二氯喹啉酸人工半抗原、人工抗原、特异性抗体制备方法及其用途

摘要

本发明公开了一种二氯喹啉酸人工半抗原、人工抗原、特异性抗体制备方法及其用途。二氯喹啉酸(3，7－二氯－8－喹啉羧酸)经氯化亚砜酰化后分别与氨基丁酸和氨基己酸反应，制备了半抗原4－(3，7－二氯－8－喹啉甲酰基)氨基丁酸或6－(3，7－二氯－8－喹啉甲酰基)氨基己酸(简称QB或QC)。二氯喹啉酸(3，7－二氯－8－喹啉羧酸)因具有活性基团(－COOH)本身也可作为半抗原(简称Q)。半抗原Q、QB和QC分别通过碳二亚胺法和混合酸酐法与蛋白质偶联制备免疫抗原和包被抗原。将免疫抗原免疫动物产生对二氯喹啉酸具有高亲合力的特异性抗体。这种抗体与其他类似化合物不易发生交叉反应。用该抗体建立的酶联免疫吸附分析法可用于快速检测样本中痕量的二氯喹啉酸残留物。这种方法灵敏度高、特异性强，样品前处理简单，便于进行现场监控，可以与常规方法互为补充。

说明书

技术领域

本发明涉及一种二氯喹啉酸人工半抗原、人工抗原、特异性抗体制备方法及其用途，属于农药免疫化学技术领域。

背景技术

由于农药使用规模不断扩大，农药残留造成环境影响和对人类健康的慢性和长期效应日益受到人们关注和担忧，对农药残留的限制也因此越来越严格，对分析测定对象、种类、数量、范围、指标等诸方面都提出了新的要求和更高的标准。对分子量小于1000道尔顿的小分子有毒化学品如农药及其代谢产物，传统的残留分析方法主要是依靠气相色谱(GC)、液相色谱(HPLC)或质谱(MS)等物化分析手段，传统的理化分析方法通常繁琐复杂，样品前处理过程复杂、工作量大、仪器昂贵、要求有熟练的技术人员及较长的分析周期，因此人们迫切希望有一种简单、快速、灵敏及价廉的检测技术能在野外和实验室内进行大批量的筛选试验。免疫分析法正具备这些优点，所以尽管免疫分析应用于农药残留分析的时间很短，但已很快用于环境样品和食品中农药残留的分析。

1958年Berson S.A和Yallow创立了放射免疫分析法(RIA)，并首先在生物医学和临床药物定量测定得到广泛应用。由于农药残留分析对象的复杂性，直到八十年代免疫分析才被逐渐应用于这一领域。

第一个农药免疫分析的报道是1967年Centen等人制备的农药马拉硫磷的抗血清，通过抗原抗体沉淀反应，证明了抗血清与马拉硫磷的可反应性。从1967年到70年代末的10余年间，由于技术上的局限，尽管已开发出了几个农药的免疫分析方法，但仍未受到普遍重视，发展相当缓慢。进入80年代以来，由于人们对分析方法的选择性和灵敏度的要求越来越高，同时对分析对象的种类和环境样品的数量要求也在不断增加，具有高度特异性、灵敏性、快速性的免疫检测技术在农药分析领域得到了较快的发展。进入90年代以来，农药的免疫检测技术发展迅速，到目前为止，已有60多种农药开发了免疫检测技术，其中除草剂和杀虫剂较多，杀菌剂较少。国内这方面的研究也渐渐起步，已有关于对硫磷、三唑酮、禾大壮、甲胺磷、莠去津均三氮苯类等农药的人工抗原和高亲合力的特异性抗体，用RIA法或ELISA法进行样品中痕量农药的分析。但总体来说，国内这方面的研究尚处于跟踪国外的发展。

二氯喹啉酸(3，7-二氯喹啉-8-羧酸)是德国巴斯夫公司开发的一种激素型的新型喹啉酸类除草剂。此除草剂熔点高、蒸汽压低、酸度大，选择性强，施用适期宽，残效期长，具有激素型除草剂的特点，是目前国内最佳的除稗剂，对稻田高龄稗草具有特效，还可有效防治鸭舌草、茨藻水芹等，主要用于秧田、移栽田、直播田。但对稻种、露芽种子和大多数蔬菜敏感，易产生药害；在土壤中有积累作用，极易对后茬敏感作物产生药害。

