用于分析丙型肝炎病毒(HCV)基因型的寡核苷酸芯片组合物及其检测方法

摘要

本发明公开了一种通过从血浆和血清中提取RNA、进行丙型肝炎病毒(HCV)RT－PCR、然后使其在寡核苷酸芯片上进行反应来分析HCV基因型的方法。本发明还提供了一种在一个载片上简单并精确的检测对4个人的HCV基因型进行的分析的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及寡核苷酸芯片组合物及其制造方法，特别的，涉及一种分析丙型肝炎病毒(HCV)基因型的寡核苷酸芯片组合物及其检测方法。

技术背景

一般而言，丙型肝炎病毒(下文称之为‘HCV’)，一种肝炎病毒，是导致严重疾病例如肝炎包括急性肝炎和慢性肝炎的主要因素，其可能会发展成为肝硬化和肝细胞瘤。HCV通过输血和体液传播(Choo等，Science 244，359-362，1989)。据估计全世界大约有4亿人感染有HCV：0.2-2％的人在发达国家例如欧洲、北美和日本；2-5％在南美和亚洲；超过5％在非洲；1.6％在韩国(Park等，J.Viral Hepat.2，195-202，1995)。对于人类健康，HCV是非常危险的病毒，而且不同于乙型肝炎病毒(HBV)，它不是渐愈性的。50-85％被感染的人患有慢性肝炎。因为HCV是RNA病毒，科学家还没有开发出任何合适的药物和疫苗，不过更少有关于HCV的基础研究。由于诊断方法随着分子生物学的发展而完善，人们能够避免因输血而引起的传染的可能性。然而，因为传染路径仍然不明朗，传染的可能性依然存在。

HCV是阳性单链线状RNA病毒，包括大约9,500个碱基和大约3,000个氨基酸，大小为50nm，为Choo等于1989年在获自黑猩猩的非-A或非-B(NANB)型肝炎病毒中发现的。HCV基本上由产生结构蛋白核心、核壳体和包膜糖蛋白以及非结构蛋白螺旋酶、病毒蛋白水解酶、RNA-依赖性RNA聚合酶、转录酶和调节多肽的可读框组成(Chou等，Jpn.J.Med.Sci.Biol.4，147-157，1991)。ORF的两端分别具有5’-非翻译区(5’UTR)和3’UTR。5’UTR，HCV基因中最保守的部分之一，具有大约340bp和一个茎环结构(Han等，Proc.Natl.Acac.Sci.U.S.A.88，1711-1715，1991)。

由于HCV的高突变率，每年产生(1.44-1.92)×10^-3的HCV碱基置换。HCV基因的5’UTR和衣壳是最保守的。突变最频繁的发生在E1和E2(Ogata等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88，3392-3396，1991)。由于这种特性，HCV表现出高度的基因多态性。因此，迄今HCV被分为6型，并且亚型的范围从数个到数十个不等(Simmonds等，J.Gen.Virol.74，2391-2399，1993；Cha等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89，7144-7148，1992)。因为没有对这些类型分类的标准方法，研究者运用不同的分类法，但是Simmond的分类法是普遍应用的。这种分类法对基因型加上数字(1，2，3，...)并对亚型加上字母(a，b，c，...)表示。根据该分类法，HCV表现出31-35％的基因型间差异，20-23％的亚型间差异，以及1-10％的甚至是同一亚型内的差异(Simmonds等，J.Gen.Virol.74，661-668，1993)。

分析HCV基因型的方法被用于鉴定HCV感染和预测感染路径以及IFN-α的治疗效果(Hino等，J.Med，Virol.42，299-305，1994)。而且这种分析基因型的方法被用于调查分布和疫苗的开发，因为它根据地区和种族表现出不同的分布(Greene等，J.Gen.Virol.76，211-215，1995)。IFN-α是治疗HCV最常见的抗病毒剂。IFN-α对50％的病人有效。不过，仅有25％的病人可能恢复正常行使功能的肝脏并且血清中没有HCV。这里，根据对IFN-α治疗效果和HCV类型之间的关系的研究，IFN-α在基因型1a、2、3和5中表现出极好的治疗效果，但在基因型1b和4中治疗效果微弱(Yoshioka等，Hepatology16，293-299，1992)。另外，基因型1b和4迅速的转变成慢性肝炎而基因型1a和2a转为较好的症状(Lopez-Labrador，等，J.Hepatol.27，959-965，1997)。

