对大肠杆菌O151型的O－抗原特异的核苷酸

摘要

本发明提供一种对大肠杆菌O151型(Escherichiacoli O151)的O－抗原特异的核苷酸，它是大肠杆菌O151型中控制O－抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长15670个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸；还包括源于大肠杆菌O151型的O－抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因的寡核苷酸；本发明通过PCR证实寡核苷酸对大肠杆菌O151型的O－抗原都有高度的特是性；本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的大肠杆菌O151型的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及大肠杆菌O151型(Escherichia coli O151)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及大肠杆菌O151型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O151型并鉴定这些致病菌中的O-抗原。

背景技术

O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚：先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens”.Trends inMicrobiology.3：178-185；Schnaitman，C.A.and J.D.Klena.(1993)“Genetics oflipopolysaccharide biosynthesis in entericbacteria”.MicrobiologicalReviews，57(3)：655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(19151)“Bacterialpolysaccharide synthesis and gene nomenclature”Trends in Microbiology，4：495-503]。在志贺氏菌、大肠杆菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigenloci：implication for Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，11：6923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichia coliO111 and Salmonella enterica O35 gene clusters：gene clusters encoding the samecolitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal ofBacteriology.182：5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因：糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。

因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification of abequose andparatose synthase genes(rfb)by polymerase chain reaction for identification ofS.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.31：2118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。19151年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecular microbiological investigation of an outbreak of Hemolytic-Uremic Syndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.34：1622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster ofEscherichia coli O111.Gene 164：17-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的。

志贺氏菌有46种血清型，但只有33种不同的O-抗原，大肠杆菌有166种不同的O-抗原[Reeves，P.R(1992)“Variation in O antigens，niche specificselection and bacterial populations”.FEMS Microbiol.Lett，100：509-516]，二者亲缘关系非常近，并且有12种是大肠杆菌和志贺氏菌共有的[Ewing，W.H.(1986)“Edwards and Ewing’s identification of the Enterobacteriaceae”.Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenicrelationships between the enteroinvasive Escherichia coli antigensO28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152 and and Shigella O antigens”J.clinMicrobiol，17(4)：681-684]

发明内容

本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O151型的O-抗原特异的核苷酸。它是大肠杆菌O151型的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于糖基转移酶基因和转运酶基因及聚合酶基因的特异的核苷酸。

本发明的次一目的是提供了大肠杆菌O151型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。

本发明的另一目的是提供了构成大肠杆菌O151型的O-抗原基因簇的基因：转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基合成酶基因，包括fnlA、fnlB、fnlC基因；糖基转移酶基因，包括orf3、orf5、orf6，orf12基因；氨基转移酶基因，包括orf7基因；组氨酸合成酶基因，包括orf8基因；未知功能基因，包括orf1、orf13基因

本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于大肠杆菌O151型的O-抗原基因簇编码转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对大肠杆菌O151型的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的寡核苷酸，它们对大肠杆菌O151型的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O151型的O-抗原也是高度特异的。

本发明的再一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法检测和鉴定大肠杆菌O151型的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O151型。

本发明的还一目的是提供了分离大肠杆菌O151型的O-抗原基因簇的全序列的方法，按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。

本发明的目的是由以下技术方案实现的。

本发明对大肠杆菌O151型的O-抗原特异的核苷酸，其是如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长15670个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O151型的O-抗原特异的核苷酸，其由13个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

前述的对大肠杆菌O151型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述的基因是：转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；其中所述的基因：wzx是SEQ ID NO：1中的2561至3781碱基的核苷酸；wzy是SEQ ID NO：1中的4596至5696碱基的核苷酸；以及它们的混合或它们的重组。

前述的对大肠杆菌O151型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的2752至2769碱基的核苷酸和3351至3368碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的3258至3275碱基的核苷酸和3579至3596碱基的核苷酸。源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的4676至4693碱基的核苷酸和5295至5312碱基的核苷酸；SEQ IDNO：1中的5293至5309碱基的核苷酸和5586至5602碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O151型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。

前述的对大肠杆菌O151型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，而且通过插入表达可提供表达大肠杆菌O151型的O-抗原，并成为细菌疫苗的应用。

前述的对大肠杆菌O151型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其中它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，检测人体和环境中的细菌。

前述的对大肠杆菌O151型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O151型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟，加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，将DNA重悬于30ul TE中；基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O151型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O151型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTGGCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环，最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并5管longPCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行，酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中，随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶，最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用Bi0-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bi0-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒至6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒，并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O151型的O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；

(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O151型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O151型的基因组作5个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库，2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率，在得到大肠杆菌O151型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到13个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O151型的O-抗原基因簇的结构；

(6)特异基因筛选：针对大肠杆菌O151型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，除在第13组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O151型的O-抗原都是高度特异的。

也就是，本发明的第一个方面，提供了大肠杆菌O151型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO：1所示，全长15670个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O151型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示，它总共由13个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

本发明的第二个方面，提供了大肠杆菌O151型的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶的基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基合成酶基因(fnlA、fnlB、fnlC基因)；糖基转移酶基因(orf3、orf5、orf6、orf12基因)；氨基转移酶基因(orf7基因)；组氨酸合成酶基因(orf8基因)；焦磷酸化酶基因(orf1基因)、未知功能基因(orf13基因)。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中；本发明尤其涉及到糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是很特异的，而本发明涉及到的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因对大肠杆菌O151型的O-抗原是高度特异的。

本发明的第三个方面，提供了源于大肠杆菌O151型的O-抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因，它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中的寡核苷酸对，在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物除在第13组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O151型的O-抗原都是高度特异的。

所述的对大肠杆菌O151型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤：1)基因组的提取；2)PCR扩增大肠杆菌O151型中的O-抗原基因簇；3)构建O-抗原基因簇文库；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接及分析；6)特异基因的筛选。

本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

如本发明所用，“寡核苷酸”主要指来源于O-抗原基因簇中的编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和编码聚合酶的基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变；更确切说这些寡核苷酸是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的2561至3781碱基的核苷酸)；wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的4596至5696碱基的核苷酸)；源于以上基因内的寡核苷酸对大肠杆菌O151型是高度特异的。

此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于糖基转移酶基因；源于转运酶和聚合酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸的组合。

在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。

本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因，(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O151型。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

本发明设计者考虑到以下情况：当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码编码转运酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由大肠杆菌O151型表达的。

另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因，(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O151型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码编码转运酶和聚合酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因，这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。

另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是：编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O151型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。

本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。而且，由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。

本发明首次公开了大肠杆菌O151型的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达大肠杆菌O151型的O-抗原，并成为有用的疫苗。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。

实施例1：基因组的提取：

在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O151型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇抽(25∶24∶1)混合溶液提两次，取上清液再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例2：通过PCR扩增大肠杆菌O151型中的O-抗原基因簇：

以大肠杆菌O151型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCTGGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long TemplatePCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环。最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并5管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。

实施例3：构建O-抗原基因簇文库：

首先是连接产物的获得：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。

其次是感受态细胞的制备：参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5□。取一环大肠杆菌DH5□单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃4000rpm离心15分钟。倾尽上清，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃6000rpm离心10分钟，弃上清，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。

最后是电转化感受态细胞：取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5□混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了大肠杆菌O151型的O-抗原基因簇文库。

实施例4：对文库中的克隆测序：

从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。

实施例5：核苷酸序列的拼接及分析：

用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O151型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O151型的基因组作5个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O151型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder发现基因，找到13个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用ClustralW软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O151型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。

通过检索和比较，发现orf9、orf10、orf11编码的蛋白与大肠杆菌K12O-抗原基因簇中fnl基因编码的蛋白有很高的氨基酸序列一致性(71-89％)，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf9、orf10、orf11编码的蛋白与已知的fnl的共有序列的同源性预期值非常高。fnl负责合成L-fucosamine我们命名orf9、orf10、orf11为fnlA、fnlB、fnlC，并推测大肠杆菌O151的O-抗原中有L-fucosamine的存在。

Orf2和orf4是大肠杆菌O151种仅有的两个编码存在跨膜片段的蛋白的基因。Orf2编码的蛋白与Methanothermobacte的O-抗原转移酶有28％的序列一致性，49％的相似性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有12个均匀的跨膜片段，这是Wzx蛋白的典型特征。所以命名orf2为wzx。orf4编码的蛋白与大肠杆菌O6的O-抗原聚合酶有29％的一致性，50％的相似性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有9个跨膜片段，并且有一个大的(61个氨基酸)胞质内亲水环(loop)，这是Wzy蛋白的典型特征。所以命名orf4为wzy。

orf 3，5，6，12四个基因编码的蛋白与其他已知的糖基转移酶有23-72％的序列一致性和46-84％的序列相似性。通过对Pfam中糖基转移酶基序数据库的搜索，这四个基因编码的蛋白与已知的糖基转移酶家族1和2的共有序列的同源性预期值为1×e^-12至5×e^-17，因此我们推测这四个基因编码糖基转移酶，而且由于每个糖基转移酶特异性催化形成一种二糖键，因此我们推测大肠杆菌O151的O-抗原的寡糖单位可能由五个单糖组成。由于这四个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这四个基因暂命名为orf3，orf5，orf6，orf12。

实施例6：特异基因的筛选：

针对大肠杆菌O151型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物，这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。

表1列出了大肠杆菌O151型的O抗原基因簇中糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及基因内的引物及PCR数据。在表中列出了大肠杆菌O151型的O抗原基因簇的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ IDNO：1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。

表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每8-10个菌分为一组，总共13组，它们的来源都列于表中。

在第13组中含有大肠杆菌O151型的基因组DNA作为阳性对照。以每组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR：在95℃预变性5分钟后，95℃变性30秒，退火时间是30秒，温度见表1，72℃延伸2分钟，这样进行25个循环。最后在72℃继续延伸5分钟，反应体系是25ul。模板为1∶20稀释，取1μl。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。

对于wzx、wzy基因，每个基因都有两对引物被检测，每对引物除了在第13组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O151型及其O-抗原是高度特异的。

最后，通过PCR从大肠杆菌O151型中筛选到对大肠杆菌O151型的O-抗原高度特异的基因：wzx、wzy。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对大肠杆菌O151型的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O151型是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O151型，并能鉴定它们的O-抗原。

表3是大肠杆菌O151型的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了大肠杆菌O151型的O-抗原基因簇的结构，共由13个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称，数字表示的是O-抗原基因簇中的开放阅读框(orf)的顺序。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。

