银线兰植物提取物及其衍生级分作为草药或营养添加剂在人恶性肿瘤的化学预防或治疗中的用途

摘要

本发明提供了具有药物活性的提取物及其级分，以及一种从兰科植物组织中提取、分部分离其组成来制备上述提取物及级分的方法。这些活性提取物及级分对预防和抑制肿瘤生长有用。

说明书

发明背景

发明领域

银线兰(Anoectochilus formosanus，兰科)是台湾当地独有和重要的一种药用植物，在台湾地区及亚洲其他国家已经被广泛地用作营养草药茶。由于它具有多种药理作用如保肝、防癌、抗糖尿病及治疗心血管疾病(Kan1986)，所以这种药用植物也被称为“药王”。然而，这种兰科植物的生物活性、生理功能及特定的临床功效仅有有限的已被证明的科学资料。

细胞程序性死亡是一种细胞死亡的机械性驱动形式，它以细胞的发育方式得到调节或为对一系列特定刺激或多种细胞损伤形式的反应而被激活。很显然目前许多癌细胞可以避开正常的细胞程序性死亡机制以避免自毁。许多先前报告提示以免疫防御机制介导的诱导的细胞程序性死亡(Willliams，1991；Bursch等，1992)或其它组织特异性的稳态控制(Raff，1992)可以对除去初期的肿瘤细胞发挥重要作用。抗癌药作用方式的最近认识表明：大部分抗癌药物均可以在靶向测试的肿瘤细胞中引起细胞程序性死亡，而与抗癌药物的不同内在性质无关(Whllie等；1980；Jiang等，1996)。此外，某些“抗细胞程序性死亡”蛋白质(例如Bcl-2或Bclx_L)的过表达可以抑制由抗癌药如紫杉醇、阿糖胞苷和依托泊苷引起的细胞程序性死亡(Fang等1998)。相反，多种公知或可疑的肿瘤促进剂，例如佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)、1，1-双(对-欧瑞香素)、二乙基己烯雌酚(DDT)、糖精、黄曲霉毒素等已知在多种类型的测试细胞中，可以诱导细胞程序性死亡抗性，表明对细胞程序性死亡的抑制作用显然是通过一种肿瘤促进机制来介导的(Wright等，1994)。因此，有利地是打破平衡，使细胞程序性死亡更有利于有丝分裂，从而作为癌症化疗和预防手段。

最近的研究显示细胞程序性死亡涉及线粒体完整膜的破坏，从而导致细胞色素c从线粒体释放到细胞溶质中，而这种顺序对于细胞死亡的过程是决定性的(Liu等1996，Yang等1997)。还证实具有对靶分子有广谱抗性的几种抗肿瘤药物例如紫杉醇、依托泊苷也可以引起线粒体成分的释放并导致胞质中细胞色素c的累积(Fang等1998)。已知的涉及细胞死亡过程的细胞机制在于命名为天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspases)的半胱氨酸蛋白酶家族的生化活性调控。

美国国家癌症研究所(NCI)的一个科研小组已经开发出了以基于生物活性为评价原则的体外肿瘤抑制筛选系统，它采用了一组与不同类型肿瘤疾病有关的人类肿瘤细胞系并联用了四唑氮(MTT)测定法和蛋白质结合染色测定(磺酰罗丹明，Bsulforhodamine B)测定法(Monks等1991)。这些测定方法在本质上是在测定肿瘤细胞的存活能力、生长及其细胞生化特性。经过各种试验性的筛选试验后，Monks及合作者以及美国NCI其他研究组达到了每周可以筛选400个化合物的筛选速度。在迄今为止已经的筛选的至少8000个单体化合物中，只有有限数量的测试样品(大约30个)显示出有显著的、可再现的、严格的体外抗癌活性。在这些有限的化合物中，仅有大约8-10种化合物显示出体内抗肿瘤活性，同时不产生过度的毒性，而且已经进一步在人体临床实验中进行了测试。这项工作和结果说明了用于癌症药物转运的单体化合物的筛选存在很大的困难。

现在，已经有一种商业化的较快速的、系统化策略，利用组合化学及药物筛选的高通量系统，并正在被许多新药研发的制药公司积极地应用。还应理解为对癌症药物开发而言“不必如此简明”，并且也应对联用化合物或“鸡尾酒”给予考虑(Dr.G.Craggi，传统中药国际研讨会，2000年8月30日-9月2日，美国马里兰州)。这种利用粗制或部分纯化的植物二级代谢物/植物化学作为混合化合物用于药物开发、食品添加剂及营养品的策略是美国新成立的National Center of Complementary and AlternativeMedicine(NCCAM)的主要政策和方向。我们的研究及本发明基于这种新策略和方向而设计。最近，已经研究了利用这种手段进行药用植物的预防和抑制肿瘤活性的系统性尝试，进行了绿茶及其衍生的活性化合物表儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)的研究(Lin等1999；Ahmad等1997)。

发明概述

本发明涉及兰科植物的草药植物提取物，特别是银线兰(“A.formosanus”)的草药植物提取物，这些提取物既可以是粗制但确定的植物提取物或经生物有机化分部的植物代谢化合物；本发明还涉及所述提取物的制备方法、包含这类提取物的组合物及其在化学预防或补充性/替代性控制人体各种恶性疾病中的应用。

在亚洲国家中，其它种类的兰科的植物，例如来自中国、美国和越南的恒春银线兰或栽培品种逐步用作银线兰的替代品，应用于草药及营养品中。这些兰科植物的植物提取物以及它们的衍生物可能也具有相似的抗肿瘤活性或预防肿瘤的活性，且由此可能用作特定的药物或营养品。

本发明涉及这类提取物及其植物化学衍生物作为预防或抑制肿瘤药物或营养品的用途。有效的肿瘤细胞抑制活性(特别对黑素瘤、乳腺癌和肝细胞瘤有强活性)，这里定义为对实体瘤的生长具有预防、控制或抑制作用，且会给正常的个体或癌症患者带来潜在的益处。在对人施用草药植物提取物时，不论是对无症状的人还是癌症患者，都可以通过口服转运(口服液)、肿瘤内(皮内)注射，腹膜内注射、局部应用乃至静脉内注射部分纯化提取物来进行。

