膜，得到了薄膜表面平整、BR分散均匀的化学修饰BR_WT-PVA薄膜。本发明主要包括，石英片表面的亲水化处理、PVA-tris溶液与BR_WT悬浮液和添加剂diaza-15-crown-5溶液的充分混合、混合悬浮液在适当温度和湿度条件下干燥成膜等几个步骤。

具体实施方法步骤为：

(1).基底石英片或K9玻璃片表面的亲水化处理

本发明人选用石英片或K9玻璃片作为基底制备BR_WT薄膜，使用的石英片或K9玻璃片标准为厚度1mm，直径20mm，表面精度λ/2，首先将其表面处理成亲水性，以使得薄膜可以更好的附着在其表面。处理过程如下a.将洗净的石英片或K9玻璃片放入饱和KOH的甲醇溶液中浸泡24小时；b.用二次水冲洗后，分别在丙酮、乙醇和二次水中各自超声清洗15～20分钟；c.处理好的石英片或K9玻璃片放入异丙醇中保存待用，此时的石英片或K9玻璃片表面呈亲水性。

(2).将PVA溶解于tris缓冲液中

选用分子量为22,000～26,000，醇解度为98％的分析纯聚乙烯醇(PVA)作为载体，将10～15g PVA浸泡于100ml浓度为50mmol/L的Tris缓冲溶液中溶胀24小时，然后加热至沸腾(回流)，直至所有的PVA溶解，溶液变为透明，得到PVA与tris缓冲液重量体积百分比浓度(W/V)10～15％的PVA-tris溶液，溶液的pH值为8.0。

(3).BR_WT分散、超声

野生型BR利用文献Oesterhelt D.；Stoeckenius W.，Meth.Enzymol1974，31，667所报道的方法制备，得到浓度范围在20～28mg/ml的BR_WT悬浮液，为了降低碎片的尺寸以减少测量时的光散射，悬浮液利用JY92-II型，宁波产超声波细胞粉碎机，采用Φ2探头超声破碎处理，超声功率300Hz，超声时间1s，间隔5s，超声30次，用冰水混合液冷却防止热量集中使BR蛋白变性，最终得到的碎片直径μ＜200nm；

(4).BR_WT+PVA-tris混合

分别取步骤(3)中所得到的BR_WT悬浮液0.1～0.15ml与步骤(2)中所得到的PVA-tris溶液0.15～0.25ml，搅拌混合均匀(利用旋涡混合器充分振荡混合均匀)。BR_WT悬浮液的用量决定了最终薄膜的光密度，尽量提高BR_WT悬浮液的浓度可以减少体积用量，PVA-tris与BR_WT悬浮液的体积比为3∶2～5∶3，过多的PVA用量会导致薄膜厚度增加，太少则不能均匀分散BR。

(5).加入化学添加剂diaza-15-crown-5

化学添加剂diaza-15-crown-5为分析纯，购自Acros公司，将其配成水溶液，浓度范围40～100mg/ml，在搅拌下(在旋涡混合器上振荡混合)向步骤(4)得到的混合液中逐滴加入diaza-15-crown-5溶液，这样可以避免局部添加剂过量，防止过量添加剂漂白BR蛋白，得到的BR_WT∶diaza-15-crown-5摩尔比为1∶100～1∶250(M态的寿命取决于添加剂diaza-15-crown-5的添加量，最大添加量为二者摩尔比为1∶250，具体添加量与M态寿命的关系如Bing Liang，Baofang Li，Long Jiang，Study on Long Lifetime of M-statein Chemically Modified Bacteriorhodopsin Film，Chem.Mater.2001，13，2746-2748的报道)。

(6).混合悬浮液超声、过滤

步骤(5)得到的混合悬浮液pH＝8.0～8.5，混合液利用JY92-II型，宁波产超声波细胞粉碎机，采用Φ2探头超声破碎混合处理，超声功率200Hz，超声时间1s，间隔10s，共超声20次，用冰水混合液冷却防止热量集中使BR蛋白变性，超声期间每超声破碎5次将装有混合液的离心管从冰水中取出，在室温条件下(20～25℃)放置1min，防止由于过冷而使PVA凝结，然后利用5μm的混合纤维素酯微孔滤膜过滤，去除混合液中残留的大颗粒和气泡。

(7).去除表层气泡

步骤(6)得到的过滤后的混合液在室温条件下(20～25℃)静置30min，使混合液中的气泡浮于表面，然后刮去表层的气泡。

(8).干燥成膜

在温度为2～4℃条件下，容积为5升的干燥器里面放入50～100ml饱和MgCl₂溶液和相对量为20～40g变色硅胶，使干燥器内的相对湿度保持在40～50％范围内，调节里面平板的水平，将亲水性的石英片或K9玻璃片放置在平板的表面，步骤(7)得到的混合液倒在石英片或K9玻璃片表面，自然铺展后，然后在温度为2～4℃，相对湿度40～50％条件下静置干燥24小时，最终得到表面平整、分散均匀的化学修饰BR_WT-PVA薄膜。

