公开/公告号CN1504481A
专利类型发明专利
公开/公告日2004-06-16
原文格式PDF
申请/专利权人 上海新世界基因技术开发有限公司;
申请/专利号CN02151030.X
申请日2002-12-04
分类号C07K14/00;C07H21/00;C12N15/63;A61K38/16;A61P35/00;
代理机构上海专利商标事务所;
代理人徐迅
地址 200122 上海市浦东新区张杨路500号23楼G座
入库时间 2023-12-17 15:26:25
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2008-01-30
专利权的终止(未缴年费专利权终止)
专利权的终止(未缴年费专利权终止)
2006-04-05
授权
授权
2004-08-25
实质审查的生效
实质审查的生效
2004-06-16
公开
公开
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及新的促凋亡基因BNIPL及其编码蛋白。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备方法。BNIPL可抑制肝癌细胞生长和促进癌细胞凋亡。
背景技术
BNIP2的全称是Bcl-2/adenovirus E1B 19 kD interacting protein 2(简称BNIP2)，是一个能与细胞抗凋亡蛋白Bcl-2和病毒抗凋亡蛋白E1B 19 kD相互作用的蛋白。BNIP是一家族，共有BNIP1、BNIP2和BNIP3三个成员(Boyd JM，et al.Cell.1994 Oct 21；79(2)：341-51)，该家族是细胞凋亡通路中的重要成员。BNIP2可以和cdc42、cdc42GAP、Bcl-2和Flg发生结合和相互作用，促进细胞凋亡(Low BC，et al.J Biol Chem.1999 Nov 12；274(46)：33123-30.J Biol Chem.2000 May 12；275(19)：14415-22.J Biol Chem.2000 Dec 1；275(48)：37742-51)。
癌症是危害人类健康的主要疾病之一。为了有效地治疗和预防肿瘤，目前人们已越来越关注肿瘤的基因治疗。因此，本领域迫切需要开发研究具有抑癌作用的蛋白或促调亡蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供一类新的具有抑癌和促调亡作用的蛋白BNIPL以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种分离的BNIPL多肽，它包含具有SEQ IDNO：2的氨基酸序列的多肽，或其具有BCH结构域的保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物，条件是所述的多肽序列不是SEQ ID NO：4。
较佳地，所述的多肽选自下组：(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促进人肝癌细胞调亡功能的由(a)衍生的多肽。
在另一优选例中，所述的促调亡蛋白含有SEQ ID NO：2中215-357位的氨基酸序列，条件是所述的多肽序列不是SEQ ID NO：4。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少85％相同性：(a)编码上述的BNIPL多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码的多肽具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。更佳地，该多核苷酸的序列选自下组：(a)SEQ ID NO：1中1-2146位的序列；和(b)SEQ ID NO：1中第158-1228位的序列。
在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了制备具有人BNIPL活性的多肽的制备方法，该方法包含：(a)在适合表达的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有人BNIPL活性的多肽。
在本发明的第五方面，提供了与上述的BNIPL多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的20-1000个核苷酸。
在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的BNIPL多肽以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗癌症以及细胞异常增殖等病症。
在本发明的第七方面，提供了一种促调亡蛋白，它含有SEQ ID NO：2中215-357位的氨基酸序列，条件是所述的多肽序列不是SEQ ID NO：4。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1是BNIPL与cdc42GAP和BNIP2的序列比对图。它们具有共同的BCH功能域。
图2显示在BCH功能域内，BNIPL与cdc42GAP和BNIP2共同具有的“精氨酸”模块。
图3是BNIPL的表达谱。
图4是BNIPL的体外翻译的电泳照片。泳道1为无模板对照；泳道2为PinPointTM Control DNA(CAT融合蛋白，分子量约39kDa)；泳道3为pT7X-BNIPL(分子量约41kDa)。
图5显示了用兔抗BNIPL抗血清，对BNIPL在人细胞株中的表达进行Western blot分析的结果。其中，L02为人肝细胞株；NCIH446为人小细胞肺癌细胞株；SMMC7721为人肝癌细胞株；BEL7402为人肝癌细胞株。
图6显示了BNIPL的酵母双杂交结果(图6a)和Pull-down实验结果(图6b-d)。
图7显示了含有BCH结构域的蛋白(包括BNIPL)具有促调亡功能。
图8是大肠杆菌表达BNIPL的电泳图。
具体实施方式
本发明采用大规模cDNA克隆转染癌细胞，在获得具有抑癌作用的基础上，首次分离得到BNIPL的全长cDNA克隆。试验证明，本发明的人BNIPL对癌细胞(肝癌细胞)具有抑制克隆形成的作用，并且有促进癌症细胞调亡的作用。在此基础上完成了本发明。
简而言之，本发明人从胎盘cDNA文库中分离出一个与BNIP2在氨基酸序列有较高同源的新基因，命名为BNIPL(Bcl-2/adenovirus E1B 19 kDinteracting protein 2 like，BNIP2 like，BNIPL)。序列分析表明，BNIPL含2146bp，开放阅读框为1074bp，编码357个氨基酸，预计分子量为39kD。经生物信息学同源比较分析，发现BNIPL与BNIP2在全蛋白水平上有较高的同源性(Identity 45％，Positive 69％)。BNIPL包含一个在BNIP2和cdc42GAP中都存在的BCH功能域(BNIP2-cdc42GAP homology，BCH)，另外，BNIPL还包含一个在Rho蛋白家族中非常保守的精氨酸斑模块(arginine-patch motif)。实验证实了BNIPL可抑制肝癌细胞生长和促进癌细胞凋亡。因此，BNIPL是一个具有功能的新基因，并在肿瘤治疗中具有应用价值。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的BNIPL或多肽”是指BNIPL多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化BNIPL。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括人BNIPL的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人BNIPL相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。一类特别优选的片段是含有SEQ ID NO：2中215-357位的BCH结构域的片段。