本发明另一个方面包括作为本发明提取物的粗提物、来源于该粗提物的级分或亚级分的获得方法。这些提取物是通过一步或多步提取步骤，利用溶剂和/或经过特定的提取时间而得到的。

在其它实施方案中，对所述的提取物或级分进行后续加工得到更提纯的形式。

本发明中的植物材料生长在特定和恒定的温室条件中。在特定条件下采集植物组织、精细匀化并用含水介质、例如水提取，接着进行阶式梯度级分。进一步的分部级分可进行有用表征化合物(index compound)的鉴定，可通过IR、质谱和NMR光谱分析表征其特征。由此可以监测、调节、标准化或控制植物提取物的批间变化的的一致性和质量，可以通过校准表征组分/化合物组成的表征化合物的水平以及确定其在特定植物提取物或衍生的生物有机分级分中的分布(profiling)而实现。通过实施这种校准/标准化及质量控制/分析(QC/QA)措施，可以明确获得的生物活性植物粗提物或衍生的有机级分的制备物并加以分类，用作预防/控制肿瘤生长及相关恶性疾病的营养品或药物。

在MTT和³H-胸苷掺入测定法进行的体外(细胞培养物)的细胞毒性实验表明所述植物提取物和其衍生级分对MCF-7细胞(人乳腺癌)、B16细胞(小鼠黑素瘤)、人或小鼠肿瘤来源的人肝细胞瘤HepG2的细胞增殖活性的有效抑制作用。体外细胞毒性研究结果证明对肿瘤细胞增殖的抑制动力学特性是一种剂量依赖性的作用。

本发明还表现出对体内肿瘤生长的抑制作用，使用小鼠B16黑素瘤细胞/C57黑色小鼠作为靶肿瘤/动物模型系统。肿瘤内注射银线兰提取物有效地抑制了B16肿瘤的体内生长，并且当将银线兰提取物经腹膜内给药时，检测到了减缓肿瘤生长的极为显著的作用。在被强制性喂药的实验小鼠中也观察到了可检测到的效果。

荧光显微法和流式细胞仪分析显示，所观察到的银线兰提取物对实验肿瘤细胞的细胞杀伤作用显然是通过程序性细胞死亡(所谓的“细胞凋亡(apoptosis)”)的过程来介导的。在本发明中，我们证实MCF-7细胞的程序性细胞死亡是通过Fas配体(FasL)信号通路的表达来介导的。当MCF-7人乳腺肿瘤细胞用银线兰植物提取物处理时，对参与已知细胞程序性死亡通路的各种信号蛋白的蛋白质印迹分析显示，顶端的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)(例如天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8和9)及效应器天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(例如天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶7)、细胞色素c以及聚ADP核糖聚合酶(PARP)蛋白质分子的表达水平都受到了明显而特异性的影响。本发明还提出了银线兰植物提取物诱导的MCF-7肿瘤细胞的程序性死亡的可能机制。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3样和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8活性的活性明显波动、增加和随后的降低，与B16黑素瘤细胞的杀伤有很好的关联关系，为银线兰提取物处理时间的函数。这些结果有力地提示所观察到的银线兰的抗肿瘤细胞作用机理为特定类型的细胞生物机制或通路而不是通常所讲的“细胞中毒”。

本发明其它有益的方面包括：

使用基本非化学的技术或方法(即无合成化合物、无缓冲液、无毒性有机溶剂)，利用沸水处理0.1-500分钟进行水提及生物有机提取。

应用单纯乙醇阶式梯度(50-87.5％，体积比)提取步骤，获得一种更具生物功效的亚级分、即AH-sup级分。

用乙酸乙酯和丁醇对AH-sup进一步的生物有机提取，得到更精制或更富集的代谢化合物的分组，与总粗提物相比，它们可提供更高水平的抗肿瘤活性。

级分(AH-sup)的制备，该级分源自总、含水粗提物(AF-Hot)，与其他级分(AF-Hot、AH-I、AH-II、AH-III级分)相比，其在体外表现出对小鼠B16黑素瘤、MCF-7人乳腺癌及HepG2人肝细胞瘤的高水平的细胞毒性。

对AH-sup级分进一步进行生物有机分部分离得到三种亚级分(命名为EA、BuOH及水级分)，基于MTT测定显示，与AH-sup、BuOH及水级分相比，EA级分具有最显著的抑制肿瘤细胞作用。

本发明的植物提取物具有抑制肿瘤生长的能力：

a)基于MTT测定及流式细胞术分析，银线兰的AH-sup、EA、BuOH和EA级分具有不同水平的抗肿瘤细胞增殖作用，并且在三种测试细胞系中都有变化，提示银线兰植物提取物具有不同的肿瘤抑制或肿瘤预防活性。

b)就HepG2人肝癌细胞而言，当用分部分离的植物提取物、尤其是EA级分处理HepG2细胞时，可以观察到极为显著的细胞杀伤作用，因此，可以使用对肝细胞具有最低毒性的银线兰粗提物，并且其对其它种类肿瘤的治疗更具功效。

c)当对带有B16黑素瘤CS7B/6J小鼠通过原位肿瘤内、腹膜内给药或口服饲喂银线兰植物提取物(AH-sup)治疗时，AH-sup或植物粗提物都会显示出抗黑素瘤的作用，即有效地抑制小鼠体内B16肿瘤的生长。

体外动物模型实验显示采用肿瘤内、腹膜内和强制喂药/饮用的方法给动物施用银线兰植物提取物会产生显著水平的肿瘤生长抑制作用，因此对癌症治疗或预防有潜在的效果。

显示本发明特征的各种新颖性特征特别地在附加并为公开组成部分的权利要求中指出。为了更好地理解本发明、其实施优点及其应用所达到的特定目标，应参照下列附图和本发明优选实施方案的描述。

