预防和治疗性传播疾病－I的药剂

摘要

具有萘基二磺酸末端基团的聚赖氨酸、聚酰胺型胺或聚甲基吖丙啶树状体作为局部应用的药剂在预防或治疗性传播疾病中的用途。

说明书

发明领域

本发明涉及性传播疾病的预防和治疗，更具体涉及具有萘基二磺酸末端基团的树状体(dendrimer)作为局部应用药剂在预防和治疗这些疾病中的用途。

发明背景

估计HIV，HSV及其他病毒与微生物病原体引起的性传播疾病(STD)的全球发病率和死亡率为全世界数亿人。控制STD传播的一个措施是使用局部应用的女性/男性控制的阴道或直肠的杀微生物剂以灭活相关的病原体。因此，发展预防和治疗STD的阴道内或直肠内应用的新型的、安全的、局部的杀微生物剂是新药开发的重要目标。

国际专利申请No.PCT/AU95/00350(WO95/34595)和PCT/AU99/00763(WO 00/15240)，这里引入它们的内容作为参考，揭示了一类新的多价药剂-树状体，它是包有明确的多阴离子或阳离子表面基团的高度分支的大分子，已经显示出了一定范围的抗病毒和抗微生物活性及极低的毒性。不象大多数抗病毒药物的小分子结构，这些树状体是一种多价的、高度分支的大分子化合物，通过重复反应顺序而形成，开始于一起始核心分子，后续的层或级以连续的“世代”加入以构建三维的、高度有序的多聚体化合物。树状体具有以下的特点：i.起始核心可以有一个或多个反应位点且呈点样或具有显著的大小以实现树状体的最终拓扑结构；ii.分支的重复单元的层连到起始核心；iii.功能性的末端基团(例如含阴离子或阳离子的部分)任选通过连接基团连到树状体的表面。

这些大分子化合物由具有多个分支或树样结构的单体结构单元合成，分子的外表面携带有多个功能性基团，其导致被生物受体识别。

树状体的制备是公知的，并在美国专利Nos.4,289,872和4,410,688(描述的树状体基于赖氨酸单元层)，以及美国专利Nos.4,507,466，4,558,120，4,568,737和4,587,329(描述的树状体其于其它单元包括聚酰胺型胺或PAMAM树状体)中以举例的方式进行描述。

在抗病毒和抗微生物的测试中，这些树状体结构的一个亚组出人意料地表现出对抗广谱的性传播疾病相关微生物的异常活性，这使得它们成为发展预防和治疗性传播疾病的阴道或直肠杀微生物剂的选择药剂。

发明概述

根据本发明，提供了式I，II或III的化合物或其可药用盐：

其中R代表式IV的基团：

合适的可药用的碱加成盐包括但不限于金属盐例如铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌盐，以及由有机胺制得的有机盐，有机胺如N，N′-二苄基-乙二胺、氯普鲁卡因、，二乙醇胺、乙二胺、二环己基胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)和普鲁卡因，季铵类如胆碱，以及硫鎓(sulphonium)和磷鎓盐。

本发明特别优选的化合物是这里称为SPL-7013，SPL-7304和SPL-7320的化合物，它们的结构分别由聚赖氨酸树状体，聚酰胺型胺(PAMAM)树状体，和聚甲基吖丙啶树状体支架构成，活性表面基团由32个萘基二磺酸基团组成，为钠盐。通过酰胺-亚甲基氧键连到32个末端基团，每个萘基二磺酸功能性表面基团连到分支的树状体支架上。

本发明还提供了一种预防性或治疗性治疗人类患者的性传播疾病的局部药物组合物，它包含以上式I，II或III的化合物或其可药用盐，以及至少一种可药用的局部用的载体或稀释剂。

在另一方面，本发明还提供了一种预防性或治疗性治疗人类患者的性传播疾病的方法，包括局部给予患者有效量的以上式I，II或III的化合物或其可药用盐。

在另一方面，本发明提供了以上式I，II或III的化合物或其可药用盐在制备预防性或治疗性治疗人类患者的性传播疾病的局部应用的药物中的用途。

本发明的详细描述

式I，II和III的化合物及其可药用盐是新的化合物，它们已出人意料地表现出对抗广谱的性传播疾病相关病原体的异常活性。

如上所述，化合物SPL-7013，SPL-7304，和SPL-7320是本发明优选的化合物，并已发现其表现出显著的抗病毒活性，尤其是对抗最为常见的性传播疾病的病毒和微生物媒介。

SPL-7013表现出广谱的抗病毒活性，其高效地对抗几种最为重要的阴道或直肠性传播疾病的媒介并具有极低的细胞或动物毒性。已在体外细胞试验和体内动物(小鼠)模型试验中确定了其对抗生殖器疱疹病毒-2(HSV-2)的高活性以及在体外细胞试验中对抗疱疹病毒-1(HSV-1)与人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)的高活性。它还表现出对生殖器疣的病原体人乳头瘤病毒(HPV)和对非特异性尿道炎的细菌媒介沙眼衣原体有活性。在细胞试验中，SPL-7103还表现出对抗对目前应用的基于修饰核苷的抗病毒剂耐药的疱疹病毒-2病毒株的活性。另外，SPL-7304和SPL-7320表现出对抗HSV-1，HSV-2，HIV-1和HIV-2的高活性。而且SPL-7013，SPL-7304和SPL-7320在CD4依赖性和CD4非依赖性HIV传播测试中有活性，并且对阻止HIV-1的附着和融合是有效的。所有的化合物都表现出不抑制多种有益的乳杆菌的生长。另外，SPL-7013，SPL-7304和SPL-7320表现出能有效地预防HIV-1 RoJo或SIV 89.6pd感染人外周血单核的细胞(PBMCs)。

