甲壳素和壳聚糖及其衍生物在制备抗病毒剂中的应用

摘要

本发明涉及甲壳素和壳聚糖及其衍生物在制备抗病毒剂中的应用，本发明通过抗病毒体外实验以及动物实验和组织病理学检查，表明甲壳素和壳聚糖及其衍生物对DNA病毒或RNA病毒或逆转录病毒具有广谱的抗病毒活性，对预防和治疗病毒引起的疾病有良好效果，且没有不必要的毒副作用，可制成抗病毒药剂或消毒剂。

说明书

技术领域

本发明涉及甲壳素和壳聚糖及其衍生物的抗病毒活性，更具体地说，涉及甲壳素和壳聚糖及其衍生物在制备抗病毒剂中的应用。

背景技术

很多折磨人类的重要传染病是由病毒引起的，由一种或多种病毒引起的疾病的流行越来越引起人们的不安。一些传染病之所以重要是由由于它们经常是致命的；这些传染病是狂犬病、天花、脊髓友质炎、肝炎、黄热病、免疫抉损和多种脑炎。其它传染病也重要的原因是它们极具传染性，并会出现急性不适，如流感，麻疹，腮腺炎和水痘，以及呼吸道—胃肠道不适。如风疹的其它传染病和巨细胞病毒可导致先天性异常，肿瘤病毒可导致人和动物的肿瘤和癌症。而目前造成SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome严重急性呼吸系统综合症，俗称非典型肺炎)全球流行的则是SARS病毒——冠状病毒的一个变种。

冠状病毒科的病毒只感染脊椎动物，与人和动物的许多疾病有关。该类病毒具有胃肠道、呼吸道和神经系统的嗜性。已知的“冠状病毒”品种超过20个，有9组基因，会存在于牛、马、狗及禽鸟身上，与人类有关的有3种。它的代表株为禽传染性支气管炎病毒，其它成员有人冠状病毒、鼠肝炎病毒、猪血凝性脑脊髓炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒、初生犊腹泻冠状病毒、大鼠冠状病毒、火鸡蓝冠病毒、猫传染性腹膜炎病毒，可能成员有犬冠状病毒、大鼠涎目腺炎病毒、人肠道冠状病毒。人冠状病毒分别属于OC43和229E两个抗原型，它是引起人类上呼吸道感染的病原，典型的冠状病毒感染呈流涕、不适等感冒症状。不同型别病毒的致病力不同，引起的临床表现也不尽相同，CC43株引起的症状一般比229E病毒严重。冠状病毒是成人普通感冒的主要病原之一，儿童的冠状病毒感染却并不常见。但是，5～9岁儿童有50％可检出中和抗体，成人中70％中和抗体阳性。冠状病毒也是成人慢性气管炎患者急性加重的重要病原。但造成本次传染性非典型肺炎的冠状病毒，其基因构造与现有的3种病毒有所不同，很可能是导致普通感冒冠状病毒的变异种，或由于病毒突破人与动物自然界限，象禽流感一样传染给人。世界卫生组织在2003年4月16日正式确认，引起非典型肺炎的病原体是冠状病毒的一个变种，以前没有在人体发现过。冠状病毒家族的成员一般有29,000至31,000个核苷，SARS病毒的基因排序共有29,727个核苷，在冠状病毒的典型的核糖核酸界值之内。

SARS病毒是一种正链有膜核糖核酸(RNA)病毒，很容易发生变异。据悉，香港大学医学院微生物学系将多个来自香港、广州和美国、加拿大等地的非典型肺炎病毒样本进行比较，竟发现当中6个病毒样本，某一段基因出现不相同的组合，这个发现与一些非典型肺炎患者感染后病情出现极大差异等现象相吻合。事实上，尽管世界卫生组织公布冠状病毒的一个变种是非典元凶，但一些科学家认为，到现在为止，非典的病原体并没有完全查明。

