菹草胚培养及菹草石芽组织培养方法

摘要

本发明属于植物组织培养技术领域。运用菹草胚培养技术和石芽组培快繁技术，大规模生产菹草优质组培苗，以克服该植物种子在自然条件下极难萌发、石芽生长受季节限制且萌发率低，阻滞大规模繁殖推广的弊端，适应我国恢复水生植被、发展草食性鱼类或蟹类的养殖和净化水质，湖泊和池塘引种的迫切需要，从而恢复良好的水生生态环境，推动我国渔业的可持续发展。

说明书

一、技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域。

二、背景技术

我国水域生态系统的污染严重，水环境质量的下降对水生生物资源造成了严重破坏，要恢复水生生态系统的平衡，净化水质，促进渔业的发展，引种水体净化植物，具有重要意义。

菹草(Potamogeton crispus L.)为眼子菜科(Potamogetonaceae)多年生沉水草本植物，其营养价值和经济价值较大。菹草对水域富营养化有较强的适应能力，在受生活污水较严重污染的水体中亦能茂密生长，具有净化水体的作用，是冬季至初夏期间净化水质的主要水生植物。但由于种子在自然条件下极难萌发、石芽生长受季节限制且萌发率低，难以大规模繁殖推广。

目前国内外尚无菹草组织培养技术研究的相关报道。

三、发明内容

本发明的目的是：发明一种大规模生产菹草优质组培苗的技术，以克服该植物种子在自然条件下极难萌发、石芽生长受季节限制且萌发率低，阻滞大规模繁殖推广的弊端，适应我国恢复水生植被、发展草食性鱼类或蟹类的养殖和净化水质，湖泊和池塘引种的迫切需要，推动我国渔业的可持续发展。

本发明的技术方案是：

1.菹草胚培养方法

利用菹草胚进行愈伤组织诱导培养，通过激素调控，可使其愈伤组织诱导频率提高至60％以上。

愈伤组织的继代培养是决定其能否顺利进入分化的关键。通过调整改善光照、激素条件、琼脂类别、氮源和有机化合物等因子，在遏止愈伤组织的褐化和污染方面取得了成功，促使其继代增殖的正常进行，从而获得胚性愈伤组织。

本发明建立了菹草优质胚性细胞系，从胚性愈伤组织转入分化，植株再生频率为90％。

在以上研究的基础上，本项发明建立了菹草胚培养再生苗的繁殖方法如下：

(1)在添加2，4-D和IAA激素条件下由菹草外植体胚诱导愈伤组织；

(2)在添加2，4-D、NAA、BA、等激素条件下，进行愈伤组织的继代培养；

(3)在添加BA等激素条件下，诱导培养再生植株；

(4)在添加IBA、NAA等激素条件下，培养出完整的生根的再生植株；

该繁殖方法性能稳定，试验重复性好，试管再生苗分化、丛生性状良好。

各培养阶段的培养基配方(激素配比)如下表：

             菹草胚培养各阶段的培养基配方

    组培阶段    培养基组成成分    愈伤组织诱导    2，4-D0.5mg/L，IAA1.0mg/L    愈伤组织继代    2，4-D0.3mg/L，NAA0.5mg/L，    BA0.5mg/L，    植株再生    BA1.0mg/L，    植株生根    NAA0.2mg/L，IBA0.1mg/L，

在试管苗生产过程中，各个培养阶段的基本培养基均为MS大量元素、微量元素，B5维生素，蔗糖3％，Gelrite或Phytagel0.2％。

采用这一技术体系，以胚为外植体，愈伤组织诱导率在60％以上；愈伤组织继代培养增殖周期为20天；愈伤组织再生植株的频率达90％；试管苗的生根率达90％以上。

2.菹草石芽组织培养技术

利用菹草石芽进行不定芽诱导培养，通过激素调控，可使其不定芽诱导频率提高至100％。

无菌体系的建立是决定其能否顺利进行分化诱导的关键。通过调整改善外植体灭菌处理条件和培养基状态等因子，在遏止外植体的褐化和污染方面取得了成功，促使其继代增殖的正常进行，从而获得快速繁殖的不定芽。

本发明建立了菹草优质快繁系，从石芽转入分化，植株再生频率为100％。

在以上研究的基础上，本项发明建立了菹草不定芽的繁殖方法如下：

(1)在添加BA和KT激素条件下由菹草外植体石芽的诱导不定芽；

(2)添加BA、等激素条件下，进行不定芽的继代培养；

(3)在添加NAA等激素条件下，培养出完整的生根的再生植株

该繁殖方法性能稳定，试验重复性好，试管苗分化良好。

各培养阶段的培养基配方和激素配比如下表：

          菹草胚培养各阶段的培养基配方

    组培阶段    培养基组成成分    不定芽诱导    BA0.5mg/L，KT1.0mg/L    愈伤组织继代    BA0.3mg/L    植株生根    NAA0.1mg/L

