高温中性蛋白酶菌株、高温中性蛋白酶及其生产工艺

摘要

本发明公开了一种产生高温中性蛋白酶的高产地衣芽孢杆菌株(Bacillus licheniformis)和利用此菌株生产高温中性蛋白酶的生产工艺，本发明还同时提供了高温中性蛋白酶和酶制剂。本发明的高温中性蛋白酶具有良好的热稳定性、酶活高的特点。本发明利用地衣芽孢杆菌(CGMCC.No.0800)，建立了菌种保藏、复壮及选育的系统工艺技术，通过培养基配方优化筛选及发酵工艺条件优化控制，使发酵周期缩短，确立了稳定的产业化发酵工艺，并且确立了发酵液预处理、浓缩、喷雾干燥新工艺，提高和稳定酶制剂质量，减少环境污染，降低成本40％以上，使制剂质量达到行业优质标准，广泛应用于国民经济各领域。

说明书

发明领域

本发明涉及微生物及微生物发酵领域。具体的说，本发明涉及一种产生高温中性蛋白酶的地衣芽孢杆菌菌株、高温中性蛋白酶及其生产工艺和酶制剂。

背景技术

蛋白酶是一类用途很广的生物催化剂。常规的中性蛋白酶是最早被发现并应用于生产的，具有重要的工业价值，其产品在皮革、纺织、化工、食品、医药等多种行业得到广泛应用。由于它不耐热、不稳定性，因而限制了它的工业化生产和广泛应用。枯草杆菌中性蛋白酶在pH7.0、60℃下处理15分钟，酶活损失90％以上；栖土曲霉3942中性蛋白酶在pH7.5、55℃下处理10分钟，其酶失活80％以上；放线菌166中性蛋白酶的热稳定性更差，只在35℃以下较稳定，45℃会很快失活。

六十年代末欧美诸国将蛋白酶加入洗涤剂内，促进了洗涤剂工业一次大的变革，七十年代随着生物工程的兴起和发展，拓展了核酸和蛋白质工程的新领域，兴起了工具酶新型产业，而生物技术用于改造酶的产生菌，则进一步促进了酶学研究和酶制剂工业的发展，因此酶已成为有关国际学术会议的中心议题。由于碱性蛋白酶和酸性蛋白酶所要求的反应条件限制了它的广泛应用，从八十年代初开始，国内外相继开展对中性蛋白酶的研究，但都局限于常温型中性蛋白酶。而常温中性蛋白酶的热稳定性差，生产和应用工艺技术复杂、成本高。为了解决这个不足，从九十年代开始国际上都致力于对高温中性蛋白酶生产菌及产酶条件的研究，并取得一些成果。国外相关文献主要是有关高温中性蛋白酶及其基因工程菌的研究，其涉及的产酶菌种有：B.brevis MIB001(短芽孢杆菌)、B.spYP-T(枯草杆菌)、Pseudomonas aurantiacus J-10-f1(假单孢菌)、B.stearothermophilus(嗜热脂肪芽孢杆菌)HY-69、Chloroflexus aurantiacus J-10-f1、B.stearothermophilus MK232、B.stearothermophilus 313-1、EAI等，其中台湾分离出的Pseudomonasaeruginosa CCRC15541，其产生的高温中性蛋白酶为金属酶类，最适反应温度60℃，pH7.0，在60℃下作用1小时酶活仍保持85％；B.stearothermophilus产生的一种胞外高温中性蛋白酶，最适反应温度60℃，最适pH6.0，在90℃下作用30分钟酶活保存90％；将B.stearothermophilus高温中性蛋白酶基因在B.subtilis中表达，使产量提高了29倍，产生的蛋白酶pH中性，最适反应温度75℃，在80℃下作用30分钟可保持活性85％。可是产业化进展较为缓慢，产量很低。

