包膜病毒的宿主范围突变及其作为疫苗基质的应用

摘要

本发明的疫苗和方法根据的是有包膜病毒的蛋白跨膜结构域中的缺失突变。产生这些突变的策略根据的是昆虫细胞的膜与哺乳动物细胞的膜不一样，它不含胆固醇；因此比哺乳动物的膜更薄。许多膜包覆的病毒其表面具有负责鉴定和感染靶细胞的膜糖蛋白。这些膜糖蛋白有将蛋白锚着在膜双层中的疏水性跨膜结构域。这些跨膜蛋白的跨膜结构域必须长得足以从双层的一侧到达另一侧，以将蛋白固定在膜中。根据在无脊椎动物中复制的病毒的膜和在脊椎动物中复制的病毒的膜之间的差别，本发明提供了一种疫苗、生产该疫苗的方法以及应用该疫苗的方法。

说明书

                                发明背景

发明领域

本发明总地涉及病毒学和疾病控制领域。具体地说，本发明涉及突变的以节肢动物为载体的病毒及其作为疫苗的应用。

相关技术描述

以节肢动物为载体的病毒(虫媒病毒)是天然通过吸血昆虫来传播的病毒。这些病毒有许多具有膜双层带有整合膜蛋白，它构成了病毒颗粒的包膜(披膜病毒)(Schlesinger，S.和M.J.Schlesinger，1990)。

总地来说，以节肢动物为载体的病毒是全世界人类和动物中仅次于疟疾的昆虫传播疾病和致死的根源(Berge A.O.1975)。这些病毒有东部、西部和Venezuelan马脑炎病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒、San Angelo热病毒和黄热病毒。另外由于蚊载体白纹伊蚊(Aedes albopictus)的引入(Sprenger和Wuithiranyagool，1985)，在北美洲再次出现由这些病毒引起的疾病(NIAID的特别工作组关于微生物学和传染病的报告，1992年，NIH出版社No.92-3320)。

它们的特征是，虫媒病毒必须能在无脊椎昆虫和哺乳动物宿主二者的组织中复制(Brown，D.T.，和L.Condreay，1986，Bowers等人，1995)。这两种宿主细胞系统的遗传学和生物化学环境的不同为能在一个宿主中复制但不能在另一宿主中复制的病毒(宿主范围突变体)的产生提供了基础。

目前，登革热病毒、东部马脑炎病毒乙基其它昆虫携带的病毒在美国再次出现。美国军队和其它政府机构自1960年起就试图制备抵抗这些病毒的疫苗，但是进展很少。因此，现有技术缺乏疫苗来抵抗大多数以节肢动物为载体的病毒和其它包膜病毒。本发明实现了本领域中这一长期以来的需要和愿望。

                                发明概述

本发明的一个目的是提供一种经基因工程改造的有包膜病毒，其中病毒编码的跨膜蛋白有一个或多个氨基酸缺失，因而该跨膜蛋白当工程改造的病毒在昆虫细胞中复制时能跨越病毒膜，而当病毒在哺乳动物细胞中复制时，该跨膜蛋白不能跨越病毒膜。本发明此目的的一个实例提供的以节肢动物为载体的病毒是经基因工程改造的包膜病毒。另外，在更佳的实例中，虫媒病毒可以选自披膜病毒、黄病毒和布尼亚病毒，和能在哺乳动物和昆虫细胞中天然复制的所有其它有包膜的病毒，以及通过基因工程改造病毒或细胞而能在哺乳动物和昆虫细胞中复制的有包膜的病毒。

在本发明的其它实例中，提供了从基因工程改造的膜结合病毒生产用于哺乳动物疫苗接种的病毒疫苗的方法，该方法包括下列步骤：对病毒跨膜蛋白作基因工程改造使得缺失一个氨基酸，以产生工程改造的病毒，其中当工程改造的病毒在昆虫细胞中复制时，跨膜蛋白能跨越包膜，而当该病毒在哺乳动物细胞中复制时，跨膜蛋白不能跨越包膜，其中病毒保留了在昆虫细胞中复制的能力；将该突变病毒导入昆虫细胞；并使突变病毒在昆虫细胞中复制，以产生病毒疫苗。

在本发明的另一个实例中，提供了一种对个体接种疫苗的方法，该方法包括下列步骤：将本发明的病毒疫苗导入哺乳动物细胞中，导致细胞和组织非产毒性感染，以引起免疫监视。

最后，本发明还有一个目的是提供一种从基因工程改造的膜结合病毒来产生病毒疫苗的方法，所述疫苗针对由野生蚊群传播给哺乳动物的疾病，该方法包括下列步骤：对病毒跨膜蛋白作基因改造使得缺失一个氨基酸，以产生工程改造的病毒，其中当工程改造的病毒在蚊细胞中复制时，该跨膜蛋白能跨越包膜，但当病毒在哺乳动物细胞中复制时，该跨膜蛋白不能跨越包膜，其中病毒保留了在野生蚊细胞中复制的能力；将突变的病毒导入野生蚊群中；和使突变的病毒在野生蚊群的细胞中复制，产生一群携带该病毒疫苗株且排除野生型(病原性)病毒的蚊子，从而通过蚊子叮咬将疫苗传输给受叮咬的哺乳动物。

本发明的其它和进一步的方面、特征和优点可以从下文描述的本发明较佳实例中明显得出。给予这些实例的目的只是为了公开。

                            附图简述

本文包括附图，以使本发明的上述特征、优点和目的清楚并能被详细了解。这些附图构成了说明书的一部分。然而，应当注意，附图描述了本发明的较佳实例，不应被认为限制了本发明的范围。

图1显示了从转染的组织培养细胞回收得到的放射性标记的辛德比斯病毒蛋白的结果。如实施例3所述，用放射活性氨基酸标记下列细胞：(1)模拟转染的BHK-21细胞，(2)突变体A391 RNA转染的细胞，和(3)Δ391 RNA转染的白纹伊蚊细胞。转染后24小时，如实施例4所述用病毒特异性抗血清使蛋白沉淀。本图显示了经缺失突变体RNA转染的BHK-21细胞和白纹伊蚊细胞产生了三个病毒结构蛋白E1，E2和C，这些在模拟转染的细胞中没有检测到。