表4是大肠杆菌O151型的O-抗原基因簇中的基因的位置图，在图中列出了大肠杆菌O151型的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在大肠杆菌中开放阅读框的起始密码子有两个：ATG和GTG。

                   SEQUENCE LISTING

<110>南开大学

<120>对大肠杆菌O151型的O抗原特异的核苷酸

<130>对大肠杆菌O151型的O抗原特异的核苷酸

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>15670

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>1

gctgcaggga tcaaagaaat cctcctggta acacatgcgt ccaagaacgc agtcgaaaac       60

cacttcgaca cctcttatga attagaatct ctccttgagc agcgcgtgaa gcgtcaactg      120

cttgcggaag tgcagtccat ctgtccgccg ggcgtgacca ttatgaacgt gcgtcagggc      180

gaacctttag gtttgggcca ctccatttta tgtgcacgac ctgccattgg tgacaaccca      240

tttgtcgtgg tactgccaga cgttgttatc gatgacgcca gcgccgaccc gctgcgctac      300

aacctggctg ccatgattgc gcgcttcaac gaaacgggcc gcagccaggt gctggcaaaa      360

cgtatgccgg gcgatctctc tgaatactcc gttattcaga ccaaagaacc actggatcgt      420

gaaggtaaag tcagccgcat tgttgaattt atcgaaaaac cggatcagcc gcagacgctg      480

gactcagaca tcatggccgt tggtcgctat gtgctttctg ccgatatttg gccggaactt      540

gaacgcactc agcctggtgc atggggacgt atccagctga ctgatgccat tgccgaactg      600

gcgaaaaaac agtctgttga cgccatgctg atgactggtg acagctacga ctgcggtaaa      660

aaaatgggct atatgcaggc gtttgtgaag tatggactgc gtaacctaaa agaaggggcg      720

aagttccgta aagggattga gaagctgtta agcgaataat gaaaatctga ccggatgtaa      780

cggttgataa gaaaattata acggcagtga agattcgtgg tgaaagtaat ttattgcgaa         840

tcttcactgc cgttgtttta tataaaaatc cagaataaca acaagttagc aataggattt         900

tagtcaaagt tgtccaggat tttccttgtt tttgagttca tttgataaga gaattagcgc         960

ataagtttta gatgctttgc tatgcgttgt agagcacatt gttggtgttt tgtaaggtag        1020

tactctggtt gctgtaatgc caggggcggt agcgtatttt ttgattatgt gcgattaaat        1080

taaaatcgta tatcatttag agttatatct gttctggcac tcaactccat ttttggagta        1140

agattatata ggttatttcg atatcttgat aacagactta atagattaag gggtcttatg        1200

aaaaatattg cagtaattct tgcatcaggc actggaagtc ggtttggggc taaaatacct        1260

aaacaattcg ttaaacttgc aggaaaacct gtaattcaat atactctaca tgccttccaa        1320

aatgcaaaga aaattgatga aattatagtt gttacaaatg aagaatatgt ggactttgtg        1380

tctgctttga ctatggaaca taactacttt aaggttacga aaataatcca tggtggtaag        1440

gaacgctatg aatcttcgtg ggcagcgtta caaagtatag aattagatga atgtaatgtg        1500

atatttcatg acgccgtgcg accgtttgtc tctcaaaaaa tcatcgatga ctgtattgat        1560

ggtcttaata attacaatgc aattgacgtg gtcgtagatc caaccgatac gattgtaaaa        1620

atcaaaaata aagagattat gtctattcct gacagaaggt ttttagctag agggcaaact        1680

ccacaaggtt ttaaaaaatc attaattgaa aaagcatata ttgatttttt aaaggaagaa        1740

aaaaaagttg cttctgatga ttgtggtatt ttcctcaaat acatgccaaa cgaacccata        1800

gggattatta aaggcgatga atctaatttt aaaataacgc accagcaaga catttatctt        1860

gcggataatt taattaagga tggtttgttg gagttaatat ctgagaataa tgattcaatt        1920

gcgcgaacga tatcagaaaa agtcatagtt atatttggag ggaatagtgg tatagggaaa        1980

actcttttag taaaagctaa atctcttgac ggaaatgttt attcattcag tcgtagcaat        2040

ggaattgaca tcagtaatgc catgaacgta agaaaggcat tacagtctgt attcgaaaaa        2100

gaaggtcgaa ttgattatat aataaataca gctgcagttt tgataaaaaa accaattaat        2160

tttatgtcag atgaggatat agaacaaagc tgtaatacaa actatttagg ggcaattaat        2220

atagctagag aaggctatgg ttatttaaag aagacaaaag ggatgttaat taactttact        2280

tctagctcat ttacacgtgg aagagcttca tatagtcttt attcatcatc taaagcagct        2340

gtggtgaatt taacacaggc cttatcagaa gagtggttaa atttgggaat taaagttaac        2400

tgtataaatc cagagcgtac agatactcct atgagaagag tcaattttgg tattgaacca        2460

ccagaatcct tactaacctc agaacaggtt gcggacatga ctttatcaat tatgtcctct        2520

gattatacag ggcaagtagt agctgtgaaa aaataacttc atgtcattgc gaaaaaatat        2580

tagcggctta gctatagctc aaatatttag ctatatagca ccattactgc aattccctta        2640

tctaagtagg attgtagggg attcatattt aggtgctatt atttttattc tctcaatatc        2700

acaaatggca atggtgttga cagattatgg gtttgattta tcgattggag aacagatagc        2760

aagagggaaa agaaataata aatggttaag cgttttttat tgtcaaactg gagtaattaa        2820

atcatttcta ttagtggtag cattcgtatt tattataagc gtgattcgcc tgtcaaaaag        2880

tgatattcct gagcaactga taattggatt aatgatttgt gttacattaa atgcttataa        2940

tccatattgg atatttcagg gccttgaaaa gatatatata tatagtgcat tagtaatcat        3000

ttcaagatta atagggcttg ttttaatcta tttgctaatt aggactccag atgattatgt        3060

atattactct tggattttgg catttcaagc ggggatgaca acgataatca gccatattat        3120

tatatccaga tggggggttc gtgtttgtcg gataaaagta aaaggtataa ttaagcaatt        3180

taaatatagt tttgactttt ttttatcaag agcttgtgtt tcattatact catctggttg        3240

cagtgttttc ttagcaacat ttggtgggag tctgaatcaa gttgcgatct atggcgttgc        3300

agaacagtta tataaagcgg gagtacaggt atttagcccc gttatttcag cgctaactcc        3360

ttacatggta agaacaaaaa actatattat tttttacaaa attatagtgg tatgcataac        3420

tgtcacagtg ataggtatgt gtgtcgggtt tttatttggt gctcaaatca ttacattgat        3480

ttatggtaat ggatatcagg aatccaaatc tgtactagat gtctttatgg ttgtaattct        3540

tgcaagtgta tttggtatgc ttttaggata tcctgcattg cttcccttag gattgggtaa       3600

ggttgctaat tatagtgtca ttgcttctgg tatattgcaa ataataatgt tctgtatttt       3660

gtatattggt ttatttccta ttacagctat tagtgtatgt ctgacatatc taatttgtga       3720

ttggtttatg ttctttattc gtctttataa ctttatgaaa tataggaaaa ttaatggata       3780

atcagttacg tgcagcccaa atgaggatgc tggcaattct taacgaagtt gatcgaatat       3840

gcagactgaa taaaataaat tattggctag atgcagggac cttgttaggt gccaaaagac       3900

atggtggttt tattccttgg gatgatgata tagatatttg tatgttaagg gatgattata       3960

ataaatttat tatggcatgt gacaaacaac ttaataaaga gatctttttt cttcaaacag       4020

cttattcaga tgaatattat gtggacttta atacaccatg taaaataaga atgaataata       4080

cggagattat agaaaagagt gaagtgaaat ataaatctac gatgaaagat ctcatcatgg       4140

tttgtttctt gatatattcc cctatgataa atattcatct aataaatata ttaggaagta       4200

tgttgaacgg tttatatctc aactatgtaa acttaaagta ttatcaaaat actctggatt       4260

tcctattaca aaaaatactt ataaaatgtt taagtagtat catttgtaaa agacgattat       4320

tagcttttgt agatttagtt agttttcgga tgagtgagag gaaacatgat tatttactag       4380

gcgctggaat tgaaacacca tctcatagag cctacttttc tgaggataca atctttccat       4440

taagtgaaat aaaatttgga ggaaggatgt acttatgccc aaataatgtt gataagtatc       4500

tctgtatgat gtttggggac aattatatga ctattccacc tgcagctcag agggtgtggc       4560

actaccatag cattaatatt gggaaataga ctactatggt tgaagggttc gttatttaca       4620

atagcatagt cttgcttgct ttattatttt gttatttgaa gagatttttt ttaccccgtt       4680

actttactgt ctgcttattt ttggttcttt gggttccatt agcgcttagg tatggtatag       4740

ggcgtgatta ttttagctat attgaaattt ataaaaatgt tctagttgca agagatggta       4800

ttgagctggg tttttattat ataaattata tacttgctta ttttaatttt cactatcaat       4860

atttatttgc actgtcatcc ttcattacag tttatttttg tgtaaaaagc tttgatagag       4920

attatacgtt agtatctatt atattatttt gtgctttaat ttacttgcag gcattcagta       4980

ttattagaca aatgattgca gtgtcactct gtctctatag ttgctcatta tggaataaag       5040

gttgtaaatg taaatcatca gtattcctta tattggcacc tttatttcat ttctctgcaa       5100

taataatatt acttttagct atagcaagcc gatatataaa aataaatacg acaagatgtt       5160

attttgtatt tgtttttgct cttgtattca tacttatatt gaatggggta gattttatat       5220

tttcaaacgc tatattatta gatagtaagt atggatacta tgtaacatca gcatttaatc       5280

gacctacaga aattggctca ggaataggtg ttgctatagc attatttcta ccgttcatgg       5340

tatttataaa atcaactcag ttatatgagt ataataaaaa ctataatttt atgctgctta       5400

taaatctagt atatgttatt tcttatacac tttctctgaa aatatatata tttgcacgat       5460

ttacagatgc tctatctttt gttcagatat tattgatacc agtaatactt aaaatctctt       5520

