蓝狐精液稀释液

摘要

本发明涉及一种蓝狐精液稀释液，属于动物繁殖技术领域。由N－乙酰基－D－葡萄糖胺0.05～0.1克，果糖6.50～7.50克，柠檬酸钠0.60～1.50克，三羟甲基胺基甲烷1.00～1.90克，缓冲剂1.30～3.50克，杀菌剂1000 UI/毫升，蒸馏水加至100毫升配制而成，稀释液pH值为6.20～6.80，渗透压为300－350mOsmo/L。本发明的稀释液能够有效延长常温条件下蓝狐精子的存活时间，提高蓝狐冻融精子的质量，提高人工授精的受孕率。

说明书

技术领域

本发明涉及一种蓝狐精液稀释液，用于饲养蓝狐的人工授精，属于动物繁殖技术领域。

背景技术

蓝狐(Alopex lagopus)又名北极狐，属于珍贵的毛皮兽，其皮张是比较流行的裘皮原料。目前国内华北、东北地区已经广泛开展了蓝狐的人工养殖，现有种狐存栏量近150万只，已成为当地农民脱贫致富的好项目。然而在蓝狐长期养殖过程中，由于饲料营养、疾病防治等条件的限制，特别是近亲繁殖的泛滥，直接导致了我国人工饲养的蓝狐品种退化，皮张质量低劣，饲养回报率低，逐渐在国际毛皮市场上失去了竞争力，给养狐人造成了巨大的经济损失。

同我国养殖的蓝狐相比，芬兰蓝狐皮张大、质量优，经济价值高。为此我国自96年以来陆续从芬兰进口大体型蓝狐千余只，通过人工授精技术改良国内原有自繁蓝狐品种，已产生了良好的经济效益。

人工授精繁殖技术包括利用鲜精液稀释后输精和冻精解冻后输精两种方式，其中涉及到的关键性技术就是稀释液的研制。稀释液质量的优劣将直接影响蓝狐人工授精繁殖的成败。研究表明，蓝狐精子与其它犬科动物的精子类似，其在冻融过程中对低温损伤的抗性较弱，冻融后精子活力下降，人工授精的受孕率及胎仔数均低于自然繁殖(Farstad，W.等，1996，Animal Reproduction Science.42：251～260.)。因此，如何长期低温保存优质蓝狐精液并充分利用优良种源是目前本领域亟待解决的问题。

当前蓝狐养殖中普遍采用的另一种繁殖方法是对鲜精液稀释后进行人工授精。常用的稀释液配方有：

配方一：氨基乙酸(1.82g)、柠檬酸钠(0.72g)、葡萄糖(6.80g)卵黄(5.00ml)青霉素(1000单位/ml)蒸馏水(97ml)。用此配方稀释蓝狐鲜精液，在22℃条件下蓝狐精子存活时间为15小时；制作冻精时，冻融精子活力为0.5，利用冻精人工输精的受孕率为90.7％(郭永佳等，1996，《养狐使用新技术》，金盾出版社)。

配方二：蔗糖(11g)、甘油(6mL)、卵黄(16mL)、蒸馏水(100mL)、青霉素(5万IU)。用此配方稀释蓝狐鲜精液，在7℃条件下蓝狐精子存活时间为42小时，22℃条件下蓝狐精子存活时间为18小时；制作冻精时，冻融精子活力为0.5(许加成等，2000，经济动物学报，4(2)：8-11)。

由于上述两种稀释液中都含有卵黄，而卵黄内易携带致病菌，所以在进行人工授精繁殖时常常会引起母狐子宫的继发感染，导致受孕率及产仔率的降低。

N-乙酰基-D-葡萄糖胺(N-acetyl-D-glucosamine)是几丁质的主要成分，存在于昆虫和甲壳动物的外骨骼中，属于多糖同聚物，在细胞外表层、细胞间隙及结缔组织形成时提供主要的结构成分，使动植物组织有弹性和韧性。Breborowicz等报道N-乙酰基-D-葡萄糖胺通过人体腹膜细胞和成纤维细胞能有效激活体内葡萄胺聚糖的合成(Breborowicz等，1998，Adv.Perit.Dial.14，31-35.)。另据报道，N-乙酰基-D-葡萄糖胺已成功应用于猪精液冷冻稀释液中(Yi等，2002，AnimalReproduction Science.74，187-194.)，但关于N-乙酰基-D-葡萄糖胺在蓝狐精液稀释液方面的研究目前还没有报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种蓝狐精液稀释液，使之能延长常温条件下蓝狐精子的存活时间，提高人工授精的受孕率。

为实现这样的目的，本发明的蓝狐精液稀释液采用了细胞培养液成分N-乙酰基-D-葡萄糖胺，同时添加果糖、三羟甲基胺基甲烷(Tris)、柠檬酸钠、杀菌剂及缓冲剂等各种成分，用蒸馏水配制而成。

本发明配制的蓝狐精液稀释液具体包含如下成分：

N-乙酰基-D-葡萄糖胺          0.05～0.1克

果糖                         6.50～7.50克

柠檬酸钠                     0.60～1.50克

三羟甲基胺基甲烷             1.00～1.90克

缓冲剂                       1.30～3.50克

杀菌剂                       1000UI/毫升

蒸馏水加至100毫升。

优选的稀释液含有如下成分：

N-乙酰基-D-葡萄糖胺           0.07克

果糖                          7.15克

柠檬酸钠                      1.25克

三羟甲基胺基甲烷              1.68克

缓冲剂                        1.95克

杀菌剂                        1000UI/毫升

蒸馏水加至100毫升。

本发明的杀菌剂可以采用青霉素或者庆大霉素。

本发明采用的缓冲剂包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二盐、磷酸二氢盐。

本发明的稀释液可按本领域的常规方法配制，按所述含量分别加入上述成分，再加蒸馏水，配成100毫升溶液即可。配制成的稀释液pH值为6.20～6.80，渗透压为300-350mOsmo/L，按优选配方配制的稀释液pH值为6.25，渗透压为320mOsmo/L，为蓝狐精子存活提供最佳基质条件。

