促肝细胞生长素注射液及制备方法和应用

摘要

本发明涉及促肝细胞生长素注射液及制备方法和应用。本发明公开的促肝细胞生长素注射液，选用的促肝细胞生长素为从乳猪肝脏中提取分离获得的一种活性蛋白质，该蛋白质由15种氨基酸组成，氨基酸总量为135.21±10.23nmol/ml；主要活性组份蛋白质分子量为2.1万道尔顿，占总含量的60％以上，具有较高的刺激肝细胞DNA合成的活性，使肝细胞再生。该注射液可用于慢性肝炎、重症肝炎、病毒性肝炎、中毒性肝炎和肝硬化的治疗。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体涉及促肝细胞生长素注射液及制备方法和应用。

背景技术

早在七十年代初，人们发现：实验性切除大鼠肝脏的2/3或手术切除大部分损伤的人体肝脏后只需7-10天就可使肝脏恢复到原体积大小并自行停止；同时胚胎肝匀浆注入肝损伤鼠体内可明显促进肝细胞再生，因此认为在体内存在某种物质调节细胞的再生。1973早LaBrecque从大鼠再生肝脏中提取一种肝再生促进物质，将70％肝部分切徐后残余的成年大鼠肝细胞制备匀浆并高速离心，从上清液中提取的物质可明显刺激单层培养的正常大鼠肝细胞DNA合成增加，并命名为“肝刺激物质(Hepatic Stimulator Substance，HSS)。Goldberg从大鼠部分肝切除后的残余肝组织提纯的肝再生因子在体内可使肝细胞DNA合成增加3-4倍；Starzl在狗的再生肝中亦发现类似物质。Russell等和盐田邦郎等证明血小板内的肝再生因子也促进肝细胞DNA合成显著；同步和彦等在肝部分切除后48小时的大鼠小肠粘膜的可溶性成份中提取的肝再生因子与肝组织中的肝再生因子不同；谢明等从人胎肝细胞中提取的人胎肝再生因子具有较强的促进鼠肝细胞DNA合成的作用。广州空军医院陈光明等从乳猪肝中提取的“肝细胞生长素(HGF)”应用于临床治疗各种肝炎患者有较好的疗效。因此，到目前已发现一系列物质均能促进肝细胞DNA合成，调节肝细胞再生，其来源不同，有肝源性、血小板源性和肠源性；分子量等理化性质亦不相同，甚至同一来源不同方法的制备的物质也有差别，所以命名有不同，如“肝细胞再生因子”、“肝细胞生长素(HGF)”、“促肝生长素(Hepatopoietin，HPP)”、“肝刺激物质(HepaticStimulator Substance，HSS)”、“DNA合成促进因子(DNA SynthesisPromoter)”，关于这类物质分子量的报导相差较大，坪内博仁等从暴发性肝炎病人血液中经Sephadex G-200分离后测其分子量为230000；Goldberg等从大鼠血浆中分离后其分子量约为38000；LaBrecque从乳鼠肝脏提取的HSS分子量为1-2万；陈光明制备的乳猪HCF分子量为10685，无论其分子量大小，他们都有其生物活性，使肝细胞DNA合成增加。

肝脏再生因子的研究在国内外都报道很多，但应用于临床研究的很少，目前，国内广州空军医院研制的“肝细胞生长素HGF”已初步应用于临床治疗各种肝病患者，为低分子量多肽，有一定的治疗效果。

病毒性肝炎在我国是常见病、多发病、其死亡率高，目前无理想的治疗药物，严重影响人们的生命健康。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是采用优化的方法从乳猪肝中提取活性高、纯度理想的促肝细胞生长素，提供一种疗效确切的治疗肝病药物。

本发明公开了一种含促肝细胞生长素注射液，所述的肝细胞生长素为从乳猪肝脏中提取分离获得的一种活性蛋白质，该蛋白质由15种氨基酸组成，氨基酸总量为135.21±10.23nmol/ml；主要活性组份蛋白质分子量为2.1万道尔顿，占总蛋白含量的60％以上，具有较高的刺激肝细胞DNA合成的活性。