图2a和2b是以辛德比斯病毒缺失突变体Δ391的RAN转染的BHK-21细胞(2a)和白纹伊蚊细胞(2b)的电子显微照片。如实施例2所述的那样转染细胞。BHK-21细胞(a)显示了细胞质中成簇病毒核心结构(A)，即使这些细胞没有产生成熟的病毒(表1)。白纹伊蚊细胞(b)也产生了成簇的病毒核心部分；但是，发现这些核心部分类似于BHK-21细胞(A)中的核心那样游离于细胞质中，并且还发现和细胞膜(B)结合。后一种情况在BHK-21细胞中没有看到，这表明糖蛋白E1和E2尽管存在却没有起结合它们的作用。

图3显示了辛德比斯病毒糖蛋白在整合入ER中后的构型。该蛋白是一种多次通过(multipass)的蛋白，它有6个膜跨越结构域(编号为1-6)。1是原始整合的信号序列。2是第一个E2跨膜结构域(TMD)。3是第二个E2 TMD。4是第一个6k TMD。5是第二个6k TMD。6是E1 TMD。S是信号肽酶断裂的位点。

图4显示E2跨膜结构域中缺失的氨基酸。缺失序列显示在合适的氨基酸下，范围从1个缺失到16个缺失。从核苷酸9787开始的组氨酸和脯氨酸序列在该蛋白的管腔侧，但被用来涉及诱变引物。

                            发明详述

本领域技术人员显然明白在不脱离本发明的范围和精神下可对本文公开的发明作各种替换和修改。

本文所用的术语“膜结合病毒”指含有脂膜双层作为其保护性外壳一部分的病毒。

本文所用的术语“病毒包膜”指含膜病毒的脂膜成分及其伴随的蛋白。

本文所用的术语“以节肢动物为载体的病毒”或“虫媒病毒”指能在节肢动物(昆虫)或哺乳动物细胞中复制和产生子代病毒的病毒。它包括披膜病毒、黄病毒和布尼亚病毒。

本文所用的术语“披膜病毒”指总的一类含有膜的病毒，它包括甲病毒属。

本文所用的术语“膜双层”指由相对的两性磷脂组成的一种结构。双层在剖面中排列成从极性头部基团—非极性碳链—非极性碳链—极性头部基团。

本文所用的术语“糖蛋白跨膜区”指膜整合蛋白跨越膜双层的区域的氨基酸序列。

本文所用的术语“病毒疫苗”指具有病毒的抗原性但是不能产生疾病的病毒株或病毒突变体。

本文所用的术语“免疫监视”指血液淋巴细胞监视哺乳动物的细胞和组织以确定外来(病毒)蛋白的存在，并刺激产生能靶向产生外来蛋白细胞的淋巴细胞，对其进行破坏的过程。该过程还导致产生抵抗外来蛋白的循环性抗体。

本文所用的术语“感染性病毒颗粒”指能进入细胞并产生病毒蛋白的病毒，无论它们是否能产生子代病毒。

本文所用的术语“非感染性病毒颗粒”指不能感染或进入细胞的病毒。

本文所用的术语“脊椎动物细胞”指任何哺乳动物细胞。

本文所用的术语“无脊椎动物细胞”指任何昆虫细胞。

本发明涉及一种基因工程改造的包膜病毒，其中病毒编码的跨膜蛋白缺失一个或多个氨基酸，因而该跨膜蛋白在工程改造的病毒在昆虫细胞内复制时能跨越病毒膜，而当病毒在哺乳动物细胞中复制时，该跨膜蛋白不能跨越病毒膜。本发明此目的的一个实例提供的以节肢动物为载体的病毒选白披膜病毒、黄病毒和布尼亚病毒，和能在哺乳动物和昆虫细胞二者中天然复制的所有其它有包膜的病毒，以及通过基因工程改造病毒或细胞能在哺乳动物和昆虫细胞中复制的有包膜的病毒。

本发明还涉及一种从基因工程改造的膜结合病毒生产用于哺乳动物疫苗接种的病毒疫苗的方法，该方法包括下列步骤：对病毒跨膜蛋白作基因工程，使得缺失一个氨基酸，以产生工程改造的病毒，其中当工程改造的病毒在昆虫细胞中复制时，跨膜蛋白能跨越包膜，而当该病毒在哺乳动物细胞中复制时，跨膜蛋白不能跨越包膜，其中病毒保留了在昆虫细胞中复制的能力；将突变的病毒导入昆虫细胞，导致产生能用作疫苗的突变病毒。

另外，本发明还提供了一种对个体进行疫苗接种的方法，该方法包括下列步骤：将本发明的病毒疫苗导入个体的细胞中；和使疫苗在个体内产生能引起免疫监视的病毒蛋白。

另外，本发明还提供了一种生产针对野生蚊群所传播疾病的病毒疫苗的方法，该方法包括下列步骤：在对病毒跨膜蛋白作基因改造使得缺失一个氨基酸，以产生工程改造的病毒，其中当所述工程改造的病毒在蚊细胞中复制时，该跨膜蛋白能跨越所述包膜，但当所述病毒在哺乳动物细胞中复制时，所述跨膜蛋白不能跨越所述包膜，其中病毒保留了在蚊细胞中复制的能力；将突变的病毒导入野生蚊群中；和使突变的病毒在野生蚊群的细胞中复制，产生一群携带病毒疫苗株且排除野生型(病原性)病毒的蚊子，从而通过蚊子叮咬将疫苗传输给受叮咬的哺乳动物。