目前国外高温中性蛋白酶研究主要集中在分子生物学与基因工程菌的构建，国内主要集中在菌种的选育、酶的分子生物学特性、酶的固定化技术及一般中性蛋白酶发酵技术等方面的研究，涉及高温中性蛋白酶研究的是中国科学院微生物研究所，该所进行了嗜热脂肪芽孢杆菌HY-69高温中性蛋白酶酶学特性研究，该酶最适pH7.5，最适反应温度85℃，90℃时酶活半衰期为22分钟，80℃保温3小时酶活仍保持60％，可是至今未有产业化方面的报道。另外，国内外也有通过酶的固定化技术来提高中性蛋白酶的热稳定性的研究，但此方法会改变酶的pH作用范围。

发明内容

针对常温中性蛋白酶反应温度低，热稳定性差的缺点，本发明根据生物与环境相适应的原理，在极度干旱、极度炎热的新疆吐鲁番地区高盐碱土壤中分离出一批耐高温、抗盐碱的微生物菌株，从中筛选出一株编号为XJT9503的菌株，从而提供了一种高温中性蛋白酶菌株，其具有高产率生产高温中性蛋白酶的优良特性，经微生物学鉴定，定为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)。

同时，在本发明的地衣芽孢杆菌的基础上，本发明提供了一种高温中性蛋白酶的生产工艺，该工艺已具备规模工业化生产能力。

本发明还提供了一种高温中性蛋白酶以及含有其的酶制剂。

本发明提供了一种高温中性蛋白酶菌株，命名为XJT9503，其能够以高产率产生高温中性蛋白酶。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，邮编：100080。保藏日期是2002年10月14日，保藏号是CGMCCNo.0800。该菌能利用葡萄糖产酸，也能利用L-阿拉伯糖，D-甘露糖，D-木糖，水解淀粉，液化明胶，分解酪素，能利用柠檬酸盐生长，不产生吲哚，并能在15％氯化钠高盐度下生长。可在较大温度范围25℃-55℃内生长，最适生长温度为45℃，生长pH范围为6-10，最适生长范围为6-8。依照伯杰氏系统细菌学手册第二卷，XJT9503菌为芽孢杆菌属中的成员，定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。本发明进一步建立菌种保藏、复壮及选育的系统工艺流程技术。

(一)菌种保藏：菌种在矿物油和真空冷冻条件下进行了保藏试验。其效果如表1所述：

表1 不同保藏方法对菌株存活率的影响

  处理方法    7天    1个月    6个月  矿物油    99％    98％    80％  真空保藏    99％    99％    99％

(二)菌种活化：取保存菌株，用接种针刮取或挑取少量接于固体LB上，在适合菌株生长的温度下培养一定时间后，连续活化数次，并进行菌株产酶能力的测定。

(三)菌种复壮：在中试中，确定了一套保持产酶特性稳定菌株筛选的流程。

依次在液体LB和固体LB中接种活化好的菌并进行培养，检测该菌特性，选取优良菌株接种于斜面培养基上培养，并将此菌株用摇瓶进行发酵实验，以检测其产酶能力。检测其产酶能力未发生退化后，此菌株可作为生产菌株使用。

本发明提供一种高温中性蛋白酶的生产工艺，其包括：

A：对地衣芽孢杆菌(CGMCC.No.0800)进行菌种活化培养步骤；

B：利用步骤A获得的活化菌种进行发酵步骤；

C：发酵后的提取步骤。

发酵过程中，以选择高温中性蛋白酶产量高时的条件为优选条件。优选发酵接种量约1％-15％，温度约42-49℃，通气量约1∶0.25-0.6vvm，搅拌速度约为100-350rpm，发酵酶活达6000u/ml以上，还原糖0.5％以下时，发酵结束，一般情况，发酵周期15-32小时。

在发酵罐发酵工艺上，可采用常规单批发酵工艺，也可进一步采用流加工艺。在本发明的一个实施方式中，采用常规单批发酵可使发酵酶活达8000u/ml，在本发明的另一个实施方式中，在采用流加工艺后，对发酵过程中碳源与氮源的代谢进行调控可使单批发酵酶活提高到11000 u/ml以上。