检测二氯喹啉酸的残留分析方法主要有液相色谱分析法(HPLC)和气相色谱法(GC)。液相色谱主要针对杂质较少的水样和土壤样品，前处理相对简单些；而对于那些杂质较多的作物样品，就必须用气相色谱法(ECD检测器)或气-质联用进行检测，前处理非常麻烦，必须进行重氮化处理，所用的重氮甲烷和乙醚溶液很容易爆炸，对人危险，不适合大批量样品的检测与分析。免疫分析为二氯喹啉酸残留研究提供了一个新的分析检测途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种二氯喹啉酸人工半抗原、人工抗原、特异性抗体制备方法及其用途。

二氯喹啉酸人工半抗原，它的分子结构式为：

其中n＝1～20

或者分子结构式为：

化学名称为4-(3，7-二氯-8-喹啉甲酰基)氨基丁酸(简称为QB)；或者分子结构式为：

化学名称为6-(3，7-二氯-8-喹啉甲酰基)氨基己酸(简称为QC)。

二氯喹啉酸人工半抗原制备方法的步骤为：

1)按氯化亚砜过量将氯化亚砜和二氯喹啉酸，回流反应1.5h，蒸馏除去剩余的氯化亚砜，即得产物3，7-二氯-8-喹啉-甲酰氯；

2)按投料比6-氨基己酸∶3，7-二氯-8-喹啉甲酰氯＝1.0∶1～1.5∶1投入6-氨基己酸1.32g～1.98g(10mmol～15mmol)，冰浴下加入5ml～7.5ml 2mol/L的NaOH溶液，搅拌溶解，2.60g(10mmol)3，7-二氯-8-喹啉甲酰氯溶解在30ml二噁烷中，加入恒压滴液漏斗中，分五次滴加此溶液，随后补加2mol/L的NaOH溶液，使反应液pH值维持在8～10，加毕，继续在0～4℃下反应2～5h，升至室温，用浓盐酸调节反应液pH值至3.0～5.0，用乙酸乙酯3×30ml提取，合并乙酸乙酯提取液，用水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩即可。

利用上述的半抗原与蛋白质合成的二氯喹啉酸人工抗原，它的分子结构式为：

其中n＝1～20

或它的分子结构式为：

或它的分子结构式为：

利用上述的二氯喹啉酸人工抗原，免疫动物制备的二氯喹啉酸特异性抗体，它是能与二氯喹啉酸发生特异性免疫反应的免疫球蛋白。

上述的二氯喹啉酸特异性抗体用于检测食品、农产品和环境样品中二氯喹啉酸的残留量。

本发明通过设计合成二氯喹啉酸人工半抗原和人工抗原，经免疫动物产生特异性抗体，以抗原抗体特异性免疫学反应为基础，并引入标记物来放大显示这一反应，则可用于样本测定。其选择性取决于免疫学反应的特异性，其灵敏度取决于抗体的亲合性和标记物的可检性。因此，可快速准确地分析检测二氯喹啉酸在样本中的残留量。这种方法灵敏度高、特异性强，样品前处理简单，便于进行现场监控，可以与常规方法互为补充。

具体实施方式

1二氯喹啉酸人工半抗原的合成

基于二氯喹啉酸喹啉环侧链上本身就具有能与蛋白质结合的特征基团-COOH，可直接将其与蛋白质偶联免疫兔子得到抗体，所以本身是一个半抗原(简称Q)。

为了让半抗原的结构特征充分暴露，可在-COOH位点上接上一个连接臂。据此以二氯喹啉酸为起始原料，同时以氯化亚砜，氨基丁酸或氨基己酸等为原料，经过二步反应，合成了半抗原4-(3，7-二氯-8-喹啉甲酰基)氨基丁酸(简称为QB)和6-(3，7-二氯-8-喹啉甲酰基)氨基己酸(QC)。产物QB和QC纯化后分别经质谱(ESI)和核磁共振氢谱(¹H-NMR)鉴定，并与类似已知的化合物数据比较确证。