(9).测光密度及M态寿命

得到的薄膜具有较高光密度(见附图1)，M态的衰减时间超过40min(见附图2)，表观照片(见附图3)。

本发明中所述的石英片或K9玻璃片表面精度λ/2，λ为光的波长。

所述的用于溶解PVA的缓冲溶液是50mmol/L的tris溶液，其pH＝8.0。

所述的PVA-tris溶液的浓度为PVA与tris缓冲液重量/体积百分比(W/V)为10～15％。

所述的BR_WT悬浮液浓度范围20～28mg/ml，尽可能的增大其浓度，这样可以减少所用体积。

所述的PVA-tris与BR_WT悬浮液的体积比为3∶2～5∶3，过多的PVA用量会导致薄膜厚度增加，太少则不能均匀分散BR_WT。

所述的添加剂diaza-15-crown-5溶液浓度范围40～100mg/ml，具体浓度用量与所需达到的添加量以及最终需要达到的光密度有关。

所述的BR_WT+PVA-tris+diaza-15-crown-5混合悬浮液，其pH＝8.0～8.5。

所述的干燥器容积为5升，使用的干燥剂为50～100ml饱和MgCl₂溶液和相对量为20～40g变色硅胶的组合，使用温度为2～4℃。

所述的干燥条件为温度2～4℃，相对湿度40～50％，干燥时间24小时。

以(聚乙烯醇)PVA作为聚合物载体，薄膜的光密度对其应用也有很大的影响，较大的光密度有利于产生更高的光对比度等。本发明人对成膜的条件及过程进行了研究，得到了具有较高光密度，表面平整、BR分散均匀的化学修饰BR_WT-PVA薄膜。

本发明的最大特点是可以得到具有长寿命M态，较大光密度(≈1.0)，表面平整、分散均匀的化学修饰BR_WT-PVA薄膜，薄膜的光密度和厚度可以通过改变BR_WT悬浮液和PVA-tris溶液的用量来调节。

                      附图说明

图1.本发明实施例4化学修饰BR_WT-PVA薄膜的吸收光谱；

图2.本发明实施例4化学修饰BR_WT-PVA薄膜M态衰减过程；

图3.本发明实施例4薄膜照片。

                      具体实施方式

实施例1.

选用石英片作为基底制备BR薄膜，使用的石英片标准为厚度1mm，直径20mm，表面精度λ/2。a.将洗净的石英片放入饱和KOH的甲醇溶液中浸泡24小时；b.用二次水冲洗后，分别在丙酮、乙醇和二次水中各自超声清洗15～20分钟；c.处理好的石英片放入异丙醇中保存待用，此时的石英片表面呈亲水性。

将经超声破碎处理(μ＜200nm)、浓度为26mg/ml的BR_WT悬浮液0.15ml与0.25ml的PVA-tris溶液利用旋涡混合器充分混合均匀，tris缓冲液的浓度为50mmol/L，PVA-tris的重量体积百分比浓度为15％，PVA-tris与BR_WT悬浮液的体积比为5∶3；在旋涡混合器上一边振荡混合，一边向里面逐滴加入80mg/ml的diaza-15-crown-5溶液0.04ml，得到的BR_WT∶diaza-15-crown-5摩尔比为1∶150，得到的混合悬浮液pH为8.2左右，超声破碎混合处理，超声期间每超声破碎5次将装有混合液的离心管从冰水中取出，在室温条件下(20～25℃)放置1min，防止由于过冷而使PVA凝结，然后利用5μm的混合纤维素酯微孔滤膜过滤，去除混合液中残留的大颗粒和气泡，过滤后的混合液在室温条件下(20～25℃)静置30min，使混合液中的气泡浮于表面，然后刮去表层的气泡。在温度为2～4℃条件下，容积为5升的干燥器里面放入50～100ml饱和MgCl₂溶液和20～40g变色硅胶，将混合液倒在水平石英片表面，自然铺展后，保持温度在2～4℃，相对湿度40～50％条件下静置干燥24小时，最终得到表面平整、分散均匀的化学修饰BR_WT-PVA薄膜。得到的薄膜具有较高光密度(见附图1)，M态的衰减时间超过15min(见附图2)，表观照片(见附图3)。

实施例2.