附图说明

附图中：

附图1.银线兰植物总提取物和分部提取物的提取方案。

本方案原则上依照“生物活性指导的分部策略”，其中按照用于银线兰(AF)的有效提取和分部分离的流程图进行抗肿瘤相关的生物活性实验。

图2.银线兰的AF-Hot提取物对MCF-7人乳腺癌、HepG2人肝瘤及小鼠B16黑素瘤细胞系的抗肿瘤细胞增殖作用，生长培养基中含或不含胎牛血清。

在有或无胎牛血清存在的情况下，用MTT测定法测定用不同剂量的粗提物(AF-Hot)处理测试细胞48小时后的细胞存活力。每个数据点为至少三份测试样品的平均值。

图3.银线兰的总植物提取物及生物有机分级分离提取物对MCF-7乳腺癌、HepG2肝瘤及小鼠B16黑素瘤细胞系的抗细胞增殖作用。

用MTT测定法测定用不同剂量的粗提物(AF-Hot)和衍生的级分(分别为AH-sup、EA、BuOH及水级分)处理测试细胞48小时后的细胞存活力。每个数据点为至少三份样品的平均值。

图4.没有用(A)和用银线兰总粗提物(AF-Hot)(B)、AH-sup级分(C)及EA级分(D)处理的MCF-7细胞的细胞形态的光学显微镜分析结果。

MCF-7细胞在补充了磷酸缓冲盐水(A，对照)或用1mg/ml指定的银线兰植物提取物处理的RPMI1640培养基中孵育48小时。每一张显微照片都是由安装在可放大两百倍的Olympus CK40显微镜上的Olympus PM-30照相机拍摄。

图5.用膜联蛋白和碘化丙锭(PI)染色的正常或细胞程序性死亡的MCF-7细胞的细胞水平的显微镜分析。

将MCF-7细胞用EA级分(1mg/ml)处理4小时，然后用PI(propidiumiodide)和膜联蛋白-V(A)或仅用膜联蛋白-V(B)染色。C和D是用媒介物(0.4％DMSO)处理并用PI和膜联蛋白-V(A)染色的对照细胞。A、B和D的荧光显微照片是由安装在Nikon ECLIPSE E800显微镜上的Olympus PM-30照相机拍摄，显微镜具有两百倍放大倍数、使用B-2A滤色镜，且C是D的明视野图。

图6.不同处理时间点的正常和细胞程序性死亡的MCF-7细胞中的DNA含量的流式细胞分析。

将MCF-7细胞在补充了0.4％DMSO(媒介物)或1mg/ml的银线兰EA级分的RPMI1640培养基中孵育，然后在指定的时间点收集。M1表示细胞程序性死亡的峰值，同时图像分析仪得到细胞程序性死亡细胞的百分比。

图7.银线兰的EA级分对诱导MCF7细胞上FasL活性的细胞表面表达的作用。将MCF7细胞分别在1mg/ml的EA提取物或0.4％DMSO溶液(媒介物对照)中暴露5、8或16小时。

通过流式细胞术分析、用小鼠抗-人FasL IgG，克隆NOK-1或同型对照小鼠IgG，MOPC-21以及用于二级染色的FITC偶连的大鼠抗小鼠IgG来测定FasL表达。通过Coulter EPICS XL流式细胞计数仪(Beckman Coulter，USA)、应用Expo XL4细胞计数软件来分析结果。

图8.未用(对照)或使用银线兰提取物处理的MCF-7细胞中的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶7、8、9、细胞色素c、NFκB、肌动蛋白(A)以及聚ADP-核糖-聚合酶(PARP)(B)的蛋白质表达分布。

将含40μg经过或未经过植物提取物处理的MCF-7肿瘤细胞蛋白质的同等细胞裂解物的部分进行5-20％SDS梯度电泳凝胶。在将SDS凝胶中的蛋白质电转移到PVDF膜上后，特异性蛋白质带与初次测试抗体反应，然后用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二次抗体室温处理1小时。通过显色法显现反应的蛋白带。

图9.银线兰植物提取物(AH-sup)对CS7BL/6J小鼠模型中的B16黑素瘤生长的体内抑制作用。

本实验对将测试小鼠施用植物提取物使用了各种给药方法，包括腹膜内(i.p.)、肿瘤内(i.t.)以及口服强制性喂药。将仅通过腹膜内(i.p.)注射磷酸盐缓冲液的小鼠(对照1)或通过强制性喂药并伴以腹膜内(i.p.)注射的小鼠(对照2)作为对照。将7只小鼠/组用于各实验。

图10.银线兰的AH-sup(A)和EA级分的化学指纹图谱和候选表征化合物。

A组：银线兰植物AH-sup提取的三批不同制备物的代谢物分布图。三种色谱图均获自C-18反相用PLC系统，且使用IR、质谱和NMR光谱分析鉴定植化化合物混合物组成分布中的8种表征化合物的结构和特性。化合物1：烟酰胺；2：腺苷；3：胞嘧啶；4：异鼠季亭3，4′-O-β-D二吡喃葡糖苷；5：异鼠季亭3-O-β-吡喃葡糖苷；6：咖啡酸；7：(6R，9S)-羟基-megastima-4，7-二烯-3-酮-9-O-β-D-吡喃葡糖苷；8：以及kinsenone。

B组表示用Si-60HPLC系统的得到的银线兰植物提取物EA级分的色谱图。EA级分中用作标定或参比的侯选化合物是：1：长链脂肪酸；2：α-香树素反式-对羟基肉桂酸酯(cinamate)；3：α-香树素  顺式-对-羟基肉桂酸酯；4：异鼠季亭；5：kinsenone；6：对-羟基苄醇。