在本发明中，术语“人BNIPL多肽”或“人BNIPL蛋白多肽”可互换使用，都指具有人BNIPL活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与人BNIPL相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人BNIPL的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人BNIPL DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人BNIPL多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人BNIPL多肽或其片段的融合蛋白(如包含SEQ IDNO：2所示序列的融合蛋白)。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人BNIPL多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人BNIPL多肽序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供人BNIPL或多肽的类似物。这些类似物与天然人BNIPL多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“人BNIPL保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表 A
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：3所示的编码区序列(第158-1228位)相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述核酸序列杂交且两个序列之间具有至少60％，较佳地至少80％，更佳地至少85％，最佳地至少90％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码人BNIPL的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的DNA序列能用几种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离DNA。这些技术包括但不局限于：1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源性核苷酸序列，和2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的DNA片段。
编码人BNIPL的特异DNA片段序列产生也能用下列方法获得：1)从基因组DNA分离双链DNA序列；2)化学合成DNA序列以获得所需多肽的双链DNA。
分离感兴趣的cDNA的标准方法是从高表达该基因的供体细胞分离mRNA并进行逆转录，形成质粒或噬菌体cDNA文库。提取mRNA的方法已有多种成熟的技术，试剂盒也可从商业途径获得(Qiagene)。而构建cDNA文库也是通常的方法(Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory.New York，1989)。还可得到商业供应的cDNA文库，如Clontech公司的不同cDNA文库。当结合使用聚合酶反应技术时，即使极少的表达产物也能克隆。
可用常规方法从这些cDNA文库中筛选本发明的基因。这些方法包括(但不限于)：(1)DNA-DNA或DNA-RNA杂交；(2)标志基因的功能出现或丧失；(3)测定人BNIPL的转录本的水平；(4)通过免疫学技术或测定生物学活性，来检测基因表达的蛋白产物。上述方法可单用，也可多种方法联合应用。
在第(1)种方法中，杂交所用的探针是与本发明的多核苷酸的任何一部分同源，其长度至少15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸。此外，探针的长度通常在2kb之内，较佳地为1kb之内。此处所用的探针通常是在本发明的基因DNA序列信息的基础上化学合成的DNA序列。本发明的基因本身或者片段当然可以用作探针。DNA探针的标记可用放射性同位素，荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等。
在第(4)种方法中，检测人BNIPL基因表达的蛋白产物可用免疫学技术如Western印迹法，放射免疫沉淀法，酶联免疫吸附法(ELISA)等。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本发明的基因，或者各种DNA片段等的核苷酸序列的测定可用常规方法如双脱氧链终止法(Sanger et al.PNAS，1977，74：5463-5467)。这类核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的cDNA序列，测序需反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列，才能拼接成全长的cDNA序列。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或人BNIPL编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的人BNIPL多肽。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码人BNIPL的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，人BNIPL多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J BioChem.263：3521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人BNIPL编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a LaboratoryManual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可包被于细胞内、细胞外或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的人BNIPL或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：直接做为药物治疗人BNIPL功能低下或丧失所致的疾病(尤其是用于抑制肿瘤生长，尤其是用于治疗肝癌)，和用于筛选促进或对抗人BNIPL功能的抗体、多肽或其它配体。例如，抗体可用于激活或抑制人BNIPL的功能。用表达的重组人BNIPL筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激人BNIPL功能的多肽分子。
本发明也提供了筛选药物以鉴定提高(激动剂)或阻遏(拮抗剂)人BNIPL的药剂的方法。激动剂提高人BNIPL刺激细胞增殖等生物功能，而拮抗剂阻止和治疗与细胞过度增殖有关的紊乱如各种癌症。例如，能在药物的存在下，将哺乳动物细胞或表达人BNIPL的膜制剂与标记的人BNIPL一起培养。然后测定药物提高或阻遏此相互作用的能力。
人BNIPL的拮抗剂包括筛选出的抗体、化合物、受体缺失物和类似物等。人BNIPL的拮抗剂可以与人BNIPL结合并消除其功能，或是抑制人BNIPL的产生，或是与多肽的活性位点结合使多肽不能发挥生物学功能。
本发明的多肽可直接用于疾病治疗，例如，各种恶性肿瘤和细胞异常增殖等。