非典型肺炎的治疗，一般重症病人可使用免疫增强药物，如胸腺肽、丙种球蛋白和干扰素等。一般认为，干扰素可使细胞预激，使之在病毒感染时充分表现出抗病毒状态，以达到预防感染、减轻症状、降低发病率、减少病毒排出的效果。干扰素作为是一种细胞调节蛋白，它与人体细胞表面的受体结合后，可以刺激细胞产生多种抗病毒蛋白来杀灭病毒，并且具有提高免疫力的作用。干扰素对目前已知的绝大多数病毒均有抑制作用，是目前国际上公认的具有抗病毒活性的药物，广泛用于治疗慢性乙型、丙型肝炎、肺炎、流行性出血热、病毒性脑膜炎、尖锐湿疣、疱疹等许多病毒性疾病。最近，美国研究人员正在试验一种采用“反义疗法”试制的新药，这种新药含有与非典型肺炎冠状病毒基因排列相对称的核糖核酸单链，能彻底中和病毒的毒性。正如此，这种新药据称能有效攻击传染性肝炎病毒、西尼罗河病毒和非典型肺炎冠状病毒等的核糖核酸(RNA)基因单链，阻止非典冠状病毒基因的复制繁衍过程，从而达到阻止病症发生和恶化的目的。很多中草药如金银花、板蓝根等及中药复方在防治非典型肺炎中发挥了很大的作用，但确切疗效需要进一步研究和证实。

甲壳索(Chitin)又称甲壳质、几丁质、几丁聚糖、壳多糖、乙酰葡萄糖胺等，化学名称为聚-N-乙酰-D-葡萄糖胺，是一种天然生物高分子化合物，广泛存在于虾、蟹等甲壳中，自然界每年生物合成的甲壳索可达数十亿吨，是一种十分丰富的自然资源。由于甲壳索结构中含有多种官能团，因此，具有很强的反应活性，可以发生脱乙酰基、水解、交联、接枝、酰化、醚化、羧甲基化、氧化还原及络合等反应，生成具有不同性能的甲壳素衍生物。其中甲壳素脱去乙酰基后称为壳聚糖(Chitosan)，又称甲壳胺、可溶性甲壳质等，化学名称为(1，4)-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖。壳聚糖含有游离氨基，反应活性和溶解性能均比甲壳素强。甲壳素和壳聚糖因其特殊结构而有较强的生物活性，现已知具有降血脂、降血压、降血糖、增强免疫力、抗菌抗癌等作用。迄今为止的研究表明，甲壳素和壳聚糖及其衍生物未见对人体有明显的毒副作用。郑连英等(材料科学与工程，2000，18(2)：22)报道，在分子量30.5万以下的范围内，随壳聚糖浓度的增加，其抗菌作用的效果增强，当浓度为1.0％时，对革兰氏阳性菌和对革兰氏阴性菌，其抗菌率均达到100％；对革兰氏阳性茵，随壳聚糖的分子量增大，抗菌作用逐渐增强，其原因主要是分子量越大，所形成的外层膜越致密，越能阻止营养物质进入细菌细胞，因而抗菌作用效果更明显。对革兰氏阴性菌，随壳聚糖的分子量越小，抗菌作用逐渐增强，分子量为5000以下，抗菌作用最强。其原因主要是分子量越小，越容易进入细胞壁的空隙结构内，干扰细胞的新陈代谢，杀死细菌。有关甲壳素和壳聚糖及其衍生物抗病毒的报道却较为少见。

本发明的研究表明，甲壳素和壳聚糖及其衍生物具有很好的广谱抗病毒活性，能抑制SARS病毒的活性，可制成优良的抗病毒制剂，可用于治疗流行性感冒、非典型肺炎、慢性乙型、丙型肝炎、肺炎、流行性出血热、病毒性脑膜炎、尖锐湿疣、疱疹等许多病毒性疾病。