所述的组成蛋白质的15种氨基酸为：Asp、Glu、Ser、Thr、Gly、His、Tyr、Arg、Ala、Met、Val、Ile、Leu、Lys、Phe。

本发明所述促肝细胞生长素注射液为每毫升含蛋白质15-25μg、pH6.0-8.0的水针或冻干粉针。

本发明所要解决的另一技术问题是公开上述促肝细胞生长素注射液的制备方法。

本发明公开的促肝细胞生长素注射液是通过将乳猪肝匀浆、搅拌、加热、过滤、吸附、洗脱、除盐、除菌、分装获得的。该注射液

具体通过下述技术方案制得：

1.匀浆：

取经洗涤后的乳猪肝先在搅肉机上初步搅碎，再用胶体磨处理，得到乳猪肝的匀浆。

2.搅拌：

把匀浆置于提取罐内，按比例加入提取液，比例为1∶3W/V，同时以慢速搅拌一小时。

3.加热：

以水浴的方式给提取罐加热，至料液温度达到95℃时停止加热，并在此温度点上保持15-20分钟。

4.过滤：

加热完成后，先把料液冷却至室温，然后用过滤的方式进行固液分离，保留滤液。

5.提纯：

5.1.上样：

把经固液分离得到的滤液以10升/时的流速上样至已经装好、并经平衡的DEAE Sepharose FF柱中，上样量为柱体积的6倍。

5.2.洗脱：

上样完毕后，分别用A、B洗脱液进行分段洗脱，并收集B液洗脱峰。

5.3.除盐：

用超滤膜超滤器除盐；

6.半成品检定：

用Lowry法测定蛋白质含量，用注射用水调整其含量，使之为15-25μg/ml；

用pH计测定pH值，调节pH值为6.0-8.0；

控制氯离子浓度小于1.0mmol/L；

7.除菌

用0.2μ微孔滤器进行除菌过滤。

9.分装，即得水针剂或冷冻干燥得冻干粉针，4℃以下保存。

本发明制备中所述的提取液为pH值7.6，0.02M的磷酸盐缓冲液(PBS)；所述的A洗液是指含氯化钠0.28M的PBS溶液；所述的B洗液是指含氯化钠0.65M的PBS溶液。

本发明所要解决的再一技术问题是公开上述促肝细胞生长素注射液在制备治疗肝病药物中的应用。

本发明促肝细胞生长素注射液能促进肝细胞DNA合成，使肝细胞再生，可用于慢性肝炎、重症肝炎、病毒性肝炎、中毒性肝炎和肝硬化的治疗。

其治疗剂量为重症肝炎和肝硬化：静脉注射，每次4毫升(60μg)，每天两次，30天为一疗程。慢性肝炎：静脉注射，每次2毫升(30μg)，每天两次，30-60天为一疗程。

本发明促肝细胞生长素注射液对热敏感，4℃以下活性可保存一年，室温14天(25℃)活性降低，95℃，30分钟失去活性。

注射液在pH6.0-8.0范围内稳定，不失去活性；对胰蛋白酶敏感，对SDS不敏感。注射液的活性测定可采用体内、外³H-TdR掺入法检测，与对照组比较，均有明显生物活性；其放射性计数(cpm)为对照组的1.7倍以上。

用本发明促肝细胞生长素注射液进行有关毒理、药代、药效和临床试验：

一、毒理试验

1.促肝细胞生长素注射液的局部试验：

采用实验豚鼠，经肌肉注射，呼吸平稳、心跳频率在正常范围内无异常改变，无过敏反应，局部亦未发红、肿、热现象，无热源反应。

2.促肝细胞生长素注射液的急性及长期毒性试验：

急性毒性试验选用健康小白鼠，肌肉和静脉两种途径给药，分别作一次肌注和一次静注毒性试验，肌肉和静脉用药剂量达到最高允许剂量即750μg/kg体重时，均无动物死亡，动物行为正常，对外界反应灵敏，LD₅₀无法测算。长期毒性试验，分成为高、中、低剂量组进行动物试验，无动物死亡，亦未发现神经系统、心血管系统、呼吸系统等的异常改变。

3.促肝细胞生长素注射液的特殊毒性试验：

为了观察促肝细胞生长素是否致癌变、畸变，利用姊妹染色体交换(SCE)，染色体畸变和细胞转化等试验，分别从染色体和细胞水平检测促肝细胞生长素注射液是否致畸变和致癌变，设三个剂量组及对照组，同时设平行管，观察细胞染色体的变化，无论从SCE细胞数观察和间隔、二着丝粒、多着丝粒，大小环及染色体间交换，与对照组比较均无统计学差异(P＞0.05)。

致癌变试验，采用3T3细胞培养，在软琼脂上培养观察，促肝细胞生长素注射液三个剂量组均无细胞克隆形成，阳性对照组细胞克隆的形成为阳性，空白对照组阴性，说明促肝细胞生长素注射液不致癌变，亦不致突、畸变。

4.促肝细胞生长素注射液的生殖毒性试验：

选用性成熟健康小白鼠、体重20克左右，分给药与对照组，治疗组分高、低剂量组，分别在受精前、妊娠期以及泌乳期用药，实验结果表明，胎胚形态、外观、器官发育正常、无畸胎发现，自然分娩后新生动物情况良好，与对照组均无差异。

上述试验表明本发明注射液安全无毒。

二、促肝细胞生长素注射液的药代动力学试验：

将¹²⁵I标记的促肝细胞生长素注射液，注射兔静脉，注射后1、2、4、6、12、24、33、48、72小时分别静脉抽血测血中放射性高、中、低剂量组浓度，结果注射后4小时血中达最高浓度，33小时后基本消失，半衰期为10小时，以肝脏分布最高，主要通过肾脏排泄。