图11.提出的银线兰植物提取物诱导的MCF7肿瘤细胞和人乳腺瘤细胞的细胞程序性死亡的信号通路。

优选实施方案的详细描述

我们采用NCI(Monks等，1991)的抗肿瘤药物筛选策略，该策略经过一些的改变，主要目的在于评价银线兰植物提取物对肿瘤细胞的特异性细胞毒性。我们采用一种确定的、可重复的“生物活性指导的分部分离策略和方案”来评价银线兰总植物提取物及生物有机衍生级分的潜在抗肿瘤细胞作用。银线兰特定的植物提取物对肿瘤细胞的机理特异性细胞毒活性很明显涉及细胞凋亡的诱导，正如用流式细胞术、蛋白质印迹分析和caspase活性测定法评价所证实的那样。这些发现与各种已公开的研究成果非常相似，这些研究结果证明细胞程序性死亡作用是由特定抗癌药物诱导的结论。参见例如Whllie等，1980和Jiang等1996发表的研究成果。

1.抗细胞增殖试验

使B16，MCF-7和HepG2细胞生长在ATCC推荐的培养基中，该培养基包含10％胎牛血清、100U/ml青霉素以及100μg/ml的链霉素作为补充剂。RPMI1640(Gibco BRL，USA)用于B16和MCF-7细胞的生长，极限必需培养基(MEM，Gibco BRL，USA)用于HepG2细胞的生长。

主要通过使用MTT比色分析来评价银线兰植物提取物及衍生的级分对肿瘤细胞生长的作用，该分析方法已经在别处(Mosmann，1983)进行了描述，这里进行了较小的改动。MTT中四唑金翁环(呈黄色)活细胞中的线粒体脱氢酶裂解，从而产生棕色的甲攒(formazan)沉淀。然后测定570nm处相对吸光度的变化。进行MTT分析的时候，将靶肿瘤细胞(5×10³至1×10⁴)在96孔滴定板上与或不与植物提取物一起孵育1到3天。孵育后，将贴壁细胞用新鲜培养基洗涤一次，并将MTT染料(0.5mg/l的PBS溶液)加入到如上所述的相应细胞培养基中，且在37℃下反应4小时。然后离心收集不溶反应产物、溶于100μL的DMSO中，并在37℃下保温两小时。所有试验都要用一式四份细胞组来完成。将细胞增殖抑制作用用微量培养板读出器(Labsystems Multiskan MS，芬兰)测定的570nm处相对吸收来表示。经植物提取物处理后的细胞的存活百分比利用下列公式计算：活细胞数(％)OD₅₇₀(处理过的细胞培养物)/OD₅₇₀(对照(未处理的)细胞培养物)×100％。对于某些测试细胞，也可以用³H胸苷结合法来测定银线兰植物提取物的抗细胞增殖活性，按照Seufferlein和Rozengurt(1995)所述的严格实验方案进行。

2.肿瘤细胞的荧光显微分析和流式细胞分析

将Apoalert膜联蛋白V-EGFP方法(CLONTECH，Palo Alto，CA)用来评价测试细胞中的细胞程序性死亡(Zhang等，1997)。将MCF-7肿瘤细胞用EA级分(1mg/ml)或媒介物(0.1％DMSO)处理4小时，用固定溶液洗涤并在黑暗中用膜联蛋白V-EGFP和/或碘化丙锭染色15分钟。使用Nikon ECLIPSEE800倒置荧光镜对细胞进行观察。

收集用或未用待测植物提取物或衍生植化部分处理的实验癌细胞(1×10⁶个细胞)，并用1ml冰冷的70％的乙醇在4℃下固定2小时。在黑暗中用PI染色液将细胞DNA染色30分钟，所述的PI染色液为中含50mg/ml碘化丙锭(PI)和100μg/ml的RNAase A的PBS缓冲液。使用Coulter EPICS XL流式血细胞计数器(Beckman Coulter，USA)将总DNA中Sub-G1 DNA含量的百分比取为细胞程序性死亡细胞群的测定值。数据来源于每次分析中至少含10000个细胞的样品，并用DNA MultiCylce程序(Beckman中心，美国)进行分析。

3.MCF-7细胞上FasL表达的诱导以及FasL表达的流式细胞分析

将1×10⁶/ml的细胞等分试样在6孔平底板中培养过夜，培养基为补充了10％加热失活胎牛血清的RPMI1640培养基。然后将EA植物提取物(1mg/ml)或0.4％DMSO加入生长培养基中，并保温5、8或16小时。经处理后，用0.5ml/孔胰蛋白酶/EDTA收集细胞并用PH值为7.2的磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤两次。

将在终体积为100μl PBS中的5×10⁵个细胞等分试样在20℃与1μg小鼠抗人FasL IgG1，克隆NOK-1(Pharmingen，USA)一起保温30分钟、洗涤一次并重新悬浮于100μl的PBS中。将小鼠IgG1，克隆MOPC-21(Pharmingen，USA)用作同型对照。二次染色如下，将细胞与1μgFITC-偶联抗小鼠IgG，克隆LO-MG1-15(Biosource，California，USA)在20℃的黑暗中保温30分钟，并用PBS洗涤两次，然后使用安装了Expo XL 4Cytometer软件的CoulterEPICS XL流式血细胞计数器(Beckman Coulter，USA)进行分析。