cccctaaagg gatttattat aatttaatga tggctgttat tttgctccat attttattat       5580

ttgaagcaaa ccttaatgcg aatacaattt ctgcaggaaa tatttcgaat agcggattag       5640

gcatcatgcc atataaaagc atactaaata ctaaaatagt aggtatatat gactagtaaa       5700

atattgttta taactccatt gcctccacca gttactggac aatctttagc ttgtatcgag       5760

ttatataatt atctagataa agataataat tgtattattg atgtaataaa tctttcaaaa       5820

cagtccttta tatcagggaa aggctcgttc aaaagagttg ctgaaatagc tggtgtgtta       5880

ttacgtttat tatttcttag acgagattat gatttaattt actttacacc agctgaatct       5940

aaaatgggaa gttataaaga tcaattgata tatcttttta tgtttgcaaa gctaaagaaa       6000

atgtatattc acttgcatgg cggtgcaggc atgaaaaaat tattagaaaa agataaatca       6060

ttaatcttca aattaaataa atatttcatc tctaggcttg ctggagtgat agtgctgggt       6120

gaaagattaa agagtattta taatggaatt attgaaagtg ataaaattta tgcagttgag       6180

aacttttctc aagattattt atttataagg caaagtgagt taaaattaaa atttaataat       6240

cggaacaaaa taaaaatact ttttcttagt aatttgttgc caggaaaagg atatattgaa       6300

ttgttaaaat ctgcagattt tttagatgat tcttgtgtgg aattccattt cgctggtggt     6360

ttcgaggatg aacaagcaaa aaaaattttt ttagaggcta ttaatttaaa gaacaatatt     6420

ttctatcatg ggattgtcag tggcgatgaa aaacggaatc tactaattaa atctgatatt     6480

ttttgtttac caacatatta tccttatgag gggcaaccta taagcatact tgaggcatat     6540

gctgctgggt gtgttgttct tactaccaac cacagtggta tatttgatgt gtttgaacct     6600

tggcgtaatg gaatagaagt tgataaaaaa agcacatctg atttagtaaa tgcaataaat     6660

tattttaatt cgaacagaga agagattcgt aaaattgcca tcaataatat tgttgatgca     6720

agaaaaaaat atagacttaa acatcattta gaaaagatga tgacagtatt aatgaatcat     6780

gaggtaatac agcaatgaaa aaatataaga tatgcaatag atgtgttatg gatacatctg     6840

atccaaacat ttcatttgac gataatggcc agtgtgatta ttgttcaaac tttgataaaa     6900

atattttacc aaattggaat gctaataatt caggcttatc aaaattgctt gaaatgtcag     6960

aatcaattaa aaaagacagt aagggaagtg attttgattg tattattggc ttatcaggag     7020

gtttagatag ctcttatgca gcgtatattg cgaaagaaaa aatgggacta cgcccattat     7080

tatttcatgt tgatgctgga tggaatactg atcaggcagt tggtaatatt gaaaagctta     7140

tcgaaggact tggtttagat ctttacacag aagttataaa ctgggaagaa atgaaagatc     7200

ttcaactgtc tttcttaaaa tcaggaattc cagatcaaga tttagttcag gatgctgcat     7260

ttttttcatc tttatataag tttgctcgga aacataaaat taaacatgtt attactggtt     7320

caaatttttc tacagagtgc tgtcgcgaac cagaagaatg gggagggtat ttaggtattg     7380

atactatgtt atttaatgat atccacagac agtttggaac ccggccatta aattcattcc     7440

ccttagtaga tatactcatc tataaggttt tttatcagaa aatccttgga atgaaagtac     7500

atcatccatt gaatttagta ccatttacta agaaggatgc cgaaaatgaa cttagtgaaa     7560

aatttggctg gcaacctttt caacataagc accatgagtc ccgttttact cgtttctatg     7620

aagattattg gttaccacgt aggtttggtt acgaaaaacg tagagctcat ttctcaagtc     7680

taattatgac agggcaaatg actcgcgaac aagctcttga gaggctttta aagccagaaa     7740

tggatgaaca ttttcttgaa caagagtttg agtatattgc acacaaacta ggcattagtg     7800

ttgacgattt aaaagaacta tttagtattc ccaaaaaaac ctacaaggat tataaaaata     7860

agcgttggtt gattagttta ggtacaaata tcctacgaac acttggattg gaaaaaaggt     7920

atttcagatg atcaaaataa ttgattatgg tattggaaat atacaagcat tccttaatgt     7980

atataagcga ttaggtatta attcaggtat tgctcattct atcgatgata ttaaaagtgc     8040

tacacatttg atattacctg gagttggagc ttttgaccaa gctatgacac tttttaataa     8100

ctcaggttta cgagaaagta ttgaaaaacg tatttttgag gatcgggttc caattattgg     8160

tatctgtgta ggtatgcaga tgcttgctac ctctagtgag gaggggagtt tgcctggttt     8220

aggatggatt cctggtacgg ttcgagcatt cagcagtaat atctcttcaa gaagcctccc     8280

gatgcctcat atgggatgga atagtttaat taaaaaagta aatactccat tactgaaaga     8340

ttttaaagaa gagtcttcct tctatttttt gcactcattc tattacgaat gtgatgacgc     8400

cggtgatgta ttagcaacag ctgaatatgg tcataatttt cattgtgtca ttggcaggaa     8460

taatatatat ggcattcaat gtcatccgga gaaaagtcat tcatcaggtt atcaactctt     8520

aaaaaatttt gcagagatcc aatataatgc ttagaccaag aatcataccc tgtttacttg     8580

tccacgattc tggcttagtc aaaacagtta atttcaaatc accgaagtat gttggtgatc     8640

caattaatgc cgttaaaatt tttaatgaga aagaagctga tgaattgatg gtccttgata     8700

ttgatgcaac ttcaagggga cttgaaccta attatgctct aataaaaaaa ctcgcagcgg     8760

aatgccgaat gccattatgc tatggaggag gtgtaactag tgtagcacag gctgtaaaaa     8820

ttatctctct tggtgttgaa aaggtatcga taagttcagc ggccgttgaa aatccaaata     8880

ttgtaaaaga tttggcagaa gccgttggta aacaaagtgt tgtagttgtg ctagatgtta     8940

ttaaacgtaa aggtcttttt tcaaagggtt atgagctttc gactaggaat aacacgcgaa     9000

cgtataaaat cgatcctatc tcgtttgctc aaaaaatggt tgctttgggt gcaggcgaaa     9060

tcgtcatcaa ttttgtagat aatgatggtg ttatgggggg atatgatgtt gaatattctt    9120

cgactatcaa atcgcaaata aacgtacctg ttacatttct cggtggtgcg ggaaactatg    9180

aacatctctc tgcattgatt gaccaatgtg gcatcgttgg tgcagcagct ggtagtcttt    9240

ttgtatttaa aggtaagtat agagctgtgt tgataagcta ccctacacct gagcagaaag    9300

atattatttg caataattta aagaagaatt attaataagg ggttatgatg ttcaaagata    9360

aaatactgtt aattactggt ggtacaggtt catttggtaa tgctgtatta aaccgttttc    9420

tttctacaga tataaaagaa attcgtattt tttctcgcga tgaaaagaaa caagatgata    9480

tgcggaaaaa atataataat cagaagctga aattttatat tggtgatgtc agagattacc    9540

gtagtatttt gaatgcgact cgcggtgttg attttatata tcatgcagcg gcacttaagc    9600

aagttccatc atgtgaattt catcctatgg aagccgttaa aactaatatc cttggtacgg    9660

aaaatgttct tgaagcagct atagcgaatg aagtgaagag ggttgtatgc ctaagtactg    9720

ataaagctgt atacccgatt aacgcaatgg gtatttcaaa agctatgatg gaaaaggtca    9780

tggtcgcgaa atcccgtaat gttgatcgca ataaaacagt aatatgtggt acccgttatg    9840

ggaatgttat ggcatctcgc ggttcagtta ttccattatt tgttgatctt attagagcgg    9900

gcaagccact cacaataact gatcctaata tgacccgctt tatgatgact cttgaggatg    9960

cggtagattt agttctttat gcgtttgaac atggtaataa tggtgatatc tttgtgcaaa   10020

aagcacctgc agcaactatt gacacattag ctattgcttt aaaggaacta ctaaatgttc   10080

cagaccatcc ggtaaatgtc attggaacgc gtcatggcga gaaattatat gaagctctac   10140

ttagtcgtga ggaaatgatc gctgctatag atatgggcga ttattaccgt gtccccccag   10200

atcttcggga ccttaattat ggaaaatatg ttgagcaagg tgatagccga atatctgaaa   10260

tagaagatta taactctcat aatactcaac ggttagatgt tgaaggcatg aaagagctct   10320

tgctaaaatt agcctttatt cgagcaattc gtgctggtga aaaatataat ctggattcat   10380

gatatgagaa tattagttac tggtgcaaat ggttttattg gtcgtaattt atgtttgagg   10440

cttgaggaac ttggttataa agatcttatt agaattgatc gagaatcaac gaagcaagat   10500

cttgaacaag gcttacagga tgccgatttt atttatcact tagctggtat caatagacct   10560

aagactgatg atgagtttat ttctggaaac agtgatttaa caaagcatat agttgagtat   10620

ctcctttcta ttggtaagaa tacatcaatt atgctaagtt cttcgataca agctgaactt   10680

aataatgctt atggggttag caaagctgta gctgaaagct atgtcgaaaa atatgctgct   10740

gctagtggtt cttcgtatta tattttcaga tatccaaacg tttttggtaa atggtgtaag   10800

ccaaactata attcttttat agcaactttt tgctacaata tttccaatga tattgagatt   10860

actatcaatg atgcatcagc gccagttaat ctggtgtata ttgatgatgt ttgtactgat   10920

gctatagctc ttctctctgg gacggttgaa agcggatata aagttgttgc accaatttat   10980

tcaacaacag ttggtgaggt tgcagaatta atttatagct tcaaaaatag ccgttccacc   11040

ctgatcacag aagctgtcgg gacgggattt acccgtgcat tgtattctac atggctgagt   11100

tatttaccag cagagaagtt tgcgtacaag gtaccttttt atggggatgc ccgcggagtc   11160

ttttgtgaga tgttgaaaac gccttcagcg gggcagtttt cattttttac tgctcaccct   11220

ggtattacgc gtggcggaca ttaccatcac agtaaaaatg agaagttttt ggtcattcga   11280

ggtcaggcat gctttaaatt tgaacatgtg attaccggtg agcgatatga actgaaagtt   11340

tcatcgggtg agtttaagat cgttgaaaca gttcctggtt ggacacatga cattacaaat   11400

attggaactg aggaattaat agtcatgctc tgggcaaatg aaattttcaa ccgtgatgag   11460

