鼠肿瘤生成及转移促进受体及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了鼠肿瘤生成及转移促进受体分子及其编码基因与应用，本发明所提供的鼠肿瘤生成及转移促进受体分子名称为TMIR－M，它是序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列或将SEQ ID№：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。鼠肿瘤生成及转移促进受体分子TMIR－M的编码基因，是下列核苷酸序列之一；1)序列表中的SEQ ID №：1；2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。TMIR－M具有癌基因功能。

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤生成及转移促进受体分子及其编码基因与应用，特别是来源于鼠的肿瘤生成及转移促进受体分子及其编码基因与应用。

背景技术

蛋白酪氨酸激酶受体(PTKR)在各种细胞调控水平及肌体不同发育阶段中起着重要作用，比如参与细胞的增殖、分化及抗凋亡等过程。典型的PTKR结构表现为细胞脂质双分子层上的单跨膜蛋白，分为胞外区、跨膜区及胞内区。胞外区具有相应配体的特异性识别位点，在结合配体过程中起重要作用。胞内区含有酪氨酸激酶功能域，参与胞内的信号转导及受体、衔接蛋白的磷酸化过程，特别是有丝分裂原的信号转导。PTKR在细胞内的异常表达常会导致遗传疾病及肿瘤。因此，PTKR蛋白的表达在肌体内受到严格调控。目前为止，至少有18种PTKR与肿瘤转化有关，可作为癌基因。重要的实例包括：成纤维生长因子受体(FGFR)、表皮生长因子受体(EGFR)、血小板来源的生长因子受体(PDGFR)、胰岛素受体(InsR)和肝细胞生长因子受体(Met)等。

研究显示部分PTKR异常剪接变异体与肿瘤的发生相关。比如从人骨肉瘤及乳腺癌细胞可分离到缺少全部跨膜区的可溶性FGFR3分子。而在胃癌细胞中，一种符合蛋白编码的49氨基酸的缺失可导致Ron酪氨酸受体的组成性激活。最近从脑垂体肿瘤中人们分离到一种新型FGFR4剪接变异体，被称做ptd-FGFR4。这种剪接变异体缺少几乎全部的FGFR4受体胞外区，并且不包含信号肽，导致该成熟蛋白仅在胞浆表达。过量表达ptd-FGFR4可导致细胞转化。通过转基因方式在小鼠体内进行组织特异性表达可形成垂体瘤。另外，利用N端和C端特异性抗体，人们发现部分恶性肌骨骼瘤临床病人样品中也有N端缺失的Met受体表达。

发明内容

本发明的目的是提供一种鼠肿瘤生成及转移促进受体分子及其编码基因。

本发明所提供的鼠肿瘤生成及转移促进受体分子名称为TMIR-M，它是序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列或将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。

序列表中SEQ ID №：2的蛋白质由429个氨基酸残基组成，是一个N端缺失异常剪接变异体，几乎所有胞外区全部缺失。

鼠肿瘤生成及转移促进受体分子TMIR-M的编码基因，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；    

3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

序列表中的SEQ ID №：1由1290个碱基组成。具有癌基因功能。

鼠源TMIR-M蛋白的氮端有保守的跨膜信号及一个150氨基酸的典型胞内酪氨酸激酶功能域。在氨基酸水平，这个蛋白与FGFR家族有29-32％一致性，与PDGFR家族有23％一致性，如图1所示。进化树分析发现，TMIR-M与FGFR及PDGFR家族蛋白在进化的早期阶段分离，说明TMIR-M有可能是一类新型蛋白酪氨酸激酶受体。

本发明的TMIR-M可以转化NIH3T3及BaF3细胞，在裸鼠中成瘤，并有恶性转化特点，可引发肿瘤侵入以及多脏器转移，提示TMIR可作为一个新的癌基因在癌症发生中发挥作用。因此，TMIR-M转化的NIH3T3和BaF3细胞，以及成瘤的裸鼠动物模型可作为筛选其他MAPK及PI3K通路抑制剂和抗肿瘤药物的技术平台，是潜在的抗肿瘤药物筛选体系，还可作为与肿瘤发生相关的信号通路的研究工具，TMIR-M的SiRNA的质粒表达系统及反转录表达系统可作为研究TMIR-M与临床肿瘤关系的工具，利用现代生物工程技术手段，特异性阻断靶基因的表达，进而达到预防和治疗癌症的目的。

附图说明

图1为本发明TMIR-M与FGFR和PDGFR家族成员的进化树比较。

图2为Northern杂交分析TMIR-M在鼠各脏器表达结果。

图3为小鼠全胚杂交结果。    

图4为RT-PCR检测不同鼠胚胎发育阶段TMIR-M表达结果。

具体实施方式

实施例1、TMIR-M cDNA的克隆及表达质粒、稳定细胞系的构建.    