本发明的多肽，及其片段、衍生物、类似物或它们的细胞可以用来作为抗原以生产抗体。这些抗体可以是多克隆或单克隆抗体。多克隆抗体可以通过将此多肽直接注射动物的方法得到。制备单克隆抗体的技术包括杂交瘤技术，三瘤技术，人B-细胞杂交瘤技术，EBV-杂交瘤技术等。
可以将本发明的多肽和拮抗剂与合适的药物载体组合后使用。这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合。组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。这些组合物可以作为药物用于疾病治疗。
本发明还提供含有一种或多种容器的药盒或试剂盒，容器中装有一种或多种本发明的药用组合物成分。与这些容器一起，可以有由制造、使用或销售药品或生物制品的政府管理机构所给出的指示性提示，该提示反映出生产、使用或销售的政府管理机构许可其在人体上施用。此外，本发明的多肽可以与其它的治疗化合物结合使用。
药物组合物可以以方便的方式给药，如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内的给药途径。人BNIPL以有效地治疗和/或预防具体的适应症的量来给药。施用于患者的人BNIPL的量和剂量范围将取决于许多因素，如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断。
人BNIPL的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗癌症。BNIPL的核苷酸序列可作为恶性肿瘤基因治疗的治疗基因，包括应用脂质体(Lipoplex)复合多肽型非病毒载体(Polyplex)、裸DNA、腺病毒及反转录病毒重组体。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将人BNIPL基因转移至细胞内。构建携带人BNIPL基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组人BNIPL基因可包装到脂质体中转移至细胞内。
抑制人BNIPL mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。
多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。
本发明还提供了针对人BNIPL抗原决定簇的抗体。这些抗体包括(但不限于)：多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库产生的片段。
抗人BNIPL的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人BNIPL。
与人BNIPL结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪其位置和分布。这种放射性标记的抗体可作为一种非创伤性诊断方法用于肿瘤细胞的定位和判断是否有转移。
本发明中的抗体可用于治疗或预防与人BNIPL相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断人BNIPL的产生或活性。
抗体也可用于设计针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如人BNIPL高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭人BNIPL阳性的细胞。
多克隆抗体的生产可用人BNIPL或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
人BNIPL单克隆抗体可用杂交瘤技术生产。将人恒定区和非人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术生产(Morrison et al，PNAS，1985，81：6851)。而已有的生产单链抗体的技术也可用于生产抗人BNIPL的单链抗体。
能与人BNIPL结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对人BNIPL分子进行标记。
本发明还涉及定量和定位检测人BNIPL水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人BNIPL水平，可以用作解释人BNIPL在各种疾病中的重要性和用于诊断人BNIPL起作用的疾病。
人BNIPL的多聚核苷酸可用于人BNIPL相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，人BNIPL的多聚核苷酸可用于检测人BNIPL的表达与否或在疾病状态下人BNIPL的异常表达。如人BNIPLDNA序列可用于对活检标本的杂交以判断人BNIPL的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用人BNIPL特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测人BNIPL的转录产物。
检测人BNIPL基因的突变也可用于诊断人BNIPL相关的疾病。人BNIPL突变的形式包括与正常野生型人BNIPL DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。该序列会特异性地针对某条人染色体具体位置且并可以与其杂交。目前，需要鉴定染色体上的各基因的具体位点。现在，只有很少的基于实际序列数据(重复多态性)的染色体标记物可用于标记染色体位置。根据本发明，为了将这些序列与疾病相关基因相关联，其重要的第一步就是将这些DNA序列定位于染色体上。
简而言之，根据cDNA制备PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。
体细胞杂合细胞的PCR定位法，是将DNA定位到具体染色体的快捷方法。使用本发明的的寡核苷酸引物，通过类似方法，可利用一组来自特定染色体的片段或大量基因组克隆而实现亚定位。可用于染色体定位的其它类似策略包括原位杂交、用标记的流式分选的染色体预筛选和杂交预选，从而构建染色体特异的cDNA库。
将cDNA克隆与中期染色体进行荧光原位杂交(FISH)，可以在一个步骤中精确地进行染色体定位。此技术的综述，参见Verma等，Human Chromosomes：aManual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦序列被定位到准确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如，V.Mckusick，MendelianInheritance in Man(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。
接着，需要测定患病和未患病个体间的cDNA或基因组序列差异。如果在一些或所有的患病个体中观察到某突变，而该突变在任何正常个体中未观察到，则该突变可能是疾病的病因。比较患病和未患病个体，通常涉及首先寻找染色体中结构的变化，如从染色体水平可见的或用基于cDNA序列的PCR可检测的缺失或易位。根据目前的物理作图和基因定位技术的分辨能力，被精确定位至与疾病有关的染色体区域的cDNA，可以是50至500个潜在致病基因间之一种(假定1兆碱基作图分辨能力和每20kb对应于一个基因)。
本发明的人BNIPL核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中的各种DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
鉴于BNIPL具有抑制癌细胞生长的作用，因此它不仅有调控细胞分裂和促进癌细胞凋亡的作用，而且具有对恶性肿瘤治疗与诊断的应用价值。此外，由于本发明的人BNIPL具有源自人的天然氨基酸序列，因此与来源于其他物种的同族蛋白相比，预计在施用于人时将具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人体内的免疫原性更低或没有)。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：BNIPL cDNA克隆的分离及对人肝癌细胞的生长抑制