根据本发明，可以采用本领域技术人员已知的常规的分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中有充分描述。例如参见，Maniatis，Fritsch &Sambrook，《分子克隆实验手册》(1982)；《DNA克隆实践方法》，第I和II卷(D.N.Glover编辑，1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑，1984)；《核酸杂交》(B.D.Hames& S.J.Higgins编辑，(1985))；《转录和翻译》(B.D.Hames & S.J.Higgins编辑(1984))；《动物细胞培养》(R.I.Freshney编辑，(1986))；《固定化细胞和酶》(IRL Press，(1986))；B.Perbal，《分子克隆实践指南》(1984)。

因此，如果下列术语在本文中出现，它们应具有下述定义。

“载体”是复制子，例如质粒、噬菌体或粘粒，它可以和另一DNA节段相连，以使所连接的节段复制。如果载体的给药能被接受的动物耐受，则称载体是“药学上可接受的”。如果给予的量在生理学上有明显效果，则称该制剂是以“治疗有效量”给予。如果制剂的存在导致哺乳动物受体生理学上发生变化，则该制剂有生理学意义。例如，在治疗病毒感染时，能降低感染程度或减少由感染而引起的生理性伤害程度的化合物将被认为是在治疗上有效的。

“DNA分子”指单链形式或双链螺旋形式的脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)的聚合物形式。该术语仅仅指分子的一级和二级结构，而不限于任何特定的三级形式。因此，该术语包括，特别是在线性DNA分子(如限制性片段)、病毒、质粒和染色体中发现的双链DNA。在讨论本文的结构时，根据常规，只给出了沿DNA非转录链(即序列与mRNA同源的链)5′至3′方向的序列。

DNA“编码序列”是当置于合适调控序列控制下能在体内转录并翻译成多肽的双链DNA序列。编码序列的边界由5′(氨基)端起始密码子和3′(羧基)端翻译终止密码子确定。编码序列可包括(但不局限于)原核序列、真核mRNA的cDNA、来自真核(例如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列，甚至是合成的DNA序列。聚腺苷酸化信号和转录终止序列通常位于编码序列的3′端。

转录和翻译控制序列是DNA调控序列，例如为编码序列在宿主细胞内表达所提供的启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、终止子等。

“启动子序列”是能结合细胞内RNA聚合酶并引发下游(3′方向)编码序列转录的DNA调控区域。为了对本发明作定义，启动子序列的3′端与转录起始位点相连，并向上游(5′方向)延伸包括了最少数量的引发高于背景可检测转录水平所需的碱基或元件。在启动子序列中会发现一个转录起始位点(常用核酸酶S1图谱来确定)，以及负责结合RNA聚合酶的蛋白结合结构域(共有序列)。真核启动子通常(但并不总是)含有“TATA”盒和“CAT”盒。可用各种启动子来驱动载体。

本文所用的术语“寡核苷酸”或“探针”指包含核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的分子。寡核苷酸或探针的确切大小取决于许多因素，而这些因素则取决于寡核苷酸的最终功能和用途。探针的长度并不关键，但通常包含至少大约12个碱基，更通常地包括至少约16个碱基，探针与细菌基因组的部分基本上互补；然而，探针不需要和基因组完全互补。探针可用合适的合成技术合成制得，最可能的是包括一个可检测的标记。通常，合成的序列在常见的、公众能获得的克隆载体和合适的宿主中扩增，以获得大量的探针。扩增的载体本身可被标记用作探针，或可以切下含有互补链的更短的片段并标记。在上述文献(同上)和授予Falkow等人的美国专利No.4,358,535中描述了制备核苷酸探针的方法以及用核苷酸探针进行诊断性测试的方法。

术语“引物”在这里指一种寡核苷酸，无论其是天然存在于纯化的限制性消化物中或是合成的，当将其置于诱导引物延伸产物合成(与核酸链互补)的条件下，即在核苷酸、诱导剂如DNA聚合酶和合适的温度、pH下，它能作为合成的起始点。引物可以是单链或双链的，且必须有足够的长度，以便在诱导剂的存在下引发合成所需的延伸产物。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源及使用方法。例如，对于诊断应用，根据靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有15-25个或更多的核苷酸，但是它也可含有较少的核苷酸。

选择本文的引物，使其与特定靶DNA序列的不同链“基本上”互补。这意味着引物必须足够互补来与它们各自的链杂交。因此，引物序列不需要反映模板的确切序列。例如，非互补性核苷酸片段可与引物的5′端连接，而引物序列的其余部分与链互补。或者，非互补的碱基或更长的序列可散布在引物中，只要引物序列与序列有足够的互补性或与其杂交，从而形成用于合成延伸产物的模板。

本文所用的术语“限制性内切核酸酶”和“限制性酶”指在特异性核苷酸序列处或附近切开双链DNA的细菌酶。

当这种DNA被引入细胞内时，细胞就被外源或异源DNA“转染”。转染性DNA可以或不必整合(共价连接)入细胞的基因组。“克隆”是一群从单个细胞或共同的祖细胞通过有丝分裂获得的细胞。“细胞系”是能在体外稳定生长许多代的原代细胞的克隆。

DNA构建物的“异源”区是在较大DNA分子中可鉴别的DNA节段，其在自然界中没有发现与较大分子连接。因此，当异源区编码哺乳动物基因时，该基因通常被在源生物体基因组中不侧接(flank)哺乳动物基因组DNA的DNA侧接。在另一个例子中，编码序列是一个构建物，其中的编码序列本身在自然界中没有发现(如基因组编码序列含有内含子的cDNA，或含有与天然基因不同的密码子的合成序列)。

预计用本发明的新的突变病毒可以制得药物组合物。在这种情况下，该药物组合物包含本发明的新的病毒以及药学上可接受的载体。本领域技术人员无需过多实验就能很容易地确定此病毒疫苗化合物的合适剂量和给药途径。当用于体内治疗时，本发明的疫苗以治疗有效量给予患者或动物，即，该用量使受治疗个体对具体病毒相关的疾病有了免疫力。通常是肠胃外给药，较佳的是静脉内给药，但是也可适当地采用其它的给药途径。给予疫苗的量通常在大约10³-10⁶pfu/千克患者体重的范围内。给药方案可以持续至使效果达到最优并同时权衡治疗的副作用。见《Remington药物科学》，第17版，(1990)Mark Publishing Co.，Easton，Penn.；和《Goodman和Gilman的治疗剂的药学基础》第8版(1990)Pergmon Press；这两篇文章均纳入本文作参考。对于肠胃外给药，疫苗最通常的是和药学上可接受的肠胃外载体一起被配制在可注射的单位剂型(溶液、悬液、乳剂)中。这些载体宜无毒性，无治疗作用。这些载体的例子是水、盐水、Ringer′s溶液、葡聚糖溶液和5％人血清白蛋白。