用于扩增鼠TMIR-M的引物为5′-ATGGGAGAGAAGGGTCACCT-3′和5′-ACAAAGGACACTGAAG CTAT-3′。扩增鼠TMIR-M的模板为小鼠直肠总RNA。反应条件按照一步法RT-PCR的使用说明进行(Takara或Clontech)，PCR产物先亚克隆到T载体，酶切鉴定有插入片段后再进行测序。

将测序过的RT-PCR产物经HindIII和XhoI双酶切后亚克隆到pcDNA3上，构成pcDNA3(TMIR-M)表达质粒。用引物5′-TATAGCGATATCATGGACAAACTCAGGGTGCC-3′和5′-TATAGCGCGGCCGCGAGAGGGTCCAGGTCGCTA-3′扩增鼠红细胞生成素受体(EPOR)胞外区，并将该片段亚克隆到pcDNA3的EcoR V和Not I位点，构成质粒pcDNA3(EPOR)。以引物5′-TATAGCGGCCGCAGTGATTATCGTCCCAACTTT-3′和5′-TATACCAGTGTGCTGGTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCAAGCATGCTATAGTTGTAGA-3′扩增鼠TMIR-M跨膜区及胞内区，并将其亚克隆到pcDNA3(EPOR)的Not I和BstXI，构成完整的融合基因表达载体pcDNA3(EPOR/TMIR-M)，该融合基因C末端携带FLAG标签，可被鼠M2抗体识别。

为使BaF3细胞(小鼠前B细胞)稳定表达TMIR-M或EPOR/TMIR融合基因，将质粒pcDNA3(TMIR-M)及pcDNA3(EPOR/TMIR-M)分别转染到BaF3，在药物如G418的筛选下获得稳定外源基因的表达。离心收取1×10⁶BaF3细胞，重悬于0.5ml无血清RPMI-1640培养液。将3μg pcDNA3(TMIR-M)或pcDNA3(EPOR/TMIR-M)与BaF3细胞混合，冰浴10分钟后，用ECM399(BTX公司)电转仪进行电转。电转条件为200-230V，电流为25-35毫秒。电转后的细胞在RPMI-1640全培养基中生长。由于质粒pcDNA3携带新酶素抗性基因，稳定细胞可在500μg/ml G418下进行筛选。每三天换一次液，连续培养三周后，在100mm培养皿中进行扩增。

实施例2、TMIR-M基因表达及组织特异性分析

以TMIR-M为模板合成随机引物探针，Northern杂交分析显示TMIR-M相关基因在各脏器组织中有限制性表达。检测小鼠各脏器总RNA，TMIR-M主要在直肠及小肠中表达，结果如图2所示，图中S，Si，C，H，B，Li，Sm，K，分别代表脾，小肠，直肠，心脏，脑，肝，骨骼肌及肾。

为了确定TMIR-M基因的表达及组织特异性，进行了小鼠原位全胚杂交分析，具体步骤是：在1×PBS缓冲液中拨离出小鼠胚胎，浸润到4％多聚甲醛中4℃过夜固定。18小时后，胚胎用6％H₂O₂漂洗，用15μg/ml蛋白酶K室温消化30分钟。然后再用4％多聚甲醛配制的0.2％戊二醛固定20分钟。利用T7启动子进行正义RNA探针的合成，用地高锌-UTP作为标记底物。预处理过的小鼠胚胎在含有50％甲酰胺，5×SSC，1％SDS，50μg/ml酵母总RNA，50μg/ml肝素及1μg/ml标记好的RNA探针的杂交液中杂交。杂交条件为70℃过夜。用洗脱液反复清洗后，将胚胎浸润在用TBST配制的含有2mM左旋咪唑的抗地高锌抗体液中，4℃震荡杂交过夜。其中地高锌抗体连有碱性磷酸酶可与NBT底物进行显色反应。结果如图3所示，表明TMIR-M在胚胎E11.5-12.5表达量最高，并且与颌面部形成及肢芽发育相关。

RT-PCR检测(如图4所示)显示TMIR-M在胚胎E11.5-12.5表达量最高。

                           序列表

<160>2

<210>1

<211>1290

<212>DNA

<213>小鼠属小鼠种(Mus musculus)