选用石英片作为基底制备BR薄膜，使用的石英片标准为厚度1mm，直径20mm，表面精度λ/2。a.将洗净的石英片放入饱和KOH的甲醇溶液中浸泡24小时；b.用二次水冲洗后，分别在丙酮、乙醇和二次水中各自超声清洗15～20分钟；c.处理好的石英片放入异丙醇中保存待用，此时的石英片表面呈亲水性。

将经超声破碎处理(μ＜200nm)、浓度为28mg/ml的BR_WT悬浮液0.1ml与0.15ml的PVA-tris溶液利用旋涡混合器充分混合均匀，tris缓冲液的浓度为50mmol/L，PVA-tris的重量体积百分比浓度为10％，PVA-tris与BR_WT悬浮液的体积比为3∶2；在旋涡混合器上一边振荡混合，一边向里面逐滴加入40mg/ml的diaza-15-crown-5溶液0.06ml，得到的BR_WT∶diaza-15-crown-5摩尔比为1∶100，得到的混合悬浮液pH为8.0左右，超声破碎混合处理，超声期间每超声破碎5次将装有混合液的离心管从冰水中取出，在室温条件下(20～25℃)放置1min，防止由于过冷而使PVA凝结，然后利用5μm的混合纤维素酯微孔滤膜过滤，去除混合液中残留的大颗粒和气泡，过滤后的混合液在室温条件下(20～25℃)静置30min，使混合液中的气泡浮于表面，然后刮去表层的气泡。在温度2～4℃条件下，容积为5升的干燥器里面放入50～100ml饱和MgCl₂溶液和20～40g变色硅胶，将混合液倒在水平石英片表面，自然铺展后，保持温度在2～4℃，相对湿度40～50％条件下静置干燥24小时，最终得到表面平整、分散均匀的化学修饰BR_WT-PVA薄膜。

实施例3.

选用K9玻璃片作为基底制备BR薄膜，使用的K9玻璃片标准为厚度1mm，直径20mm，表面精度λ/2，a.将洗净的K9玻璃片放入饱和KOH的甲醇溶液中浸泡24小时；b.用二次水冲洗后，分别在丙酮、乙醇和二次水中各自超声清洗15～20分钟；c.处理好的K9玻璃片放入异丙醇中保存待用，此时的K9玻璃片表面呈亲水性。

将经超声破碎处理(μ＜200nm)、浓度为20mg/ml的BR_WT悬浮液0.15ml与0.25ml的PVA-tris溶液利用旋涡混合器充分混合均匀，tris缓冲液的浓度为50mmol/L，PVA-tris的重量体积百分比浓度为15％，PVA-tris与BR_WT悬浮液的体积比为5∶3；在旋涡混合器上一边振荡混合，一边向里面逐滴加入100mg/ml的diaza-15-crown-5溶液0.05ml，得到的BR_WT∶diaza-15-crown-5摩尔数之比为1∶200，得到的混合悬浮液pH为8.3左右，超声破碎混合处理，超声期间每超声破碎5次将装有混合液的离心管从冰水中取出，在室温条件下(20～25℃)放置1min，防止由于过冷而使PVA凝结，然后利用5μm的混合纤维素酯微孔滤膜过滤，去除混合液中残留的大颗粒和气泡，过滤后的混合液在室温条件下(20～25℃)静置30min，使混合液中的气泡浮于表面，然后刮去表层的气泡。在温度2～4℃条件下，容积为5升的干燥器里面放入50～100ml饱和MgCl₂溶液和20～40g变色硅胶，将混合液倒在K9玻璃片表面，自然铺展后，保持温度在2～4℃，相对湿度40～50％条件下静置干燥24小时，最终得到表面平整、分散均匀的化学修饰BR_WT-PVA薄膜。

实施例4.

选用K9玻璃片作为基底制备BR薄膜，使用的K9玻璃片标准为厚度1mm，直径20mm，表面精度λ/2，a.将洗净的K9玻璃片放入饱和KOH的甲醇溶液中浸泡24小时；b.用二次水冲洗后，分别在丙酮、乙醇和二次水中各自超声清洗15～20分钟；c.处理好的K9玻璃片放入异丙醇中保存待用，此时的K9玻璃片表面呈亲水性。

将经超声破碎处理(μ＜200nm)、浓度为26mg/ml的BR_WT悬浮液0.15ml与0.25ml的PVA-tris溶液利用旋涡混合器充分混合均匀，tris缓冲液的浓度为50 mmol/L，PVA-tris的重量体积百分比浓度为15％，PVA-tris与BR_WT悬浮液的体积比为5∶3；在旋涡混合器上一边振荡混合，一边向里面逐滴加入100mg/ml的diaza-15-crown-5溶液0.08ml，得到的BR_WT∶diaza-15-crown-5摩尔数之比为1∶250，得到的混合悬浮液pH为8.5左右，超声破碎混合处理，超声期间每超声破碎5次将装有混合液的离心管从冰水中取出，在室温条件下(20～25℃)放置1min，防止由于过冷而使PVA凝结，然后利用5μm的混合纤维素酯微孔滤膜过滤，去除混合液中残留的大颗粒和气泡，过滤后的混合液在室温条件下(20～25℃)静置30min，使混合液中的气泡浮于表面，然后刮去表层的气泡。在温度2～4℃条件下，容积为5升的干燥器里面放入50～100ml饱和MgCl₂溶液和20～40g变色硅胶，将混合液倒在K9玻璃片表面，自然铺展后，保持温度在2～4℃，相对湿度40～50％条件下静置干燥24小时，最终得到表面平整、分散均匀的化学修饰BR_WT-PVA薄膜。