cccgatacta ttgcgaggcc tctataatga aaaaattaaa agttatgtct gttgttggaa   11520

cccgtcctga gattatccgt ttgtcgaggg ttcttgctaa gtttgatgaa tactgcgagc   11580

atattattgt ccatactggt caaaattatg attacgaatt aaatgaggtg ttcttcaatg   11640

acttgggtgt tcgaaaacct gattattttt taaatgcagc gggtaaaaat gcggcggaaa   11700

ccattggcca ggttattatt aaggtagatg aagtattaga aatcgaaaaa cctgaagcaa   11760

tactggtatt gggcgatacg aattcatgta tttctgccat tccggccaaa cgccgtaaag   11820

tgcctatatt tcatatggaa gcaggtaacc gttgtttcga tcaacgcgtg cctgaagaaa     11880

ccaatagacg tattgttgac catacggctg atatcaatat gacctacagt gatattgctc     11940

gtgaatatct cttggctgaa ggtatcccag ctgatcggat cataaaaact ggtagcccta     12000

tgtatgaggt tctttcatat tatatgcccc aaattgatgg ttcagatgtg ctatcgcgtt     12060

tgaatctaca gtctggtgag ttttttgtag taagtgcgca tcgtgaagag aatgttgatt     12120

ctccaaaaca gctcgtaaag cttgcgaaca ttctaaatac tgttgctgaa aaatataatc     12180

ttccagttat tgtctccaca cacccaagga cacgtaaccg aatccgtgag caaggaattg     12240

aatttcattc aaatataaat ttactgaaac cattgggttt ccatgattat aaccacttgc     12300

agaagaactc acgagctgtg ctttcagata gcggtactat cactgaagag tcatccatca     12360

tgaatttccc agcggtaaac atccgggaag cgcatgagcg tccggaaggc tttgaggaag     12420

catccgtcat gatggtgggg ttagagtgtg aacgcgtatt acaagcgctg gatattctgg     12480

caacacaacc gcgaggtgaa gtccgtcttt tacgtcaggt tagtgattac agcatgccaa     12540

atgtgtcgga taaagttgtc agaattgttc actcttacac agattatgtt aagagagtcg     12600

tctggaaaga atattgatga aacttgcttt aatcatagat gattacctgc ccaacagtac     12660

tcgtgttggt gcaaaaatgt ttcatgaact tgctcaagaa tttatccagc gtgggcacga     12720

tgttacggta attactcctg gtacgggcat gcaagaagag atttcttttg atacctttca     12780

gggggtaaaa acatggcgtt ttaaaagcgg gccgctcaag gatgtaagta aaattcagcg     12840

agcggtcaat gaaacgcttt tgtcctatcg ggcgtggaaa gccatcaaaa aatgggtaaa     12900

aaaagagacc tttgagggtg tgatttatta ttcaccttcc atattctggg ggcatttagt     12960

taaaaaaatt aaagctcgtt gccaatgtcc tgcttatctt attttaagag atatgtttcc     13020

acaatgggta attgatgcag gaatgcttaa tgctggttcc ccaatagaac gctactttcg     13080

tctttttgaa aaaatatctt atcgtcaggc aaatcgtatt ggacttatgt ctgataagaa     13140

tcttgatgtt tttcggaaag ataataaagg ctatccgtgc gaagttttgc gtaactgggc     13200

atccctaaca ccaacgatca tacccaagga ttatatacca ctacgtaagc gacttggcct     13260

agaggataaa accattttct tctatggtgg aaacataggt catgcacagg acatgacaaa     13320

cttgatgcga cttgtgagaa acatggcagt atatcctcaa gctcatttcc tatttattgg     13380

ccagggtgat gaagttgaat taattaattc attagcctct gagtgggcat tgacgaattt     13440

cacctatttg ccctcggtta atcaggatga atttaagttc attttgtcgg aaatggatat     13500

cggcttgttt tctctttccg ctagacactc ttcccataat tttcctggta agttattagg     13560

ctatatggtt cagtcgctac ctattttagg tagcgtaaat gccggaaatg atttgctcga     13620

cattgtcaat caaaataatg ccggattaat ccatgtcaat ggtgaggacg ataaattatg     13680

tcaatctgcg ctattaatgt tgcatgatat tgatgtgcgc cggcaacttg gtttgggagc     13740

gaatatattg ttgaaagaac aattctccgt tgagtctgcg gcacagacga tagaaatgag     13800

gttggaggca tgcaatgcga ttaattgata atgaccaact cgacaaatta tatgatcaag     13860

ccgggcaatc ggaacgttta cgttcccacc ttatgatgca cggctcgcat caagaaaagg     13920

tacagcgttt acttattgca ttagtaaagg gcagctatgt tgaaccgcat tatcacgcac     13980

ttcctcatca gtgggaaatg ttcatagtta tggaggggca acttcaggtt tgtttgtatg     14040

gtagaaatgg tgaggttata aagcaattta tagcaggaga taatactggg ataagcattg     14100

tggagttttc tccgggcgat atacacagtg tcgaatgcct atctcctcgt gctcttatgg     14160

tggaagttaa agaggggccg tttgactctt cttttgcaaa attgttcgtg tgatgctcgt     14220

ctaaaatgca tcttctgcta tctacccaag ctaaacctga gttaacatcc ataccatatt     14280

tcaagccgcg aatatcttgc gcggtgacca cccctgacag gagtatacaa tgtcaaagca     14340

acagatcggc gtcgttggta tggctgtgat gggacgcaat cttgcgctca acatcgaaag     14400

ccgtggttat accgtctcta ttttcaaccg ttcccgtgaa aaaacggaag aagtgattgc     14460

tgaaaaccca ggcaagaaac tggttcctta ctatacggtg aaagagttcg ttgaatctct     14520

ggaaacgcct cgtcgcatcc tgttaatggt gaaagcaggt gcaggcacgg atgctgctat     14580

tgattccctc aagccgtacc tcgataaagg tgacatcatc attgatggtg gtaacacctt     14640

cttccaggac accattcgtc gtaaccgtga gctttctgca gaaggcttta acttcattgg     14700

taccggtgtt tccggcggtg aagagggggc gctgaaaggg ccgtccatca tgcctggtgg     14760

ccagaaagaa gcctatgaac tggttgcacc gatcctgacc aaaatcgccg cagtagctga     14820

agacggggag ccatgcgtta cctatattgg tgccgatggt gcaggtcact atgtgaagat     14880

ggttcacaac ggtattgaat atggtgatat gcaactgatt gctgaagcct attctctgct     14940

taaaggtggc ctgaacctca ccaacgaaga actggcgcag acctttaccg agtggaataa     15000

cggtgaactg agcagctacc tgatcgacat cactaaagac atcttcacta aaaaagatga     15060

agacggtaac tacctggttg atgtgattct ggatgaagca gcaaacaaag gtaccggtaa     15120

atggactagc cagagcgcgc tggatctcgg cgaaccgctg tcgctgatta ccgagtctgt     15180

gtttgcacgt tatatctctt ctctgaaaga tcagcgcgtt gccgcgtcta aagttctcac     15240

tggtccgcaa gctcagtcag caggcgacaa ggctgagttc atcgaaaaag ttcgccgtgc     15300

gctgtatctg ggcaaaatcg tttcttacgc tcagggcttc tctcagctac gcgccgcgtc     15360

tgaagagtac aattgggatc tgaactacgg cgaaatcgcg aagattttcc gtgctggttg     15420

catcatccgt gcgcagttcc tgcagaaaat caccgatgca tatgccgaaa atccgcagat     15480

cgctaacctg ctgctggctc cgtacttcaa gcaaattgcc gatgactacc agcaggcgct     15540

gcgtgatgtc gttgcttatg cggtacagaa cggtatcccg gttccgacct tcgccgctgc     15600

ggttgcctat tatgacagct accgtgccgc tgttctgcct gctaacctga tccaggccca     15660

gcgcgactag                                                            15670

表1大肠杆菌O151型的O抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及其中的引物及PCR数据

  基因    功能基因的碱基    位置    正向引物    反向引物  PCR产物  的长度产生正确大小电泳带的组数  PCR的退  火温度    (℃)  WzxO-抗原转运酶1142-2389    2752-2769    3351-3368    616bp    0^*    58    3258-3275    3579-3596    338bp    0^*    55  WzyO-抗原聚合酶4447-5487    4676-4693    5295-5312    636bp    0^*    56    5293-5309    5586-5602    309bp    0^*    56

^*只在大肠杆菌O151型中得到正确的一条带

表2 166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源

组号                 该组中含有的菌株                                    来源 

1、野生型大肠杆菌    O1，O2，O5，O7，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O19ab，O20，    IMVS^a

                     O21，O22，O23，O24，O59

2、野生型大肠杆菌    O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O33，O35，O36，O37，       IMVS^a

                     O38，O40，O41，O42，O43

3、野生型大肠杆菌    O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56，       IMVS^a

                     O57，O58，O60，O61，O62

4、野生型大肠杆菌    O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78，       IMVS^a

                     O79，O80，O81，O82，O83

5、野生型大肠杆菌    O84，O85，O86，O87，O88，O89，O91，O92，O98，O99，O101，      IMVS^a

                     O1O2，O103，O104，O106

6、野生型大肠杆菌    O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113，          IMVS^a

                     O115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O128

7、野生型大肠杆菌    O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O136，O137，        IMVS^a

                     O138，O139，O141，O142，O143，O144，O145

8、野生型大肠杆菌    O146，O147，O148，O150，O152，O154，O156，O157，O158，                    IMVS^a

                     O159，O160，O161，O163，O164，O165，O166                                  b

9、野生型大肠杆菌    O168，O169，O170，O171，O172，O173，                                      c

                     D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12                         d

10、野生型大肠杆菌   B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15，            d

                     B16，B17，B18

11、野生型大肠杆菌   F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4b，F5(v：4)，F5(v：7)，F6，F_X变，F_Y变，DS，DR，d