通过8例正常人药代动力学观察，药物剂量120μg/8ml/次，用药前、用药后5’、10’、30’、45’、1°、2°、3°、4°、6°、8°、12°、24°共13次标本分离血清后低温保存，用生物活性检测方法检测，实验结果对受试者实验前后肝功能、心电图、肾功能均无改变。血中开始出现最高活性为0.84小时，半衰期为6.96小时。

三、药效试验

A.促进肝细胞DNA合成作用

(一)材料和方法

动物：健康纯系SD大白鼠，体重200-250g。

HepG2细胞。

试剂：³H-TdR(0.5mci/ml)，1640培养基及细胞培养其它常用试剂。促肝细胞生长素注射液，蛋白浓度15μg/ml。

(二)方法：

1.体内法

选健康SD大白鼠，体重200g左右。设五个剂量组，分别给药2.5μg/kg体重/天、1.25μg/kg体重/天、0.63μg/kg体重/天、0.32μg/kg体重/天、0.16μg/kg体重/天。并设一个对照组，用生理盐水代替促肝细胞生长素注射液。各剂量组及对照组分配大白鼠5只。首先将大白鼠用乙醚麻醉，外科手术方法切除其肝脏的三分之一，给予正常饮食饮水，六小时后按上述方案腹腔给药一次，再过十八小时后腹注射³H-TdR50μCi，三小时后处死取肝组织1克，加0.1mol/L NaCl-柠檬酸钠充分匀浆后，3000转/分离心20分钟，去上清，沉淀加1mol/LNaCl匀浆，于4℃静置过夜后，3000转/分离心10分钟，取上清，加无水乙醇至出观沉淀，低速离心10分钟，收集沉淀加2ml1mol/LNaCl，迅速搅拌加速溶解，加等体积氯仿—异戊醇(24∶1)剧烈振荡15分钟，3000转/分离心10分钟，取上层加2倍无水乙醇，离心取沉淀，加2ml蒸馏水溶解，取1ml滴在玻璃纤维膜上，烤干后加闪烁液放射性计数，另1ml稀释后在260nm波长处测吸收度。按0.200相当于0.01mg/ml DNA换算成DNA的浓度，计算各组1分钟放射性计数值cpm/mgDNA。

2.体外法：

将体外培养的HepG2培养液中加入三种不同剂量的促肝细胞生长素注射液，使促肝细胞生长素终浓度分别为16.6μg/ml、3.3μg/ml和0.66μg/ml。另设空白对照组，用生理盐水代替促肝细胞生长素。各剂量组和空白对照组又各设四个平行孔。37℃、5％的二氧化碳培养箱中培养24小时后每孔加入^3H-TdR5μCi，继续培养6小时，吸去培养液，用胰酶——EDTA使细胞脱壁，离心收集细胞，将细胞吸至玻璃纤维膜上，在膜上用蒸馏水破细胞，然后用5％三氯醋酸变性蛋白、95％乙醇固定，膜片在37℃烤箱中烤干后放入液闪杯中，加闪烁液(POP-POPOP)5ml，用液体闪烁仪测一分钟的放封性计数值(cpm值)。

(三)结果：

1.体内法测定结果

表1  体内法测定肝细胞生长素注射液活性结果给药途径    剂量(μg/kg体重)     X±SD(cpm/mgDNA)      倍数  静注           2.50                8508±821         2.57

             1.25                8342±799         2.53

             0.63                6427±650         1.95

             0.32                5758±542         1.74

             0.16                3001±290         0.91

        生理盐水对照组           3302±185

注：X±SD(×10⁴)表示各剂量组平行管cpm/mgDNA计数的平均值±标准差。

静注ED₅₀为0.60μg/kg体重/天。

静注的有效剂量范围为0.32μg/kg体重/天以上。

2.体外细胞培养法测定结果。

表2体外法测定(放射性计数)结果

分组      剂量(μ g/ml)     X±SD(cpm/2.5×10⁵)   倍数 空白对照组  不加细胞，不加           40(本底)

         促肝细胞生长素

             16.6                10.520±311      2.14   给药组        3.3                 9.678±280       1.98

             0.66                8.142±184       1.67   对照组        生理盐水            4.923±111

注：X±SD表示各组平行孔cpm计数的均值±标准差。

(四)结论

经体内法活性测定得知，促肝细胞生长素注封液有明显促进肝细胞DNA合成的作用，³H-TdR的掺入明显优于对照组。通过对不同剂量促肝细胞生长素注射液活性的研究表明，静注的有效剂量为0.32μg/kg体重以上；静注的半有效剂量为0.60μg/kg体重；静注的药效随剂量增加而升高，但达1.25μg/kg体重/天时达到一种类似“稳定”的状态。体外细胞培养中活细胞计数和放射性计数与对照组相比也显著差异。放射性计数cpm值代表了肝细胞中³H-TdR的掺入量，因而也反映了细胞DNA的合成速度。由此可见促肝细胞生长素不论在体内或体外均有明显促进肝细胞DNA合成的作用。认为促肝细胞生长素是一种活性高、药效强的刺激肝细胞DNA合成的药物。