分析HCV基因型的一般方法如下。第一，SSP-PCR方法利用对HCV基因型具有特异性的PCR引物。该方法是通过重组对各种基因型核心区域特异的PCR引物进行RT-PCR。该方法具有可在RT-PCR结束后立即获得结果的优点，但该方法具有如果在引物的识别位点周围发生突变就无法分析新的类型的缺点。因此，SSP-PCR方法在分析具有变化多样的突变的HCV基因型中不令人满意。第二，PCR-RFLP方法通过RT-PCR扩增5’UTR区并利用限制性内切酶(Park等，J.Med.Microbiol.47，1998)。PCR-RFLP方法具有结果可容易并清楚地获得的优点，但是除非所用的限制性内切酶识别突变区域，否则不能分析HCV基因型。第三，一种通过RT-PCR扩增5’UTR区并与硝化纤维(NC)膜上HCV基因型特异性的寡核苷酸探针杂交的方法。根据该方法，精确的结果可通过数种探针获得，但是在NC膜上固定许多探针具有一定的限度。另外，该方法花费大量的时间和劳动处理和分析各种样本，因为只有一个人的一种基因型可以在该NC膜上分析。

发明内容

因此，为了克服前述的问题，本发明的一个目的是提供一种改进的组合物用于分析HCV基因型。

本发明的另一个目的是提供一种改进的方法利用该组合物分析HCV基因型。

为了实现前述的目的，本发明提供了包含序列ID NO：1到14中所示的碱基序列的多元寡核苷酸探针组合物。

本发明的寡核苷酸探针是用于测定HCV基因型的探针并且固定在底物上。

本发明提供了序列ID NO：15到20中所示的初级或次级引物序列用于检测探针与靶基因的结合。

序列ID NO：18所示的次级引物中的一个反义引物是耦合生物素的，序列ID NO：19所示的次级引物中的一个反义引物与荧光探针相互作用，而序列ID NO：20中所示的荧光探针是耦合花色素苷的。

本发明提供了一种分析HCV基因型的方法，包含步骤：从血浆或血清中制备HCV RNA；利用所制备的RNA进行初级RT-PCR；在初级PCR之后进行次级不对称PCR；将探针与次级不对称PCR的副产物杂交；以及检测杂交结果。

在本发明分析HCV基因型的方法中，杂交结果利用抗生蛋白链菌素-碱性磷酸酶和四唑氮蓝氯化物/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐(NBT-BCIP)联合生物素或微矩阵扫描仪来鉴定。

在本发明中，开发了一种HCV寡核苷酸芯片利用最新发展的DNA微矩阵技术在一个载片上同时分析4个人的样本。该芯片比现存的寡核苷酸芯片更为改善。为了测定HCV基因型，本发明制备了可与6种类型、11种亚型、53个种的HCV 5’UTR进行反应的14个寡核苷酸。这些材料整合于一个含有用于4个人的4个小室的乙醛玻璃载片上。RT-PCR扩增的HCV基因与PCR副产物和整合于该载片上的寡核苷酸探针进行杂交。杂交探针利用发色反应或荧光反应进行分析，并且确定了HCV的6种基因型和11种基因亚型。

附图说明

图1显示了HCV寡核苷酸芯片完整的外形照片。具有如所标数字显示的4个小室，可在一个载片上同时分析4个人的HCV基因型。表5中所示的可辨别HCV基因型的12个探针两次固定于该载片上，而作为阳性和阴性对照的2个探针固定四次，总计32个探针。HCV寡核苷酸芯片通过将coverwell灌注小室(Sigma Cat#Z37916-6，美国)加在探针之上而造成。

图2显示了该HCV寡核苷酸芯片上关于HCV 1b型的发色反应结果照片。该照片是图1载片4个小室中的一个所产生的反应的放大图像。该照片显示了频繁感染韩国人的HCV 1b型。照片中反应在如表5“反应的HCV类型”所示的14个探针中的探针1和2中同时发生。探针13是一个在所有反应中呈现的阳性对照，而探针14是一个在所有反应中均不呈现的阴性对照，从而确保实验的精确性。固定了同一探针的两个相同的样斑以使反应更为精确。探针13和14两次分别固定在最顶部和最底部以确定阳性和阴性对照及其位置。

图3显示了该HCV寡核苷酸芯片上关于HCV 1b型的荧光反应结果照片。其与探针的反应和图2中的反应相同。但它不同于图2中的反应因为杂交反应和PCR反应中利用了荧光引物和探针，并且扫描仪(GenePiX4000，Axon instruments，美国)被用来分析反应。