发明内容

本发明的目的是提供甲壳素和壳聚糖及其衍生物在预防或治疗人或动物中的病毒感染中的新用途，甲壳素或壳聚糖及其衍生物抗病毒谱广，对SARS病毒有效，对预防和治疗病毒引起的疾病有良好效果，且没有不必要的毒副作用。

本发明的另一个目的是提供由甲壳素和壳聚糖及其衍生物制成的抗病毒药剂或消毒剂，其中含有药物可接受的治疗有效量或消毒有效量的甲壳素或壳聚糖及其衍生物和药物可接受的载体。

本发明通过抗病毒体外实验，包括病毒致细胞病变(CPE)抑制实验、血凝抑制实验、诱生干扰素实验，以及动物实验和组织病理学检查，观察甲壳素或壳聚糖及其衍生物对病毒所致细胞病变的抑制作用，对病毒感染的阻断作用，对病毒的直接杀伤作用。结果表明，甲壳素和壳聚糖及其衍生物具有广谱的抗病毒活性。

本发明所述“病毒”包括但不限于一般的DNA和RNA病毒以及逆转录病毒。DNA病毒包括细小病毒科，乳多空病毒科，腺病毒科，疱疹病毒科，痘病毒科和嗜肝DNA病毒科。RNA病毒包括小RNA病毒科，披膜病毒科，弹状病毒科，正粘病毒科，副粘病毒科，冠状病毒科，呼肠孤病毒科，RNA肿瘤病毒科和线状病毒科。尤其包括DNA病毒类疱疹病毒科、腺病毒科，RNA病毒类的副粘病毒科，正粘病毒科，小RNA病毒科，冠状病毒科，披膜病毒科，弹状病毒科。更加包括疱疹病毒科水痘病毒属的水痘-带状疱疹病毒(VZV)、单纯疱疹病毒属的单纯疱疹病I、II型(HSV-I、II)；腺病毒科腺病毒属的腺病毒3、7型(AdV3、7)；副粘病毒科麻疹病毒属的麻疹病毒(MV)、肺病毒属的小鼠肺炎病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)和副流感病毒-I；正粘病毒科流感病毒属的的流感病毒(A3V)、流感病毒亚甲型鼠肺适应株FM1(用于体内试验)；小RNA病毒科肠病毒属的脊髓灰质炎病毒III型(PVIII)、埃可病毒6、11型(ECH06、11)、柯萨奇B族病毒3、4、5、6型(CVB3、CVB4、CVB5、CVB6)、柯萨奇病毒A16(CVA16)、新型肠道病毒71型(EV71)；冠状病毒科冠状病毒属的SARS病毒；披膜病毒科风疹病毒属的风疹病毒(RV)；弹状病毒科水泡病毒属的水泡性口炎病毒(VSV)。

本发明所述甲壳素和壳聚糖及其衍生物一般分子量在20万以下，以分子量在2万以下、水溶性较好的为佳。甲壳素和脱乙酰度高的壳聚糖都易结晶，不溶于水，而40～80％脱乙酰度，特别是50％左右中度脱乙酰度的甲壳素则有非常好的水溶性，而且分子量越低水溶性越好。与高分子的壳聚糖相比，分子量低于1万的低分子壳聚糖具有更好的溶解性，更高的抗病毒活性。壳寡糖(Chitosan oligosaccharide)，或称几丁寡糖，学名为β-1，4-寡聚-葡萄糖胺，为分子量小于1万的低聚物，在人体内吸收率近100％，抗病毒效果很好。聚合度低于10的低聚甲壳素或壳聚糖，或者它们的盐类如盐酸盐或硫酸盐的抗病毒效果都很好，其中包括双糖和单糖，如壳二糖、2-氨基-D-葡萄糖胺(C₆H₁₁NO₄)、壳糖胺盐酸盐(C₆H₁₃NO₅·HCl)，特别是聚合度为3～7的N-乙酰低聚壳聚糖或脱乙酰的低聚壳聚糖，如壳己糖、壳庚糖的抗病毒效果更为理想。将甲壳素或壳聚糖上的OH基或NH2适当取代后，可制成水溶性较好的甲壳素或壳聚糖衍生物，例如，羧甲基或丁基化，N-季铵盐化，磺化或N-硫酸盐化，羟基化，二(或三)乙氨乙基化等，典型物有N-羧甲基壳聚糖、N-羧苄基壳聚糖、N-羧丁基壳聚糖、N-硫酸盐化壳聚糖、N-季铵盐壳聚糖、羟丙基甲壳素、三乙氨基乙级甲壳素、羧酰化壳聚糖等。另外，通过接枝或复合亦可增加水溶性，但一般以壳聚糖分子量在2万以下为好。