B.D-半乳糖胺或四氯化碳所致肝损害动物试验

实验用纯系健康大小白鼠各50只，大鼠体重在132-214克，小鼠体重50-100克，随机分组：(1)肝损伤组10只；(2)治疗组30只(促肝细胞生长素组：2.5μg/kg、1.25μg/kg、0.63μg/kg；各10只)；(3)生理盐水组10只。肝损伤组用D-半乳糖胺按500毫克/公斤体重腹腔注射或四氯化碳按0.5ml/100克体重造成肝损害，每天腹腔或静脉注射1ml生理盐水，72小时后处死取肝组织进行病理检查。治疗组动物如前造成肝损害，促肝细胞生长素组每天用促肝细胞生长素注射液分别按2.5μg/kg、1.25μg/kg、0.63μg/kg体重腹腔和静脉注射共三天(每天一次)，治疗组动物均在72小时处死取肝脏进行病理检查。生理盐水组的大白鼠不用D-半乳糖胺造成肝损害，小白鼠不用四氯化碳造成肝损害，仅每天用无菌生理盐水5毫升腹腔和静脉注射一次，共三次，72小时处死取肝送病理检查(表3)。

说明：表中+、++、+++分别表示肝组织学观察中，光镜下以中央静脉和门静脉为视野中心，肝细胞坏死、变性、浸润和浊肿程度为轻、中、重；0表示无病毒改变。括号中数字表示产生各病理改变程度的动物数。

表3不同剂量的促肝细胞生长素注射液对不同动物、不同途径、不同药物所致肝损害的疗效观察

                        大白鼠D-半乳糖胺肝组织学观察

   分类     动物数                                           途径

                      坏死    变性    细胞浸润    浊肿

生理盐水      10        0      0        +(1)      +(1)       腹腔

肝损伤组      10      +++(5) +++(2)    +++(2)    ++(4)       腹腔

促肝细胞生长素治疗组

2.5μg/kg     10        0      0         0        +(1)       腹腔

1.25μg/kg    10        0      0         0        +(1)       腹腔

0.63μg/kg    10        0    +(1)       +(1)      +(2)       腹腔

                        小白鼠四氯化碳组织学观察

   分类     动物数                                           途径

                      坏死    变性    细胞浸润    浊肿

生理盐水      10        0      0        +(1)      +(1)       静脉

肝损伤组      10     +++(4)  +++(2)    ++(3)     ++(5)       静脉

促肝细胞生长素治疗组

2.5μg/kg     10        0      0        +(1)      +(1)       静脉

1.25μg/kg    10        0      0         0        +(1)       静脉

0.63μg/kg    10        0     +(1)       0        +(1)       静脉

小结：

促肝细胞生长素注射液治疗组有明显的改善肝细胞坏死、变性、炎症侵润、浊肿作用，病变恢复接近正常。生理盐水注射组，与病理组的病变有显著差异，证示了促肝细胞生长素有再生肝细胞的能力，从理论上证明了促肝细胞生长素有促使DNA的合成和支持代谢、免疫调节的作用。

四、临床试验

(一)用药方法、剂量及疗程

分重型肝炎组和重度慢性肝炎组，二组均在常规的基础综合治疗基础上，加用促肝细胞生长素注射液。

使用时剂量为；120μg加入10％葡萄糖100-250ml中静脉滴注，每日一次，疗程4周，有效者可延长至6-8周。

常规的基础综合治疗包括：静滴葡萄糖注射液、茵栀黄注射液、维生素、脂肪乳、支链氨基酸、适量的新鲜血、新鲜血浆、白蛋白及止血药等，但在治疗期间，重型肝炎组不能用皮质激素、日达仙，前列腺素、胎肝注射液、胎肝及其他乳肝制剂等治疗药物；重度慢性肝炎组不能使用皮质激素、抗病毒药物、日达仙等治疗药物。

(二)观察内容

1.症状及体征(包括乏力、食欲、恶心、呕吐、腹胀、神志、尿量、出血情况、腹水量、黄疸、肝浊音界)，于治疗前、治疗后每2周和治疗结束时各观察记录一次。

2.血常规、尿常规、血尿素氮及肌酐，血氨、甲胎蛋白(AFP)、电解质、腹水常规及细菌培养，于治疗前、治疗后每2周和治疗结束时各观察记录一次。

3.肝功能：血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、凝血酶原活动度(PTA)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、于治疗前、治疗2周时和治疗结束时各观察记录一次。