在发酵过程中，培养基是发酵工艺的基础。本发明在实验中，利用摇瓶发酵对发酵培养基进行筛选与优化，并对菌种活性进行检测。本着高产率、低成本的原则，在实验室的基础上进行了工业化中试研究的培养基筛选和优化。本发明的地衣芽孢杆菌(CGMCC.No.0800)对培养基的营养源并无特殊的规定，可使培养基中含有常规的用于微生物培养的碳源、氮源。例如，XJT9503菌株可以葡萄糖、麦芽糖、玉米粉、淀粉等作碳源，生长并产酶。其中，以葡萄糖为碳源菌体生长最快，但使用玉米粉可使该菌株的产酶量最大。可利用氨水、蛋白胨、豆饼粉、玉米浆等作为氮源使用，但豆饼粉为最佳氮源，其获取、使用容易，且可使生产菌株达最大的产酶量。

通过实验证明，金属离子对发酵有一定的作用，Cu离子、Al离子、Fe离子对产酶具有不同的抑制作用，Na、Zn离子对产酶无显著作用，而Ca、Mg离子对产酶具有促进作用，K离子可使菌体生长加快，有益于产酶。优选0.01％-1％的Ca、Mg和K离子。

在发酵过程中，物料灭菌与菌体代谢都会使发酵液pH发生较大的变化，因此，在发酵培养基中本发明使用磷酸盐调节发酵过程的pH变化，使用碳酸盐控制物料灭菌过程带来的pH变化。

本发明发酵中产生的发酵液由于物料性质和发酵过程中代谢副产物等原因，使发酵液粘度较高，这给酶的提取造成困难。因此对发酵酶液除掉固形物，降低粘度，便成为提取工艺的难点。根据发酵液与絮凝剂的性质，本发明通过大量的实验，通过絮凝剂的絮凝作用，解决了发酵液的粘度问题，且絮凝剂所产生的絮状物可通过分步离心法去除，得到澄清的发酵液，而发酵液酶活力基本不损失。本发明优选采用海藻酸钠处理发酵液。更优选采用0.1％-1％海藻酸钠处理发酵液。

发酵液经过预处理后可得到澄清的发酵处理液，但处理液量较大，若将发酵处理液浓缩，则可以减少下游提取工艺中原料的用量及处理液量，降低了生产成本，同时在液体酶的制备中大量减少了存贮空间。因此本发明对发酵液的浓缩进行了研究，通过大量的实验，得到优选实施方案。使用薄膜旋转浓缩器进行了母液加热浓缩实验，在一定温度负压条件下，可使发酵处理液浓缩数倍，其酶活力基本不损失。使用超滤机对母液进行了分子截留，效果良好。本发明提取工艺并无特别的限制，可以使用有机溶剂和中性盐沉淀等方法，优选采用硫酸铵沉淀的方法。本发明还可以在浓缩后的发酵处理液中加入辅料，经喷雾干燥塔一次性制得干粉酶制剂。喷雾干燥所得到的酶粉制剂为淡黄褐色，无结块、无潮解现象，粉粒细小。将发酵处理液浓缩技术与喷雾干燥相接合，可根据需要生产不同规格的酶制剂产品。本发明还可以在浓缩后的发酵处理液中加入防腐剂，低温密封，获得液体酶制剂。

本发明同时提供了利用高温中性蛋白酶菌株(CGMCC.No.0800)，获得的高温中性蛋白酶，不仅具有一般中性蛋白酶特性，而且克服了常温中性蛋白酶反应温度低，热稳定性差的缺点。本发明提供的高温中性蛋白酶具有良好的热稳定性、酶活高，可使中性蛋白酶的应用温度提高20℃，且产品已具备规模工业化生产能力。本领域普通技术人员已知，高温中性蛋白酶指蛋白酶的反应温度较高，一般反应温度50-70℃，在中性条件下反应，一般pH5.0-8.0。本发明的高温中性蛋白酶是生产菌株(CGMCC.No.0800)的代谢产物，通过对发酵培养基及发酵工艺参数的优化，在发酵醪液中富集高温中性蛋白酶分子，并利用酶分子的物化性质进行产物分离。本发明的高温中性蛋白酶，最适反应温度为65℃，最适作用pH7.0-7.2；分子量：酶用SDS-PAGE凝胶电泳检测，与标准蛋白相比较，测定分子量为40000；等电点：酶经聚丙烯酰胺等电聚焦电泳测定，酶分子的等电点为6.8；金属离子对酶的作用：Ca离子与Mg离子对酶分子有激活作用，而Cu离子、Fe离子、Al离子及Zn离子对酶分子的活性有不同程度的抑制作用；酶的半衰期：在50℃保温1小时，酶活力下降10％，在60℃下酶的半衰期45分钟。