上述甲壳素和壳聚糖及其衍生物具有光谱的抗病毒活性，对DNA和RNA病毒以及逆转录病毒引起的病毒感染有效果，但对某一种病毒而言则不是特异性的，因此对变异后的病毒也有效果。

可使用任何适当的施药类型或模式给哺乳动物，尤其是人提供有效剂量的本发明的甲壳素和壳聚糖及其衍生物药剂。例如，可使用口服，非肠道和局部施药。剂型包括片剂、胶囊、粉末、溶液、分散剂、悬浮液、乳剂、软膏和气雾剂以及外部消毒用药剂等。本发明的药物组合物含有作为有效成分的甲壳素和壳聚糖及其衍生物药剂和药物可接受的载体和任选的含有其它治疗成分。本发明甲壳素和壳聚糖及其衍生物药剂可以与其它药剂联合使用，所述其它治疗成分包括但不限于抗病毒剂、抗癌剂、免疫增强或抑制剂、抗炎剂、细胞因子等。

病毒是一种非细胞形态的微生物，它的感染是分子水平的感染。由于其基因组只含一种类型核酸(RNA或DNA)，体内缺乏产生能量的酶系统，只能寄生在活细胞内依靠宿主细胞提供原料和酶系统进行病毒复制增殖。它通过：①杀细胞效应引起细胞熔解破坏；②整合感染引起宿主细胞癌变；②引起免疫应答导致宿主细胞损伤最终引起相应疾病。本发明的甲壳素和壳聚糖及其衍生物抗病毒活性的可能机制如下：甲壳素和壳聚糖及其衍生物具有强烈的吸附作用，使病毒难以附着和穿入细胞内，影响病毒的复制增殖；甲壳素和壳聚糖及其衍生物激活网状内皮系统和细胞免疫系统，增强巨嗜细胞的吞噬作用，强化免疫功能，使T淋巴细胞释放出多种淋巴因子参与杀伤感染病毒的细胞，并阻止病毒核酸和蛋白质在宿主细胞内组合成病毒体。

具体实施方式

参考下列实施例将更易于理解本发明，给出实施例是为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

实施例一    水溶性甲壳素抗病毒效应

(一)材料与方法

1.细胞Hep-2、Hela、BHK21 3种细胞均用Eagle培养基培养传代；PRK细胞取自5d龄的乳兔。用5％乳蛋白水解物培养。

2.病毒 VZVJ1株滴度为10^-5TCID50/ml，HSV-1滴度为10^-7TCID50/ml，RVGos-10株滴度为10^-6.25TCID50/ml，RVJR23株滴度为10^-5TCID50/ml。

3.药物：水溶性甲壳素，分子量16000～20000，脱乙酰度为60％；无环鸟苷(Acy)，用Hanks缓冲液配制成1g/L，4℃保存备用。

4.细胞毒性试验  每种细胞长成单层后，换成含2％小牛血清的维持液，加入不同浓度的药物，37℃培养96h，每天观察细胞形态变化。

(二)药物抗病毒实验

1.水溶性甲壳素对病毒所致细胞质变(CPE)的抑制作用：每种细胞接近长成单层时接种病毒，同时加入不同浓度的药物，每一浓度4管，用含2％小牛血清的维持液于33℃培养。当病毒对照CPE达++++时，判断结果。