<400>1

atgggagaga agggtcacct gagccgggtg ttgttggaat gcagtctcag tgacaagctg      60

tgtgttgtcc aagagaagca gtatgaagta atcattgttc cggctctcct agttggcggc     120

tttctcatcc ttcttgcaat catcctgtgg ctttttatca gaggacagag atcccaaagg     180

cagagccctg gaccccgagg cactgcctct gtacctgcat ctaggggcag aagccaggag     240

gcagcaggac atggagaaaa agtacttctg cctcttaagg agacctcagt ggagggcttt     300

ctgcgagcgg ccacaccccg cctggctaag ctgcaggtgc ccagggaaca gctcttggag     360

gttctggagc aaatccacag tggtagttgt gggaccctct atcatgcaac agtgaccgcc     420

aaggatcacc ctaagccaaa aagtgtggtc cttaaggctt tagaagatcc agttggactc     480

caggaggtcc aggattttat aggacgaata caattctatc agtacctggg gaaacacaag     540

aacctggtac agctggaggg ctgctgtaca gaaaggctgc cactctatat gatgctggag     600

gatgtggtcc caggggacct gctcagcttt ctttggacct gtagaaggga tgtgatgacc     660

atggatggcc tgctctatga tctcacagaa aaacaaatat atcacattgg aaagcagatc     720

cttttggccc tggaattcct gcaggagaag cacctgtttc atggggatgt ggctgccagg     780

aacatcctga tccaaagtga cctgactccc aaactttgtc atctgggcct ggcttatgaa     840

gttcatgccc atggggccat ctcctctgct cgatccagca ccatccctct caagtggctt     900

gctccagaaa ggcttctcct gagacctgca agcatcaggg gagatatttg gtcctttggg     960

atcctgcttt atgagatggt gactctagga gcaccaccat accctgaagt ccctcccacc    1020

agcatcctac agtatcttca gagaaagaaa atcatgaaga gacccagcag ctgctcacat    1080

gccatgtaca acatcatgaa gtgctgttgg cgctggagtg aggacagccg ccccttactt    1140

ggtcagctgc tccagcgcct agaagctgct tctagatctg ccgatgacaa ggctgtgttg    1200

caagtgccag agttggtggt gcctgaactg tatgcagatg tggctggcat cagggcagaa    1260

agcatttcct atagcttcag tgtcctttga                                     1290

<210>2

<211>429

<212>PRT

<213>小鼠属小鼠种(Mus musculus)

<400>2

Met Gly Glu Lys Gly His Leu Ser Arg Val Leu Leu Glu Cys Ser

 1               5                   10                  15  

Leu Ser Asp Lys Leu Cys Val Val Gln Glu Lys Gln Tyr Glu Val

                 20                  25                  30

Ile Ile Val Pro Ala Leu Leu Val Gly Gly Phe Leu Ile Leu Leu

                 35                  40                  45

Ala Ile Ile Leu Trp Leu Phe Ile Arg Gly Gln Arg Ser Gln Arg

                 50                  55                  60

Gln Ser Pro Gly Pro Arg Gly Thr Ala Ser Val Pro Ala Ser Arg

                 65                  70                  75

Gly Arg Ser Gln Glu Ala Ala Gly His Gly Glu Lys Val Leu Leu

                 80                  85                  90

Pro Leu Lys Glu Thr Ser Val Glu Gly Phe Leu Arg Ala Ala Thr

                 95                 100                 105

Pro Arg Leu Ala Lys Leu Gln Val Pro Arg Glu Gln Leu Leu Glu

                110                 115                 120

Val Leu Glu Gln Ile His Ser Gly Ser Cys Gly Thr Leu Tyr His

                125                 130                 135

Ala Thr Val Thr Ala Lys Asp His Pro Lys Pro Lys Ser Val Val

                140                 145                 150

Leu Lys Ala Leu Glu Asp Pro Val Gly Leu Gln Glu Val Gln Asp

                155                 160                 165

Phe Ile Gly Arg Ile Gln Phe Tyr Gln Tyr Leu Gly Lys His Lys

                170                 175                 180

Asn Leu Val Gln Leu Glu Gly Cys Cys Thr Glu Arg Leu Pro Leu

                185                 190                 195

Tyr Met Met Leu Glu Asp Val Val Pro Gly Asp Leu Leu Ser Phe

                200                 205                 210

Leu Trp Thr Cys Arg Arg Asp Val Met Thr Met Asp Gly Leu Leu

                215                 220                 225

Tyr Asp Leu Thr Glu Lys Gln Ile Tyr His Ile Gly Lys Gln Ile

                230                 235                 240

Leu Leu Ala Leu Glu Phe Leu Gln Glu Lys His Leu Phe His Gly

                245                 250                 255

Asp Val Ala Ala Arg Asn Ile Leu Ile Gln Ser Asp Leu Thr Pro

                260                 265                 270

Lys Leu Cys His Leu Gly Leu Ala Tyr Glu Val His Ala His Gly

                275                 280                 285

Ala Ile Ser Ser Ala Arg Ser Ser Thr Ile Pro Leu Lys Trp Leu

                290                 295                 300

Ala Pro Glu Arg Leu Leu Leu Arg Pro Ala Ser Ile Arg Gly Asp

                305                 310                 315

Ile Trp Ser Phe Gly Ile Leu Leu Tyr Glu Met Val Thr Leu Gly

                320                 325                 330

Ala Pro Pro Tyr Pro Glu Val Pro Pro Thr Ser Ile Leu Gln Tyr

                335                 340                 345

Leu Gln Arg Lys Lys Ile Met Lys Arg Pro Ser Ser Cys Ser His

                350                 355                 360

Ala Met Tyr Asn Ile Met Lys Cys Cys Trp Arg Trp Ser Glu Asp

                365                 370                 375

Ser Arg Pro Leu Leu Gly Gln Leu Leu Gln Arg Leu Glu Ala Ala

                380                 385                 390

Ser Arg Ser Ala Asp Asp Lys Ala Val Leu Gln Val Pro Glu Leu

                395                 400                 405

Val Val Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Val Ala Gly Ile Arg Ala Glu

                410                 415                 420

Ser Ile Ser Tyr Ser Phe Ser Val Leu

                425             429