本发明效果是：采用这一技术体系，种子萌发率可达到50％以上；以胚为外植体，愈伤组织诱导率在60％以上；愈伤组织继代培养增殖周期为20天；愈伤组织再生植株的频率达90％；以石芽为外植体不定芽诱导频率达到100％；试管苗的生根率达90％以上。

通过体细胞胚的诱导培养研究，大规模生产菹草的试管苗，并用组织培养等技术手段改良菹草的农艺品质，以利于推广开发。如有足够投资，用此技术方案，可年生产菹草试管苗100万株以上。菹草经济价值较大，首先因其草质嫩脆而为草食性鱼类的良好饵料，石芽含有丰富的核黄素有助于蛋黄质量的提高而作为鸭等禽类的饲料，菹草丛生之处是蟹类的良好栖息地和脱壳期与蟹殖期的隐蔽场所和上等农田绿肥；其次是具一定的营养价值：物质含量中粗蛋白质占26.72％，粗脂肪占5.48％，粗纤维占15.78％，无氮浸出物占35.67％。更重要的是菹草对水域富营养化有较强的适应能力，在受生活污水较严重污染的水体中亦能茂密生长，具有净化水体的作用，是冬季至初夏期间净化水质的主要水生植物。兼有优良饲料、恢复水生植被和净化水体的特点，使之在湖泊、池塘发展可持续的渔业系统的需求方面将有所作为。

四、具体实施方式

1.建立无菌体系

将菹草种子和石芽用自来水洗净后，在70％乙醇中浸泡30s，用0.1％HgClz水溶液，含少量吐温80，灭菌9min，再用无菌蒸馏水洗涤5次。将灭菌后的种子和石芽接种到附加3％蔗糖的不加外源激素的MS培养基上，在温度为25±2℃和光强为2000lx，每日光照12h的条件下建立无菌体系。

2.菹草胚培养方法的实施方式

(1)愈伤组织诱导及继代培养

在超净工作台中将无菌菹草种子进行胚剥离，接至2，4-D0.5mg/L，IAA1.0mg/L培养基上诱导愈伤组织。温度为25±2℃、光强为800lx、每日光照12h条件下培养。利用菹草胚进行愈伤组织诱导培养，通过激素调控，可使其愈伤组织诱导频率提高至60％以上。

诱导出的愈伤组织转入含有2，4-D0.3mg/L，NAA0.5mg/L，BA0.5mg/L，的MS培养基上进行继代培养，每20d转代1次。

愈伤组织的继代培养是决定其能否顺利进入分化的关键。通过调整改善光照、激素条件、琼脂类别、氮源和有机化合物等因子，在遏止愈伤组织的褐化和污染方面取得了成功，促使其继代增殖的正常进行，从而获得胚性愈伤组织。

(2)苗的分化

将在弱光下诱导的愈伤组织转移到含BA1.0mg/L，的MS培养基上，在温度为25±2℃、光强为2000lx、每日光照12h条件下诱导苗的分化。本发明建立了菹草优质胚性细胞系，从胚性愈伤组织转入分化，植株再生频率为90％。

(3)根的分化

当分化苗长至5-7cm高时，将其从愈伤组织上取下来切成3cm左右并含有2-4片叶子的茎切段，按原来的向地方向插入到含NAA0.2mg/L，IBA0.1mg/L的MS培养基上，在温度为25±2℃和光强2000lx，每日光照12h的条件下诱导根的分化。

该繁殖方法性能稳定，试验重复性好，试管苗分化、丛生性状良好。采用这一技术体系，以胚为外植体，愈伤组织诱导率在60％以上；愈伤组织继代培养增殖周期为20天；愈伤组织再生植株的频率达90％；试管苗的生根率达90％以上。

3.菹草石芽组织培养方法

利用菹草石芽进行不定芽诱导培养，通过激素调控，可使其不定芽诱导频率提高至100％。

无菌体系的建立是决定其能否顺利进行分化诱导的关键。通过调整改善外植体灭菌处理条件和培养基状态等因子，在遏止外植体的褐化和污染方面取得了成功，促使其继代增殖的正常进行，从而获得快速繁殖的不定芽。

具体实施方法如下：

(1)不定芽诱导

无菌的石芽外植体切成3cm左右的小段，接种在添加BA0.5mg/L，KT1.0mg/L的MS培养基上，在温度为25±2℃、光强为2000lx、每日光照12h条件下进行菹草外植体石芽的不定芽诱导。

(2)不定芽的继代培养

将诱导出的丛状不定芽分离成小丛，在添加BA0.3mg/L的MS培养基上，进行不定芽的继代培养。

(3)生根培养

丛状不定芽分离并切成3cm左右的单个植株，在添加NAA0.1mg/L条件下，培养出完整的生根的再生植株，培养条件温度25±2℃和光强2000lx，每日光照12h。

该繁殖方法性能稳定，试验重复性好，试管苗分化良好。以石芽为外植体不定芽诱导频率达到100％；试管苗的生根率达90％以上。