2.水溶性甲壳素对病毒感染的阻断作用：每种细胞形成单层后加入不同浓度的药物，于37℃培养48h，弃掉含药物的维持液，用Hanks缓冲液洗涤3次，加入病毒攻击，在33℃培养72h。

3.水溶性甲壳素对病毒的的直接杀伤作用：将10000mg/L水溶性甲壳素与病毒液等量混合，于37℃分别处理12h和34h，每一时间4管。用混合流接种细胞，在33℃吸附1h，然后用Hanks缓冲液洗涤3次，去掉药物，在33℃培养、双察CPE产生情况。未加药物的病毒用同样方法处理作为对照。

(三)结果

1.水溶性甲壳素对不同细胞的毒性  每一浓度组对每种细胞均无毒性作用。细胞形态正常。提示此药有促进细胞生长的作用。Acy的细胞毒性剂量为5000mg/L。

2.水溶性甲壳素对VZV所致CPE的抑制作用：药物浓度＞100mg/L时，对VZV、HSV所致的CPE有抑制作用，在每种细胞上药物对病毒的作用程度一致，提示此药的抗病毒作用无细胞差异。对RV JR23和RV Gos-10的有效抑制浓度分别为5000mg/L和10000mg/L。

3.水溶性甲壳素对病毒侵入细胞的阻断作用：药物浓度＞5000mg/L时，可减轻和延续VZV引起的CPE，与病毒对照组有明显的差异，提示此药大剂量应用才有阻断感染的作用。

4.水溶性甲壳素对病毒的直接杀伤作用：将10000mg/L的水溶性甲壳素分别与VZV和HSV悬液混合，于37℃作用24h使病毒感染力明显减弱。

本实验表明，水溶性甲壳素在体外有较明显的抗VZV、HSV、RV的作用，且随剂量增加抗病毒作用明显，并能对病毒颗粒产生直接破坏作用和阻断感染的作用，提示其作用的多样性。VZV和HSV属DNA病毒，而RV属RNA病毒，水溶性甲壳素对它们均有作用。表明其抗病毒谱广。

实施例二    壳寡糖抗病毒效应

(一)实验材料

1.药物：壳寡糖，分子量3000～5000。

2.动物：小白鼠，封闭群瑞士种，13～15g，雌雄不拘。

3.病毒：流感病毒亚甲型鼠肺适应株FM1，用于体内试验，为本实验室保存于-60℃低温的毒株；副流感病毒-I、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒3、7型(AdV3，7)、肠道埃可病毒11型(ECHO11)、柯萨奇B族病毒4、5、6型(CoxB4，5，5)、单纯疱疹病I、II型(HSV-I、II)，经传代后使用。

4.细胞：人喉癌传代细胞Hep-2株。

5.细胞培养液：含10％小牛血清、0.29mg/ml谷氨酰胺、100u/ml青、链霉素的Eagles液；细胞维持液；除所含小牛血清为2％外，其它含量均同培养液。

6.标记抗体：羊抗免IgG-FITC，4℃保存备用。

7.免疫血清：用鸡胚尿囊液传代的流感病毒FM1免疫家兔，获得高效价的免疫血清，冻于-60℃冰箱备用。

(二)实验方法

1.壳寡糖对Hep-2培养细胞的毒性试验：将药液以细胞培养液作1∶4～1∶1024倍比稀释，加入列96孔微量培养板已长成Hep-2细胞单层上，每孔加100ul，每个稀释度各加入4孔细胞，同时设正常细胞对照。将培养板置37℃ 5％CO₂培养箱中培育4天，每日用倒置显微镜观察药液对细胞的影响，以细胞不出现退变的最小稀释度判为该药对细胞的无毒界限。