4.蛋白质印迹分析

将测试细胞(2×10⁶)用PBS洗涤一次，并在冰上用100μl裂解缓冲液(pH7.0，20mM PIPES，10mM NaCl，1mM EDTA，0.1％ CHAPS，10％蔗糖，10mM DTT，5mM HEPES，0.05％(v/v)Triton X-100，1mM MgCl₂，2.5mMEDTA和0.438％(w/v)β-甘油磷酸酯)和2μl的蛋白酶抑制剂混合物组III(Calbiochem Co，USA)中裂解20分钟，并且每5分钟涡旋混合一次。PIPES、CHAPS和HEPES化学品购自Sigma Chemical Co.(MO，USA)。离心后，用Bradford(1976)所述方法测定上清液中蛋白质的浓度，使用小牛血清白蛋白作为标准品。将40μg的蛋白质等分试样在5-20％的梯度小-SDS-聚丙烯酰胺凝胶(Laemmli，1970)上分离，并且然后转移到PVDF膜(Mlilipore)上。用3％的脱脂干奶的TBS缓冲液(10mM Tris，PH 7.5和100mM NaCl)封闭PVDF滤膜，以避免发生非特异性结合，并在40℃以在封闭溶液中的特异性初级抗体的探测过夜、同时不停地摇动。将兔抗肌动蛋白(Oncogene ResearchProducts)、小鼠抗-PARP(Related Products)、小鼠抗细胞色素c(Pharmingen)、兔抗-NF-κB(Oncogene Research Products)、小鼠抗-前半胱天冬酶(porcaspase)-2、-7和-9以及抗前半胱天冬酶-8(BD Research Products)用作初级抗体。用TBST缓冲液(0.1％ Tween20的TBS缓冲液溶液)洗涤后，用碱性磷酸酯酶偶联二级抗体在室温处理印迹膜3小时。反应的蛋白质带通过比色法或使用增强化学发光系统(ECL，Amersham Pharmacia Biotech Co.，UK)来进行显示，并在Kodak Biomax MS胶片(Eastman Kodak Company，USA)上进行图象分析。

5.C57BL/6J小鼠体内B16肿瘤生长的抑制

所用的动物肿瘤系统是携带鼠B16黑素瘤细胞的C57BL/6J鼠品系，或通称为C57或B6的小鼠系。使用B16黑素瘤细胞中度细胞滴度接种并生长的2-3个月龄测试小鼠来银线兰植物提取物对肿瘤生长的可能体内作用的评价。

实验用五组小鼠，每组7只小鼠。在第0天将悬浮于50μl磷酸缓冲盐(PBS)中的总计1×10⁵B-16肿瘤细胞植入每只小鼠的右腹部区域的皮肤组织(皮内)。三组小鼠用来评价AH-sup的治疗作用，经腹膜内(i.p.)注射或肿瘤内(i.t.)注射测试植物提取物或强制性喂药(f.f.)方式来测试抗肿瘤作用。具体地，从第二天起，1组的试验小鼠只接受腹膜内注射PBS(对照1)，2组小鼠仅用PBS处理，通过强制性喂食并同时进行腹膜内注射(对照2)。3、4和5组小鼠分别经肿瘤内注射、腹膜内注射及经口强制性喂药接受AH-sup溶液治疗。

每只测试小鼠的注射剂量为每天1mg AH-sup的100μl PBS溶液，而强制性喂药的小鼠则每天口服2mg AH-sup的200μl PBS溶液。两个试验组小鼠均在接种肿瘤细胞后连续治疗7天。从第8天开始，减慢治疗频率，每两天治疗小鼠一次，直到第21天为止。就强制性喂药而言，小鼠的草药相对剂量相当于一个50kg的人饮用两份由约30g干燥银线兰植物制成的速溶草药茶粉末(2包茶)的摄入量或摄取量。

6.银线兰的AH-sup和EA级分的代谢物分布和表征或组成化合物分析

使用Waters HPLC系统进行分析型高效液相色谱(HPLC)分析，该液相色谱安装了Waters600控制器、Waters Delta 600泵和2478双波长吸光度检测器。使用5μm C-18柱(250×10nm，Merck，Germany)分析AH-sup级分，其中使用甲醇-水(90∶10，v/v)(A)和甲醇(B)两种溶剂系统。洗脱条件如下：0至5分钟，80％A至B(不变梯度(isocratic))；5至30分钟，80-0％A至B(线性梯度)；30至60分钟，100％B(不变梯度)。检测器波长设定在254nm。使用5μm Si-60柱(250×10nm，Merck，Germany)进行EA活性级分分析，其中使用正己烷(n-haxeane)(A)和乙酸乙酯(B)这两种溶剂系统。洗脱梯度分布如下：0-5分钟，70％A至B(不变梯度)；5-15分钟，70-30％A至B(线性梯度)；15至20分钟，30％A至B(不变梯度)；20-30分钟，30％-0％A至B，流速为5ml/分钟，将检测器波长设定在280nm。然后使用各种光谱分析阐明AH-sup级分中化合物1-8和EA级分中化合物1-6的结构。用Jasco V-550分光计记录测试化合物的UV光谱，且IR光谱获自Bia-Rad FTS-40分光光度计。使用Finnigan MAT-958质谱仪采集电子碰撞质谱(EIMS)和高分辨电子碰撞质谱(HREIMS)数据，并且用Bruker Avance 500和300MHz FT-NMR光谱计在500MHz(¹H)和75MHz(¹³C)处记录NMR谱。

用已知浓度的EA级分，通过HPLC分析对EA级分中的表征化合物定量。在观察到的最大吸光度OD₂₈₀处，测定EA级分的HPLC图中(代谢物分布图)相应于表征化合物各个体峰面积。范围从0.05-1mg/ml的化合物的标准校正曲线(峰面积-浓度)显示出良好的线性关系和R²值(＞0.98)。通过对已知浓度EA级分的HPLC分析，对EA级分中的表征化合物进行定量，然后测定特定化合物的峰面积并基于标准校正曲线确定其在提取物中的含量。

7.银线兰植物提取物的制备和分部分离

从著名的银线兰培养基地购买新鲜的银线兰植物，并经过对花的形态学和解剖学特征的鉴定验证了该植物的特性和可靠性。

将新鲜(1000g)或干燥(100g)整株银线兰全植物，包括叶、茎和根组织通过用研钵和研杵粉碎而匀化，并通过用三倍体积的蒸馏水缓慢而持续的煮沸(约100℃)1小时进行提取。然后将上述提取步骤重复一次。对二次提取液在25℃以24000xg离心20分钟，收集上清液，然后用冷冻干燥机(LABCONCO，USA)冻干。这种制备方法得到总AF-Hot粗提物(以干重计约为49g)。将这种AF-Hot提取物溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中，用于对靶肿瘤细胞的抗细胞增殖活性评价。将确定的“生物活性指导的分部分离策略和方案”用于对银线兰AF-Hot的进一步分部分离，如图1及上述内容中所述。