12、野生型大肠杆菌   O3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O95，O100，O114，O151，                 IMVS^a

                     O155，O124

13、第8组菌株加上大肠杆菌标准菌株O151                                                          IMVS

^*为了检测的方便，我们将每13-17个菌分为一组，总共13组

a. Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australia

b.Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark

c.O172和O173来自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余来自于IMVS

d.中国预防医学科学院流行病学研究所

表3大肠杆菌O151型O抗原基因结构图

galF     orf1       wzx     orf3  wzy    orf5    orf6  orf7  orf8  fnlA   fnlB   fnlC   orf12   orf13   gnd

表4大肠杆菌O151型O抗原基因簇基因位置

GCTGCAGGGA  TCAAAGAAAT    CCTCCTGGTA  ACACATGCGT  CCAAGAACGC  AGTCGAAAAC        60

CACTTCGACA  CCTCTTATGA    ATTAGAATCT  CTCCTTGAGC  AGCGCGTGAA  GCGTCAACTG       120

CTTGCGGAAG  TGCAGTCCAT    CTGTCCGCCG  GGCGTGACCA  TTATGAACGT  GCGTCAGGGC       180

GAACCTTTAG  GTTTGGGCCA    CTCCATTTTA  TGTGCACGAC  CTGCCATTGG  TGACAACCCA       240

TTTGTCGTGG  TACTGCCAGA    CGTTGTTATC  GATGACGCCA  GCGCCGACCC  GCTGCGCTAC       300

AACCTGGCTG  CCATGATTGC    GCGCTTCAAC  GAAACGGGCC  GCAGCCAGGT  GCTGGCAAAA       360

CGTATGCCGG  GCGATCTCTC    TGAATACTCC  GTTATTCAGA  CCAAAGAACC  ACTGGATCGT       420

GAAGGTAAAG  TCAGCCGCAT    TGTTGAATTT  ATCGAAAAAC  CGGATCAGCC  GCAGACGCTG       480

GACTCAGACA  TCATGGCCGT    TGGTCGCTAT  GTGCTTTCTG  CCGATATTTG  GCCGGAACTT       540

GAACGCACTC  AGCCTGGTGC    ATGGGGACGT  ATCCAGCTGA  CTGATGCCAT  TGCCGAACTG       600

GCGAAAAAAC  AGTCTGTTGA    CGCCATGCTG  ATGACTGGTG  ACAGCTACGA  CTGCGGTAAA       660

AAAATGGGCT  ATATGCAGGC    GTTTGTGAAG  TATGGACTGC  GTAACCTAAA  AGAAGGGGCG       720

AAGTTCCGTA  AAGGGATTGA    GAAGCTGTTA  AGCGAATAAT  GAAAATCTGA  CCGGATGTAA       780

CGGTTGATAA  GAAAATTATA    ACGGCAGTGA  AGATTCGTGG  TGAAAGTAAT  TTATTGCGAA       840

TCTTCACTGC  CGTTGTTTTA    TATAAAAATC  CAGAATAACA  ACAAGTTAGC  AATAGGATTT       900

TAGTCAAAGT  TGTCCAGGAT    TTTCCTTGTT  TTTGAGTTCA  TTTGATAAGA  GAATTAGCGC       960

ATAAGTTTTA  GATGCTTTGC    TATGCGTTGT  AGAGCACATT  GTTGGTGTTT  TGTAAGGTAG      1020

TACTCTGGTT  GCTGTAATGC    CAGGGGCGGT  AGCGTATTTT  TTGATTATGT  GCGATTAAAT      1080

TAAAATCGTA  TATCATTTAG  AGTTATATCT  GTTCTGGCAC  TCAACTCCAT  TTTTGGAGTA      1140

                                                                     orf1的起始

AGATTATATA   GGTTATTTCG   ATATCTTGAT   AACAGACTTA      ATAGATTAAG   GGGTCTTATG  1200

AAAAATATTG   CAGTAATTCT   TGCATCAGGC   ACTGGAAGTC      GGTTTGGGGC   TAAAATACCT    1260

AAACAATTCG   TTAAACTTGC   AGGAAAACCT   GTAATTCAAT      ATACTCTACA   TGCCTTCCAA    1320

AATGCAAAGA   AAATTGATGA   AATTATAGTT   GTTACAAATG      AAGAATATGT   GGACTTTGTG    1380

TCTGCTTTGA   CTATGGAACA   TAACTACTTT   AAGGTTACGA      AAATAATCCA   TGGTGGTAAG    1440

GAACGCTATG   AATCTTCGTG   GGCAGCGTTA   CAAAGTATAG      AATTAGATGA   ATGTAATGTG    1500

ATATTTCATG   ACGCCGTGCG   ACCGTTTGTC   TCTCAAAAAA      TCATCGATGA   CTGTATTGAT    1560

GGTCTTAATA   ATTACAATGC   AATTGACGTG   GTCGTAGATC      CAACCGATAC   GATTGTAAAA    1620

ATCAAAAATA   AAGAGATTAT   GTCTATTCCT   GACAGAAGGT      TTTTAGCTAG   AGGGCAAACT    1680

CCACAAGGTT   TTAAAAAATC   ATTAATTGAA   AAAGCATATA      TTGATTTTTT   AAAGGAAGAA    1740

AAAAAAGTTG   CTTCTGATGA   TTGTGGTATT   TTCCTCAAAT      ACATGCCAAA   CGAACCCATA    1800

GGGATTATTA   AAGGCGATGA   ATCTAATTTT   AAAATAACGC      ACCAGCAAGA   CATTTATCTT    1860

GCGGATAATT   TAATTAAGGA   TGGTTTGTTG   GAGTTAATAT      CTGAGAATAA   TGATTCAATT    1920

GCGCGAACGA   TATCAGAAAA   AGTCATAGTT   ATATTTGGAG      GGAATAGTGG   TATAGGGAAA    1980

ACTCTTTTAG   TAAAAGCTAA   ATCTCTTGAC   GGAAATGTTT      ATTCATTCAG   TCGTAGCAAT    2040

GGAATTGACA   TCAGTAATGC   CATGAACGTA   AGAAAGGCAT      TACAGTCTGT   ATTCGAAAAA    2100

GAAGGTCGAA   TTGATTATAT   AATAAATACA   GCTGCAGTTT      TGATAAAAAA   ACCAATTAAT    2160

TTTATGTCAG   ATGAGGATAT   AGAACAAAGC   TGTAATACAA      ACTATTTAGG   GGCAATTAAT    2220

ATAGCTAGAG   AAGGCTATGG   TTATTTAAAG   AAGACAAAAG      GGATGTTAAT   TAACTTTACT    2280

TCTAGCTCAT   TTACACGTGG   AAGAGCTTCA   TATAGTCTTT      ATTCATCATC   TAAAGCAGCT    2340

GTGGTGAATT   TAACACAGGC   CTTATCAGAA   GAGTGGTTAA      ATTTGGGAAT   TAAAGTTAAC    2400

TGTATAAATC   CAGAGCGTAC   AGATACTCCT   ATGAGAAGAG      TCAATTTTGG   TATTGAACCA    2460

CCAGAATCCT   TACTAACCTC   AGAACAGGTT   GCGGACATGA      CTTTATCAAT   TATGTCCTCT    2520

                                       orf1的终止      wzx的起始

GATTATACAG   GGCAAGTAGT   AGCTGTGAAA   AAATAACTTC   ATGTCATTGC   GAAAAAATAT    2580

TAGCGGCTTA   GCTATAGCTC   AAATATTTAG   CTATATAGCA      CCATTACTGC   AATTCCCTTA    2640

TCTAAGTAGG   ATTGTAGGGG   ATTCATATTT   AGGTGCTATT      ATTTTTATTC   TCTCAATATC    2700

ACAAATGGCA   ATGGTGTTGA   CAGATTATGG   GTTTGATTTA      TCGATTGGAG   AACAGATAGC    2760

AAGAGGGAAA   AGAAATAATA   AATGGTTAAG   CGTTTTTTAT      TGTCAAACTG   GAGTAATTAA    2820

ATCATTTCTA   TTAGTGGTAG   CATTCGTATT   TATTATAAGC      GTGATTCGCC   TGTCAAAAAG    2880

TGATATTCCT   GAGCAACTGA   TAATTGGATT   AATGATTTGT      GTTACATTAA   ATGCTTATAA    2940

TCCATATTGG   ATATTTCAGG   GCCTTGAAAA   GATATATATA      TATAGTGCAT   TAGTAATCAT    3000

TTCAAGATTA   ATAGGGCTTG   TTTTAATCTA   TTTGCTAATT      AGGACTCCAG   ATGATTATGT    3060

ATATTACTCT   TGGATTTTGG   CATTTCAAGC   GGGGATGACA      ACGATAATCA   GCCATATTAT    3120

TATATCCAGA   TGGGGGGTTC   GTGTTTGTCG   GATAAAAGTA      AAAGGTATAA   TTAAGCAATT    3180

TAAATATAGT   TTTGACTTTT   TTTTATCAAG   AGCTTGTGTT      TCATTATACT   CATCTGGTTG    3240

CAGTGTTTTC   TTAGCAACAT   TTGGTGGGAG   TCTGAATCAA      GTTGCGATCT   ATGGCGTTGC    3300

AGAACAGTTA   TATAAAGCGG   GAGTACAGGT   ATTTAGCCCC      GTTATTTCAG   CGCTAACTCC    3360

TTACATGGTA   AGAACAAAAA   ACTATATTAT   TTTTTACAAA      ATTATAGTGG   TATGCATAAC    3420

TGTCACAGTG   ATAGGTATGT   GTGTCGGGTT   TTTATTTGGT      GCTCAAATCA   TTACATTGAT    3480