2.壳寡糖对病毒致细胞病变作用的影响：取已长成单层细胞的培养板，倒掉培养液，接种100 TCID₅₀的不同病毒液50ul于细胞孔，每种病毒接种8孔，置37℃ 5％CO₂培养箱中吸附1小时，倒掉病毒液，用维持液洗细胞面3次后，加入1∶256、1∶512稀释度药液100ul。同时设病毒、药液、阳性对照药病毒唑、正常细胞等4个对照组。培养4天，每日用倒置显微镜镜检一次，观察细胞有无病变。连续4天。细胞出现病理变化的程度按以下4级标准记录。+：细胞病变约占整个单层细胞的25％以下；++：细胞病变约占整个单层细胞的50％以下；+++：细胞病变约占整个单层细胞的75％以下；++++：细胞病变约占整个单层细胞的75％以上。根据细胞病变程度，用秩和检验法，比较给药组与病毒对照组有无显著性差异。凡试验孔细胞病变程度与病毒对照组有显著性差异者，判为有抑制作用(+)，否则判为无抑制作用(-)。试验均经2次重复。

3.壳寡糖对流感病毒感染小鼠所致病毒性肺炎的影响：将小鼠按体重随机分为6组，其中3组分别给予壳寡糖，3组分别为病毒唑组，病毒对照组，正常对照组。对照组给予相同药液容积的蒸馏水。除正常对照组外，将小鼠用乙醚轻度麻醉，以15LD₅₀流感病毒液滴鼻感染，每只0.05ml。从感染前一天开始给药或水，每天2次.每次0.5ml，连续5天，第6天称取体重，解剖取肺称重，肉眼观察肺部病变，记录肺部肝样实变程度，逐个计算肺指数值，并求出肺指数抑制率。肺指数＝肺重(g)/体重(g)×100；肺指数抑制率＝[病毒对照组肺指数均值-试验组肺指数均值]÷病毒对照组肺指数均值×100％，肺指数值大，表示肺重量大，肺病变程度严重。将各组肺指数进行组间t检验。

4.壳寡糖对流感病毒在鼠肺内增殖的影响：除病毒感染量为1000LD₅₀外，动物分组、给药方法等均同上。实验组从感染前一天给予壳寡糖6，12.24g/kg/d，感染病毒后48小时处死小鼠，解剖取肺，摘取左侧中叶肺固定，按病理切片常规脱水、包埋、制作石蜡切片。以间接免疫荧光法染色，以荧光素标记的抗流感病毒血清作示踪原，通过间接免疫荧光结合，观察感染鼠肺内特异性的病毒抗原，判断药物对病毒增殖的作用，荧光阳性率高，表明病毒颗粒增殖多，给药组荧光阳性率降低，表明药物对病毒的复制有抑制效果。具有抗病毒作用。

(三)实验结果

壳寡糖对副流感-1、RSV、ECHO11、CoxB4、B5、B6、HSV-II病毒致细胞病变有抑制作用，当药液浓度增至4mg/ml时，对AdV3、HSV-1病毒也有抑制作用。壳寡糖对流感病毒感染小鼠所致肺病变有抑制作用。壳寡糖对小鼠肺内流感病毒增殖量有显著的作用，具有明显的抗流感病毒效果。

实施例三    聚合度3～7的壳聚糖抗病毒效应

(一)材料与方法

1.细胞系：人羊膜细胞(FL)，人胚肾细胞(293)，人宫颈癌细胞(HeLa)。

2.动物：昆明种小鼠，雌雄各半，18～20g，4周龄。

3.病毒：柯萨奇病毒B3、B4〔CVB3、CVB4〕、柯萨奇病毒A16(CVA16)、新型肠道病毒71型(EV17)、脊髓灰质炎病毒III型(PVIII)、埃可病毒6型(ECHO6V)、腺病毒III型(Adv III)、单纯疱疹病毒I型、II型(HSV-1、HSV-2)、呼吸道合胞病毒(RV)、SARS病毒、流感病毒〔A3V〕、麻疹病毒(MV)、风疹病毒(RV)、水泡性口炎病毒(VSV)。