本发明在中试阶段，制得酶固体粉制剂与液体制剂，产品质量符合国家相关行业标准Q/GB1805.3-93。其中，固体酶制剂呈淡黄褐色，无结块，无潮解现象，酶总收率大于60％；每克酶活力约为5-21.8万单位；保存约210-575天。

本发明获得的50000u/g-150000u/g的固体粉酶制剂产品，其发酵处理液的收率可达70％；本发明已获得30000u/g-100000u/g的液体酶制剂，液体酶收率可达90-94％。

目前，本发明已经完成中试实验，并通过科技部“中国生物工程中心”专家委员会鉴定验收。采用国家相关行业标准GB1805.3-93进行检测。进行了250升发酵罐35批次的发酵中试，平均酶活在8000u/ml以上；进行了3吨发酵罐11批次其中连续8个批次的发酵中试，酶活稳定在11000u/ml以上，最高发酵酶活达到11970u/ml；在科技部“中国生物工程中心”两名专家现场监督下，进行了10吨发酵罐连续2个批次的发酵中试，酶活稳定在14000u/ml以上，最高发酵酶活达到14934u/ml。已制得固体酶粉制剂与液体酶制剂，固体酶制剂收率在60％以上，液体酶可达90-94％。其保存效果如表2、表3和表4所述：

表2液体酶保藏效果：

  时间(天)    0天    10天    40天    105天 酶活(u/ml)    3096    2944    3008    2568 损失率(％)    0    4.9    2.8    17

表3食品级固体酶制剂保存效果：

时间(天)  0  30  60  180  210酶活(u/g)  111230  111230  111230  111230  109005损失率(％)  0  0  0  0  2

表4工业级固体酶制剂保存效果：

时间(天)  0    30    60    180    210酶活(u/g)  153230    153200    150165    145569    140972损失率(％)  0    0    2    5    8

有益效果：

A、定向筛选到XJT9503高温中性蛋白酶高产菌株经鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，并建立菌种保藏、复壮及选育的系统工艺流程技术。利用本发明的菌株发酵获得的高温中性蛋白酶具有反应温度高，热稳定性好的特点。

B、通过本发明优选实施方案，例如培养基配方及发酵工艺条件的优化，确立了XJT9503生产菌株稳定的发酵工艺，使发酵周期由36小时减少到16小时左右，3吨发酵罐酶活稳定在11000u/ml以上，最高发酵酶活达11970u/ml；10吨发酵罐酶活稳定在14000u/ml以上，最高发酵酶活达14934u/ml，超过原定计划指标(10000u/ml)，成本较计划指标降低30％以上。

C、利用建立的XJT9503高温中性蛋白酶发酵液预处理、浓缩、喷雾干燥等完整的提取工艺，生产出的酶制剂质量达到部颁行业优质标准。减少了环境污染，降低成本。

附图说明

图1显示本发明高温中性蛋白酶酶活力测定方法流程图。

图2显示发酵流程图1。

图3显示发酵流程图2。

具体实施方式

实施例1  本发明选用菌种的保藏与复壮

在吐鲁番地区分离得到了一株高温中性蛋白酶产生菌XJT9503，经鉴定为芽孢杆菌(CGMCC No.0800)，所产生的高温中性蛋白酶最造反应温度65℃，60℃下酶的半衰期约45分钟。

采用两种方法进行菌种保藏，即液体石蜡保藏法和真空冷冻干燥法。前者用于菌种短期保存(3-6个月)，后者用于生产菌种的长期保藏(6个月-数年)。

保存菌种的活化：取保存菌株，用接种针挑取菌种接种装有2毫升无菌水的试管中，振荡10分钟。然后用无菌吸管取0.2毫升加到斜面培养基(牛肉膏，3g；蛋白胨，10g；氯化钠，5g；琼脂，15-20g；水，1000ml；pH：7.0-7.2)平板培养基上，再用玻璃刮铲涂匀，置46℃温箱中培养12小时后取出培养基平板。