具体实施方式

本发明将以参照伴随附图详细描述示范性实施方式的方式予以说明，其仅仅是用于解释而不是限制本发明。

实施例1：HCV引物的人工合成以及碱基序列

通过分析与6型5’UTR共同反应的位点，如表1中所示的HCV PCR引物被用于RT-PCR。用于次级不对称PCR的反义引物根据鉴定方法被分成两类。第一类，引物被连接到生物素上以通过杂交发应鉴定发色反应。第二类，花色素苷被用来通过杂交反应鉴定荧光反应。在次级PCR反义引物的5’端额外人工合成了25bp碱基(SP6)，并且合成了连接于花色素苷的与该位点互补的碱基。引物根据发明人的预定由MWG-biotech公司(德国)合成，并且引物用《分子克隆》第三版10.42节所写的合成寡核苷酸的方法合成(Sambrook和Rusell，冷泉港实验室出版，纽约，美国，2001)。

表1.分析HCV基因型的引物碱基序列

        引物    碱基序列(HCV 5’UTR)    备注初级有义(序列ID NO：15)    CTGTG AGGAA CTACT GTCTT    PCR    大小    268bp反义(序列ID NO：16)    ACTCG CAAGC ACCCT ATCAGG次级有义(序列ID NO：17)    TTCAC GCAGA AAGCG TCTAG    PCR    大小    236bp反义发色反应  生物素-TATCA GGCAG TACCA  CAAGG  (序列ID NO：18)荧光反应  CGATT TAGGT GACAC  TATAG GGAGG TATCA GGCAG  TACCA CAAGG  (序列ID NO：19)    PCR    大小    261bp  花色素苷-CCTTG TGGTA  CTGCC TGATA CCTCC CTATA  GTGTC  (序列ID NO：20)    荧光探针

实施例2：HCV RNA的制备、反转录-初级PCR和次级PCR反应

1)混合5ul HCV RNA抽提缓冲液(1ml中DEPC-DW 860ul、Taq 10×buffer100ul、1M DTT 20ul、10％NP40 20ul)和10ul血浆或血清。

2)将装有该混合血清的试管在PCR设备中于92℃加热2分钟，然后迅速在冰上轻轻敲打试管

3)试管离心5-10秒

4)继而如表2所示在GeneAmp PCR system 9600热循环仪(Perkin ElmerCetus，U.S.A)中进行反转录和初级PCR反应

5)如表3所示用2ul初级PCR产物进行次级不对称PCR反应

6)在将1ul凝胶上样缓冲液(0.25％溴酚蓝、0.25％二甲苯苯胺FF、15％非可聚蔗糖400)混合至5ul次级不对称PCR产物中、并用含1μg/ml溴乙锭(EtBr)的2％琼脂糖凝胶进行电泳之后，用配备有紫外透射仪的图像分析仪(Vilber Lourmat，法国)鉴定236bp或261bp的条带。

表2.HCV反转录和初级PCR反应条件

反应组合物条件反应温度条件蒸馏水 16.857℃，3.0分42℃，45.0分95℃，3.0分1次10×buffer 3.02mM Dntp 1.510pmol初级引物 1.5100mM DTT 1.594℃，1.0分52℃，1.0分72℃，1.0分30次100UAMV RT 0.340U Rnasin 0.35u Taq 0.1HCV核酸 5.0总计 30ul72℃，5.0分1次

表3.HCV次级PCR反应条件

反应组合物条件 反应温度条件无菌蒸馏水 12.9 95℃，3.0分1次10×buffer 2.02mM dNTP 1.0 94℃，1.0分 53℃，1.0分 72℃，1.0分25次1pmol次级有义引物 1.010pmol次级反义引物 1.05U Taq 0.1初级PCR产物 2.0总计 20ul 72℃，5.0分1次

实施例3：用于制备HCV寡核苷酸芯片的探针的合成和碱基序列

所有探针的5’端加上了氨基连接用于共价键连接到乙醛玻璃。10-20个寡聚(dT)连到探针上以易化杂交反应。然后，表5所示的碱基序列被连到氨基连接-寡聚(dT)_10-20。简短的表示，具有“氨基连接-寡聚(dT)_10-20-探针碱基序列”排列次序的引物根据发明人的预定在MWG-biotech公司(德国)合成。所鉴定的HCV基因型的碱基序列通过分析如表4所示的所有属于6种类型的53个种的HCV基因来鉴定。