本发明的疫苗依据的是包膜病毒的蛋白的跨膜结构域中的缺失突变。产生这些突变的策略所根据的是下列信息：与哺乳动物细胞膜不同，昆虫细胞的膜不含胆固醇(Clayton 1964，Mitsuhashi等人，1983)。膜中胆固醇的存在通常使得膜较厚，厚度随着胆固醇量的增加而增加(Bretscher，1993)。许多包膜病毒在它们的表面有膜糖蛋白，这些糖蛋白负责鉴别和感染靶细胞(Schlesinger，S.和M.J.Schlesinger，1990)。这些膜糖蛋白有疏水性的跨膜结构域，这些结构域将蛋白锚定在膜双层中(Rice等人，1982)。

这些跨膜蛋白的跨膜结构域必须长得足以从双层的一侧到达双层的另一侧，以将蛋白固定或锚定在膜中。实验已经表明，如果此种结构域由于结构域中缺失氨基酸而缩短，则蛋白质就不能和膜恰当地连接并将掉落(Adams和Rose，1985)。

由于昆虫的膜中没有胆固醇，因此昆虫产生的病毒膜横截面将比哺乳动物产生的病毒膜薄。由于昆虫的膜较薄，因此整合入昆虫膜的蛋白质的跨膜结构域不需要象整合入哺乳动物膜的那些蛋白质的结构域那样长。因此，就可能在工程改造的病毒中产生缺失，除去病毒糖蛋白跨膜结构域中的氨基酸。这样就产生了一种糖蛋白，该糖蛋白能正常地整合入在昆虫细胞内复制的病毒的膜中，但是不能正常地整合入在哺乳动物中复制的病毒的膜中。这样，产生了象其亲代野生型病毒在昆虫宿主中一样在昆虫细胞中复制的突变病毒。另一方面，在哺乳动物中，突变病毒能感染宿主产生病毒蛋白；然而，由于突变的病毒糖蛋白不能跨越和锚定在哺乳动物膜中，因此哺乳动物细胞中不能产生子代病毒。本发明方法的另一个优点是突变体被改造成缺失突变体，因此绝没有机会回复成野生型表型(这是病毒疫苗的一个常见的问题)。

本发明预计的疫苗适用于在脊椎动物和无脊椎动物细胞中生长的任何包膜的病毒。实际上，本发明适用于能被改造成在昆虫细胞中生长的包膜病毒，或在基因工程修饰的昆虫细胞中生长的包膜病毒。

给予下列实施例是为了描述本发明的不同实施方案，并不是为了以任何方式限制本发明：

                                实施例1

用前述的α辛德比斯病毒的全长克隆(Liu等人，1996，Rice等人，1987)，构建病毒糖蛋白E2的氨基酸序列，序列中缺失除去1编码391位赖氨酸的3个碱基。此赖氨酸是此蛋白推定的跨膜结构域的一部分(1982)。

用定点诱变方法在Toto1101中产生一个缺失型突变体(Lys391)，Toto1101是一种含有全长辛德比斯cDNA和SP6启动子的质粒，它能用来体外从该克隆转录感染性RNA(Rice等人，1987 Liu和Brown，1993a)。采用以前描述的(Liu和Brown，1993a)PCR诱变(Sarkar和Sommer，1990)巨大引物(megaprimer)方法，除去Toto1101的cDNA克隆中的三个核苷酸，核苷酸(nt)9801、9802、9803，导致除去密码子AAA(K391)。

用30个碱基寡核苷酸序列5′CTCACGG CGCGCAC AGGCACA TAACACTGC3′(SEQ ID NO：1)作为诱变引物。该引物和“正向引物”5′CCATCAAGCAGTGCGTCG3′(SEQ ID NO：2；18聚体)一起产生了一个518碱基的“巨大引物”(核苷酸9295-9813)。第二个PCR反应包括0.5微克巨大引物、100微克Toto1101模板和0.5微克“反向引物”5′GGCAGT GTGCAC CTTAAT CGCCTGC 3′(SEQ ID NO：3)。所有PCR反应采用30轮95℃1分钟、64℃1分钟、72℃1分钟的循环，以及最后于72℃培育8分钟。用BCL I和SPL切割所得PCR产物(1149核苷酸)，并插入Toto 1101中对应位点中，产生缺失突变体K391。在用测序酶^TM(U.S.Biochemical，Cleveland，OH)以双脱氧核苷酸测序法通过整个亚克隆区确认缺失后，在体外用SP6聚合酶转录感染性RNA，并导入(转染入)BHK-21细胞中。

                            实施例2

体外转录和RNA转染

如以前所述的那样(Rice等人，1987)，用XhoI使含有辛德比斯病毒K391或野生型RNA的全长cDNA拷贝的质粒DNA线性化，并在体外用SP6 RNA聚合酶转录。1微克Xho I线性化K391 cDNA或野生型辛德比斯病毒cDNA在以下缓冲液中进行转录：反应体积为20微升的缓冲液中含有80mM Hepes pH7.5，12mM MgCl，10mM DTT和2mM亚精胺和100微克BSA、ATP、UTP、CTP各3mM，1.5mM GTP和4.5mM m7 GpppG，20单位SP6 RNA聚合酶和20单位RNA酶抑制剂。37℃培育2小时后，使2微升RAN产物在1％琼脂糖凝胶上跑电泳来测定RNA的产生。