主要半抗原的结构如下：

2人工抗原的合成

免疫原的合成采用碳二亚胺法。将0.2毫摩尔的半抗原Q(或QB或QC)溶解在N，N-二甲基甲酰胺中，加入1.5当量的二环己基碳二亚胺和3当量的N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应过夜，离心，取上清液加入到10～20mg/mL的牛血清蛋白碳酸盐缓冲溶液中，搅拌反应1～6小时，装入透析袋，分别用蒸馏水和0.01mol/L的PBS缓冲溶液透析3～5d，分装保存于-20℃的冰箱中。

包被抗原的合成利用混合酸酐法。将0.25毫摩尔半抗原Q(或QB或QC)溶解在N，N-二甲基甲酰胺中，加入60uL正三丁胺和30uL氯甲酸丁酯，室温下反应1～2小时，反应液加入到10～20mg/mL的卵清蛋白(OVA)碳酸盐缓冲溶液中，搅拌反应1～4小时，装入透析袋，分别用蒸馏水和0.01mol/L的PBS缓冲溶液透析3～5d，分装保存于-20℃的冰箱中。

按照合成二氯喹啉酸免疫原和包被抗原时反应物和产物的比例，分别取反应物和产物进行紫外(200nm～400nm)分析。偶联物与半抗原Q、QB、QC、BSA和OVA的吸收峰相比，发生了明显的变化，表明人工抗原Q-BSA、Q-OVA、QC-BSA、QC-OVA、QB-BSA和QB-OVA的合成是成功的。

经计算半抗原与蛋白质的结合比如下：    

Q-BSA  1～10∶1  QC-BSA  10～30∶1  QB-BSA  10～30∶1

Q-OVA  1～5∶1   QC-OVA  2～10∶1   QB-OVA  2～10∶1    

3抗体的制备及二氯喹啉酸酶联免疫分析方法的建立

三种免疫原复合物(Q-BSA、QC-BSA、QB-BSA)按常规方法各免疫了三只兔子。从加强免疫第二次开始，在每次免疫后第8天于兔子耳缘静脉采血，血清经适当稀释后用间接ELISA测定效价。待第4次免疫时，兔子获得了高效价的抗体，经纯化制成冻干粉后的效价分别为2000、1.2×10⁶、1.6×10⁶。由于抗Q-BSA抗体的效价太低，将不作进一步试验。

利用二氯喹啉酸抗原抗体免疫反应和酶促反应建立二氯喹啉酸酶联免疫分析法。在检测分析食品、植物和环境土壤与水等样品中二氯喹啉酸残留时具有很高的特异性和灵敏度，最低检测限可达到0.005ppm，与类似化合物的交叉反应率低，同时操作方法简单快速，不需要复杂的前处理过程，一次可同时检测大批样品，成本低廉，对操作人员的要求低，便于进行现场监控，可以与常规方法互为补充。

实施例1：半抗原QC的合成

1)按氯化亚砜过量将37.5mlSOCl₂和2.42g(10mmol)二氯喹啉酸装入三口烧瓶中，在磁力搅拌下，加热回流反应1.5h，蒸馏除去多余的SOCl₂，即得产物3，7-二氯-8-喹啉甲酰氯。

2)按投料比6-氨基己酸∶3，7-二氯-8-喹啉甲酰氯＝1∶1在三口烧瓶中投入6-氨基己酸1.32g(10mmol)，冰浴下加入5ml 2mol/L的NaOH溶液，搅拌溶解，2.60g(10mmol)3，7-二氯-8-喹啉甲酰氯溶解在30ml二噁烷中，加入恒压滴液漏斗中，分五次滴加此溶液，随后补加2mol/L的NaOH溶液，使反应液pH值维持在8～10，加毕，继续在0～4℃下反应2h。升至室温，用浓盐酸调节反应液pH值至4.0左右，用乙酸乙酯3×30ml提取，合并乙酸乙酯提取液，用水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩得到固体物，经硅胶柱层析纯化得半抗原6-(3，7-二氯-8-喹啉甲酰基)氨基己酸(QC)。    

取上述合成的产物分别经ESI、¹H-NMR和IR测定其分子结构。该物质的ESI分子离子峰为353(M-1)，且该峰旁有一同位素峰355，其峰高为353峰的2/3强，由此可知该物质有2个Cl原子，分子量为354。¹H-NMR(C₃D₆O)为：δ8.87(s，1H，NH)，7.67～8.49(s+s+m+s，4H，4ArH)，3.48～3.53(q，2H，CH₂COO)，2.31～2.35(t，2H，NCH₂)，1.51～1.72(t，6H，3CH₂)。