使用阶式乙醇分部分离步骤从AF-Hot粗提物中得到多种亚级分。AH-I、II和III级分是来源于AF-Hot样品的乙醇沉淀物质，将AF-Hot样品分别用50％、75％和87.5％(v/v)乙醇依次有机提取得到，而AH-sup是用87.5％乙醇处理的AF-Hot样品中剩余的可溶形式/级分。简单讲，在搅拌的同时将等体积无水乙醇缓慢加入到AF-Hot粗提物中，并且在室温下放置30分钟。然后通过在4℃以24000xg离心20分钟，收集沉淀得到AH-I级分(以干重计约为17.6％)，然后使用上述制备AH-I级分相同的步骤，向上清液中加入乙醇，直到其终浓度达到75％(v/v)为止。在这一步骤中，获得了AH-II级分(以原植物材料干重计约为4.4％)。AH-III级分(以干重计约为1.7％)和和AH-sup级分(约占干重的23％)分别获自87.5％(v/v)的乙醇沉淀物和可溶性部分。对AH-sup(19.3g)的进一步分部分离步骤用区分溶剂进行分部分离，先用乙酸乙酯(EA)然后再用丁醇(BuOH)，从而分别得到EA(约1.2g)、丁醇(约3.4g)和水(14.4g)亚级分(图1)。在这些有机溶剂分部分离步骤中，将乙酸乙酯和AH-sup以等体积(1∶1)剧烈混合，并在室温放置直到获得分离和澄清有机EA层和水层。然后收集EA级分并用乙酸乙酯再次提取水层。合并两份EA级分并用旋转蒸发仪(rotavaper)蒸干。使用与乙酸乙酯提取相同的步骤，进一步用丁醇提取水层，从而得到BuOH和水亚级分。将由此得到的AF-Hot、AH-I、AH-III和AH-sup级分溶于磷酸盐缓冲液(PBS)，并将EA、BuOH和水级分溶于二甲亚砜(DMSO)溶剂，用于随后的下列实验。

细胞毒性分析

将MTT(四唑氮)测定法(Mosmamn，1983)，一种测定活细胞线粒体中各种脱氢酶活性的比色测定法，以及测定活细胞中DNA合成的³H-胸苷掺入测定法，用来评价抗肿瘤细胞活性。将三种类型的肿瘤细胞系，即人乳房肿瘤(MCF-7)、小鼠黑素瘤(B16)和人肝细胞瘤(HepG2)用于相同或平行的实验。

图2表示AF-Hot对在含有或不含胎牛血清的测试肿瘤细胞培养物的生长培养基中的MCF-7、HepG2及B16肿瘤细胞的细胞毒性作用。无论培养基中是否补充了胎牛血清，对总植物提取物AF-Hot观察到了极为相似的抗肿瘤细胞作用。这是一个有用的和重要的基本信息，它证明了胎牛血清成分与测试植物间的可能干扰作用不会在银线兰植物提取物显示的抗肿瘤细胞增殖作用中起作用。由两组不同的植物原料制备的总粗提物(AF-Hot)对测试肿瘤细胞提供了相似的或可比较的细胞毒性作用(数据没有显示)。基于MTT分析结果，与来源于AF-Hot总植物提取物的AH-I、AH-II和AH-III级分分别显示的作用相比，AH-sup样品对MCF-7、B16和HepG2细胞表现出的细胞毒性或抗增殖作用最显著。当使用1.5mg/ml剂量的AH-sup级分对MCF-7、B16和HepG2肿瘤细胞处理48小时，检测到测试细胞的存活比例少于45％-55％。而当使用相同剂量的AH-I、AH-II和AH-III级分对这三种测试细胞处理时，观察到多于80％的细胞存活。当对肿瘤细胞采用³H-胸苷结合测定法进行评价时，也观察到AF-Hot和AH-sup级分具有相似的细胞毒性作用趋势。将总粗提物(AH-Hot)、AH-sup、EA、BuOH和水级分的相对细胞毒性(或抗肿瘤细胞活性)进一步MTT测定法特征化并进行比较。

如图3中所示，与银线兰提取物的AF-Hot级分或其它有机亚级分相比，EA级分对所有的测试细胞系表现出最高水平的细胞毒性作用。表1总结了四种不同的生物有机亚级分(AH-sup、EA、BuOH和水)对MCF-7、B16和HepG2细胞的细胞增殖的50％抑制作用的有效剂量(ED₅₀)。经检测EA级分对MCF-7人乳腺癌细胞的ED₅₀为0.08mg/ml，且十倍低于AH-sup亚级分的ED₅₀值。

                          表1

    银线兰植物的各种有机溶剂提取亚级分对三种靶向的人或小鼠肿瘤细胞的细胞毒性          细胞               ED₅₀(mg/ml)Sup    EA    BuOH水    MCF-70.86    0.08    1.52.70    HepG2ND(＞＞1.5)    0.09    0.232.5    B16～1.60    0.07    ＞4ND(＞＞2.0)    ND：在指定剂量下未检测到ED₅₀：抑制50％细胞增殖的有效剂量(ED)

测试肿瘤细胞的形态和培养性质的光学和荧光显微镜分析

光学显微镜分析显示经过银线兰提取物处理的培养物中的MCF-7细胞形态发生了明显变化。在剂量为1mg/ml时，与AH-sup和AF-Hot级分相比，EA级分对MCF-7细胞形态改变的显示出最显著的作用(图4)。在HepG2和B16肿瘤细胞实验中观察到相似的结果(数据没有显示)。这些观察结果与观察到的表1中所列这些提取物部分的ED₅₀值有良好的一致性。为了进一步证实经处理的MCF-7细胞是否发展为细胞程序性死亡，使用膜联蛋白V-GFP和碘化丙锭染色进行荧光显微镜分析。图5显示在用EA级分处理4小时后，在MCF-7细胞中很易检测到质膜磷脂酰丝氨酸的早期再分布。该结果证实EA级分可以有效地诱导MCF-7细胞的细胞程序性死亡。