取3、6、10月龄的胎盘组织，用Trizol试剂(GIBCO BRL公司)按厂方说明书提取总RNA，用mRNA提纯试剂盒(pharmacia公司)提取mRNA。用pCMV-script TMXR cDNA文库构建试剂盒(Stratagene公司)构建上述mRNA的cDNA文库。其中反转录酶改用MMLV-RT-Superscript II(GIBCO BRL)，反转录反应在42℃进行。转化XL 10-Gold感受态细胞，获得了1×106cfu/μg cDNA滴度的cDNA文库。第一轮随机挑取cDNA克隆，其后以高丰度cDNA克隆和已证明有抑癌细胞生长功能的cDNA克隆为探针，杂交筛选cDNA文库，挑取弱阳性及阴性克隆。用Qiagen 96孔板质粒抽提试剂盒，按厂家说明书进行质粒DNA的提取。质粒DNA和空载体同时转染肝癌细胞系7721。100ng DNA酒精沉淀干燥后，加6μl H2O溶解，待转染。每份DNA样品中加0.74μl脂质体及9.3μl无血清培液，混匀后，室温放置10分钟。每管中加150μl无血清培液，均分加入3孔生长于96孔板的7721细胞中，37℃放置2小时，每孔再加50μl无血清培液，37℃24小时。每孔换100μl全培液，37℃24小时，换含G418的全培液100μl，37℃24-48小时，边观察，边换G418浓度不等的培液。约2-3次后，直到镜检细胞有克隆形成，计数。结果发现有一个cDNA克隆有抑制克隆形成的功能(空载体克隆形成数为50、26、31，cDNA克隆为0、0、0)。
对cDNA克隆序列分析后发现基因尚不完整，采用Clontech公司SMART RACEcDNA扩增试剂盒(Cat.No.K1811-1)，设计并合成以下基因特异引物：
5’ATTCAGCCTTCCGTCCCAGCAACTG 3’(SEQ ID NO：5)
5’CCCAGCAGATCAGTTTCCCAGCCTC 3’(SEQ ID NO：6)
按说明书进行SMART RACE反应，获得全长克隆，命名为BNIPL。其全长序列如SEQ ID NO：1所示，共2146个核苷酸。在157-1228位含有一个ORF，编码一个全长为357个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO：2)，预测分子量为39710.55Da。
MGTIQEAGKK TDVGVREIAE APELGAALRH GELELKEEWQ DEEFPRLLPE EAGTSEDPED 60
PKGDSQAAAG TPSTLALCGQ RPMRKRLSAP ELRLSLTKGP GNDGASPTQS APSSPDGSSD 120
LEIDELETPS DSEQLDSGHE FEWEDELPRA EGLGTSETAE RLGRGCMWDV TGEDGHHWRV 180
FRMGPREQRV DMTVIEPYKK VLSHGGYHGD GLNAVILFAS CYLPRSSIPN YTYVMEHLFR 240
YMVGTLELLV AENYLLVHLS GGTSRAQVPP LSWIRQCYRT LDRRLRKNLR ALVVVHATWY 300
VKAFLALLRP FISSKFTRKI RFLDSLGELA QLISLDQVHI PEAVRQLDRD LHGSGGT 357
(SEQ ID NO：2)
BNIPL先前称之为PP753B。提交国际人类基因组组织(Human GenomeOrgnization，HUGO)时，正式将该基因(PP753B)命名为BNIPL(Bcl-2/adenovirus E1B 19 kD interacting protein 2 like，BNIP2 like，BNIPL)。
实施例2：BNIPL cDNA的序列分析
(A)同源分析
在核苷酸和氨基酸水平上，BNIPL(也称为“BNIPL_v1”)与中国专利申请00125281.X中的NIP2相关蛋白(在本申请称为“BNIPL_v2”)有较高的同源性。BNIPL_v2的全长序列列于SEQ ID NO：3，全长氨基酸序列列于SEQ ID NO：4。
与BNIPL_v1序列相比，在BNIPL_v2中含有252bp序列的插入，插入位点对应于SEQ ID NO：1中第198位，插入序列对应于SEQ ID NO：3中154-405位。BNIPL_v2的序列中，插入252bp后造成蛋白提前终止。
因此，与BNIPL_v2相比，BNIPL_v1的氨基酸序列多了SEQ ID NO：2中第1-82位所示的82个氨基酸。
(B)氨基酸序列的motif分析
基序分析结果如图1所示。BNIPL与cdc42GAP(一种已知的细胞骨架蛋白和调亡相关蛋白)和BNIP2(一种已知的调亡相关蛋白)一样，都具有BCH结构域。
此外，在BCH功能域内，BNIPL与cdc42GAP和BNIP2共同具有的“精氨酸”模块(图2)。
实施例3：BNIPL在人组织中mRNA表达谱
用BNIPL基因为探针，与多种组织mRNA膜片(Clontech公司)进行杂交。
结果如图3所示。BNIPL在心、脑、胎盘、肺、肝、肌肉、胰中有表达，肾中无表达或较弱。
实施例4：BNIPL在体外翻译系统的表达
将实施例1用SMART RACE获得的具有完整编码区的BNIPL的全长序列，装载于pT-Adv载体(Clontech公司)中，得到含BNIPL完整编码序列的pT-Adv/BNIPL质粒。用BamH I和Not I双酶切pT-Adv/BNIPL质粒，回收含BNIPL完整编码序列的酶切片段，并亚克隆于含T7启动子的表达载体，采用E.coli T7S30 Extract System for Circular DNA(Promega，Cat#L1130)，并利用TranscendTM Colorimetric Translation Detection System(Promema，Cat.#L5070)，体外表达BNIPL。
1.建立体外翻译反应体系：
质粒DNA： 1-4μg
完全氨基酸tRNA混合液： 5μl
无氨基酸的S30预混合液： 20μl
TranscendTMtRNA*： 1μl
T7S30细胞裂解液： 15μl
无核酸酶无菌水加至终浓度： 50μl
*TranscendTM tRNA是ε-NH2被生物素标记的Lys-tRNA。
37℃反应1-2小时。
2.体外翻译产物的分析：
SDS-PAGE电泳分析：15％分离胶，4％浓缩胶。
电转移至PVDF：100V，60分钟。
利用Streptavidin-Alkaline Phosphatase(链霉抗生物素-碱性磷酸脂酶)结合含生物素的翻译蛋白，并通过Western Blue Stablized Substrate forAlkaline Phosphatase(碱性磷酸脂酶固定化染色剂)显色。
结果如图4所示。正对照样品CA7融合蛋白表达质粒在39KD处有蛋白条带(泳道2)，BNIPL表达质粒pT7X-BNIPL在41KD处有蛋白条带(泳道3)。这表明BNIPL在体外表达系统中获得了表达。
实施例5.BNIPL的原核表达
构建原核重组表达载体：pET32a(+)/BNIPL_v1和pET32a(+)/BNIPL_v2。方法如下：
合成正向引物TTAAATGGGAACTATACAAGA(含BamH I位点)(SEQ IDNO：7)和反向引物AGATTTATCCAGTCCTGTG(含Xho I位点)(SEQ ID NO：8)，以常规方法抽提和反转录获得人胎盘cDNA为模板，经PCR扩增，经BamH I和Xho I双酶切后，连入相同酶切的pET32a(+)原核表达载体(NOVAGEN公司)，获得pET32a(+)/BNIPL_v1。测序验证阅读框架正确。