4.血清病毒标志物：测定抗-HAVIgM、HBsAg、HbeAg，抗-HBs、抗-HBe、抗-HBc，HBsAg或/和HBeAg阳性者测HBVDNA，抗-HCV阳性者测定HCVRNA，HBsAg阳性者测抗-HDV、HDVAg，另外，还测定抗-HEV，以上指标于治疗前记录一次。

5.记录药物在应用过程中的不良事件。

(三)疗效判定标准

疗效分为显效、有效、无效三个标准。

重型肝炎和重度慢性肝炎疗效判定标准：

1.显效：临床症状恢复，血清胆红素、ALT复常。

2.有效；血清胆红素，ALT降至治疗前水平50％以下。

3.无效：疗程结束后临床及肝功能未达到上述标准或死亡。

将显效例数和有效例数合并统计为总有效例数。

(四)统计学方法

1.病人症状、体征的变化用X²检验进行统计分析。

2.病人的生化指标，如ALT、AST、TBIL、ALB、PTA及AFP的变化用改变率来表示：

因改变率呈偏态分布，因此用中位数表示之，+代表上升，一代表下降。用秩和检验进行统计分析。

(五)结果

A.促肝细胞生长素(威佳)注射液对重度慢性肝炎的治疗效果

1.病死率及死亡原因：应用促肝细胞生长素后，333例重度慢性肝炎病人中，死亡2例。其中1例死于消化道出血，另一例死于肝肾综合征。存活331例。用药观察期间病死率为0.6％。

2.肝细胞生长素(威佳)注射液对重度慢性肝炎病人症状、体征的疗效：    表4

               二周                四周                  六周

               好转                好转              例  好转              X²        P

         例数         (％)  例数            (％)                 (％)

               例数                例数              数  例数

乏力     322   235    73.0   302   266      88.1     87   77     88.5     27.73   ＜0.001

纳差     316   245    77.5   294   271      92.2     86   81     94.2     33.47   ＜0.001

恶心     263   224    85.2   246   235      95.5     70   67     95.7     19.25   ＜0.001

呕吐     167   140    83.8   157   153      97.5     50   50     100      25.04   ＜0.001

腹胀     247   176    71.3   233   211      90.6     74   66     89.2     33.85   ＜0.001

上腹不   192   112    58.3   183   150      82.0     59   51     86.4     36.11   ＜0.001

适

黄疸     311   170    54.7   292   234      80.1     85   74     87.1     60.42   ＜0.001

出血     46    29     63.1   42    35       83.3     18   17     94.4     8.93      0.01

用药后2周，病人的乏力、纳差、恶心、呕吐、腹胀、上腹不适、黄疸及出血的好转率分别为73.0％、77.5％、85.2％、83.8％、71.3％、58.3％、54.7％和63.1％；用药至4周时好转率分别为88.1％、92.2％、95.5％、97.5％、90.6％、82.0％、80.1％和83.3％；用药6周时分别为88.5％、94.2％、95.7％、100％、89.2％、86.4％、87.1％和94.4％。这些变化经统计学处理，差异非常显著，有统计学意义，P＜0.01。

3.促肝细胞生长素(威佳)注射液对重度慢性肝炎病人生化指标的疗效：

           表5

                 治后二周                 治后四周              治后六周  Z       P               M     Max    Min              Max             M     Max    Min        N                          N    M          Min  N              (％)   (％)   (％)            (％)            (％)   (％)   (％) ALT   324    -51    543    -99   304  -76  394   -99   87   -82    208   -100 AST   307    -33    145    -478  291  -51  280   -485  82   -56    28    -383 TBIL  324    -13    435    -407  304  -24  832   -903  87   -33    203   -800 ALB   298     3     81     -34   284   8   85    -29   81    7     105   -24 PTA   293     11    163    -57   284   22  184   -100  80    36    161   -47 AFP   216     0     999    -98   227   0   3189  -99   61   -28    595   -98 95.3   ＜0.001 34.2   ＜0.001 39.4   ＜0.001 27.2   ＜0.001 51.2   ＜0.001 12.8     0.001

N：病例数，M：改变率的中位数，Min：改变率最小值，Max，改变率最大值。重度慢性肝炎病人用促肝细胞生长素后ALT、AST、TBIL变化明显下降，PTA、ALB的变化逐渐上升，AFP也有上升，但上升幅度逐渐减少。这些变化，经统计学处理，有非常显著的差异，P＜0.01。

4.促肝细胞生长素(威佳)注射液对重度慢性肝炎的总临床效果：    表6

        疗效            病例数          ％

        显效             124           38.3

        有效             164           50.6

        无效             36            11.1

       总有效            288           88.9

用促肝细胞生长素(威佳)注射液治疗重度慢性肝炎总有效率为88.9％。

B.促肝细胞生长素对重型肝炎的治疗效果

1.促肝细胞生长素(威佳)注射液对重型肝炎病人症状、体征的影响：

表7

                   二周              四周               六周

                   好转              好转         例    好转          X²        P

           例数          (％)  例数        (％)               (％)