从以上分析综合可知，所合成的产物为目标物。

实施例2：半抗原QC的合成

1)按氯化亚砜过量将37.5mlSOCl₂和2.42g(10mmol)二氯喹啉酸装入三口烧瓶中，在磁力搅拌下，加热回流反应1.5h，蒸馏除去多余的SOCl₂，即得产物3，7-二氯-8-喹啉甲酰氯。

2)按投料比6-氨基己酸∶3，7-二氯-8-喹啉甲酰氯＝1.2∶1在三口烧瓶中投入6-氨基己酸1.584g(12mmol)，冰浴下加入6ml2mol/L的NaOH溶液，搅拌溶解，2.60g(10mmol)3，7-二氯-8-喹啉甲酰氯溶解在30ml二噁烷中，加入恒压滴液漏斗中，分五次滴加此溶液，随后补加2mol/L的NaOH溶液，使反应液pH值维持在8～10，加毕，继续在0～4℃下反应3h。升至室温，用浓盐酸调节反应液pH值至4.0左右，用乙酸乙酯3×30ml提取，合并乙酸乙酯提取液，用水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩得到固体物，经硅胶柱层析纯化得半抗原6-(3，7-二氯-8-喹啉甲酰基)氨基己酸(QC)。

实施例3：半抗原QC的合成

1)按氯化亚砜过量将37.5mlSOCl₂和2.42g(10mmol)二氯喹啉酸装入三口烧瓶中，在磁力搅拌下，加热回流反应1.5h，蒸馏除去多余的SOCl₂，即得产物3，7-二氯-8-喹啉甲酰氯。

2)按投料比6-氨基己酸∶3，7-二氯-8-喹啉甲酰氯＝1.5∶1在三口烧瓶中投入6-氨基己酸1.98g(15mmol)，冰浴下加入7.5ml 2mol/L的NaOH溶液，搅拌溶解，2.60g(10mmol)3，7-二氯-8-喹啉甲酰氯溶解在30ml二噁烷中，加入恒压滴液漏斗中，分五次滴加此溶液，随后补加2mol/L的NaOH溶液，使反应液pH值维持在8～10，加毕，继续在0～4℃下反应5h。升至室温，用浓盐酸调节反应液pH值至4.0左右，用乙酸乙酯3×30ml提取，合并乙酸乙酯提取液，用水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩得到固体物，经硅胶柱层析纯化得半抗原6-(3，7-二氯-8-喹啉甲酰基)氨基己酸(QC)。

实施例4：半抗原QB的合成

1)按氯化亚砜过量将37.5mlSOCl₂和2.42g(10mmol)二氯喹啉酸装入三口烧瓶中，在磁力搅拌下，加热回流反应1.5h，蒸馏除去多余的SOCl₂，即得产物3，7-二氯-8-喹啉甲酰氯。

2)按投料比γ-氨基丁酸∶3，7-二氯-8-喹啉甲酰氯＝1∶1在三口烧瓶中投入γ-氨基丁酸1.03g(10mmol)，冰浴下加入5ml2mol/L的NaOH溶液，搅拌溶解，2.60g(10mmol)3，7-二氯-8-喹啉甲酰氯溶解在30ml二噁烷中，加入恒压滴液漏斗中，分五次滴加此溶液，随后补加2mol/L的NaOH溶液，使反应液pH值维持在8～10，加毕，继续在0～4℃下反应2h。升至室温，用浓盐酸调节反应液pH值至4.0左右，用乙酸乙酯3×30ml提取，合并乙酸乙酯提取液，用水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩得到固体物，经硅胶柱层析纯化得半抗原4-(3，7-二氯-8-喹啉甲酰基)氨基丁酸(QB)。

取上述合成的产物分别经ESI和¹H-NMR测定其分子结构。该物质的ESI分子离子标准峰为325(M-1)，且该峰旁327有一同位素峰，其峰高为325峰的2/3强，由此可知该物质有2个Cl原子，分子量为326。该产物¹H-NMR(C₃D₆O)为：δ8.83(s，1H，NH)，7.60～8.46(t+m+s，4H，3ArH)，3.51～3.56(q，2H，CH₂COO)，2.54～2.58(t，2H，NCH₂)，1.90～1.97(f，2H，CH₂)。