TTATGGTAAT   GGATATCAGG   AATCCAAATC   TGTACTAGAT      GTCTTTATGG   TTGTAATTCT    3540

TGCAAGTGTA   TTTGGTATGC   TTTTAGGATA   TCCTGCATTG      CTTCCCTTAG   GATTGGGTAA    3600

GGTTGCTAAT   TATAGTGTCA   TTGCTTCTGG   TATATTGCAA      ATAATAATGT   TCTGTATTTT    3660

GTATATTGGT   TTATTTCCTA   TTACAGCTAT   TAGTGTATGT      CTGACATATC   TAATTTGTGA    3720

                                                            orf3的起始wzx的终止

TTGGTTTATG TTCTTTATTC GTCTTTATAA   CTTTATGAAA   TATAGGAAAA  TTAATGGATA3780

ATCAGTTACG TGCAGCCCAA ATGAGGATGC   TGGCAATTCT   TAACGAAGTT  GATCGAATAT    3840

GCAGACTGAA TAAAATAAAT TATTGGCTAG   ATGCAGGGAC   CTTGTTAGGT  GCCAAAAGAC    3900

ATGGTGGTTT TATTCCTTGG GATGATGATA   TAGATATTTG   TATGTTAAGG  GATGATTATA    3960

ATAAATTTAT TATGGCATGT GACAAACAAC   TTAATAAAGA   GATCTTTTTT  CTTCAAACAG    4020

CTTATTCAGA TGAATATTAT GTGGACTTTA   ATACACCATG   TAAAATAAGA  ATGAATAATA    4080

CGGAGATTAT AGAAAAGAGT GAAGTGAAAT   ATAAATCTAC   GATGAAAGAT  CTCATCATGG    4140

TTTGTTTCTT GATATATTCC CCTATGATAA   ATATTCATCT   AATAAATATA  TTAGGAAGTA    4200

TGTTGAACGG TTTATATCTC AACTATGTAA   ACTTAAAGTA   TTATCAAAAT  ACTCTGGATT    4260

TCCTATTACA AAAAATACTT ATAAAATGTT   TAAGTAGTAT   CATTTGTAAA  AGACGATTAT    4320

TAGCTTTTGT AGATTTAGTT AGTTTTCGGA   TGAGTGAGAG   GAAACATGAT  TATTTACTAG    4380

GCGCTGGAAT TGAAACACCA TCTCATAGAG   CCTACTTTTC   TGAGGATACA  ATCTTTCCAT    4440

TAAGTGAAAT AAAATTTGGA GGAAGGATGT   ACTTATGCCC   AAATAATGTT  GATAAGTATC    4500

TCTGTATGAT GTTTGGGGAC AATTATATGA   CTATTCCACC   TGCAGCTCAG  AGGGTGTGGC    4560

                      orf3的终止       wzy的起始

ACTACCATAG CATTAATATT GGGAAATAGA CTACTATGGT TGAAGGGTTC  GTTATTTACA    4620

ATAGCATAGT CTTGCTTGCT TTATTATTTT   GTTATTTGAA   GAGATTTTTT  TTACCCCGTT    4680

ACTTTACTGT CTGCTTATTT TTGGTTCTTT   GGGTTCCATT   AGCGCTTAGG  TATGGTATAG    4740

GGCGTGATTA TTTTAGCTAT ATTGAAATTT   ATAAAAATGT   TCTAGTTGCA  AGAGATGGTA    4800

TTGAGCTGGG TTTTTATTAT ATAAATTATA   TACTTGCTTA   TTTTAATTTT  CACTATCAAT    4860

ATTTATTTGC ACTGTCATCC TTCATTACAG   TTTATTTTTG   TGTAAAAAGC  TTTGATAGAG    4920

ATTATACGTT AGTATCTATT ATATTATTTT   GTGCTTTAAT   TTACTTGCAG  GCATTCAGTA    4980

TTATTAGACA AATGATTGCA GTGTCACTCT   GTCTCTATAG   TTGCTCATTA  TGGAATAAAG    5040

GTTGTAAATG TAAATCATCA GTATTCCTTA   TATTGGCACC   TTTATTTCAT  TTCTCTGCAA    5100

TAATAATATT ACTTTTAGCT ATAGCAAGCC   GATATATAAA   AATAAATACG  ACAAGATGTT    5160

ATTTTGTATT TGTTTTTGCT CTTGTATTCA   TACTTATATT   GAATGGGGTA  GATTTTATAT    5220

TTTCAAACGC TATATTATTA GATAGTAAGT   ATGGATACTA   TGTAACATCA  GCATTTAATC    5280

GACCTACAGA AATTGGCTCA GGAATAGGTG   TTGCTATAGC   ATTATTTCTA  CCGTTCATGG    5340

TATTTATAAA ATCAACTCAG TTATATGAGT   ATAATAAAAA   CTATAATTTT  ATGCTGCTTA    5400

TAAATCTAGT ATATGTTATT TCTTATACAC   TTTCTCTGAA   AATATATATA  TTTGCACGAT    5460

TTACAGATGC TCTATCTTTT GTTCAGATAT   TATTGATACC   AGTAATACTT  AAAATCTCTT    5520

CCCCTAAAGG GATTTATTAT AATTTAATGA   TGGCTGTTAT   TTTGCTCCAT  ATTTTATTAT    5580

TTGAAGCAAA CCTTAATGCG AATACAATTT   CTGCAGGAAA   TATTTCGAAT  AGCGGATTAG    5640

                                                orf5的起始     wzy的终止

GCATCATGCC ATATAAAAGC ATACTAAATA   CTAAAATAGT   AGGTATATAT GACTAGTAAA    5700

ATATTGTTTA TAACTCCATT GCCTCCACCA   GTTACTGGAC   AATCTTTAGC  TTGTATCGAG    5760

TTATATAATT ATCTAGATAA AGATAATAAT   TGTATTATTG   ATGTAATAAA  TCTTTCAAAA    5820

CAGTCCTTTA TATCAGGGAA AGGCTCGTTC   AAAAGAGTTG   CTGAAATAGC  TGGTGTGTTA    5880

TTACGTTTAT TATTTCTTAG ACGAGATTAT   GATTTAATTT   ACTTTACACC  AGCTGAATCT    5940

AAAATGGGAA GTTATAAAGA TCAATTGATA   TATCTTTTTA   TGTTTGCAAA  GCTAAAGAAA    6000

ATGTATATTC ACTTGCATGG CGGTGCAGGC   ATGAAAAAAT   TATTAGAAAA  AGATAAATCA    6060

TTAATCTTCA AATTAAATAA ATATTTCATC   TCTAGGCTTG   CTGGAGTGAT  AGTGCTGGGT    6120

GAAAGATTAA AGAGTATTTA TAATGGAATT   ATTGAAAGTG   ATAAAATTTA  TGCAGTTGAG    6180

AACTTTTCTC AAGATTATTT ATTTATAAGG   CAAAGTGAGT   TAAAATTAAA  ATTTAATAAT    6240

CGGAACAAAA TAAAAATACT TTTTCTTAGT   AATTTGTTGC   CAGGAAAAGG  ATATATTGAA    6300

TTGTTAAAAT CTGCAGATTT TTTAGATGAT   TCTTGTGTGG   AATTCCATTT  CGCTGGTGGT    6360

TTCGAGGATG   AACAAGCAAA    AAAAATTTTT    TTAGAGGCTA    TTAATTTAAA  GAACAATATT    6420

TTCTATCATG   GGATTGTCAG    TGGCGATGAA    AAACGGAATC    TACTAATTAA  ATCTGATATT    6480

TTTTGTTTAC   CAACATATTA    TCCTTATGAG    GGGCAACCTA    TAAGCATACT  TGAGGCATAT    6540

GCTGCTGGGT   GTGTTGTTCT    TACTACCAAC    CACAGTGGTA    TATTTGATGT  GTTTGAACCT    6600

TGGCGTAATG   GAATAGAAGT    TGATAAAAAA    AGCACATCTG    ATTTAGTAAA  TGCAATAAAT    6660

TATTTTAATT   CGAACAGAGA    AGAGATTCGT    AAAATTGCCA    TCAATAATAT  TGTTGATGCA    6720

AGAAAAAAAT   ATAGACTTAA    ACATCATTTA    GAAAAGATGA    TGACAGTATT  AATGAATCAT    6780

         orf6的起始  orf5的终止

GAGGTAATAC  AGCAATGAAA   AAATATAAGA    TATGCAATAG    ATGTGTTATG  GATACATCTG    6840

ATCCAAACAT   TTCATTTGAC    GATAATGGCC    AGTGTGATTA    TTGTTCAAAC  TTTGATAAAA    6900

ATATTTTACC   AAATTGGAAT    GCTAATAATT    CAGGCTTATC    AAAATTGCTT  GAAATGTCAG    6960

AATCAATTAA   AAAAGACAGT    AAGGGAAGTG    ATTTTGATTG    TATTATTGGC  TTATCAGGAG    7020

GTTTAGATAG   CTCTTATGCA    GCGTATATTG    CGAAAGAAAA    AATGGGACTA  CGCCCATTAT    7080

TATTTCATGT   TGATGCTGGA    TGGAATACTG    ATCAGGCAGT    TGGTAATATT  GAAAAGCTTA    7140

TCGAAGGACT   TGGTTTAGAT    CTTTACACAG    AAGTTATAAA    CTGGGAAGAA  ATGAAAGATC    7200

TTCAACTGTC   TTTCTTAAAA    TCAGGAATTC    CAGATCAAGA    TTTAGTTCAG  GATGCTGCAT    7260

TTTTTTCATC   TTTATATAAG    TTTGCTCGGA    AACATAAAAT    TAAACATGTT  ATTACTGGTT    7320

CAAATTTTTC   TACAGAGTGC    TGTCGCGAAC    CAGAAGAATG    GGGAGGGTAT  TTAGGTATTG    7380

ATACTATGTT   ATTTAATGAT    ATCCACAGAC    AGTTTGGAAC    CCGGCCATTA  AATTCATTCC    7440

CCTTAGTAGA   TATACTCATC    TATAAGGTTT    TTTATCAGAA    AATCCTTGGA  ATGAAAGTAC    7500

ATCATCCATT   GAATTTAGTA    CCATTTACTA    AGAAGGATGC    CGAAAATGAA  CTTAGTGAAA    7560

AATTTGGCTG   GCAACCTTTT    CAACATAAGC    ACCATGAGTC    CCGTTTTACT  CGTTTCTATG    7620