                   例数              例数         数    例数

乏力       346     197  56.9   291   243   83.5   113   98    86.7   71.86  ＜0.001

纳差       333     214  64.3   278   240   86.3   113   106   93.8   64.68  ＜0.001

恶心       302     215  71.2   257   230   89.5   104   99    95.2   47.75  ＜0.001

呕吐       212     162  76.4   181   168   92.8   76    70    92.1   24.91  ＜0.001

腹胀       315     183  58.1   264   225   85.2   104   92    88.5   80.07  ＜0.001

上腹不     231     125  51.4   197   156   79.2   84    72    85.7   46.89  ＜0.001

适

黄疸       345     141  40.9   287   200   69.7   110   85    77.3   74.20  ＜0.001

出血       77      39   50.7   64    46    71.9   23    20    87.0   17.11    0.002

用药后2周，病人的乏力、纳差、恶心、呕吐、腹胀、上腹不适、黄疸及出血的好转率分别为56.9％、64.3％、71.2％、76.4％、58.1％、51.4％、40.9％和50.7％；用药至4周时好转率分别为83.5％、86.3％、89.5％、92.8％、85.2％、79.2％、69.7％和71.9％：用药6周时分别为86.7％、93.8％、95.2％、92.1％、88.5％、85.7％、77.3％和87.0％，这些变化经统计学处理，差异非常显著，有统计学意义，P＜0.01。

2.使用促肝细胞生长素(威佳)注射液对重型肝炎病人生化指标的影响：    表8

                治后二周                  治后四周                   治后六周  Z       P             M     Max     Min               Max                   M      Max     Min       N                           N     M            Min    N            (％)   (％)    (％)              (％)                 (％)   (％)    (％) ALT  346  -38.7   569    -99.3   288  -68.3  331   -99.3   112  -78.6    369   -98.2 AST  324  -29.0   449    -824    272  -51.5  585   -1110   100  -61.8    464   -1124 TBIL 346  -16.1   191    -203    287  -42.2  1185  -1350   111  -49.4    863   -1147 ALB  312   2.6    56.2   -35.5   270   6.2   87.1  -40     107   7.1     88.9  -33.3 PTA  327   16.7   750    -80.0   281   45.9  275   -56.3   104   60.8    400   -81.4 AFP  231   0      12273  -97.9   213   0     690   -93.7   73   -5.0     989   -89.8 76.94   ＜0.01 48.92   ＜0.01 51.76   ＜0.01 18.49   ＜0.01 85.36   ＜0.01 4.61      0.10

重型肝炎病人应用促肝细胞生长素后ALT、AST、TBIL、ALB及PTA均有明显的改变，随着治疗时间的延长，ALT、AST、TBIL逐渐下降，ALB与PTA上升，改变率经统计学处理，有非常显著的差异，P＜0.01。

3.促肝细胞生长素(威佳)注射液对重型肝炎的临床效果：

①促肝细胞生长素对重型肝炎的总临床效果：表9

        疗效        病例数          ％

        显效         118           34.0

        有效         154           44.4

        无效         75            21.6

       总有效        272           78.4

用促肝细胞生长素(威佳)注射液治疗重型肝炎总有效率为78.4％。

②促肝细胞生长素对重型肝炎(亚急性、慢性)不同分期病人的临床观察效果：  表10

                  显效      有效       无效     总有效

      病例数

                N    ％    N    ％    N    ％    N    ％

早期   129      49  38.0  67   51.9   13  10.1  116  89.9

中期   145      56  38.6  67   46.2   22  15.2  123  84.8^*

晚期   51       1    2.0  13   25.5   37  72.6  14   27.5^*

用促肝细胞生长素治疗亚急性、慢性重型肝炎早期、中期和晚期的总有效率分别为89.9％、84.8％和27.5％。

^*重型肝炎早期与中期的总有效率比较差异无统计学意义，X²＝1.59，P＝0.21；重型肝炎晚期的总有效率与早期和中期比较差异显著，有高度统计学意义，X²＝89.08，P＜0.001。

结论：

在基础综合治疗上加用促肝细胞生长素对重度慢性肝炎的总有效率为88.9％，对重型肝炎的总有效率为78.4％。表现为病人病死率较低，症状、体征及生化指标的改善较明显。这与促肝细胞生长素注射液能够促进肝细胞的再生、降低肿瘤坏死因子(TNF)水平，及对肝细胞膜有一定的修复作用有关。