从以上分析综合可知，所合成的产物为目标物。

实施例5：半抗原QB的合成

1)按氯化亚砜过量将37.5mlSOCl₂和2.42g(10mmol)二氯喹啉酸装入三口烧瓶中，在磁力搅拌下，加热回流反应1.5h，蒸馏除去多余的SOCl₂，即得产物3，7-二氯-8-喹啉甲酰氯。

2)按投料比γ-氨基丁酸∶3，7-二氯-8-喹啉甲酰氯＝1.2∶1在三口烧瓶中投入γ-氨基丁酸1.236g(12mmol)，冰浴下加入6ml 2mol/L的NaOH溶液，搅拌溶解，2.60g(10mmol)3，7-二氯-8-喹啉甲酰氯溶解在30ml二噁烷中，加入恒压滴液漏斗中，分五次滴加此溶液，随后补加2mol/L的NaOH溶液，使反应液pH值维持在8～10，加毕，继续在0～4℃下反应4h。升至室温，用浓盐酸调节反应液pH值至4.0左右，用乙酸乙酯3×30ml提取，合并乙酸乙酯提取液，用水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩得到固体物，经硅胶柱层析纯化得半抗原4-(3，7-二氯-8-喹啉甲酰基)氨基丁酸(QB)。

实施例6：半抗原QB的合成

1)按氯化亚砜过量将37.5mlSOCl₂和2.42g(10mmol)二氯喹啉酸装入三口烧瓶中，在磁力搅拌下，加热回流反应1.5h，蒸馏除去多余的SOCl₂，即得产物3，7-二氯-8-喹啉甲酰氯。    

2)按投料比γ-氨基丁酸∶3，7-二氯-8-喹啉甲酰氯＝1.5∶1在三口烧瓶中投入γ-氨基丁酸1.545g(15mmol)，冰浴下加入7.5ml 2mol/L的NaOH溶液，搅拌溶解，2.60g(10mmol)3，7-二氯-8-喹啉甲酰氯溶解在30ml二噁烷中，加入恒压滴液漏斗中，分五次滴加此溶液，随后补加2mol/L的NaOH溶液，使反应液pH值维持在8～10，加毕，继续在0～4℃下反应5h。升至室温，用浓盐酸调节反应液pH值至4.0左右，用乙酸乙酯3×30ml提取，合并乙酸乙酯提取液，用水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩得到固体物，经硅胶柱层析纯化得半抗原4-(3，7-二氯-8-喹啉甲酰基)氨基丁酸(QB)。    

实施例7：人工抗原的合成

7.1免疫原的合成与纯化

免疫原的合成利用碳二亚胺法。将0.2毫摩尔半抗原Q，溶解在1mL的N，N-二甲基甲酰胺中，加入1.5当量的二环己基碳二亚胺和3当量的N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应过夜，离心，取上清液100～800μL缓慢加入到4mL10mg/mL的牛血清蛋白(BSA)碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应1～6小时，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用0.01mol/L的PBS缓冲溶液透析3～5d，分装保存于-20℃的冰箱中。

7.2包被抗原的合成与纯化

包被抗原的合成利用混合酸酐法。将0.25毫摩尔半抗原Q溶解在1mL的N，N-二甲基甲酰胺中，加入60uL正三丁胺和30uL氯甲酸丁酯，室温下反应1～2小时，反应液100μL～800μL加入到5mL10mg/mL的卵清蛋白(OVA)碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应1小时，然后装入透析袋，先用蒸馏水透析3次，然后用0.01mol/L的PBS缓冲溶液透析3～5d，分装保存于-20℃的冰箱中。

7.3人工抗原的鉴定

按照合成二氯喹啉酸免疫原和包被抗原时反应物和产物的比例，分别取反应物和产物进行紫外(200nm～400nm)扫描。

经计算半抗原与蛋白质的结合比如下：

Q-BSA   1～10∶1    Q-OVA    1～5∶1

实施例8：人工抗原的合成

8.1免疫原的合成与纯化

免疫原的合成利用碳二亚胺法。将0.2毫摩尔半抗原QC，溶解在1mL的N，N-二甲基甲酰胺中，加入1.5当量的二环己基碳二亚胺和3当量的N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应过夜，离心，取上清液100～800μL缓慢加入到4mL10mg/mL的牛血清蛋白(BSA)碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应1～6小时，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用0.01mol/L的PBS缓冲溶液透析3～5d，分装保存于-20℃的冰箱中。