用突变型或野生型克隆衍生的RNA转染乳仓鼠肾(BHK21)细胞和白纹伊蚊(蚊)细胞。蚊细胞转染的进行采用重悬于含20mM Hepes pH7.05，137mM NaCl，0.7mMNa₂HPO₄和6mM葡聚糖的电泳缓冲液中的5×10⁶细胞。发现对于这些最优的电泳参数为2Kv，25μF，I电阻。37℃培育转染的细胞直至观察到细胞病变效应(约24小时)。

培育24小时后，收集感染的细胞系以及RAN未转染对照的培养基。通过在蚊细胞和BHK-21细胞单层上进行噬斑试验(Renz和Brown，1976)，测定各细胞系培养基中感染性病毒的存在(表1)。

                            表1

          辛德比斯病毒野生型或突变型K391转染BHK21

            细胞或白纹伊蚊细胞而产生的感染性病毒

  转染的细胞系  BHK模拟^a转染BHK，用野生型RNA BHK，用K391 RNA    AA模拟转染AA，用野生  型RNAAA，用K391    RNA在BHK上测定的培养    基的滴度  未检测  到病毒5×10⁷感染性病毒/毫升  未检测  到病毒  未检测  到病毒2×10⁷感染性病毒/毫升  未检测  到病毒在白纹伊蚊细胞上测定的培养基的滴度未检测到病毒8×10⁷感染性病毒/毫升  未检测  到病毒  未检测  到病毒4×10⁷感染性病毒/毫升1×10⁷感染性病毒/毫升

a.模拟表明转染过程的进行没有用RNA

如表1所示，突变型K391仅仅在昆虫细胞中复制时才产生感染性病毒颗粒。该病毒进而仅仅在蚊细胞中产生噬斑。当试验结束时，K391转染的BHK细胞在BHK或白纹伊蚊细胞中均没有产生可检测的病毒。如果用转染的蚊细胞产生的病毒感染BHK的培养物，则没有产生可检测的病毒。编码野生型病毒的RNA产生了感染性病毒，该病毒进而在两个细胞系中均产生了噬斑(表1)。

                            实施例3

病毒蛋白的代谢性放射活性标记：

如上所述，用野生型或K391突变型RNA转染25cm²瓶中的BHK21细胞亚铺满单层。使单层在含有1％FCS、2mM谷氨酰胺和5％TPB的无甲硫氨酸、无半胱氨酸培养基(MEM-E)(饥饿培养基)中饥饿30分钟。转染后16小时，用含有50μCi/ml[³⁵S]Met/Cys蛋白标记混合物的饥饿培养基脉冲标记细胞20分钟。通过用含有75微克/毫升放线菌酮的PBS洗涤单层来终止标记。在含有10倍正常浓度的甲硫氨酸和半胱氨酸以及75微克/毫升放线菌酮的培养基中追踪(chase)单层(的放射活性)45分钟。

                            实施例4

免疫沉淀和聚丙烯酰胺凝胶电泳：

如Knipfer和Brown，1989年所述的那样，用抗血清免疫沉淀放射性标记的病毒蛋白。在冷的PBS中洗涤[³⁵S]Met/Cys标记的细胞两次，并在裂解缓冲液(0.5％NP-40，0.02M Tris HCl pH7.4，0.05M NaCl，0.2mM PMSF，0.2mM TPCK和0.02mM TLCK)中裂解。离心沉淀胞核弃去。用悬浮在裂解缓冲液中的100微升蛋白A/Sepharose珠(Sigma)预先吸收上清液1小时，沉淀珠粒。用200微升偶联了家兔抗SVHR血清或E2尾单特异性多克隆血清的蛋白A/Sepharose珠粒处理4℃搅拌过夜预先吸收上清液。用裂解缓冲液洗涤免疫沉淀的珠粒—抗体—蛋白复合物三次，然后溶解在含有12％甘油、4％SDS、50mM Tris pH6.8、5％巯基乙醇和0.02％溴酚蓝的SDS-PAGE样品缓冲液中。95℃加热样品3分钟，离心除去样品中的珠粒。如前所述(Liu和Brown，1993 a，b)，在10.8％SDS-PAGE或16％Tricine凝胶上进行凝胶电泳。如Bonner和Laskey，1974所述的那样进行荧光照相，并使干燥的凝胶曝光Kodak XAR-5胶片(见图1)。

                            实施例5

投射电镜术

在所需时间点通过胰蛋白酶处理从瓶中取出转染蚊细胞产生的K391感染的或K391 RNA转染的BHK-21细胞单层，通过低速离心沉淀细胞。用PBS洗涤细胞沉淀两次，并在4％戊二醛中4℃固定过夜。然后用0.2M卡可酸盐缓冲液(pH7.2)洗涤细胞三次，后用2％四氧化锇室温固定1小时，用卡可酸盐缓冲液洗涤三次。细胞用0.5％乙酸双氧铀室温下整体染色1小时。洗涤三次后，将细胞沉淀包埋在1％琼脂糖中，并通过分级的乙醇/丙酮系列脱水。最终的包埋是用Mollenhauer′s(1964)Epon-Araldite环氧混合物#1于70℃进行两天。在Sorvall MT5000显微切片机上切下超薄切片，并收集在150目铜网格上。切片用1％乙酸双氧铀和/或柠檬酸铅染色，并在Jeol 100CX投射电镜中照相(见图2)。

尽管K391病毒感染的或K391 RNA转染的BHK细胞没有产生可被噬斑试验检测的病毒，但PAGE显示，它们确实产生了所有的病毒结构蛋白(图1)。另外，电子显微镜显示，它们装配成胞内(非感染性)病毒核心(图2)。

                            实施例6

辛德比斯缺失型突变体K391和其它披膜病毒中产生的类似突变的应用

当允许K391在蚊细胞中复制时，它产生了辛德比斯病毒颗粒。蛋白的外露区域(胞外结构域)为野生型序列。这些野生型蛋白允许病毒进入哺乳动物细胞并产生病毒蛋白(见图1)，但是如图2的电子显微镜照片所显示，并没有装配成新的病毒。