用相同方法和以下引物：正向引物GGAATTCATGCGCAAGCGTCTTTCT(含EcoRI位点)(SEQ ID NO：9)，反向引物为SEQ ID NO：8，以常规方法抽提和反转录获得人胎盘cDNA为模板，PCR扩增后，经EcoR I和Xho I双酶切后，连入相同酶切的pET32a(+)原核表达载体(NOVAGEN公司)，获得pET32a(+)/BNIPL_v2。测序验证阅读框架正确。
分别以1mM IPTG诱导转化了pET32a(+)/BNIPL_v1和pET32a(+)/BNIPL_v2的大肠杆菌表达菌株BL2ltrxB(ΔDE3)，扩增。以不加IPTG的表达菌株BL21trxB(ΔDE3)做对照。裂解处理，走10％SDS-PAGE电泳，考马斯亮兰染色。结果如图8所示。有大量诱导蛋白BNIPL表达。
实施例6：BNIPL兔抗血清的制备及Western检测分析
利用非融合表达载体pT7450，原核表达BNIPL蛋白，采用(NH4)2SO4沉淀和DEAE-Sepharose离子交换层析法纯化表达蛋白。纯化的蛋白免疫新西兰大白兔，制备相应的兔抗血清，ELISA测定抗血清的效价。
抽提细胞总蛋白，用BCH蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。抽提的每一细胞株(L02为人肝细胞株；NCIH446为人小细胞肺癌细胞株；SMMC7721为人肝癌细胞株；BEL7402为人肝癌细胞株)的总蛋白各10μg，用10％SDS-PAGE进行电泳，并转移到硝酸纤维膜上，50g/L脱脂奶粉封闭，兔抗BNIPL多抗血清(1∶2000)为一抗，羊抗兔IgG-HRP(1∶5000)为二抗进行杂交，用化学发光法进行发色显迹。
结果如图5所示。证明BNIPL在4种肿瘤细胞中都有表达。
实施例7：BNIPL与Bcl-2和cdc42GAP的相互作用
(A)酵母双杂交实验
采用Clontech公司的酵母双杂交系统(Matchmaker LexA two-hybridsystem)检测BNIPL与Bcl-2、cdc42GAP、cdc42、BNIP2、Bax、Bcl-xL、Flg及BNIPL自身之间是否存在相互作用。
结果发现BNIPL可以与Bcl-2、cdc42GAP和BNIPL自身发生相互作用，而与cdc42、BNIP2、Bax、Bcl-xL和Flg之间不发生相互作用(图6a)。
(B)Pull-down实验
进一步用Pull-down实验加以验证，方法如下：
B.1构建下列重组原核表达载体：pET32a(+)/Bcl-2、pET32a(+)/BNIPL_v2和pET32a(+)/cdc42GAP，用于表达His-Bcl-2、His-BNIPL_v2和His-cdc42GAP重组蛋白(带His蛋白标签)。pET32a(+)原核表达载体为NOVAGEN公司产品。测序验证上述3个重组原核表达载体的阅读框架正确。IPTG诱导，可获得原核表达的带His标签的His-Bcl-2、His-BNIPL_v2和His-cdc42GAP重组蛋白，用于Pull-down实验。
B.2构建下列重组载体：pcDNA3.1-HA2/BNIPL_v2和pcDNA3.1-HA2/BNIPL_v2ΔBCH，用于体外翻译HA-BNIPL_v2和HA-BNIPL_v2ΔBCH重组蛋白(带HA蛋白标签)，pcDNA3.1-HA2载体为Invitrogen公司产品。测序验证上述2个重组表达载体的阅读框架正确。取大约4微升(大约1微克)质粒，0.5微升甲硫氨酸(Promega)和20.5微升TNT-T7-transcription/translationMaster Mix(Promega)，混合，30℃放置30-60min，体外翻译获得带HA标签的HA-BNIPL_v2和HA-BNIPL_v2ΔBCH重组蛋白，用于Pull-down实验。
B.3取结合有His-Bcl-2、His-BNIPL_v2和His-cdc42GAP重组蛋白的Ni-NTA-resin(Qiagen)各2微升进行蛋白电泳，染色，与蛋白标准分子量的条带比较估计浓度，将蛋白浓度调整一致。同样，将体外翻译获得的HA-BNIPL_v2和HA-BNIPL_v2ΔBCH重组蛋白的浓度调整到一致。
B.4 Pull-down实验反应体系为：
1×PBS
5％NP-40
1mg/ml BSA
蛋白酶抑制剂(1mM PMSF，10μg/ml leupeptin，5μg/ml aprotinin)
5μl结合有原核表达蛋白的树脂珠(Ni-NTA-resin)
B.5 Pull-down实验操作步骤：
1)将含有合适反应体系的螺口管于4℃冷库中颠倒混匀，预结合45分钟。
2)加入2μl体外翻译产物，注意使HA-BNIPL_v2和HA-BNIPL_v2ΔBCH蛋白的量一致。
3)4,000rpm离心2分钟，用一次性注射器小心吸去上清。
4)加入500μl Washing Buffer(Washing buffer：1×PBS，0.5％NP-40)，用手指轻弹管底，将树脂珠悬起。
5)4,000rpm离心2分钟，小心吸去上清。
6)重复步骤4)，5)两次。
7)加入10μl 1×蛋白电泳上样液，98℃作用3分钟，全部上样进行蛋白电泳。
8)Western检测。
B.6结果
如图6b，6c，和6d所示，再次证实了BNIPL与Bcl-2、cdc42GAP及BNIPL自身之间的这种相互作用。
实施例8：BNIPL基因对肝癌细胞BEL7402的促凋亡作用
分别用BNIPL的全长基因、缺失BNIPL基因C-端BCH功能域的缺失子和BNIPL基因单独的BCH功能域，转染人肝癌细胞BEL7402，采用Clontech公司的早期凋亡检测试剂盒(ApoAlert Annexin V-EGFP Apoptosis kit)，分析BNIPL全长基因、缺失BNIPL基因C-端BCH功能域的缺失子和BNIPL基因单独的BCH功能域分别转染BEL7402后，对人肝癌细胞BEL7402凋亡的影响。
结果发现BNIPL全长基因和单独的BCH功能域(对应于SEQ ID NO：2中215-357位)对人肝癌细胞BEL7402的凋亡具有促进作用，而缺失BNIPL基因C-端BCH功能域的缺失子对人肝癌细胞BEL7402的凋亡没有促进作用(图7a和7b)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>上海新世界基因技术开发有限公司
<120>促凋亡基因BNIPL及其编码蛋白和用途
<130>024920
<160>9
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>2146
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(158)..(1228)
<223>
<400>1
ggaagatgag gttacctccc ttccacacct ccctccttgg aggcaagagc tacaacagct 60
gagacagaaa agaggtaagg aagtgttggg ggctgggaca accagctccc caacaactcc 120
taggtgttta aagaaggagg caggaagact tgtgaag atg gga act ata caa gag 175
Met Gly Thr Ile Gln Glu
1 5
gca gga aaa aag aca gat gtt ggg gtc agg gag att gca gaa gca cca 223
Ala Gly Lys Lys Thr Asp Val Gly Val Arg Glu Ile Ala Glu Ala Pro
10 15 20
gaa cta gga gca gcc ctg aga cat ggg gag ttg gag ctg aag gag gaa 271
Glu Leu Gly Ala Ala Leu Arg His Gly Glu Leu Glu Leu Lys Glu Glu
25 30 35
tgg cag gat gaa gaa ttc cct aga ttg ctt cct gag gag gct ggc act 319
Trp Gln Asp Glu Glu Phe Pro Arg Leu Leu Pro Glu Glu Ala Gly Thr