8.2包被抗原的合成与纯化

包被抗原的合成利用混合酸酐法。将0.25毫摩尔半抗原QC溶解在1mL的N，N-二甲基甲酰胺中，加入60uL正三丁胺和30uL氯甲酸丁酯，室温下反应1～2小时，反应液100μL～800μL加入到5mL10mg/mL的卵清蛋白(OVA)碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应1小时，然后装入透析袋，先用蒸馏水透析3次，然后用0.01mol/L的PBS缓冲溶液透析3～5d，分装保存于-20℃的冰箱中。

8.3人工抗原的鉴定

按照合成二氯喹啉酸免疫原和包被抗原时反应物和产物的比例，分别取反应物和产物进行紫外(200nm～400nm)扫描。

经计算半抗原与蛋白质的结合比如下：

QC-BSA   10～30∶1    QC-OVA    2～10∶1

实施例9：人工抗原的合成

9.1免疫原的合成与纯化

免疫原的合成利用碳二亚胺法。将0.2毫摩尔半抗原QB，溶解在1mL的N，N-二甲基甲酰胺中，加入1.5当量的二环己基碳二亚胺和3当量的N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应过夜，离心，取上清液100～800μL缓慢加入到4mL10mg/mL的牛血清蛋白(BSA)碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应1～6小时，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用0.01mol/L的PBS缓冲溶液透析3～5d，分装保存于-20℃的冰箱中。

9.2包被抗原的合成与纯化

包被抗原的合成利用混合酸酐法。将0.25毫摩尔半抗原QB溶解在1mL的N，N-二甲基甲酰胺中，加入60uL正三丁胺和30uL氯甲酸丁酯，室温下反应1～2小时，反应液100μL～800μL加入到5mL10mg/mL的卵清蛋白(OVA)碳酸盐缓冲溶液中，在磁力搅拌下反应1小时，然后装入透析袋，先用蒸馏水透析3次，然后用0.01mol/L的PBS缓冲溶液透析3～5d，分装保存于-20℃的冰箱中。    

9.3人工抗原的鉴定

按照合成二氯喹啉酸免疫原和包被抗原时反应物和产物的比例，分别取反应物和产物进行紫外(200nm～400nm)扫描。    

经计算半抗原与蛋白质的结合比如下：

QB-BSA   10～30∶1    QB-OVA    2～10∶1

实施例10：抗体的制备

10.1免疫动物制备抗血清

实验选用半周岁左右，体重为2-3公斤，健康的雄性家兔。每种免疫原免疫三只兔子(由浙江省中医学院负责兔子的饲养工作)，分别编号为兔子1-6。

实验免疫剂量基础免疫为0.25～4.0mg/kg，加强免疫剂量为0.5～4.0mg/kg，用生理盐水分别稀释适量人工抗原复合物，加入等体积弗氏完全佐剂，充分乳化，直至滴入水中乳滴不分散。采用背部皮下多点注射与大腿肌肉注射相结合的方法。3～4周后进行加强免疫，以后每隔2周再次加强免疫，加强免疫时采用弗氏不完全佐剂。从第三次免疫开始，每次免疫后第8～10天，从兔子心脏或耳缘静脉采血，测定效价和特异性。待免疫血清效价合格后，就进行采血。

本实验采用心脏取血法。每只兔子可得血80mL左右。采血后，先待收集在三角烧瓶中的血液凝固后，然后用接种针沿三角烧瓶边缘将血块与玻璃脱离，放置于37℃温箱中半小时，再放到4℃冰箱中3～4小时，待血块收缩后，用吸管将血清吸入试管中，以3000rpm离心15分钟，分离出血清。