高产菌株的筛选：将活化好的菌种接种于液体LB培养基中，于46℃、150rpm下培养12小时，以无菌水将其稀释为10^-12涂布于固体LB培养基平板上，于46℃下培养，再挑取单菌落接种于固体LB筛选培养基上，过夜培养，检测其菌斑与菌落径比大小，比值大的为高产菌株，将其再接种于斜面培养基(同上)上，46℃培养12小时，于4℃下保存，同时将此菌株用摇瓶进行发酵实验，以检测其产酶能力(见下)。检测其产酶能力未发生退化者可作为生产菌株使用。

1)XJT9503高温中性蛋白酶酶活力检测方法

——根据中华人民共和国轻工业部于1993-07-29发布，并于1994-03-01实施的《(中华人民共和国行业标准》QB/T 1803、1804-93，QB/T1805、1806-93，工业酶制剂通用试验方法，及XJT9503高温中性蛋白酶特性，在测试过程中温度定为65℃、pH为7.2。

(1)定义

1克固体酶粉(或1ml液体酶)，在一定温度下和pH条件下，1分钟水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以u/g(u/ml)表示。

(2)福林法

2.1原理

XJT9503高温中性蛋白酶在65℃，pH7.2条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸，在碱性条件下，将福林试剂(Folin)还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度计测定，计算其酶活力。

2.2试剂与溶液

2.2.1福林试剂的制备

于2000L磨口回流装置中加入钨酸钠(Na₂WO₄·2H₂O)100g、钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)25g、水700ml、85％磷酸50ml、浓盐酸100ml，小火沸腾回流10小时，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂(Li₂SO₄)50g、水50ml和数滴浓溴水(99％)，再微沸15分钟，以除去多余和溴(冷后仍有绿色需再加溴水)，冷却，加水定容至1000ml。混匀，过滤。制得的试剂应呈金黄色，贮于棕色瓶内。

使用溶液：一份福林试剂与两份水混合，摇匀。

2.2.2碳酸钠溶液c(Na₂CO₃)＝0.4mol/L

称取无水碳酸钠(Na₂CO₃)42.4g，用水溶解并定溶至1000ml。

2.2.3三氯乙酸c(CCl₃COOH)＝0.4mol/L

称取三氯乙酸(CCl₃COOH)65.4g，用水溶解并定溶至1000ml。

2.2.4 0.02M、pH7.2磷酸缓冲液的配制

称取磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)4.90g和磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O)0.99g，加水溶解并定溶至1000ml。

2.2.5 50g/L酪素溶液

称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液湿润后，加入适量的pH7.2的磷酸缓冲液约80ml，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100ml容量瓶中，用适量的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液于冰箱中保存，有效期为三天。

2.2.6 100ug/ml L-酪氨酸标准溶液

a.称取恒重的L-酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸60ml溶解后定溶至100ml，即为1mg/ml酪氨酸标准溶液。

b.取1mg/ml酪氨酸标准溶液10.00ml，用0.1mol/L盐酸定溶至100ml，即得到100ug/ml

2.3仪器和设备

2.3.1恒温水浴65±0.2℃、40±0.2℃。

2.3.2分光光度计应符合GB 9721的规定。

2.2.4测定步骤

2.2.4.1标准曲线的绘制

a.L-酪氨酸标准溶液

按下表配制

管号 酪氨酸标准溶液浓度ug/ml 取100ug/ml酪氨酸标准溶液体积ml 取水的体积ml 0 0 0 10 1 10 1 9 2 20 2 8 3 30 3 7 4 40 4 6 5 50 5 5

b.分别取上述溶注液各1.00ml(须做平行试验)，各加0.4mol/ml碳酸钠溶液5.00ml、福林试剂1.00ml，置于40℃水浴中显色20分钟，取出用分光光度计于波长680nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的0号管为空白，分别测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线(此线应通过零点)。