4.药品和试剂：聚合度3～7的壳聚糖。

(二)仪器与方法

1.仪器：酶标测定仪、LBK紫外可见分光光度计，LC-9A输液泵，低温离心机，Olympus相差显微镜。

2.细胞的筛选与制备：所用14种病毒分别接种于FL、HeLa及293细胞以测定敏感性，细胞按常规方法传代。同时制成2×10^-5/ml细胞悬液，每孔0.1ml，24h后形成单层细胞备用。

3.病毒毒力测定：采用TCID₅₀微量法，采用不同病毒的100-TCID₅₀/0.1ml。

4.初筛与分组实验：形成单层细胞孔弃去培养液，加入对细胞无毒性浓度的药物作用24h，吸出药液加入病毒液，按一般病毒吸附的时间，均采用37℃吸附1h吸出，加入含药的维持液，置37℃、5％CO₂恒温箱培养48～96h，待病毒对照孔病变达+++～++++，细胞对照正常时测结果。将初筛有意义的病毒分4组进行实验，探讨药物的具体作用环节。I组：感染前24h给药，吸出药液，用Hank’s液洗3遍，加入病毒液。II组：感染后给药，先加液置37℃吸附1h洗去病毒加含药维持液。III组：药液与病毒同时加入细胞层。IV组：药液与病毒混合置37℃、2h后加入细胞层。以上均设正常对照及病毒对照。

5.感染动物模型的建立及给药方案：病毒性心肌炎、胰腺炎，肺炎模型建立参见文献。实验动物随机分为病毒感染模型组、正常对照组、聚合度为3～7的壳聚糖不同浓度给药组，其他同类药比较组，每组10只，均在相同条件下饲养，均为ip给药。

6.结果测定：①光镜下观察细胞病变(CPE)；②染色摄入法；②药物对组织细胞保护率计算。连续给药1周，无菌取小鼠胰腺、肺、心脏，分别作病理学、组织学检查，判断药物疗效。

(三)结果

利用光镜检查CPE，结果表明聚合度为3～7的壳聚糖可以不同程度地抑制14种病毒对组织细胞的CPE。在镜下观察CPE基础上，用结晶紫染色细胞，测定吸光度，以便进一步客观地反映加药与不加药之差别。I组：实验目的是观察药物能否进入细胞或吸附于细胞表面，以阻止病毒的吸附与穿入。结果表明，聚合度为3～7的壳聚糖此法对A3V，AdVIII，RSV，HSV-1，HSV-2，EV71，SARS、CVB3，CVB4，CVA15 10种病毒有意义(P＜0.05＝。II组：实验目的是观察药物能否对已进入细胞内的病毒起作用，抑制其生物合成及成熟释放。结果表明，聚合度为3～7的壳聚糖此法对A3V，AdVIII，MV，RSV，HSV-1，HSV-2，SARS、CVB3，CVB4，CVA15，EV71 11种病毒有意义(P＜0.05＝。III、IV组：为药物与病毒在不同条件下作用，观察药物对病毒直接灭活作用，结果表明。聚合度为3～7的壳聚糖对除RV以外的13种病毒均有作用。说明聚合度为3～7的壳聚糖无论是药物与病毒同时加入细胞层或是药物与病毒先作用2h然后加入细胞层，均具有抗病毒效应。对细胞的保护率最高可达96％。聚合度为3～7的壳聚糖对CVB4病毒感染所致的胰腺炎和心肌炎有明显的保护作用，治疗组胰腺组织结构基本正常，有少量淋巴细胞侵润，心肌仅见小灶状坏死，病毒对照鼠胰腺有大量淋巴细胞及分叶核细胞侵润，心肌大片灶状坏死。双黄连对小鼠病毒肺炎有保护作用。