10.2抗体的纯化与鉴定

一般采用辛酸-硫酸铵盐析法，也可采用蛋白A柱层析。辛酸-硫酸铵盐析法是一个经典的方法。辛酸在偏酸性的条件下能将血清中除IgG以外的蛋白质都沉淀下来中，上清液中只有IgG。辛酸加入因抗体的来源不同而不同，人血清为70ul/ml，兔血清为75ul/ml，小鼠血清为40ul/ml，小鼠腹水为33ul/ml。这种方法IgG的回收率达90％以上。

10.3抗体效价测定

三种免疫原复合物(Q-BSA、QC-BSA、QB-BSA)按常规方法各免疫了三只兔子。从加强免疫第二次开始，在每次免疫后第8天于兔子耳缘静脉采血，血清经适当稀释后用间接ELISA测定效价。待第4次免疫时，兔子获得了高效价的抗体，经纯化制成冻干粉后的效价分别为2000、1.2×10⁶、1.6×10⁶。由于抗Q-BSA抗体的效价太低，将不作进一步试验。

实施例11：二氯喹啉酸酶联免疫吸附测定方法建立与鉴定    

11.1二氯喹啉酸ELISA测定方法的原理

采用间接竞争酶联免疫分析方法。它是将农药分子与大分子载体(如蛋白质)偶联制得的复合物作为包被抗原吸附于固相载体(96孔酶标板)上，制备成固相抗原，然后加入待测农药和相应抗体，固相抗原中的农药，待测农药，与抗体进行竞争结合反应，待测农药含量多，被结合在固相抗原上的抗体就少，反之结合在固相抗原的抗体多，反应后加入酶标二抗(只能与结合在固相抗原上的抗体相结合)，最后用底物进行显色加以测定，当抗体量一定时，加入的待测农药量越多，与固相抗原结合的抗体就越少，显色反应就减弱，抑制率增高，反之，则显色反应增强，抑制率减低，因而可根据已知量农药的标准线和待检样品的抑制率，推算出待测农药的浓度。

11.2最佳抗体工作浓度和包被抗原复合物浓度的确定

选择包被抗原Q-BSA、抗QC-BSA抗体和抗QB-BSA抗体用方阵滴定法，同时稀释抗体和固相抗原包被液。

在同一包被液浓度下，随着抗体的稀释，所得的OD值呈下降趋势，同样在同一抗体稀释浓度下，随着包被液浓度的下降，所得OD值也呈下降趋势。经试验，抗QC-BSA抗体和抗QB-BSA抗体分别以4μg.mL^-1和8μg.mL^-1作为最适工作浓度，包被抗原浓度1.0μg.mL^-1作为最佳包被浓度。

11.3标准曲线和检测灵敏度

11.3.1标准曲线的制备，其基本的操作步骤如下：

11.3.1.1包被

1)包被抗原溶液的配制

从低温冰箱中取出Q-OVA偶联复合物，使之完全解冻后，稀释成相应工作浓度。

2)微量反应板的包被

96孔聚苯乙烯微量反应板用PBST洗涤后，每孔加入上面所配的抗原包被液100μL，于37℃温箱中温育2h。

11.3.1.2封闭

取出包被好的微量反应板，甩掉包被液，用PBST洗涤后，每孔加入2.0％的脱脂奶200μL，于37℃温箱中温育0.5h。

11.3.1.3点板

1)配制二氯喹啉酸的标准溶液

取二氯喹啉酸标样配制100ppm的标准溶液，从中取出200μL，待溶剂丙酮挥发后，加入2mLPBS溶液，使之成10ppm溶液，稀释成若干(5～8)个浓度。

2)二氯喹啉酸抗体稀释液的配制

从冰箱中取出已经配制成适当浓度的抗体(抗QC-BSA抗体或抗QB-BSA抗体)，用PBS稀释成工作浓度。

3)点板

取出经封闭的板，经200ulPBST洗涤3次后，每孔加入系列浓度的二氯喹啉酸标准液50μL，再加入抗体稀释液50μL，对照孔加入PBS50μL和抗体稀释液50μL。放入37℃温箱中温育1h，弃去孔内液体，用200ulPBST溶液洗涤3次。

11.3.1.4加酶标二抗

每孔加入经1∶1000稀释的羊抗兔辣根过氧化物酶PBS溶液100μL，放入37℃温箱中1小时，用PBST溶液洗涤3次，甩干。

11.3.1.5显色

每孔加入底物OPD-过氧化氢溶液100μL，37℃温箱中温育15min，用50μL2MH₂SO₄终止反应。在酶联仪上测定490nm波长下的吸光值。根据抑制率与农药浓度之间的半对数关系作图即得到标准曲线。