K391是一种疫苗株。它在培育的昆虫细胞中产生的浓度很高。然而，当病毒注入哺乳动物宿主中时，该病毒在哺乳动物宿主体内循环并感染细胞，这些被感染的细胞产生并呈递引起免疫监视的病毒蛋白，但是，由于其膜结构域截短，感染局限于开始时被接种物感染的那些细胞。因为该疫苗株是缺失突变产生的，因此不可能回复成野生型致病性表型。

进而，可以将工程改造的缺失突变体导入野生蚊群中。已表明，这些病毒通过卵巢传递过程从雌性亲代传播给子代(Leakey 1984)。当这些蚊子叮咬脊椎动物时，它们将提供免疫剂量(10⁶感染性颗粒)的疫苗株(例如K391)。Karpf和Brown(1997)已经证明，一种甲病毒感染昆虫细胞可长时间(在细胞培养物中超过两年，而蚊子的寿命为28天)防止该细胞被另一种甚至是远缘关系的甲病毒感染。因此，疫苗株(例如辛德比斯K391)的存在将通过这些昆虫来阻断其它相关的和致病性病毒的传播。

                            实施例7

其它缺失突变

制备了辛德比斯病毒糖蛋白E2跨膜结构域中的其它缺失突变。产生这些缺失突变的方法如下所述。针对含膜辛德比斯病毒的膜模型描述了这些过程，然而，该程序也易应用于其它病毒膜糖蛋白。

将辛德比斯病毒的包膜糖蛋白以具有6个跨膜结构域的多次通过蛋白形式整合入内质网的膜中。因此，可以有6个潜在的产生缺失突变的靶标来防止跨膜结构域的正确整合(见图3)。这些目标中有一些不如其它目标那样适用于此过程。TMD#1(图2)是信号序列，它被信号识别颗粒识别，并指导ER的膜蛋白质合成。截短这一结构域可能扰乱在哺乳动物和昆虫细胞中的寻靶作用。TMD#3含有识别并结合壳蛋白的E2蛋白的序列。已经表明，这个相互作用性质上非常特异，并需要在跨膜结构域中有该序列(Liu等人，1996；Lopez等人，1994)。因此，象TMD#1一样，TMD#3具有功能性和结构性成分。该结构域中的明显缺失可能会消除两种细胞系统中的出芽。这样就留下了四个跨膜结构域可以作为产生影响膜整合的缺失的目标(图3，TMD2、4、5、6)。

6k蛋白不是成熟病毒的成分，它在病毒装配中的功能还不清楚。在多蛋白中，6k蛋白在ER膜中的适当整合和取向对于E1的正确整合很关键。6k跨膜结构域(TMD4和5)是进行缺失突变的优秀的靶标，因为这些结构域中的一个不整合就可能会使多蛋白以错误的构型整合入膜中，或使其不能整合E1。TMD2和6是E2和E1的跨膜结构域，它们均是进行缺失突变的明显目标。此多蛋白中的多个跨膜结构域提示，如果单个跨膜结构域中的缺失突变不能完全阻断哺乳动物细胞的病毒产生，则其它跨膜结构域中的缺失能进一步将成熟化降低到可忽略的水平。

                            实施例8

E2疏水性膜锚着点(TMD#2)的诱变引物的设计

下面给出了测试E2的跨膜结构域上的需求的流程(图3，TMD2)。该流程容易重复用于任何其它的辛德比斯跨膜结构域或任何其它病毒糖蛋白的跨膜结构域。疏水性的辛德比斯PE2膜锚着点由26个氨基酸组成。和其它跨膜结构域一样，甲病毒之间保守的氨基酸同源性很低，但是此疏水性区域长度却是高度保守的(Strauss和Strauss，1994)。此结构域缺乏序列保守性提示，该结构域的疏水性质才是整合的关键，而不是其序列。

E2的跨膜结构域从PE2序列的氨基酸365开始。此疏水性区域包括以下序列：VYTILA VASATV AMMIGVTVAV LCAC(SEQ ID NO：4)。Adams和Rose(1985)证实，为适当锚着在哺乳动物细胞，VSV G蛋白的跨膜结构域中需要最少14个氨基酸。因此，已经设计了在E2跨膜结构域中产生一系列嵌套缺失的诱变性引物。以缺失16个氨基酸开始(在疏水性区域中留下10个氨基酸)，构建了自膜锚着点开始从多达16个氨基酸缺失到少至1个氨基酸缺失的一组缺失(图4)。

用PCR巨大引物诱变方法构建缺失，产生含有唯一的BclI和SplI位点的缺失片段。将得到的所有构建物置入野生型辛德比斯cDNA构建物Toto Y420中，产生突变型质粒。在用XhoI线性化并用SP6聚合酶转录后，将转录本电穿孔转染入BHK或白纹伊蚊细胞中(如上所述)。在BHK和C710蚊细胞上测定这些转染产生的感染性病毒的滴度，以确定这些构建物的宿主范围。表2显示了用于其构建的缺失序列和引物序列。

对于每个构建物，采用相同的引物对来产生完整的BclI到SplI区域。正向引物E1Bcl21包含核苷酸9306-9327的序列，从5′到3′读为GCGTC GCCTA TAAG AGCGACC(SEQ ID NO：5)。反向引物Splext包含核苷酸10420-10444的序列，它是互补的序列，从5′到3′读为CAGTGT GCACCT TAATCG CCTGC(SEQ ID NO：6)。

象对突变体E2 ΔK391那样，测试转染昆虫细胞产生的病毒在BHK和C7-10蚊细胞中产生噬斑的能力。用免疫荧光试验测试感染单层，测试在BHK细胞中不产生噬斑的那些突变体相对于野生型病毒的感染BHK细胞的能力。将后一试验与突变体及野生型病毒的纯化制备物中的总蛋白比较，以建立每个突变群体的相对感染性。目的是尽可能多地截短跨膜结构域，并仍然在C7-10蚊细胞单层中获得合理量的病毒，该病毒能感染但不在BHKH细胞中产生成熟病毒。如果出现这样的情况，即单个跨膜结构域的截短减少但不消除BHK细胞中的病毒生长，则截短第二个结构域，并这样做直到四个结构域。