AAGATTATTG   GTTACCACGT    AGGTTTGGTT    ACGAAAAACG    TAGAGCTCAT  TTCTCAAGTC    7680

TAATTATGAC   AGGGCAAATG    ACTCGCGAAC    AAGCTCTTGA    GAGGCTTTTA  AAGCCAGAAA    7740

TGGATGAACA   TTTTCTTGAA    CAAGAGTTTG    AGTATATTGC    ACACAAACTA  GGCATTAGTG    7800

TTGACGATTT   AAAAGAACTA    TTTAGTATTC    CCAAAAAAAC    CTACAAGGAT  TATAAAAATA    7860

AGCGTTGGTT   GATTAGTTTA    GGTACAAATA    TCCTACGAAC    ACTTGGATTG  GAAAAAAGGT    7920

orf7的起始   orf6的终止

ATTTCAGATG  ATCAAAATAA  TTGATTATGG     TATTGGAAAT    ATACAAGCAT  TCCTTAATGT    7980

ATATAAGCGA   TTAGGTATTA    ATTCAGGTAT    TGCTCATTCT    ATCGATGATA  TTAAAAGTGC    8040

TACACATTTG   ATATTACCTG    GAGTTGGAGC    TTTTGACCAA    GCTATGACAC  TTTTTAATAA    8100

CTCAGGTTTA   CGAGAAAGTA    TTGAAAAACG    TATTTTTGAG    GATCGGGTTC  CAATTATTGG    8160

TATCTGTGTA   GGTATGCAGA    TGCTTGCTAC    CTCTAGTGAG    GAGGGGAGTT  TGCCTGGTTT    8220

AGGATGGATT   CCTGGTACGG    TTCGAGCATT    CAGCAGTAAT    ATCTCTTCAA  GAAGCCTCCC    8280

GATGCCTCAT   ATGGGATGGA    ATAGTTTAAT    TAAAAAAGTA    AATACTCCAT  TACTGAAAGA    8340

TTTTAAAGAA   GAGTCTTCCT    TCTATTTTTT    GCACTCATTC    TATTACGAAT  GTGATGACGC    8400

CGGTGATGTA   TTAGCAACAG    CTGAATATGG    TCATAATTTT    CATTGTGTCA  TTGGCAGGAA    8460

TAATATATAT   GGCATTCAAT    GTCATCCGGA    GAAAAGTCAT    TCATCAGGTT  ATCAACTCTT    8520

                          orf8的起始    orf7的终止

AAAAAATTTT   GCAGAGATCC    AATATAATGC  TTAGACCAAG  AATCATACCC  TGTTTACTTG    8580

TCCACGATTC   TGGCTTAGTC    AAAACAGTTA    ATTTCAAATC    ACCGAAGTAT  GTTGGTGATC    8640

CAATTAATGC   CGTTAAAATT    TTTAATGAGA    AAGAAGCTGA    TGAATTGATG  GTCCTTGATA    8700

TTGATGCAAC   TTCAAGGGGA    CTTGAACCTA    ATTATGCTCT    AATAAAAAAA  CTCGCAGCGG    8760

AATGCCGAAT   GCCATTATGC    TATGGAGGAG    GTGTAACTAG    TGTAGCACAG  GCTGTAAAAA    8820

TTATCTCTCT   TGGTGTTGAA    AAGGTATCGA    TAAGTTCAGC    GGCCGTTGAA  AATCCAAATA    8880

TTGTAAAAGA   TTTGGCAGAA    GCCGTTGGTA    AACAAAGTGT    TGTAGTTGTG  CTAGATGTTA    8940

TTAAACGTAA    AGGTCTTTTT TCAAAGGGTT ATGAGCTTTC   GACTAGGAAT   AACACGCGAA    9000

CGTATAAAAT    CGATCCTATC TCGTTTGCTC AAAAAATGGT   TGCTTTGGGT   GCAGGCGAAA    9060

TCGTCATCAA    TTTTGTAGAT AATGATGGTG TTATGGGGGG   ATATGATGTT   GAATATTCTT    9120

CGACTATCAA    ATCGCAAATA AACGTACCTG TTACATTTCT   CGGTGGTGCG   GGAAACTATG    9180

AACATCTCTC    TGCATTGATT GACCAATGTG GCATCGTTGG   TGCAGCAGCT   GGTAGTCTTT    9240

TTGTATTTAA    AGGTAAGTAT AGAGCTGTGT TGATAAGCTA   CCCTACACCT   GAGCAGAAAG    9300

                                orf8的终止            fnla的起始

ATATTATTTG    CAATAATTTA AAGAAGAATT ATTAATAAGG GGTTATGATG TTCAAAGATA    9360

AAATACTGTT    AATTACTGGT GGTACAGGTT CATTTGGTAA   TGCTGTATTA   AACCGTTTTC    9420

TTTCTACAGA    TATAAAAGAA ATTCGTATTT TTTCTCGCGA   TGAAAAGAAA   CAAGATGATA    9480

TGCGGAAAAA    ATATAATAAT CAGAAGCTGA AATTTTATAT   TGGTGATGTC   AGAGATTACC    9540

GTAGTATTTT    GAATGCGACT CGCGGTGTTG ATTTTATATA   TCATGCAGCG   GCACTTAAGC    9600

AAGTTCCATC    ATGTGAATTT CATCCTATGG AAGCCGTTAA   AACTAATATC   CTTGGTACGG    9660

AAAATGTTCT    TGAAGCAGCT ATAGCGAATG AAGTGAAGAG   GGTTGTATGC   CTAAGTACTG    9720

ATAAAGCTGT    ATACCCGATT AACGCAATGG GTATTTCAAA   AGCTATGATG   GAAAAGGTCA    9780

TGGTCGCGAA    ATCCCGTAAT GTTGATCGCA ATAAAACAGT   AATATGTGGT   ACCCGTTATG    9840

GGAATGTTAT    GGCATCTCGC GGTTCAGTTA TTCCATTATT   TGTTGATCTT   ATTAGAGCGG    9900

GCAAGCCACT    CACAATAACT GATCCTAATA TGACCCGCTT   TATGATGACT   CTTGAGGATG    9960

CGGTAGATTT    AGTTCTTTAT GCGTTTGAAC ATGGTAATAA   TGGTGATATC   TTTGTGCAAA   10020

AAGCACCTGC    AGCAACTATT GACACATTAG CTATTGCTTT   AAAGGAACTA   CTAAATGTTC   10080

CAGACCATCC    GGTAAATGTC ATTGGAACGC GTCATGGCGA   GAAATTATAT   GAAGCTCTAC   10140

TTAGTCGTGA    GGAAATGATC GCTGCTATAG ATATGGGCGA   TTATTACCGT   GTCCCCCCAG   10200

ATCTTCGGGA    CCTTAATTAT GGAAAATATG TTGAGCAAGG   TGATAGCCGA   ATATCTGAAA   10260

TAGAAGATTA    TAACTCTCAT AATACTCAAC GGTTAGATGT   TGAAGGCATG   AAAGAGCTCT   10320

                                                                  fnla的终止

TGCTAAAATT    AGCCTTTATT CGAGCAATTC GTGCTGGTGA   AAAATATAAT   CTGGATTCAT 10380

       fnlb的起始

GATATGAGAA TATTAGTTAC TGGTGCAAAT GGTTTTATTG   GTCGTAATTT   ATGTTTGAGG   10440

CTTGAGGAAC    TTGGTTATAA AGATCTTATT AGAATTGATC   GAGAATCAAC   GAAGCAAGAT   10500

CTTGAACAAG    GCTTACAGGA TGCCGATTTT ATTTATCACT   TAGCTGGTAT   CAATAGACCT   10560

AAGACTGATG    ATGAGTTTAT TTCTGGAAAC AGTGATTTAA   CAAAGCATAT   AGTTGAGTAT   10620

CTCCTTTCTA    TTGGTAAGAA TACATCAATT ATGCTAAGTT   CTTCGATACA   AGCTGAACTT   10680

AATAATGCTT    ATGGGGTTAG CAAAGCTGTA GCTGAAAGCT   ATGTCGAAAA   ATATGCTGCT   10740

GCTAGTGGTT    CTTCGTATTA TATTTTCAGA TATCCAAACG   TTTTTGGTAA   ATGGTGTAAG   10800

CCAAACTATA    ATTCTTTTAT AGCAACTTTT TGCTACAATA   TTTCCAATGA   TATTGAGATT   10860

ACTATCAATG    ATGCATCAGC GCCAGTTAAT CTGGTGTATA   TTGATGATGT   TTGTACTGAT   10920

GCTATAGCTC    TTCTCTCTGG GACGGTTGAA AGCGGATATA   AAGTTGTTGC   ACCAATTTAT   10980

TCAACAACAG    TTGGTGAGGT TGCAGAATTA ATTTATAGCT   TCAAAAATAG   CCGTTCCACC   11040

CTGATCACAG    AAGCTGTCGG GACGGGATTT ACCCGTGCAT   TGTATTCTAC   ATGGCTGAGT   11100

TATTTACCAG    CAGAGAAGTT TGCGTACAAG GTACCTTTTT   ATGGGGATGC   CCGCGGAGTC   11160

TTTTGTGAGA    TGTTGAAAAC GCCTTCAGCG GGGCAGTTTT   CATTTTTTAC   TGCTCACCCT   11220

GGTATTACGC    GTGGCGGACA TTACCATCAC AGTAAAAATG   AGAAGTTTTT   GGTCATTCGA   11280

GGTCAGGCAT    GCTTTAAATT TGAACATGTG ATTACCGGTG   AGCGATATGA   ACTGAAAGTT   11340

TCATCGGGTG    AGTTTAAGAT CGTTGAAACA GTTCCTGGTT   GGACACATGA   CATTACAAAT   11400

ATTGGAACTG    AGGAATTAAT AGTCATGCTC TGGGCAAATG   AAATTTTCAA   CCGTGATGAG   11460

                 fnlb的终止   fnlc的起始

CCCGATACTA  TTGCGAGGCC    TCTATAATGA  AAAAATTAAA  AGTTATGTCT  GTTGTTGGAA   11520

CCCGTCCTGA  GATTATCCGT    TTGTCGAGGG    TTCTTGCTAA  GTTTGATGAA  TACTGCGAGC   11580