上述试验结果显示，本发明促肝细胞生长素注射液有显著的再生肝细胞的能力，促使DNA的合成和支持代谢、免疫调节的作用，是理想的治疗肝病药物。

具体实施方式

实施例1    促肝细胞生长素注射液的制备

原料：健康乳猪，猪龄15-20天，体重7-7.5kg/只，于上午6-8时放血处死取肝脏，清洗血液后-20℃保存。

1.匀浆：

取经洗涤后的乳猪肝先在搅肉机上初步搅碎，再用胶体磨处理，得到乳猪肝的匀浆。

2.搅拌：

捣碎后的匀浆置于提取罐内，按1∶3W/V的比例加入提取液，于室温下低速(60转/分)搅拌一小时，以充分提取所需成分。

3.加热：

以水浴的方式给提取罐加热，至料液温度达到95℃时停止加热，并在此温度点上保持15-20分钟。

4.过滤和冷却：

加热完成后，先把料液冷却至室温，然后用过滤的方式进行固液分离，保留滤液。

5.提纯：

5.1.DEAE-Sepharose FF的装柱和处理：

把新购入的DEAE-Sepharose FF中的酒精倒掉，加入3倍以上体积的PBS，摇匀，以“自然沉降法”装柱，装好后柱内无气泡，无分层观象。然后用2M的氯化钠溶液洗1个柱体积，用蒸馏水洗3个柱体积，再用PBS平衡至流出液的pH值与PBS相同。

5.2、上样：

把经固液分离得到的滤液以10升/时的流速给已经装好、并经平衡的DEAE Sepharose FF柱上样，上样量为柱体积的6倍。

5.3.A液洗脱：

上样完毕后，先用A液洗脱，流速15000ml/小时，用紫外分光光度计检测洗脱液在280nm的吸收度，小于0.5后停用A液洗脱。

5.4.B液洗脱：

当A液洗脱液的A280nm小于0.5时，换为B液洗脱，流速8000ml/小时，同样用A280nm监测，当A280nm开始上升时，收集此部分洗脱液，至A280nm小于0.5时停止收集。

5.5.除盐：

采用进口超滤膜超滤器除盐，经除盐后即为半成品促肝细胞生长素。

6.半成品检定：

6.1.蛋白质含量：用Lowry法测定蛋白质含量，用注射用水调整其含量，使之为15-25μg/ml。

6.2.PH值调整：

用pH计测定pH值，调节pH值为7.0-7.8(6.0-8.0)。

6.3.氯离子检查：

用“硝酸银滴定法”测定，要求氯离子浓度小于1.0mmol/L。

6.4、内毒素检测：

以鲎试剂检测半成品的内毒素，使蛋白含量在15-25μg/ml时，其内毒素值应小于5.25EU/ml。

7.除菌

用0.2μ微孔滤器进行除菌过滤。

8.分装：

安瓿，2ml/支，蛋白质含量为15μg/ml，保存于4℃以下。

实施例2  促肝细胞生长素蛋白质含量测定

对照品溶液的制备  取已在五氧化二磷干燥器中减压干燥至恒重的牛血清白蛋白对照品约15mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml分别置具塞试管中，均加水使成4.0ml，分别精密加入福林酚试液甲6ml，摇匀，放置10分钟，再分别精密加入福林酚试液乙1ml，立即摇匀，至35℃水浴中保温35分钟，放冷至室温，以第一份为空白，照分光光度法(中国药典1990年版二部附录24页)，在660nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵座标，浓度为横座标，绘制标准曲线。

测定法：精密量取本品4ml，照标准曲线制备项下的方法，自“分别精密加入福林酚试液甲6ml”起，依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中蛋白质的含量(μg)，计算，即得。

取8个批号的促肝细胞生长素注射液，每批取5支样品，依上述方法测得其蛋白质含量。结果见表11。促肝细胞生长素注射液的蛋白质含量为15.0-25.0μg/ml。

表11  不同批号促肝细胞生长素注射液的蛋白质含量(μg/ml)

实施例3  促肝细胞生长素注射液的氨基酸组成分析：

取10个不同批号的促肝细胞生长素注射液，每批号取10个样品，经盐酸处理，110℃加热，离心取上清液，用邻苯二甲醛柱前衍生高效液相色谱测定其氨基酸组成，与氨基酸标准品的高效液相色谱图谱比较。

取促肝细胞生长素注射液2.5ml加12N盐酸2.5ml，110℃水解后，取上清液1ml抽干，加入双蒸水溶解，加邻苯二甲醛、巯基乙醇等上HPLC所得图谱与标准比较，计算每个峰的面积。其氨基酸组成共有15种(见表12)，氨基酸总量为135.21±10.23nmol/L。

表12  促肝细胞生长素注射液的氨基酸组成及浓度测定

氨基酸    浓度(nmol/ml±SD)    氨基酸   浓度(nmol/ml±SD)

  Asp        12.71±3.23         Ala       13.63±4.27

 Glu       19.40±5.65     Met            0.31±0.12

 Ser       14.33±4.37     Val            8.57±2.48

 Thr        7.36±2.31     ILe            5.88±2.18

 Gly       22.18±8.02     Leu           11.05±4.20

 His        2.75±0.61     Lys             6.3±1.63

 Tyr        1.83±0.62     Phe            3.54±1.04

 Arg        5.36±1.20     Total        135.21±10.23

实施例4  促肝细胞生长素注射液的聚丙烯酰胺疑胶电泳和分子量测定：

将促肝细胞生长素注射液经10％聚丙烯酰胺凝胶电泳(显)示产品中有三个蛋白质组份，经细胞培养TdR³H掺入法用β-液体闪烁仪检测得知其中跑在最前面的一条主要区带A为有活性的区带，其余两条带为无活性的次要区带。经紫外扫描检测和高效液相色谱图面积计算主带占总蛋白时的60％以上(Folin-酚法测定蛋白质含量)。