40 45 50
tct gaa gat cct gaa gac cct aaa gga gat tca cag gca gct gca ggt 367
Ser Glu Asp Pro Glu Asp Pro Lys Gly Asp Ser Gln Ala Ala Ala Gly
55 60 65 70
acc ccc agc act tta gcc ctg tgt ggc cag cgc ccc atg cgc aag cgt 415
Thr Pro Ser Thr Leu Ala Leu Cys Gly Gln Arg Pro Met Arg Lys Arg
75 80 85
ctt tct gcc cca gag ttg cgg ctg agt ctg act aag ggg cct gga aat 463
Leu Ser Ala Pro Glu Leu Arg Leu Ser Leu Thr Lys Gly Pro Gly Asn
90 95 100
gat gga gct tca ccc acc cag tct gca cct tcc tct cct gat ggc agt 511
Asp Gly Ala Ser Pro Thr Gln Ser Ala Pro Ser Ser Pro Asp Gly Ser
105 110 115
tct gac ctg gag ata gac gaa ttg gag aca cct tca gac tcg gag cag 559
Ser Asp Leu Glu Ile Asp Glu Leu Glu Thr Pro Ser Asp Ser Glu Gln
120 125 130
ctg gac agt gga cat gaa ttt gaa tgg gaa gat gaa cta ccc cgg gca 607
Leu Asp Ser Gly His Glu Phe Glu Trp Glu Asp Glu Leu Pro Arg Ala
135 140 145 150
gag ggt ctg ggc acc agt gag aca gct gaa agg ctg ggc cga ggt tgt 655
Glu Gly Leu Gly Thr Ser Glu Thr Ala Glu Arg Leu Gly Arg Gly Cys
155 160 165
atg tgg gat gtg act gga gaa gat gga cat cac tgg agg gtg ttc cga 703
Met Trp Asp Val Thr Gly Glu Asp Gly His His Trp Arg Val Phe Arg
170 175 180
atg gga cca cgg gag cag cgc gta gac atg act gtc att gag ccc tat 751
Met Gly Pro Arg Glu Gln Arg Val Asp Met Thr Val Ile Glu Pro Tyr
185 190 195
aag aaa gtc ctg tct cat gga ggt tac cac ggt gat ggc ctc aat gct 799
Lys Lys Val Leu Ser His Gly Gly Tyr His Gly Asp Gly Leu Asn Ala
200 205 210
gtc atc ctt ttt gct tcc tgt tat cta ccc aga agc agc atc ccc aac 847
Val Ile Leu Phe Ala Ser Cys Tyr Leu Pro Arg Ser Ser Ile Pro Asn
215 220 225 230
tac acc tat gtc atg gaa cac ttg ttt agg tat atg gtg gga act ctg 895
Tyr Thr Tyr Val Met Glu His Leu Phe Arg Tyr Met Val Gly Thr Leu
235 240 245
gag ctg cta gta gct gaa aat tac ctg ctt gtt cat ttg agt gga ggc 943
Glu Leu Leu Val Ala Glu Asn Tyr Leu Leu Val His Leu Ser Gly Gly
250 255 260
aca agc agg gcc caa gtt cca cct cta agc tgg ata cgt cag tgt tac 99l
Thr Ser Arg Ala Gln Val Pro Pro Leu Ser Trp Ile Arg Gln Cys Tyr
265 270 275
cgt acc ctg gat cgg cgg cta cgg aaa aac ctg cga gcc ctg gtg gtt 1039
Arg Thr Leu Asp Arg Arg Leu Arg Lys Asn Leu Arg Ala Leu Val Val
280 285 290
gtc cat gct aca tgg tat gtg aaa gca ttt ctg gca ctg ctt cgg ccc 1087
Val His Ala Thr Trp Tyr Val Lys Ala Phe Leu Ala Leu Leu Arg Pro
295 300 305 310
ttc atc agt tcc aaa ttc aca cga aaa atc cgt ttt ctg gac agc ctg 1135
Phe Ile Ser Ser Lys Phe Thr Arg Lys Ile Arg Phe Leu Asp Ser Leu
315 320 325
ggg gag ctg gcc caa ctc ata tcc ctg gat caa gtc cac atc cct gaa 1183
Gly Glu Leu Ala Gln Leu Ile Ser Leu Asp Gln Val His Ile Pro Glu
330 335 340
gct gtc aga cag ctg gac cgg gat ctc cat ggc tca gga ggg aca 1228
Ala Val Arg Gln Leu Asp Arg Asp Leu His Gly Ser Gly Gly Thr
345 350 355
tagcacagga ctggataaag ggccttagaa ccagttagtg atctgcctac acctgaatcc 1288
ctgaaacatc tgaactgttt tgtaaatcat cttatcccca acctcagtac caccggatct 1348
tcacttctca gtgggatttt gtcctttgca tgaccctact ttcagcaggg ctttgaggct 1408
gggaaactga tctgctgggt gactttcatt ccagttgctg ggacggaagg ctgaatgtag 1468
ggtcattttg tatgggatat gcagagctct gggttttttt gttttttgtt ttttgagacg 1528
gagtctcgct ctgtcgccag gctggagtgc agtggtgcga tctcggctca ctgcaacctc 1588
cgcctcccgg ttcaagccat tcttctgcct cagcctcagc gagtagctga gactaccggc 1648
gcacgccacc acgcccagct aattgttttg tatttttagt agagacgggg tttcaccatg 1708
ttggccagga tggtctcgat ctcttgacct cgtgatctgc ccgcctcggc ctcccaaagt 1768
gccgagatta caggtgtgag ccaccgcgct cggccagagc tctgggtttt aatcctactt 1828
