一种毛细管区带电泳对药物进行筛选的方法

摘要

本发明提供一种毛细管区带电泳对药物进行筛选的方法，具体步骤如下：1)将受体或配体配制成一系列标准浓度进样，加压运行、检测，获得电泳信号谱图，测量峰高h，每个浓度对应一个峰高，由此求得线性相关方程，作为工作曲线；2)将与1)相同浓度的受体或配体分别与不同浓度的配体或受体混合进样；在与1)相同的工艺条件下加压运行、检测，获得电泳信号谱图，测量峰高h，将h代入工作曲线，求得相应的受体或配体的游离浓度C

说明书

技术领域：

本发明涉及一种对药物进行筛选的方法，一种用毛细管区带电泳方法对药物进行筛选，尤其适用于生物工程。

背景技术：

目前在药物筛选中采用亲和毛细管电泳方法，如在相关文献：1)D.Chen，L.Clohs，J.Chapman，“Capillary Electrophoresis and Its Applicationsin Pharmaceutical Industry”，the educational short course of Canadian Societyfor Chemistry Conference and Exhibition，2002，Vancouver，Canada.2)J.N.Little，J.L.WATERS，D.E.Hughes，”Affinity capillary electro-phoresis forrapid assay development and Screening of newly discovered targets”，Societyfor Biomolecular Screening，2001，USA中，亲和毛细管电泳通过监测溶质的迁移速率变化来定量，重现性较好，但是需要将受体或配体加入到运行缓冲液中，样品消耗比较大，只能用于弱相互作用体系，而且在寻找用于衡量电渗流变化的标示物方面也比较苛刻。

发明内容：

本发明的目的是提供一种更有效的用毛细管区带电泳对药物进行筛选的方法，该方法分离效果比较好，并且试剂及样品消耗极少，适用于强结合及弱结合体系，可用于天然产物(如中药)、合成药物或生物工程制药的药物筛选。

本发明提供的毛细管区带电泳对药物进行筛选的方法，其具体步骤如下：

1)将受体或配体配制成一系列标准浓度进样，加压运行、检测，获得电泳信号谱图，测量峰高h，每个浓度对应一个峰高，由此求得线性相关方程，作为工作曲线；

2)将与1)相同浓度的受体或配体分别与不同浓度的配体或受体混合进样；在与1)相同的工艺条件下加压运行、检测，获得电泳信号谱图，测量峰高h’，将h’代入工作曲线，求得相应的受体或配体的游离浓度C_f；

3)如果以受体为考察对象，C_f是游离的受体浓度，则γ＝(C₀-C_f)/C_t，其中，C₀是加入的受体总浓度，C_t是加入的配体总浓度；

4)采用方程γ/C_f＝-Kγ+nK，

式中：K是热力学结合常数，

      n是结合位点数，

γ是与配体结合的受体浓度与配体总浓度之比(与受体体结合的配体体浓度与受体体总浓度之比)。

按上述方程回归，定量求得热力学结合常数K、结合位点数n。

经实验发现：在只有受体进样时的受体信号峰高与受体、配体混合物进样(两中情况下的受体浓度是一样的)时的峰高有明显差别。本发明正是利用浓度和峰高的线性相关性，通过简单地测量谱线的峰高，然后由步骤1)-4)定量地求得了热力学结合常数K、结合位点数n。

本发明提供的毛细管区带电泳对药物进行筛选的方法中，可以采用涂渍的毛细管柱，毛细管柱上可以涂渍丙烯酰胺，以取得较好的柱效和峰值。

本发明提供的毛细管区带电泳对药物进行筛选的方法，其受体可以是蛋白，配体是药物；受体可以是酶，配体是酶抑制剂；或者受体可以是核酸，配体是药物。

本发明提供的毛细管区带电泳对药物进行筛选的方法，其缓冲液是三羟甲基氨基甲烷-乙酸盐(含有一定浓度的氯化钠)溶液。

本发明提供的毛细管区带电泳对药物进行筛选的方法，其检测方法可以是紫外的，也可以是荧光的。

本发明提供的毛细管区带电泳对药物进行筛选的方法，必要时在混合后要温育一段时间再进样。

用毛细管区带方法定量求算药物(配体)和受体相互作用的结合常数大都是药物和蛋白体系，并且同时得出结合常数和计量结合比(结合位点数)的例子甚少，在核酸和药物的作用中更未见有能同时给出这两方面信息的报导；我们的方法适合于蛋白-药物、酶-抑制剂、核酸-药物等受体-配体体系，覆盖面比较广，而且能同时给出结合常数和计量结合比。

我们的毛细管电泳方法具有低成本、高效、节时等效果，并且可以灵活采毛细管区带技术定量考察药物(配体)和受体的相互作用，并可以比较其合理性，这种方法在生物工程中的药物筛选中无疑是一种很有吸引力的方法。

附图说明：

图1是11.1μM 14-mer DNA与不同浓度纺锤菌素相互作用的结果

     线a)0μM纺锤菌素，

     线b)3μM纺锤菌素，

     线c)19.8μM纺锤菌素，

      线d)23.8μM纺锤菌素，

      线e)39.9μM纺锤菌素；

图2是根据图1的曲线按Scatchard方程回归的结果。

具体实施方式：

以纺锤菌素和双链DNAR的反应体系为例：工艺上采用20mM三羟甲基氨基甲烷-乙酸(Tris-acetate)，10mM氯化钠(pH7.0-7.2)为运行缓冲液，使用紫外检测(260nm)，内径50μm的丙烯酰胺涂层毛细管柱(柱长31.2cm，有效长21cm)，在压力0.5psi下进样4秒，施加8kV的反向电压运行；受体为11.1μM 14-mer DNA，配体分别为0μM纺锤菌素，3μM纺锤菌素，19.8μM纺锤菌素，23.8μM纺锤菌素，39.9μM纺锤菌素；很方便地检测到DNA的信号(峰形及柱效都比较好)(见图1)，并经按方程γ/h＝-Kγ+nK回归，很好地反映出加入纺锤菌素后DNA信号的变化；γ/C_f＝0.125-0.107γ，即K＝0.107，nK＝0.125，n＝1.168。