表4.HCV基因型和类别的分析

 HCV类型HCV类别 1aHCV-1(M62321)，HCV-H(M67463)，HC-J1(D10749)，GM1(M61728)，GM2(M61719)，H90(M62382)，US9(L38353)，H77(AF009606)，H99，PT-1 1bHCV-J(D90208)，HCV-BK(M58335)，HCV-JK1(X61596)，HCV-China(L02836)，HCV-T(M84754)，HCV-JT(D11168)，HCV-J4/83(D13558)，HCV-J4/91(D10750)，HCV-JT(D11355)，HCV-N(S62220)，HCV-C2(D10934)，HCV-L2(U01214)，CON1(AJ238799)，NC1(L02836)，FR3(L38351)，HCV-K1-S1(D50483)，HCV-K1-R1(D50480)，HCV-TA 1cHC-G9(D14853) 2aHC-J6(D00944)，K2A(D12507)，Eb-9，FR5(L38334) 2bHC-J8(D01221)，MA(AB030907)，K2B-1(D12509) 2cBE1369L38322) 3aNZL1(D17763)，HCV-K2a(D28917)，Eb-1(D10123)，CB(AF046866) 3bHCV-Tr(D26556)，TR-KJ(D49374) 4aGB358(L29608)，ED43(Y11604)，Z4(M84848)，ED43(Y11604) 5aBE96(L29585)，EUH1480(Y13184)，BE95(L29581) 6aQC26(U33431)，HK2(D43679)，EUHK2(Y12083)，HK

在表5所示的碱基序列中，中间的以大写字母表示的碱基是最重要的部分。以该碱基为中心，确定62℃左右的Tm值合成了15-25bp左右的探针。

表5.用于测定HCV基因型的探针碱基序列

探针名称碱基序列反应的HCV类型HCV01(序列ID NO：1)gaattgccaggaCgaccgggtcctt1a，1b，1cHCV02(序列ID NO：2)gcccccgcGagactgct1b，4a(Z4)，5aHCV03(序列ID NO：3)cctttcttggatTaacccgctcaat1c，4a(ED43)，5a(BE95)HCV04(序列ID NO：4)ttggataaacccActctatgcccgg2a，2cHCV05(序列ID NO：5)AattgccgggaAgactgggtcct2aHCV06(序列ID NO：6)acccactctatgTccggtcatttgg2bHCV07(序列ID NO：7)ctctatgcccAgccatttggg2cHCV08(序列ID NO：8)aatcgctgggGtgaccgggtc3aHCV10(序列ID NO：9)cccgcgagatCactagccgag3a，3bHCV11(序列ID NO：10)tagtatgagtgtTgtacagcctcca4aHCV12(序列ID NO：11)gtatgagtgtcgAacagcctccagg5aHCV13(序列ID NO：12)ccgggtcctttcCattggatcaaa6aHCV14(序列ID NO：13)agtggtctgcggAaccggtgagtac与所有的类型反应(阳性对照)HCV15(序列ID NO：14)ggtctgcggGaccggtgag不与任何类型反应(阴性对照)

实施例4：HCV寡核苷酸芯片的制备

1)Telechem公司生产的优等乙醛玻璃载片被用于制备寡核苷酸芯片。连有100pmole氨基的探针与100pmole的DMSO混合。混合的探针用纳米-绘图仪(NP 1.2，GeSiM，德国)固定于载片上。载片用0.2％的SDS洗涤两次各5分钟，随后用蒸馏水洗涤两次各5分钟。在用加热的蒸馏水95℃ 2分钟洗涤一次后，载片于室温下用蒸馏水洗涤一次。

2)在载片与硼氢化钠(1.3g NaBH₄，375ml PBS，125ml 100％ EtOH)反应5分钟后，载片用0.2％的SDS洗涤三次各1分钟，用蒸馏水1分钟洗涤一次，然后室温干燥。

3)为在载片上分别分析4个样本，4个小室通过将Sigma公司生产的灌注小室(4个小室)加到载片上而分隔开。上述完工的HCV寡核苷酸芯片室温保存于黑暗处备用。

实施例5：与HCV PCR产物的杂交反应

1)20-200ul的预杂交缓冲液(1％BSA，5×SSC，0.1％ SDS)滴到结合有寡核苷酸的载片上，接着载片于42℃反应30-60分钟。载片用蒸馏水洗涤5次，以异丙醇清洗，于室温干燥，然后在80℃干燥2小时。

2)在发色反应中，结合有生物素的HCV PCR产物于95℃变性3分钟，然后按照1∶3的比率与杂交液(4×SSC，0.3％ SDS)混合。在荧光发应中，结合有SP6的HCV PCR产物于95℃变性3分钟，然后分别与等体积的花色素苷-探针和杂交液(6×SSC，0.5％ SDS)混合。

3)在小室覆盖的情况下，向载片上的小室填充50-200ul的杂交缓冲液，然后在63℃反应1-3小时。

4)载片用1×SSC，0.2％ SDS室温洗涤5-10分钟，用0.1×SSC，0.2％ SDS在63℃洗涤5-10分钟，用0.1×SSC洗涤5-10分钟，然后室温干燥。