本发明的蓝狐精液稀释液中的果糖成分为精子在体外代谢的能量来源，柠檬酸钠可维持稀释液环境与精子内环境的渗透压平衡。此外，在本发明的稀释液中还加入青霉素等杀菌剂，磷酸氢二钠等缓冲剂，还可以加入甘油、乙二醇等保护剂，提高稀释液的低温保存效果。

本发明使用由N-乙酰基-D-葡萄糖胺等多种成分组成的稀释液，稀释蓝狐鲜精液以及进行细管冻精试验，并用稀释后的鲜精液及冻融精子进行人工授精，研究该稀释液对蓝狐精子存活时间及冻融精子质量的影响，结果表明：由N-乙酰基-D-葡萄糖胺等多种成分组成的稀释液，无论是在稀释蓝狐鲜精液还是在冷冻精子时，均能有效延长蓝狐精子的存活时间、保护冻融精子膜结构的完整性，表现出了良好的精子保护作用和防冻效果。

与现有技术相比，本发明的稀释液效果显著，不仅能够有效延长常温条件下蓝狐精子的存活时间，提高蓝狐冻融精子的质量，提高人工授精的受孕率，而且稀释液中不含卵黄成分，避免了由于常规稀释液中的卵黄易携带病原体所导致的人工授精继发感染，同时配制简单，取材容易，成本价格低廉，易于推广。

本发明的蓝狐精液稀释液既适用于鲜精稀释后人工输精繁殖，也适用于蓝狐细管冻精人工输精繁殖以及蓝狐精液稀释后的短期保存和短途运输后输精，它可明显提高蓝狐精子的生存指数，保持其授精活力。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下实施例的作用应被理解为是对本发明的诠释而并非对本发明的任何方式的限制。

实施例1(稀释液1)

先称取0.07g N-乙酰基-D-葡萄糖胺，溶于5ml蒸馏水中，使其完全溶解。称取7.15g果糖溶于20ml蒸馏水中，待完全溶解后分别加入1.68g三羟甲基胺基甲烷、1.25g柠檬酸钠、2.25g磷酸氢二钠，按上述顺序逐一加入，添加时待先加入的试剂完全溶解后再加入后一种，溶解后把两种制剂相混合，然后加入10万单位青霉素，最后蒸馏水定容100ml，定容后pH值为6.25，渗透压为340mOsmo/L，放入5℃冰箱保存。所有制备过程均在无菌条件下进行。该配方对蓝狐精液超低温冷冻保存效果极佳。使用时按1∶2比例与蓝狐精液相混合，同时要保持稀释液的温度与待稀释精液温度相同。

使用按实施例1方法制备的稀释液按1∶2比例稀释蓝狐精液，检测7℃、22℃精子存活时间、冻融精子活力(采用相差显微镜检测精子活力)、冻融精子顶体完整率(CTC-Hoechst 33258活体荧光染料联合染色法检测精子顶体完整率)、鲜精稀释后受孕率以及冻精稀释后受孕率，结果表明：在22℃下蓝狐精子能够存活25小时，利用该稀释液进行鲜精液稀释分别保存2小时后人工输精，母狐受孕率分别为94.6％，与使用鲜精液立即输精的母狐受孕率(95.8％)无显著差异。

实施例2：(稀释液2)

称取0.08g N-乙酰基-D-葡萄糖胺，溶于5ml蒸馏水中，待完全溶解后放入5℃冰箱保存。称取6.83g果糖溶于20ml蒸馏水中，待完全溶解后分别加入1.05g三羟甲基胺基甲烷、0.78g柠檬酸钠、1.86g磷酸二氢钾，按上述顺序逐一加入，添加时待先加入的试剂完全溶解后再加入后一种，溶解后混合均匀并放入5℃冰箱保存。使用时取出并把两种制剂相混合，然后加入10万单位青霉素，最后蒸馏水定容100ml，定容后pH值为6.24，渗透压为315mOsmo/L。所有制备过程均在无菌条件下进行。该配方对蓝狐精液超低温冷冻保存效果极佳。使用时按1∶2的比例与蓝狐精液相混合，同时要保持稀释液的温度与待稀释的精液温度相同。

实施例3：(稀释液3)

先称取7.46g果糖溶于20ml蒸馏水中，待完全溶解后分别加入1.48g三羟甲基胺基甲烷、0.61g柠檬酸钠、1.75g磷酸二氢钠，按上述顺序逐一加入，添加时待先加入的试剂完全溶解后再加入后一种，溶解后混合均匀并放入5℃冰箱保存。使用时取出并调整至所要保存精液的温度或者人工输精的温度，然后称取0.05g N-乙酰基-D-葡萄糖胺，溶于调整好温度的稀释液中。最后加入10万单位青霉素，最后蒸馏水定容100ml，定容后pH值为6.25，渗透压为305mOsmo/L。所有制备过程均在无菌条件下进行。该配方对蓝狐鲜精液稀释保存效果极佳。使用时按1∶2的比例与蓝狐精液相混合，同时要保持稀释液的温度与待稀释的精液温度相同。

利用该稀释液进行鲜精液稀释后制作细管冻精，冻融精子活力、精子顶体完整率分别为57.2％、64.8％、67.5％。利用冻精人工输精繁殖母狐受孕率达到93.7％，接近利用鲜精稀释后输精的母狐受孕率(活力及顶体完整率的检测方法同上)。