流式细胞分析

图6表示作为用EA级分处理的时间函数的MCF-7细胞DNA含量变化和细胞周期特性的流式细胞分布。MCF-7细胞经EA级分(0.25-1mg/ml)处理48小时后，获得了大约有48％水平的细胞程序性死亡DNA水平(从sub-G1峰确定)，而且经72小时处理之后，这种编程性死亡的DNA水平增长到71％。在同样的实验条件下，与MCF-7细胞相比，HepG2细胞也被测定出具有类似的DNA分布，而B16细胞经过48小时处理之后，已经被检测出大约有72％编程性死亡的DNA水平。银线兰AH-sup级分(6mg/ml)对MCF-7细胞和B16细胞DNA含量及细胞周期特性也显示出类似的作用(数据未显示)。这些结果显示银线兰对肿瘤细胞的细胞毒性作用可能通过程序性细胞死亡或细胞凋亡的过程来介导(Wiliams，1991)。

EA提取物诱导MCF-7细胞上的FasL表达

众所周知，Fas-配体(FasL)的表达通过与其相应的受体Fas结合而介导细胞程序性死亡(Nauiokat等1999)。在本研究中，使用与荧光团(FITC)偶联的抗人FasL IgG1的流式细胞分析，用于评价所观察到的银线兰的EA提取物诱导的MCF-7细胞的细胞程序性死亡是否由FasL的表达引起。如图7所示，当将肿瘤细胞在培养物中经过EA级分处理5-16小时，相对于未处理的对照MCF-7细胞而言，FasL蛋白质的表达从10％急剧增加到76％(图7A和B)。

蛋白质印迹分析

几种表现出抗肿瘤活性的单一化合物药物，包括紫杉醇和依托泊苷，已经证实导致线粒体损伤和内含物释放，从而导致胞质细胞色素c的积累(Fang等1998)。我们已经评价了银线兰植物提取物对线粒体细胞色素c释放到测试肿瘤细胞胞质中的可能作用。图8显示当用银线兰植物提取物的EA(或AH-sup)级分处理时，MCF-7细胞中胞质细胞色素c的水平显著增加。已经证实caspase蛋白酶驱动细胞程序性死亡信号传导并通过特别地和仅裂解天冬氨酸残基后面的关键细胞蛋白质而实现(Wolf和Green，1991)。caspase作为潜伏的酶原形式存在，然而，一旦被细胞程序性死亡信号激活，则前半胱天冬酶(procaspase)将以蛋白水解方式被裂解并开始发挥作用。激活的细胞程序性死亡的起始子(caspase-8和-9)反过来能够激活执行(executioner)半胱天冬酶(caspase-3、-6和-7)。在我们的研究中，发现在用EA提取物处理之后大约16个小时内，MCF-7细胞中的前半胱天冬酶-8(procaspase-8)(～55kDa)会发生蛋白水解裂解(图8A)。就caspase-7的前体蛋白而言，从经过EA提取物处理后的24小时开始到32小时，可以检测到诱导的caspase-7蛋白水解发生。在被EA级分处理过的MCF-7细胞中，公知的参与早期活化级联的caspase-9同样会被激活。用EA提取物处理MCF-7细胞也导致聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的时间依赖性蛋白水解裂解，细胞程序性死亡另一个特点，伴随28kDa蛋白的积累以及同时全长116kDa分子的消失(图8B)。已经报导了NK-kB的活化可以导致防止体外宫颈癌细胞系，HeLa细胞中TNF-α-诱导的细胞程序性死亡(Bursch等，1992)。已知NK-kB的Rel A亚单位(p65)直接参与细胞程序性死亡的抑制(Liu等，1996)。在本研究中，EA处理后，在MCF-7细胞中Rel A蛋白质水平的抑制有可检测到效果(图8A)。小鼠B16黑素瘤细胞中Rel A亚单位的表达受到显著抑制，这种抑制作用是银线兰的AH-sup(6mg/ml)或EA(0.25-1.0mg/ml)级分处理时间的函数(数据未显示)。在B16黑素瘤细胞中，观察到caspase-3的活性变化是AH-sup处理时间的函数(数据未显示)，从4小时到24小时增加，然后从24小时到48小时下降。这些结果证实了有特定细胞程序性死亡机制参与观察到的靶肿瘤细胞系杀伤作用，而不是通常的、非特异性化学毒性和杀伤作用。根据流式细胞分析、蛋白质印迹分析和caspase活性试验的结果，我们提出了一种银线兰植物提取物诱导MCF-7肿瘤细胞中细胞程序性死亡的可能的机制(图11)。

对C57BL/6J小鼠模型中B16肿瘤生长的体内抑制

本发明另一方面还证实银线兰植物提取物在C57BL/6小鼠肿瘤模型中抑制或延缓体内肿瘤生长。在本研究中平行进行三种常用的给药方法，包括肿瘤内注射(第3组)、腹膜内注射(第4组)和通过口服强制给药(第5组)。图9概括了实验结果。在所有的三种情况下，用AH-sup级分治疗的测试小鼠表现出明显的肿瘤生长延缓，在体内肿瘤生长的早期阶段可以观察到(治疗后6-10天)(图9)。在植入肿瘤细胞后8-16天观察到了对肿瘤生长的最强抑制作用。在第17天，所有实验测试组，包括肿瘤内注射、腹膜内注射和强制性喂药组都维持在每组有4-7只小鼠，其中经测量体内肿瘤直径低于12mm。相反，在非AH-sup治疗的对照组1和对照组2中，分别只有3只和2只小鼠的肿瘤直径低于12mm；且对照组2中的3只小鼠由于肿瘤过大而有搔痕(scarified)(图9)。在21天，两个对照组中所有存活的小鼠的肿瘤直径超过了15mm的临界极限值，依据动物室(Animal Room)规则，达到这个值可以合法处死(sacrificing)测试小鼠。相反，在治疗后相同实验阶段的第21天，第3组仍有4只小鼠，第4组中有2只小鼠，而第5组有1只小鼠，带有肿瘤的直径仍然小于15mm(数据未显示)。这些结果提示所有三种转运草药提取物给药方法都可以提供显著水平的抗肿瘤作用，其中从经腹膜内注射银线兰AH-sup级分的第3组小鼠显示的抗肿瘤作用最为显著。特别是当使用银线兰植物提取物经肿瘤内对动物给药时，测试小鼠体内超过70％的肿瘤生长受到抑制。这些实验结果显示，在本发明的实验条件下通过给予部分纯化的银线兰植物提取物可以有效且易于抑制C57BL/6J小鼠体内的B16黑素瘤。