根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量(ug)，即为吸光常数K值。其K值应在100左右。

2.2.4.2待测酶样的制备与测定

a.称取酶粉1-2g，精确至0.0002g(或吸取液体酶1.00ml)，用少量pH7.2的磷酸缓冲液溶解，并用捣研，然后将上清液倾入容量瓶中，沉渣中再添加适量缓冲液，研捣3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀，用四层纱布过滤，滤液根据酶活力再一次用缓冲液稀释至适当的浓度，供测试用(稀释至测试液吸光值在0.25-0.45范围内)，稀释好的酶液置于冰箱中保存。

酶粉测定时，稀释倍数参考表：

酶活单位稀释倍数第一次稀释第二次稀释2万2000 2g→200ml(100倍)5ml→100ml(20倍)3万2500 2g→500ml(250倍)5ml→50ml(10倍)4万4000 2g→200ml(100倍)5ml→200ml(40倍)5万5000 2g→500ml(250倍)5ml→100ml(20倍)8、10万10000 2g→500(250倍)5ml→200ml(40倍)

b.测定

先将酪素溶液放入65℃恒温水浴中，预热5分钟。并按如图1所述的程序操作：

c.计算

      X＝A*K*4/10*N

式中：X-样品的酶活力，u/ml(u/g)；

      A-样品平行试验的平均吸光度；

      K-吸光常数；

      4-反应试剂的总体积，ml；

      10-反应时间10分钟，以分钟计；

      N-稀释倍数。

      所测定的结果表示为整数。平行试验相对误

      差不超过3％。

实施例2、本发明发酵培养基的筛选

培养基是发酵工艺技术的基础，本着高产酶率、低成本的原则，在实验室研究的基础上进行了工业化中试研究的培养基筛选和优化。碳源选择玉米粉，氮源为豆饼粉，并加入0.01％-1％Ca、Mg和K离子，促进菌体生产和产酶率的提高，并以磷酸盐和碳酸盐调节培养基在发酵过程中pH的变化。

1、筛选培养基

    名称    用量    牛肉膏    3g    蛋白胨    10g    氯化钠    5g    琼脂    15-20g    酪素    5g    水    1000ml

注：pH7.0-7.2，酪素需完全溶解。

2、摇瓶检测培养基

    名称    用量(％)    葡萄糖    6    玉米粉    3    磷酸氢二钠    0.4    硫酸镁    0.02    氯化钙    0.02

于45-46℃、240转/分钟、200ml物料/瓶(500ML摇瓶)、加棉塞，培养60小时，4000rpm离心去菌体，检测发酵液酶产量，当酶产量达3000u/ml以上时，证明菌生产能力符合生产要求。

3、种子培养基与发酵培养基

a.种子罐培养基

    名称    用量(％)    玉米粉    2    豆饼粉    1    磷酸氢二钠    0.4    硫酸镁    0.02    氯化钙    0.02    鱼粉    0.4    消泡剂(泡敌)    0.03

b.发酵罐培养基

    名称    用量(％)    玉米粉    3    葡萄糖    0.5    豆饼粉    1.5    鱼粉    0.2    磷酸氢二钠    0.4    硫酸镁    0.02    氯化钙    0.02    碳酸钠    0.085    消泡剂(泡敌)    0.03

实施例3、本发明的摇瓶、7升和25升发酵工艺研究

在摇瓶(采用上述筛选培养基)试验中发现摇床转速和三角瓶装料量对该酶的产率有较大影响，在一定范围内提高摇床转速可使酶的产率提高；500ml三角瓶装150ml培养基较装200ml培养基的产酶率高，这说明XJT9503菌的产酶率与溶氧量在一定范围内成正相关。

在7升自动发酵罐(采用上述摇瓶检测培养基)上经过数十批次试验证明了产酶率与溶氧的相关性，确定了优化工艺，发酵温度45-46℃，通气量1∶0.6vvm，搅拌速度为350rpm，罐压为0.1MPa，发酵周期32小时，产酶率达6000u/ml；在25升发酵罐上优化工艺试验进一步证实了7升发酵罐的结果。

实施例4、本发明的250升自动发酵罐发酵工艺的研究

参照附图2所述的流程，在250升发酵罐上进行35批次优化工艺技术试验研究，最终研定的工艺是接种量5％，温度46℃，通气量1∶0.45nnm，搅拌转速220rpm，发酵周期16-18小时，平均酶活为8000u/ml以上。