实施例四    水溶性甲壳低聚糖抗病毒效应

(一)实验材料

1.病毒与实验用细胞：柯萨奇病毒3、5型(CB3、CB5)，SARS病毒，腺病毒3、7型(AdV3、AdV7)，合胞病毒(RSV)，流感病毒，副流感病毒，水泡性口腔炎病毒(VSV)。Hep-2细胞，来源于人喉上皮细胞癌细胞系。

2.药物：水溶性甲壳低聚糖，分子量1500～1600。

(二)方法

1.对CB、AdB、RSV、SARS病毒的体外抑病毒实验：①实验用细胞选用对实验用病毒敏感的制成1×10^5-6万/ml的细胞悬液的Hep-2细胞。②实验样品对实验用细胞毒性测定：将样品用细胞维持液从1∶10浓度开始做2倍系列稀释，以对50％细胞产生毒性时的药物浓度为CC₅₀。③病毒感染滴度测定：取CB3、CB5、AdV3、AdV7、RSV、SARS的新鲜病毒悬液，以10倍递次稀释法稀释成不同稀释度，分别接种到组织培养单层细胞管内，每管接种100ul，每个稀释度接种4只细胞管，使病毒与细胞充分接触，37℃吸附1h，以Hank’s液洗3次，加入细胞维持液，37℃培养，逐日在普通显微镜下观察记录细胞病变情况，观察1～5d，测定组织培养半数感染量TCID₅₀。本实验选用不同病毒的100TCID₅₀/0.5ml。④中和实验  将样品自对细胞不产生毒性的前一孔浓度起作系列倍比稀释，1药物与100TCID₅₀的病毒等量相加，摇匀放37℃水浴作用1.5h，接种到形成单层细胞的96孔培养板内，同时设病毒对照、正常细胞对照、中药对照组，以产生50％细胞病变的药物最高稀释度作为判定结果。

2.对流感、副流感病毒的血凝抑制实验：取96孔培养板，将样品顺序作倍比稀释至1∶5120，每孔加入4个单位的血凝素100ul等量混合，37℃作用1h，加入1％鸡红细胞各100ul，摇匀后置室温30’、45’各观察1次结果，以45’为准。对照组设药物对照，病毒对照(分别加入4、2、1、1/2单位血凝素各100ul+生理盐水各100ul、红细胞对照，以上各对照组再分别加入1％鸡红细胞100ul，摇匀，在相同条件下观察结果。以能完全抑制红细胞凝集的最小药物浓度为终点。

4.样品诱生人白细胞干扰素效价测定实验：①样品诱生干扰素：将100ml新鲜人全血3000rpm离心1min，分离血浆，取血细胞加3倍量0.83％NH₄Cl作用一定时间后，低速离心留取白细胞，稀释成200万单位/ml，与不同稀释度的药物混合，37℃摇床摇晃培养18h，离心，上清即为诱生的a干扰素。②干扰素效价测定：将每组样品每个稀释度诱生的干扰素分别做4倍稀释，接种到已形成单层细胞的呢孔培养板内，同时设5组对照系统：药物对照系统、VSB病毒对照系统、药物+VSV病毒对照系统、干扰素(IFN)对照系统、正常细胞对照系统。37℃孵育24h，每孔加入100ul 100TCID₅₀ VSV病毒(药物对照和正常细胞对照系统加入维持液)，待对照孔的细胞全部或75％以上发生明显病变时阅读结果，判定保护50％细胞免疫病毒破坏的样品诱生干扰素的稀释度。

(三)结果

水溶性甲壳低聚糖对CB3、CB5、AdV3、AdV7、RSV、SARS均有抑制效果。从样品诱生干扰素的效价测定结果来看，随着样品稀释，诱生干扰素的能力逐渐下降，证明水溶性甲壳低聚糖的抗病毒及免疫调节作用。