tagctgtaga accttgggca aataacttca tctttttggg tcctaatttt cctcctgtct 1888
aactggaggg actgtgatcc ttccaccttg gatggaagag gcttacctga cagccagcct 1948
gcctgctggg agccaggaga gtcagctcat taaatcttga agaaccgctg tatgcccttt 2008
ttccttctaa gtcatgtctg ctgcctgtga gcctgggaag gagtgctttc aaaacctgta 2068
tttttgccct ctttagtaaa tttagaactg tagaggctaa taaactgcga tgagacattt 2128
aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2146
<210>2
<211>357
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
Met Gly Thr Ile Gln Glu Ala Gly Lys Lys Thr Asp Val Gly Val Arg
1 5 10 15
Glu Ile Ala Glu Ala Pro Glu Leu Gly Ala Ala Leu Arg His Gly Glu
20 25 30
Leu Glu Leu Lys Glu Glu Trp Gln Asp Glu Glu Phe Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Pro Glu Glu Ala Gly Thr Ser Glu Asp Pro Glu Asp Pro Lys Gly Asp
50 55 60
Ser Gln Ala Ala Ala Gly Thr Pro Ser Thr Leu Ala Leu Cys Gly Gln
65 70 75 80
Arg Pro Met Arg Lys Arg Leu Ser Ala Pro Glu Leu Arg Leu Ser Leu
85 90 95
Thr Lys Gly Pro Gly Asn Asp Gly Ala Ser Pro Thr Gln Ser Ala Pro
100 105 110
Ser Ser Pro Asp Gly Ser Ser Asp Leu Glu Ile Asp Glu Leu Glu Thr
115 120 125
Pro Ser Asp Ser Glu Gln Leu Asp Ser Gly His Glu Phe Glu Trp Glu
130 135 140
Asp Glu Leu Pro Arg Ala Glu Gly Leu Gly Thr Ser Glu Thr Ala Glu
145 150 155 160
Arg Leu Gly Arg Gly Cys Met Trp Asp Val Thr Gly Glu Asp Gly His
165 170 175
His Trp Arg Val Phe Arg Met Gly Pro Arg Glu Gln Arg Val Asp Met
180 185 190
Thr Val Ile Glu Pro Tyr Lys Lys Val Leu Ser His Gly Gly Tyr His
195 200 205
Gly Asp Gly Leu Asn Ala Val Ile Leu Phe Ala Ser Cys Tyr Leu Pro
210 215 220
Arg Ser Ser Ile Pro Asn Tyr Thr Tyr Val Met Glu His Leu Phe Arg
225 230 235 240
Tyr Met Val Gly Thr Leu Glu Leu Leu Val Ala Glu Asn Tyr Leu Leu
245 250 255
Val His Leu Ser Gly Gly Thr Ser Arg Ala Gln Val Pro Pro Leu Ser
260 265 270
Trp Ile Arg Gln Cys Tyr Arg Thr Leu Asp Arg Arg Leu Arg Lys Asn
275 280 285
Leu Arg Ala Leu Val Val Val His Ala Thr Trp Tyr Val Lys Ala Phe
290 295 300
Leu Ala Leu Leu Arg Pro Phe Ile Ser Ser Lys Phe Thr Arg Lys Ile
305 310 315 320
Arg Phe Leu Asp Ser Leu Gly Glu Leu Ala Gln Leu Ile Ser Leu Asp
325 330 335
Gln Val His Ile Pro Glu Ala Val Arg Gln Leu Asp Arg Asp Leu His
340 345 350
Gly Ser Gly Gly Thr
355
<210>3
<211>2353
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>3
ggagctacaa cagctgagac agaaaagagg taaggaagtg ttgggggctg ggacaaccag 60
ctccccgaca actcctaggt gtttaaagaa ggaggcagga agacttgtga agatgggaac 120
tatacaagag gcaggaaaaa agacagatgt tgggtggagc aactgctaca gaggtaaata 180
tgattaactt tacattccat ctttcgtctg ctcccaaact taacagcagg taatctgctt 240
ctagcaagtg gtgaaggtaa gagaagcatc tgtataggag gcaagagatc tgagtccttt 300
tgaaggccta tcctctgctc tgtatctcaa ttactgttct tcatttcaat tattcttacc 360
tactattcag ttcccttgat cttttcttct tgggggctgt cttagggtca gggagattgc 420
agaagcacca gaactaggag cagccctgag acatggggag ttggagctga aggaggaatg 480
gcaggatgaa gaattcccta gattgcttcc tgaggaggct ggcacttctg aagatcctga 540
agaccctaaa ggagattcac aggcagctgc aggtaccccc agcactttag ccctgtgtgg 600
ccagcgcccc atgcgcaagc gtctttctgc cccagagttg cggctgagtc tgactaaggg 660
gcctggaaat gatggagctt cacccaccca gtctgcacct tcctctcctg atggcagttc 720
tgacctggag atagacgaat tggagacacc ttcagactcg gagcagctgg acagtggaca 780
tgaatttgaa tgggaagatg aactaccccg ggcagagggt ctgggcacca gtgagacagc 840
tgaaaggctg ggccgaggtt gtatgtggga tgtgactgga gaagatggac atcactggag 900
ggtgttccga atgggaccac gggagcagcg cgtagacatg actgtcattg agccctataa 960
gaaagtcctg tctcatggag gttaccacgg tgatggcctc aatgctgtca tcctttttgc 1020
ttcctgttat ctacccagaa gcagcatccc caactacacc tatgtcatgg aacacttgtt 1080