化学指纹分析和表征化合物的鉴定和定量

使用安装了Waters600控制器、Waters Delta600泵和2478 Duelλ吸光度检测器的Waters HPLC系统进行分析型高效液相色谱(HPLC)分析。用C-18反相HPLC系统得到银线兰AH-sup植物提取物的三种色谱图。这里表征化合物代表相关植物粗提物或植物化学混合物的确定化学组成和/或特征。就AH-sup而言，使用IR、质谱和NMR光谱分析鉴定的8种侯选表征化合物是：1：烟酰胺；2：腺苷；3：胞嘧啶；4：异鼠季亭3，4′-O-β-D-双吡喃葡糖苷；5：异鼠季亭3-O-β-D-吡喃葡糖苷；6：咖啡酸；7：(6R，9S)-羟基-megastima-4，7-二烯-3-酮-9-O-β-D-吡喃葡糖苷；以及8：kinsenone(图10A)。

根据MS和NMR分析结果，并通过与文献(Wang等，2002；Ali等，1997)中光谱数据比较，分离自银线兰EA的6种化合物鉴定为：长链脂肪酸(1；保留时间(RT)＝6.0分钟)；α-香树素反式-对羟基肉桂酸酯(2；RT＝8.9分钟)；α-香树素顺式-对-羟基肉桂酸酯(3；RT＝9.7分钟)；异鼠季亭(4；RT＝13.5分钟)；kinsenone(5；RT＝14.6分钟)；对-羟基苄醇(6；RT＝18.0分钟)(图10B)。

用分析型HPLC对AH-sup级分中侯选表征化合物2(腺苷)和5(异鼠季亭3-O-β-D-吡喃葡糖苷)以及EA级分中侯选表征化合物2(α-香树素反式-对羟基肉桂酸酯)和4(异鼠季亭)进行定量测定。监测并测定在AH-sup和EA级分的HPLC图中相应于侯选表征化合物的最大UV吸光度的各个峰面积。范围从0.05-1mg/ml的α-香树素反式-对羟基肉桂酸酯和异鼠季亭的标准校正曲线(峰面积-浓度)，显示出良好的线性关系和R²值(＞0.98)(数据未显示)。基于用于HPLC分析特定部分的已知浓度，对AH-sup和EA级分中的侯选表征化合物进行定量，并且侯选化合物峰面积的计算值与我们的HPLC分布分析显示出的化合物充分一致。每克银线兰AH-sup级分包含0.72mg(0.072％)腺苷和3.4mg(0.34％)异鼠季亭3-O-β-D-吡喃葡糖苷。发现1克银线兰EA提取物分别含有4.9mg(0.49％)和52.3mg(5.23％)的α-香树素顺式-对-羟基肉桂酸酯和异鼠季亭。

将腺苷、异鼠季亭3-O-β-D-吡喃葡糖苷、α-香树素反式-对羟基肉桂酸酯和异鼠季亭的光谱数据概括如下：

腺苷

无色针状晶体；熔点234-235℃；C₁₀H₁₃N₅O₄的EIMS测定值为274.2；

¹HNMR(D₂O)：δ(ppm)8.18(1H，s)，8.08(1H，s)，5.19(1H，d，J＝6.0Hz)，4.28(1H，dd，J＝5.2，3.0Hz)，4.15(1H，dd，J＝5.2，3.0Hz)，3.78(1H，d，J＝1.5Hz)，3.69(1H，d，J＝1.5Hz)。

异鼠季亭3-O-β-D-吡喃葡糖苷

黄色无定形；熔点162℃；C1₂H₂₀O₁₂的EIMS测定值为464.38；

¹HNMR(D₂O)：δ(ppm)7.96(1H，d，J＝2.0Hz)，7.56(1H，dd，J＝8.0，2.1Hz)，7.04(1H，d，J＝7.8)，6.39(1H，d，J＝2.0Hz)，6.02(1H，d，J＝2.0Hz)，5.39(1H，d，J＝7.0)，3.72(1H，dd，J＝11.5，2.0Hz)，3.54(1H，m)，3.23(1H，m)。

α-香树素反式-对羟基肉桂酸酯

白色固体；mp105-106℃；C₂₉H₅₆O₃的EIMS测定值为572.43；

¹HNMR(CDCl₃)：6(ppm)7.62(d，J＝8.0)，7.45(d，J＝8.0)，6.85(d，J＝18.2)，6.32(d，J＝18.2)，5.22(m)，4.70(m)，1.17(s)，1.01(s)，1.00(s)，0.96(s)，0.90(s)，0.89(s)，0.86(s)。

异鼠季亭

黄色无定形物；C₁₆H₁₂O₇的EIMS测定值为312.6；

¹HNMR(CDCl₃)：δ(ppm)7.96(d，J＝2.0)，7.56(dd，J＝8.0，2.1)，7.04(d，J＝7.8)，6.39(d，J＝2.0)，6.20(d，J＝2.0)。

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已经使用的术语和表达方式只用作描述术语而非起限定作用，应用这类术语和表达方式并不排除所示的和所述的任何等同的特征或其部分，应该认识到，本发明范围内可能有各种修改。将本文参照的参考文献以全部内容引入作为参考。