5)鉴定结果

A.发色反应(生物素方法)：载片与30-120ul封闭缓冲液室温反应30分钟，然后与稀释为1/2,000的30-120ul抗生蛋白链菌素-碱性磷酸酶反应30分钟。在与稀释为1/50的四唑氮蓝氯化物/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐(NBT-BCIP)黑暗中室温下反应1小时后，载片小心的用蒸馏水洗涤。HCV基因型通过显色分析。

B.荧光反应(花色素苷方法)：荧光HCV基因型用扫描仪分析(GenePiX4000，Axon instruments，美国)。

如上所述，为了分析HCV基因型，本发明人发明了通过PCR和分析取决于类型而表现出不同结果的碱基来扩增HCV 5’UTR的方法。由于5’UTR的碱基变化在特定区域是被限定的(Okamoto等，Jpn.J.Exp.Med.60，215-222，1990)，分析5’UTR HCV基因型的方法具有引物容易选择并使得关于突变或新型的RT-PCR反应成为可能的优点。此外，由于利用5’UTR的HCV基因分型的分析结果与那些核心、NS3和NS5的结果完全相同(Karachristos等，J.Med.Microbiol.42，367-371，1995)，本发明利用5’UTR区域分析HCV的基因型。

如早先所讨论的，在本发明中，开发了一种通过分析HCV 5’UTR基因用于诊断基因型的寡核苷酸芯片。在本发明的HCV寡核苷酸芯片中，解决了常规芯片的缺点。修饰了两个常规探针并且加入了两个新的探针。结果，有可能额外的鉴定1c和2c并更精确地分析4a和5a。利用这些探针对HCV基因型的分析可用来鉴定HCV感染和感染路径，并预测IFN-α的治疗效果。此外，提起基因型的分布，这种分析可用于开发适合地区和种族的HCV疫苗，并且它可有助于研究慢性肝炎、肝硬化和肝细胞瘤。

                                 序列表

<110>株式会社生物核心

<120>用于分析丙型肝炎病毒(HCV)基因型的寡核苷酸芯片组合物及其检测方法

<150>KR2001-19648

<151>2001-04-12

<150>KR2002-997

<151>2002-01-08

<160>20

<170>Kopatentln 1.71

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<223>用于分析HCV基因类型的探针

<400>1

gaattgccag gacgaccggg tcctt                                25

<210>2

<211>17

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<223>用于分析HCV基因类型的探针

<400>2

gcccccgcga gactgct                                         17

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<223>用于分析HCV基因类型的探针

<400>3

cctttcttgg attaacccgc tcaat                                 25

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<223>用于分析HCV基因类型的探针

<400>4

ttggataaac ccactctatg cccgg                                 25

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<223>用于分析HCV基因类型的探针

<400>5

aattgccggg aagactgggt cct                                   23

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<223>用于分析HCV基因类型的探针

<400>6

acccactcta tgtccggtca tttgg                               25

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<223>用于分析HCV基因类型的探针

<400>7

ctctatgccc agccatttgg g                                   21

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<223>用于分析HCV基因类型的探针

<400>8

aatcgctggg gtgaccgggt c                                   21

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<223>用于分析HCV基因类型的探针

<400>9

cccgcgagat cactagccga g                                 21

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<223>用于分析HCV基因类型的探针

<400>10

tagtatgagt gttgtacagc ctcca                             25

<210>11

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<223>用于分析HCV基因类型的探针

<400>11

gtatgagtgt cgaacagcct ccagg                             25

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<223>用于分析HCV基因类型的探针

<400>12

ccgggtcctttccattggat caaa                                    24

<210>13

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<223>用于分析HCV基因类型的探针

<400>13

agtggtctgc ggaaccggtg agtac                                  25

<210>14

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<223>用于分析HCV基因类型的探针

<400>14

ggtctgcggg accggtgag                                         19

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<223>用于分析HCV基因类型的引物

<400>15

ctgtgaggaa ctactgtctt                                          20

<210>16

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<223>用于分析HCV基因类型的引物

<400>16

actcgcaagc accctatcag g                                        21

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<223>用于分析HCV基因类型的引物

<400>17

ttcacgcaga aagcgtctag                                          20

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<223>用于分析HCV基因类型的引物

<400>18

tatcaggcag taccacaagg                                          20

<210>19

<211>45

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<223>用于分析HCV基因类型的引物

<400>19

cgatttaggt gacactatag ggaggtatca ggcagtacca caagg              45

<210>20

<211>35

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<223>用于分析HCV基因类型的引物

<400>20

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