ATATTATTGT  CCATACTGGT    CAAAATTATG    ATTACGAATT  AAATGAGGTG  TTCTTCAATG   11640

ACTTGGGTGT  TCGAAAACCT    GATTATTTTT    TAAATGCAGC  GGGTAAAAAT  GCGGCGGAAA   11700

CCATTGGCCA  GGTTATTATT    AAGGTAGATG    AAGTATTAGA  AATCGAAAAA  CCTGAAGCAA   11760

TACTGGTATT  GGGCGATACG    AATTCATGTA    TTTCTGCCAT  TCCGGCCAAA  CGCCGTAAAG   11820

TGCCTATATT  TCATATGGAA    GCAGGTAACC    GTTGTTTCGA  TCAACGCGTG  CCTGAAGAAA   11880

CCAATAGACG  TATTGTTGAC    CATACGGCTG    ATATCAATAT  GACCTACAGT  GATATTGCTC   11940

GTGAATATCT  CTTGGCTGAA    GGTATCCCAG    CTGATCGGAT  CATAAAAACT  GGTAGCCCTA   12000

TGTATGAGGT  TCTTTCATAT    TATATGCCCC    AAATTGATGG  TTCAGATGTG  CTATCGCGTT   12060

TGAATCTACA  GTCTGGTGAG    TTTTTTGTAG    TAAGTGCGCA  TCGTGAAGAG  AATGTTGATT   12120

CTCCAAAACA  GCTCGTAAAG    CTTGCGAACA    TTCTAAATAC  TGTTGCTGAA  AAATATAATC   12180

TTCCAGTTAT  TGTCTCCACA    CACCCAAGGA    CACGTAACCG  AATCCGTGAG  CAAGGAATTG   12240

AATTTCATTC  AAATATAAAT    TTACTGAAAC    CATTGGGTTT  CCATGATTAT  AACCACTTGC   12300

AGAAGAACTC  ACGAGCTGTG    CTTTCAGATA    GCGGTACTAT  CACTGAAGAG  TCATCCATCA   12360

TGAATTTCCC  AGCGGTAAAC    ATCCGGGAAG    CGCATGAGCG  TCCGGAAGGC  TTTGAGGAAG   12420

CATCCGTCAT  GATGGTGGGG    TTAGAGTGTG    AACGCGTATT  ACAAGCGCTG  GATATTCTGG   12480

CAACACAACC  GCGAGGTGAA    GTCCGTCTTT    TACGTCAGGT  TAGTGATTAC  AGCATGCCAA   12540

ATGTGTCGGA  TAAAGTTGTC    AGAATTGTTC    ACTCTTACAC  AGATTATGTT  AAGAGAGTCG   12600

       fn1c的终止       orf12的起始

TCTGGAAAGA  ATATTGATGA  AACTTGCTTT    AATCATAGAT  GATTACCTGC  CCAACAGTAC   12660

TCGTGTTGGT  GCAAAAATGT    TTCATGAACT    TGCTCAAGAA  TTTATCCAGC  GTGGGCACGA   12720

TGTTACGGTA  ATTACTCCTG    GTACGGGCAT    GCAAGAAGAG  ATTTCTTTTG  ATACCTTTCA   12780

GGGGGTAAAA  ACATGGCGTT    TTAAAAGCGG    GCCGCTCAAG  GATGTAAGTA  AAATTCAGCG   12840

AGCGGTCAAT  GAAACGCTTT    TGTCCTATCG    GGCGTGGAAA  GCCATCAAAA  AATGGGTAAA   12900

AAAAGAGACC  TTTGAGGGTG    TGATTTATTA    TTCACCTTCC  ATATTCTGGG  GGCATTTAGT   12960

TAAAAAAATT  AAAGCTCGTT    GCCAATGTCC    TGCTTATCTT  ATTTTAAGAG  ATATGTTTCC   13020

ACAATGGGTA  ATTGATGCAG    GAATGCTTAA    TGCTGGTTCC  CCAATAGAAC  GCTACTTTCG   13080

TCTTTTTGAA  AAAATATCTT    ATCGTCAGGC    AAATCGTATT  GGACTTATGT  CTGATAAGAA   13140

TCTTGATGTT  TTTCGGAAAG    ATAATAAAGG    CTATCCGTGC  GAAGTTTTGC  GTAACTGGGC   13200

ATCCCTAACA  CCAACGATCA    TACCCAAGGA    TTATATACCA  CTACGTAAGC  GACTTGGCCT   13260

AGAGGATAAA  ACCATTTTCT    TCTATGGTGG    AAACATAGGT  CATGCACAGG  ACATGACAAA   13320

CTTGATGCGA  CTTGTGAGAA    ACATGGCAGT    ATATCCTCAA  GCTCATTTCC  TATTTATTGG   13380

CCAGGGTGAT  GAAGTTGAAT    TAATTAATTC    ATTAGCCTCT  GAGTGGGCAT  TGACGAATTT   13440

CACCTATTTG  CCCTCGGTTA    ATCAGGATGA    ATTTAAGTTC  ATTTTGTCGG  AAATGGATAT   13500

CGGCTTGTTT  TCTCTTTCCG    CTAGACACTC    TTCCCATAAT  TTTCCTGGTA  AGTTATTAGG   13560

CTATATGGTT  CAGTCGCTAC    CTATTTTAGG    TAGCGTAAAT  GCCGGAAATG  ATTTGCTCGA   13620

CATTGTCAAT  CAAAATAATG    CCGGATTAAT    CCATGTCAAT  GGTGAGGACG  ATAAATTATG   13680

TCAATCTGCG  CTATTAATGT    TGCATGATAT    TGATGTGCGC  CGGCAACTTG  GTTTGGGAGC   13740

GAATATATTG  TTGAAAGAAC    AATTCTCCGT    TGAGTCTGCG  GCACAGACGA  TAGAAATGAG   13800

            orf13的起始      orf12的终止

GTTGGAGGCA  TGCAATGCGA  TTAATTGATA  ATGACCAACT  CGACAAATTA  TATGATCAAG   13860

CCGGGCAATC  GGAACGTTTA    CGTTCCCACC    TTATGATGCA  CGGCTCGCAT  CAAGAAAAGG   13920

TACAGCGTTT  ACTTATTGCA    TTAGTAAAGG    GCAGCTATGT  TGAACCGCAT  TATCACGCAC   13980

TTCCTCATCA  GTGGGAAATG    TTCATAGTTA    TGGAGGGGCA  ACTTCAGGTT  TGTTTGTATG   14040

GTAGAAATGG  TGAGGTTATA    AAGCAATTTA    TAGCAGGAGA  TAATACTGGG  ATAAGCATTG   14100

TGGAGTTTTC  TCCGGGCGAT  ATACACAGTG  TCGAATGCCT  ATCTCCTCGT  GCTCTTATGG   14160

                                                        orf13的终止

TGGAAGTTAA  AGAGGGGCCG  TTTGACTCTT  CTTTTGCAAA  ATTGTTCGTG  TGATGCTCGT 14220

CTAAAATGCA  TCTTCTGCTA  TCTACCCAAG  CTAAACCTGA  GTTAACATCC  ATACCATATT   14280

TCAAGCCGCG  AATATCTTGC  GCGGTGACCA  CCCCTGACAG  GAGTATACAA  TGTCAAAGCA   14340

ACAGATCGGC  GTCGTTGGTA  TGGCTGTGAT  GGGACGCAAT  CTTGCGCTCA  ACATCGAAAG   14400

CCGTGGTTAT  ACCGTCTCTA  TTTTCAACCG  TTCCCGTGAA  AAAACGGAAG  AAGTGATTGC   14460

TGAAAACCCA  GGCAAGAAAC  TGGTTCCTTA  CTATACGGTG  AAAGAGTTCG  TTGAATCTCT   14520

GGAAACGCCT  CGTCGCATCC  TGTTAATGGT  GAAAGCAGGT  GCAGGCACGG  ATGCTGCTAT   14580

TGATTCCCTC  AAGCCGTACC  TCGATAAAGG  TGACATCATC  ATTGATGGTG  GTAACACCTT   14640

CTTCCAGGAC  ACCATTCGTC  GTAACCGTGA  GCTTTCTGCA  GAAGGCTTTA  ACTTCATTGG   14700

TACCGGTGTT  TCCGGCGGTG  AAGAGGGGGC  GCTGAAAGGG  CCGTCCATCA  TGCCTGGTGG   14760

CCAGAAAGAA  GCCTATGAAC  TGGTTGCACC  GATCCTGACC  AAAATCGCCG  CAGTAGCTGA   14820

AGACGGGGAG  CCATGCGTTA  CCTATATTGG  TGCCGATGGT  GCAGGTCACT  ATGTGAAGAT   14880

GGTTCACAAC  GGTATTGAAT  ATGGTGATAT  GCAACTGATT  GCTGAAGCCT  ATTCTCTGCT   14940

TAAAGGTGGC  CTGAACCTCA  CCAACGAAGA  ACTGGCGCAG  ACCTTTACCG  AGTGGAATAA   15000

CGGTGAACTG  AGCAGCTACC  TGATCGACAT  CACTAAAGAC  ATCTTCACTA  AAAAAGATGA   15060

AGACGGTAAC  TACCTGGTTG  ATGTGATTCT  GGATGAAGCA  GCAAACAAAG  GTACCGGTAA   15120

ATGGACTAGC  CAGAGCGCGC  TGGATCTCGG  CGAACCGCTG  TCGCTGATTA  CCGAGTCTGT   15180

GTTTGCACGT  TATATCTCTT  CTCTGAAAGA  TCAGCGCGTT  GCCGCGTCTA  AAGTTCTCAC   15240

TGGTCCGCAA  GCTCAGTCAG  CAGGCGACAA  GGCTGAGTTC  ATCGAAAAAG  TTCGCCGTGC   15300

GCTGTATCTG  GGCAAAATCG  TTTCTTACGC  TCAGGGCTTC  TCTCAGCTAC  GCGCCGCGTC   15360

TGAAGAGTAC  AATTGGGATC  TGAACTACGG  CGAAATCGCG  AAGATTTTCC  GTGCTGGTTG   15420

CATCATCCGT  GCGCAGTTCC  TGCAGAAAAT  CACCGATGCA  TATGCCGAAA  ATCCGCAGAT   15480

CGCTAACCTG  CTGCTGGCTC  CGTACTTCAA  GCAAATTGCC  GATGACTACC  AGCAGGCGCT   15540

GCGTGATGTC  GTTGCTTATG  CGGTACAGAA  CGGTATCCCG  GTTCCGACCT  TCGCCGCTGC   15600

GGTTGCCTAT  TATGACAGCT  ACCGTGCCGC  TGTTCTGCCT  GCTAACCTGA  TCCAGGCCCA   15660

GCGCGACTAG                                                               15670

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。