分子量测定：取本品1支，冻干后，加蒸馏水20μl使溶解，加水解液(取十二烷基硫酸钠0.1g，硫基乙醇100μl，甘油1g，溴酚蓝指示液适量)，置沸水浴中水解3分钟，备用。标准蛋白(SIGM公司，分子量14400-94000)，水解方法同供试品。凝胶浓度为10％。照SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定(部颁标准生化药品第一册1989附录61页)，以相对适移率(R’m)为横座标，已知分子量标准蛋白的对数为纵座标，在半对数坐标纸上绘图，从标准曲线中查出供试品的分子量。促肝细胞生长素注射液的有效成份为A带，分子量约2.1万道尔顿。

实施例5  促肝细胞生长素注射液的活性测定

促肝细胞生长素促使肝细胞DNA合成，利用此原理建立体内、体外的测活方法。(HepG₂细胞培养³H-TdR掺入法)

材料和方法：

1.促肝细胞生长素注射液(自制蛋白含量15μg/ml)。

2.试剂：柠檬酸钠、氯仿、异戊醇、无水乙醇、PPO-POPOP闪烁液、1640培养基、氯化钠等。

3.仪器：754紫外分光光度计、液体闪烁仪、二氧化碳培养箱。

4.促肝细胞生长素活性测定方法一体内³H-TdR掺入法。

(1)动物实验：SD大白鼠体重180-230g，于上午8:00-10:00用乙醚麻醉，手术切除1/3(切左后叶)，术后六小时于腹腔内注射促肝细胞生长素注射液，术后23小时于腹腔注入50uCi³H-TdR(中国原子能科学研究所)，术后25小时处死鼠取肝脏。对照组大白鼠用等体积生理盐水代替促肝细胞生长素注射液腹腔注射，其余同实验组。

(2)肝细胞DNA提取及测定：

肝组织1克，加0.1mol/L NaCL-0.05mol/L柠檬酸纳4ml制成匀浆，3000rpm/分离心20’，沉淀再用0.1mol/L NaCl-0.05mol/L柠檬酸钠洗涤二次，沉淀加5ml 5M NaCl研磨，粘度逐渐增加，4℃放置24-48小时，取上清液加95％乙醇至出现凝胶状态停止，取胶状物加5ml1mol/L NaCl溶解，加等量氯仿-异戌醇(24∶1)，振荡15分钟，3000rpm/分离心10分钟分三层，取上清液加2倍体积95％乙醇出现纤维状物，取此物用75％乙醇洗二次，加2ml蒸馏水溶解，其中1ml滴于49型玻璃纤维膜，干燥后用FJ-2107液体闪烁测放射性计数(cpm值)，最后计算cpm值/mgDNA。

5、体外法测定促肝细胞生长素注射液生物活性：

由于体内法测活性比较繁琐复杂，而且动物个体之间差异较大，存在一定的实验误差。参照LaBreque和Romero等推荐的体外细胞培养测活性方法，本发明建立了体外测定促肝细胞生长素生物活性的方法，多次实验证实此方法简便、准确、重复性好。故此我们将此方法作为促肝细胞生长素注射液产品的常规活性检查方法。现将方法报导如下。

HepG₂细胞，调至细胞浓度为2.5×10⁵/ml/孔，用1640培养基培养贴壁后每孔加一定剂量的促肝细胞生长素注射液，5％CO₂连续培养24小时后，加5uCi^3H-TdR/每孔，6小时用胰酶-EDTA消化细胞并全部收集于49型玻璃纤维膜上，用蒸馏水破细胞后三氯醋酸、乙醇处理，将膜烘干，放于闪烁液中，计数60秒的放射性计数(cpm)值，即为cpm值/2.5×10⁵细胞/孔。为对照组的1.7倍以上者为合格产品。

结果：

  1.体内法测定结果(表13)

  表13体内法测定促肝细胞生长素注射液活性结果

分组                  X±SD(cpm mgDNA)      倍数(与对照组比)

给药组(促肝细胞生长素)    9315±2120             1.725

生理盐水对照组            5400±1402

  2.体外法测定结果(表14)

  表14体外法测定促肝细胞生长素注射液活性结果

分组                     X±SD(cpm/2.5×10⁵细胞)    倍数

空白对照组(不加细胞)           36±10(本底)

生理盐水对照组                  6010±128

给药组(促肝细胞生长素0.2ml)    1.2488±249          2.08