250升发酵罐流加工艺是提高发酵产品产率的有效手段之一，可以有效解决发酵过程中菌体生长与代谢产物的矛盾。XJT9503高温中性蛋白酶产生菌在产酶高峰期糖的代谢较为缓慢，但在产酶阶段糖的浓度和菌体量与酶的产率直接相关。实验中发现在产酶阶段只流加糖会造成菌体由产酶转变为菌体生长，不利于酶产率提高。在产酶阶段不流加糖，只而单独流加氮源酶产率不见提高。这就说明，在产酶阶段需要适当补充碳源和氮源。因此本发明在发酵过程中根据pH变化，流加一定量的糖和氮源，酶的产率明显提高，达到10000u/ml以上。

实施例5、本发明的3吨发酵罐发酵工艺的研究

在250升发酵罐发酵工艺研究的基础上，进行3吨发酵罐工艺研究，对发酵培养基和工艺条件进一步优化，经过10余批次实验，都取得成功，以实施例1的方法测定酶活，酶活稳定在11000u/ml，最高达13000u/ml以上。

参照附图3所示的流程，将筛选的活化菌株接种于装有150ml种子培养液的500ml摇瓶中，置于46℃、转速240rpm下培养16小时后，以2％的接种量接种于25L种子罐，在46℃、转速100rpm、通气量1∶0.3vvm下培养8小时后移种于300升种子罐，再移种于3吨发酵罐，以46℃、转速180rpm、通气量1∶0.25vvm下发酵培养16-18小时，测定发酵酶产率达10000u/ml以上，残糖0.5％以下，并大量产生芽孢即可下罐。本发明确立的XJT9503生产菌株稳定的发酵工艺，3吨发酵罐酶活稳定在11000u/ml以上，最高发酵酶活达11970u/ml；10吨发酵罐酶活稳定在14000u/ml以上，最高发酵酶活达14934u/ml，超过原定计划指标(10000u/ml)，成本较计划指标降低30％以上。

实施例6、本发明提取工艺研究

1)本发明发酵液预处理工艺

本发明的发酵液由于物料性质和发酵过程中代谢副产物等原因，使发酵液粘度较高，这给酶的提取造成困难。因此对发酵酶液除掉固形物，降低粘度，便成为提取工艺的难点。发明人曾分别采取10000rpm高速离心、有机溶剂、高盐等方法处理，均未取得理想结果，不是酶液浑浊度降不下来，就是酶活力损失较大，或成本较高。后来在絮凝剂的选择和应用上有了突破，采用海藻酸钠处理发酵液得到理想结果。海藻酸钠所形成的凝聚物通过分步离心去除，得到澄清的酶液。本发明可以采用约0.1％-1％海藻酸钠处理发酵液。

2)本发明酶液浓缩工艺

本发明经预处理后发酵酶液进行浓缩是降低成本的关键性工艺。本发明采用薄膜真空浓缩，在40℃左右，约-0.094～-0.096Mpa真空度下，45-55分钟可将预处理液浓缩2-3倍，其酶活损失不超过10％。

3)本发明的高温中性蛋白酶及酶制剂的制备

本发明做了有机溶剂和中性盐沉淀的试验，得出以硫酸铵沉淀为最好。经预处理和浓缩的酶液，利用25％饱和度的硫酸铵沉淀去除大量杂蛋白，离心后再调节硫酸铵饱和度至55％，并加入1％的硅藻土过滤，风干。酶的总收率可达70％以上。另一种制备方法是，经预处理和浓缩的酶液加入7-9％氯化钠和1-2％可溶性淀粉等，再喷雾干燥，直接得到干酶粉制剂。酶粉呈淡黄褐色，无结块，无潮解现象。酶总收率68％左右。所制备的5万u/克-21.8u/克酶制剂达到部颁行业优质标准。从环保、成本和保存期考虑，这将是大规模工业化生产最佳酶制剂制备工艺。

液体酶制剂的制备过程简单，直接将发酵预处理液加入防腐剂低温密封即可。