                            表2

            辛德比斯病毒E2中的缺失和所用引物的名单表

设计的引物    缺失的核苷酸      诱变引物的序列

E2TM10        9734-9782         ACATAACACTGCGATGGTGTACAC

                                (SEQ ID No.：7)

E2 TM12       9740-9782         ACATAACACTGCGGCTAAGATGG

                                (SEQ ID No.：8)

E2 TM14       9746-9782         ACATAACACTGCTGCGACGGCT

                                (SEQ ID No.：9)

E2 TM16       9743-9773         GCAACAGTTACGACGGCTAAG

                                (SEQ ID No.：10)

E2 TM17       9743-9770         ACAGTTACGCCGACGGCTAAG

                                (SEQ ID No.：11)

E2 TM18       9743-9767         GTTACGCCAATGACGGCTAAG

                                (SEQ ID No.：12)

E2 TM19       9743-9764         CGCCAATCATGACGGCTAAGA

                                (SEQ ID No.：13)

E2 TM20       9755-9773         GCAACAGTTACGGTAGCTGA

                                (SEQ ID No.：14)

E2 TM21       9755-9770         AGTTACGCCGGTAGCTGA

                                (SEQ ID No.：15)

E2 TM22       9761-9773         TGCAACAGTTACCGCCACGGT

                                (SEQ ID No.：16)

E2 TM23       9761-9770         ACAGTTACGCCCGCCACGGT

                                (SEQ ID No.：17)

E2 TM24       9761-9767         GTTACGCCAATCGCCACGGT

                                (SEQ ID No.：18)

E2 TM25       9761-9764         ACGCCAATCATCGCCACGGT

                                (SEQ ID No.：19)

本发明描述的此流程适用于在昆虫和哺乳动物体内复制、且具有整合膜蛋白作为其结构一部分的任何病毒，即披膜病毒、黄病毒和布尼亚病毒，能在哺乳动物和昆虫细胞中天然复制的所有其它有包膜的病毒，以及能通过基因工程改造病毒或细胞而在哺乳动物和昆虫细胞中复制的有包膜的病毒。

通过除去病毒包膜的蛋白的跨膜结构域中的氨基酸，制得针对任何含膜病毒的疫苗。这通过除去所述病毒的cDNA克隆中的碱基来实现。将改变的克隆转录出的RNA转染入昆虫细胞内。通过在昆虫细胞中重复生长至获得大量突变型病毒来扩增产生的病毒。测试该病毒感染哺乳动物细胞并在其中产生子代的能力。测试在哺乳动物细胞中不产生子代的病毒在实验动物体内产生免疫力的能力。确实产生免疫力的那些病毒就是用于生产本领域中已知的人和动物疫苗的候选物。该流程可用于任何虫媒病毒或其它有包膜的病毒。

本文引用了下列参考文献：

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NIAID的特别工作组关于微生物学和传染性疾病的报告，1992年，NIH出版号92-3320

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Rice.，C.M.，R.Levis，J.H.Strauss，和H.V.Huang.1987.″从辛德比斯病毒cDNA克隆产生感染性RNA转录本：致死性突变的图谱，温度敏感型标记的挽救，和体外诱变以产生定义的突变体″J.Virol.61：3809-3819.

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本说明书中提及的任何专利或出版物表现出本发明所属领域技术人员的水平。另外，这些专利和出版物在本文以相同程度作引证参考，就如每个单独的出版物特别单独纳入本发明作参考一样。

本领域技术人员容易理解，本发明能改变成用来实现本文所提到的和隐含的目的、最终产品和优点。本发明的实施例以及本文描述的方法、步骤、处理过程、分子和特定的化合物是较佳实例的代表，是典型的例子，并不是要限制本发明的范围。本领域技术人员可在权利要求范围确定的本发明精神范围内作变化和其它应用。

                                序列表

<110>Brown，Dennis T.

     Hernandez，Raquel

<120>用节肢动物为载体的病毒生产疫苗

<130>D6123

<140>

<141>1998-09-18

<150>US 60/059,668

<151>1997-09-18

<160>34

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>和“正向引物”一起用作诱变引物，以产生对

     应于核苷酸9295-9813的518碱基″巨大引物″

<400>1

ctcacggcgc gcacaggcac ataacactgc                    30

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作“正向引物”和诱变引物一起产生对应于

     核苷酸9295-9813的518碱基″巨大引物″

<400>2

ccatcaagca gtgcgtcg                                 18

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作“反向引物”和巨大引物以及Toto1101质粒模板一起产生1149