taggtatatg gtgggaactc tggagctgct agtagctgaa aattacctgc ttgttcattt 1140
gagtggaggc acaagcaggg cccaagttcc acctctaagc tggatacgtc agtgttaccg 1200
taccctggat cggcggctac ggaaaaacct gcgagccctg gtggttgtcc atgctacatg 1260
gtatgtgaaa gcatttctgg cactgcttcg gcccttcatc agttccaaat tcacacgaaa 1320
aatccgtttt ctggacagcc tgggggagct ggcccaactc atatccctgg atcaagtcca 1380
catccctgaa gctgtcagac agctggaccg ggatctccat ggctcaggag ggacatagca 1440
caggactgga taaagggcct tagaaccagt tagtgatctg cctacacctg aatccctgaa 1500
acatctgaac tgttttgtaa atcatcttat ccccaacctc agtaccaccg gatcttcact 1560
tctcagtggg attttgtcct ttgcatgacc ctactttcag cagggctttg aggctgggaa 1620
actgatctgc tgggtgactt tcattccagt tgctgggacg gaaggctgaa tgtagggtca 1680
ttttgtatgg gatatgcaga gctctgggtt tttttgtttt ttgttttttg agacggagtc 1740
tcgctctgtc gccaggctgg agtgcagtgg tgcgatctcg gctcactgca acctccgcct 1800
cccggttcaa gccattcttc tgcctcagcc tcagcgagta gctgagacta ccggcgcacg 1860
ccaccacgcc cagctaattg ttttgtattt ttagtagaga cggggtttca ccatgttggc 1920
caggatggtc tcgatctctt gacctcgtga tctgcccgcc tcggcctccc aaagtgccga 1980
gattacaggt gtgagccacc gcgctcggcc agagctctgg gttttaatcc tactttagct 2040
gtagaacctt gggcaaataa cttcatcttt ttgggtccta attttcctcc tgtctaactg 2100
gagggactgt gatccttcca ccttggatgg aagaggctta cctgacagcc agcctgcctg 2160
ctgggagcca ggagagtcag ctcattaaat cttgaagaac cgctgtatgc cctttttcct 2220
tctaagtcat gtctgctgcc tgtgagcctg ggaaggagtg ctttcaaaac ctgtattttt 2280
gccctcttta gtaaatttag aactgtagag gctaataaac tgcgatgaga catttaaaaa 2340
aaaaaaaaaa aaa 2353
<210>4
<211>275
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>4
Met Arg Lys Arg Leu Ser Ala Pro Glu Leu Arg Leu Ser Leu Thr Lys
1 5 10 15
Gly Pro Gly Asn Asp Gly Ala Ser Pro Thr Gln Ser Ala Pro Ser Ser
20 25 30
Pro Asp Gly Ser Ser Asp Leu Glu Ile Asp Glu Leu Glu Thr Pro Ser
35 40 45
Asp Ser Glu Gln Leu Asp Ser Gly His Glu Phe Glu Trp Glu Asp Glu
50 55 60
Leu Pro Arg Ala Glu Gly Leu Gly Thr Ser Glu Thr Ala Glu Arg Leu
65 70 75 80
Gly Arg Gly Cys Met Trp Asp Val Thr Gly Glu Asp Gly His His Trp
85 90 95
Arg Val Phe Arg Met Gly Pro Arg Glu Gln Arg Val Asp Met Thr Val
100 105 110
Ile Glu Pro Tyr Lys Lys Val Leu Ser His Gly Gly Tyr His Gly Asp
115 120 125
Gly Leu Asn Ala Val Ile Leu Phe Ala Ser Cys Tyr Leu Pro Arg Ser
130 135 140
Ser Ile Pro Asn Tyr Thr Tyr Val Met Glu His Leu Phe Arg Tyr Met
145 150 155 160
Val Gly Thr Leu Glu Leu Leu Val Ala Glu Asn Tyr Leu Leu Val His
165 170 175
Leu Ser Gly Gly Thr Ser Arg Ala Gln Val Pro Pro Leu Ser Trp Ile
180 185 190
Arg Gln Cys Tyr Arg Thr Leu Asp Arg Arg Leu Arg Lys Asn Leu Arg
195 200 205
Ala Leu Val Val Val His Ala Thr Trp Tyr Val Lys Ala Phe Leu Ala
210 215 220
Leu Leu Arg Pro Phe Ile Ser Ser Lys Phe Thr Arg Lys Ile Arg Phe
225 230 235 240
Leu Asp Ser Leu Gly Glu Leu Ala Gln Leu Ile Ser Leu Asp Gln Val
245 250 255
His Ile Pro Glu Ala Val Arg Gln Leu Asp Arg Asp Leu His Gly Ser
260 265 270
Gly Gly Thr
275
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>5
attcagcctt ccgtcccagc aactg 25
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>6
cccagcagat cagtttccca gcctc 25
<210>7
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>7
ttggatccaa atgggaacta tacaaga 27
<210>8
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>8
agactcgagt ttatccagtc ctgtg 25
<210>9
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>9
ggaattcatg cgcaagcgtc tttct 25
机译： 涉及抗凋亡基因和抗凋亡基因产物的化合物，筛选方法以及体外和体内用途
机译： 涉及抗凋亡基因和抗凋亡基因产物的化合物，筛选方法以及体外和体内用途
机译： 涉及抗凋亡基因和抗凋亡基因产物的化合物，筛选方法以及体外和体内用途