ELISA方法的标准曲线以抑制率与农药浓度的半对数曲线表示，抑制率以下式计算：

式中：OD_max为不加药时的吸光值，OD_x为农药x时的吸光值，OD_min为空白对照孔的吸光值。

由上述公式计算得二氯喹啉酸各浓度的抑制率，作图。用抗QC-BSA抗体测定时，抑制率为50％时二氯喹啉酸的浓度为2.7ppm，最低检测限为0.04ppm，二氯喹啉酸在0.04ppm～20.00ppm范围内，抑制率与二氯喹啉酸浓度的对数值呈显著的线性关系，相关系数为r＝0.9932，；用抗QB-BSA抗体测定时，抑制率为50％时二氯喹啉酸的浓度为0.4ppm，最低检测限同样也为0.006ppm，二氯喹啉酸在0.006ppm～10.00ppm范围内，抑制率与二氯喹啉酸浓度的对数值呈显著的线性关系，相关系数为r＝0.9912。

11.4抗体的特异性

抗血清的特异性就是指它同特异性抗原结合的能力与同该抗原类似物结合能力的比较。常用交叉反应活性作为评价的重要标准。交叉反应越小，抗血清的特异性则越好。    

将二氯喹啉酸及其类似物做系列稀释，分别与同一种抗体竞争反应，按制4.3的方法制作标准曲线，并在曲线上找出抑制率50％的剂量和类似物抑制率50％时的用量，然后计算出各类似物的交叉反应率。

抗QC-BSA抗体对一些类似农药的交叉反应率：甲萘威为1.7％，克百威为1.22％，喹硫磷为＜0.1％。

抗QB-BSA抗体对一些类似农药的交叉反应率：甲萘威为1.0％，克百威为0.72％，喹硫磷为＜0.1％。

从而可知，所制备的三种抗体的特异性均较强。

实施例12：水稻样品快速测定

12.1提取方法

12.1.1水样

水样(或经过滤)可直接检测

12.1.2土壤和植物(水稻)样品

(1)可分别称取土壤样品、稻米(将稻米和稻壳分离，并捣碎)、水稻稻杆(剪成＜1cm长)或其它植物样品，各10g，装入三角瓶中。

(2)配制三个不同水平的二氯喹啉酸甲醇溶液。药液浓度为100ppm、10ppm、1ppm，分别从中取0.5mL和1mL加入到每类样品中，重复2次，余下的作对照。

(3)一定时间后，在样品中加入50mL的甲醇放在国际型振荡器上振荡提取30分钟。

(4)振荡完毕后，提取液用布氏漏斗抽滤，用30mL的甲醇冲洗滤渣，抽滤完毕后，移入到250mL的容量瓶中。

(5)用旋转蒸发器浓缩至2mL左右，用PBS定容至10mL。

12.2样品的ELISA法测定

方法同标准曲线的操作。已包被好的板每孔加入系列已知添加浓度的样品液50μL，再加配制好的抗体溶液50μL，对照孔加入100μL抗血清，盖好板，37℃温育1小时，弃去孔内液体，余后步骤同前。经分析可知，该方法的平均回收率为97.9％，平均变异系数为7.85％，且二氯喹啉酸的添加量为0.050ppm以上时，方法的变异系数均小于10.00％，而小于0.050ppm时，方法的变异系数为10～20％之间。随着农药添加量的降低，回收率基本上也呈现下降的趋势。

在制作标准曲线时，得到的检测极限为0.006ppm，而在测定水稻样品的过程中，受到基质与测定环境的影响检测限有所下降0.01 ppm，而用气相色谱对吡虫啉的检测限为0.02ppm，从而可知用ELISA分析方法来测定水稻样品中二氯喹啉酸残留量是可行的。且与气相色谱相比，ELISA分析方法样品的前处理快捷简单，只用甲醇提取后浓缩定容即可进行检测，而用气相色谱法分析，样品前处理过程复杂，工作量大，所以建立二氯喹啉酸的ELISA分析方法能够大大提高工作效率。