     核苷酸产物，用来产生Toto1101中的缺失突变株K391

<400>3

ggcagtgtgc accttaatcg cctgc                            25

<210>4

<211>26

<212>PRT

<213>辛得比斯病毒

<220>

<222>365..390

<400>4

Val Tyr Thr Ile Leu Ala Val Ala Ser Ala Thr Val Ala Met Met

                5                   10                  15

Ile Gly Val Thr Val Ala Val Leu Cys Ala Cys

                20                  25

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<222>9306-9327

<223>来自巨大引物的正向引物E1Bcl21，和

     反向引物一起用来产生含有独特BclI

     和SplI位点的缺失构建物

<400>5

gcgtcgccta taagagcgac c            21

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<222>10420-10444

<223>来自巨大引物的反向引物Splext，和正向引物

     一起用来产生含有独特BelI和SplI位点的缺

     失构建物

<400>6

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>诱变引物(负链)用来在辛得比斯病毒糖蛋白的

     E2跨膜结构域中产生缺失

<400>7

acataacact gcgatggtgt acac    24

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>诱变引物(负链)用来在辛得比斯病毒糖蛋白的

     E2跨膜结构域中产生缺失

<400>8

acataacact gcggctaaga tgg     23

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>诱变引物(负链)用来在辛得比斯病毒糖蛋白的

     E2跨膜结构域中产生缺失

<400>9

acataacact gctgcgacgg ct            22

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>诱变引物(负链)用来在辛得比斯病毒糖蛋白的

     E2跨膜结构域中产生缺失

<400>10

gcaacagtta cgacggctaa g             21

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>诱变引物(负链)用来在辛得比斯病毒糖蛋白的

     E2跨膜结构域中产生缺失

<400>11

acagttacgc cgacggctaa g             21

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>诱变引物(负链)用来在辛得比斯病毒糖蛋白的

     E2跨膜结构域中产生缺失

<400>12

gttacgccaa tgacggctaa g            21

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>诱变引物(负链)用来在辛得比斯病毒糖蛋白的

     E2跨膜结构域中产生缺失

<400>13

cgccaatcat gacggctaag a            21

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>诱变引物(负链)用来在辛得比斯病毒糖蛋白的

     E2跨膜结构域中产生缺失

<400>14

gcaacagtta cggtagctga              20

<210>15

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>诱变引物(负链)用来在辛得比斯病毒糖蛋白的

     E2跨膜结构域中产生缺失

<400>15

agttacgccg gtagctga                18

<210>16

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>诱变引物(负链)用来在辛得比斯病毒糖蛋白的

     E2跨膜结构域中产生缺失

<400>16

tgcaacagtt accgccacgg t            21

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>诱变引物(负链)用来在辛得比斯病毒糖蛋白的

     E2跨膜结构域中产生缺失

<400>17

acagttacgc ccgccacggt              20

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>诱变引物(负链)用来在辛得比斯病毒糖蛋白的

     E2跨膜结构域中产生缺失

<400> 8

gttacgccaa tcgccacggt            20

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>诱变引物(负链)，用来在辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨

     膜结构域中产生缺失

<400>19

acgccaatca tcgccacggt            20

<210>20

<211>849870

<212>DNA

<213>辛得比斯病毒

<220>

<223>

<400>20

catcctgtgt acaccatctt agccgtcgca tcagctaccg tggcgatgat gattggcgta 60

actgttgcag tgttatgtgc ctgt                                        84

<210>21

<211>28

<212>PRT

<213>辛得比斯病毒

<220>

<222>363..390

<400>21

His Pro Val Tyr Thr Ile Leu Ala Val Ala Ser Ala Thr Val Ala

                5                   10                  15

Met Met Ile Gly Val Thr Val Ala Val Leu Cys Ala Cys

                20                  25

<210>22

<211>27

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜结构域在缺失氨基

     酸378后的序列

<400>22

His Pro Val Tyr Thr Ile Leu Ala Val Ala Ser Ala Thr Val Ala

                5                   10                  15

Met Ile Gly Val Thr Val Ala Val Leu Cys Ala Cys

                20                  25

<210>23

<211>26

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜结构域在缺失氨基

     酸378和379后的序列    

<400>23

His Pro Val Tyr Thr Ile Leu Ala Val Ala Ser Ala Thr Val Ala

                5                   10                  15

Ile Gly Val Thr Val Ala Val Leu Cys Ala Cys

                20                  25

<210>24

<211>25

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜结构域在缺失氨基酸378至

     380后的序列

<400>24

His Pro Val Tyr Thr Ile Leu Ala Val Ala Ser Ala Thr Val Ala

                5                   10                  15

Gly Val Thr Val Ala Val Leu Cys Ala Cys

                20                  25

<210>25

<211>24

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜结构域在缺失氨基酸378至

     381后的序列

<400>25

His Pro Val Tyr Thr Ile Leu Ala Val Ala Ser Ala Thr Val Ala

                5                   10                  15

Val Thr Val Ala Val Leu Cys Ala Cys

                20

<210>26

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜结构域在缺失氨基酸376至

     380后的序列

<400>26

His Pro Val Tyr Thr Ile Leu Ala Val Ala Ser Ala Thr Gly Val

                5                   10                  15

Thr Val Ala Val Leu Cys Ala Cys

                20

<210>27

<211>22

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜结构域在缺失氨基酸376至

     381后的序列

<400>27

His Pro Val Tyr Thr Ile Leu Ala Val Ala Ser Ala Thr Val Thr

                5                   10                  15

Val Ala Val Leu Cys Ala Cys

                20

<210>28

<211>21

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜结构域在缺失氨基酸372至

     378后的序列

<400>28

His Pro Val Tyr Thr Ile Leu Ala Val Met Ile Gly Val Thr Val

                5                   10                  15

Ala Val Leu Cys Ala Cys

                20

<210>29

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜结构域在缺失氨基酸372至

     379后的序列

<400>29

His Pro Val Tyr Thr Ile Leu Ala Val Ile Gly Val Thr Val Ala

            5                   10                  15

Val Leu Cys Ala Cys

            20

<210>30

<211>19

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜结构域在缺失氨基酸372至

     380后的序列

<400>30

His Pro Val Tyr Thr Ile Leu Ala Val Gly Val Thr Val Ala Val

                5                   10                  15

Leu Cys Ala Cys

<210>31

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜结构域在缺失氨基酸372

     至381后的序列

<400>31

His Pro Val Tyr Thr Ile Leu Ala Val Val Thr Val Ala Val Leu

                5                   10                  15

Cys Ala Cys

<210>32

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜结构域在缺失氨基酸373

     至384后的序列

<400>32

His Pro Val Tyr Thr Ile Leu Ala Val Ala Ala Val Leu Cys Ala

                5                   10                  15

Cys

<210>33

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜结构域在缺失氨基酸371

     至384后的序列

<400>33

His Pro Val Tyr Thr Ile Leu Ala Ala Val Leu Cys Ala Cys

                5                   10

<210>34

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜结构域在缺失氨基酸369

     至384后的序列

<400>34

His Pro Val Tyr Thr Ile Ala Val Leu Cys Ala Cys

                5                   10