因此，这些化合物作为旨在应用于阴道或直肠粘膜以保护性对抗性传播感染的局部杀微生物剂在预防和治疗性治疗性传播疾病中是有用的。

本发明还提供了一种预防性或治疗性治疗人类患者的性传播疾病的局部药物组合物，它包括如上所述的式I，II或III的化合物或其盐，以及至少一种可药用的局部载体或稀释剂。

这种组合物的配制对于本领域技术人员而言是熟知的。合适的可药用载体和/或稀释剂包括任何和所有常规溶剂，分散介质，填充剂，固体载体，水溶液，包衣，抗菌剂和抗真菌剂，等渗剂，及吸收增强剂或延迟剂，活性增强剂或延迟剂以及诸如此类。这些介质和试剂用于药学活性物质在本领域是熟知的，并且在Remington’sPharmaceutical Sciences(第18版，Mack Publishing Company，宾夕凡尼亚，美国)中以举例的方式有所描述。除了与活性成分不相容的任何常规载体和/或稀释剂，在本发明的药物组合物中都可以考虑使用。附加的活性成分包括有着抗病毒或抗微生物活性的药剂也能掺入本发明的组合物中。

特别有利的是将组合物配制成剂量单位形式以易于给药与剂量均一。这里使用的剂量单位形式指的是物理上分离的单位，适合作为用于待治疗人类对象的单元剂量；每个单位包含经计算可产生所需的治疗效果的预定量的活性成分，以及所需要的药用载体和/或稀释剂。本发明的新剂量单位形式的规格决定于和直接取决于(a)活性成分的独特特点和有待获得的特定的治疗效应，以及(b)将这种活性成分配成用于特定治疗的工艺所固有的限制。

如前所述，本发明还提供了一种通过局部给予患者有效量的上述的式I，II或III的化合物或其盐而预防性或治疗性治疗人类患者的性传播疾病的方法。另外，本发明提供了上述式I，II或III的化合物或其盐在制备用于这种预防性或治疗性治疗性传播疾病的局部应用的药物中的用途。

多种局部给药途径都是可行的。所选择的特定的方式当然将取决于所治疗的特定病症以及预防或治疗效力所需的剂量。一般来说，本发明的方法可以使用医学上可接受的任何给药方式实施，意思是任何产生本发明活性成分的预防性或治疗性水平而不引起临床不可接受的副作用的方式。这种给药方式包括阴道，直肠和经皮途径。对于局部，特别是阴道或直肠给药的合适制剂包括溶液，悬浮液，凝胶，洗剂和乳霜，以及独立单位如栓剂和微胶囊化的悬浮液。其他给药系统可包括持续释放给药系统，它能提供本发明活性成分的缓慢释放，包括持续释放凝胶，乳霜，栓剂，或胶囊。许多类型的持续释放给药系统都是可行的。这些包括但不限于：(a)侵蚀系统，其中活性成分包含在基质之中；(b)弥散系统，其中活性成分通过聚合物控速渗透。

本发明的活性成分按预防或治疗有效量给药。预防或治疗有效量意思是至少部分获得预期效果，或延迟所治疗的特定病症的发生，抑制它的进展，或完全停止它的发生或进展的必需剂量。当然这种量将取决于所治疗的特定病症，病症的严重程度和个体患者参数包括年龄，身体健康状况，体型，体重和同时进行的治疗。这些因素对于本领域的普通技术人员是熟知的，并且仅通过常规试验就可加以确定。通常优选使用最高剂量，即根据合理医学判断的最高安全剂量。然而，那些本领域的普通技术人员将明白，出于医学原因、心理原因或事实上任何其他原因，可给予较低剂量或可耐受剂量。

通常地，以预防或治疗致病状态所确定的间隔，活性成分的阴道内或直肠内剂量将从每天约0.01mg/kg到每天1000mg/kg。最初可以给予小剂量(0.01-1mg)，之后增加剂量直至每天约1000mg/kg。当以这种剂量对象的反应不足时，可以给予对象甚至更高的剂量(或通过不同的、更局部化的给药途径给予有效的更高剂量)至患者耐受所允许的程度。每天多个剂量可预计获得适宜的化合物全身水平。

在特别优选的方面，本发明提供了SPL-7013，SPL7304或SPL7320作为在预防和治疗病毒性和微生物性性传播疾病中有用的广谱的阴道或直肠杀微生物剂的用途。SPL-7013，SPL7304和SPL7320是水溶性的并可以以溶液形式使用，或在合适的载体中配成凝胶、洗剂、乳霜或栓剂或微胶囊化的在含水或非水溶剂中的悬浮液的形式，结合其活性的增强剂或延缓剂，增强或延缓其局部应用吸收的试剂，或增强与阴道/直肠上皮或粘膜层粘附的试剂。

在本说明书和随后的权利要求书的全文中，除非上下文另外要求，措词“包含/包括(comprise)”或其变体如“包含/包括(comprises)”或“包含/包括(comprising)”，应理解为指包括一个或多个所述的步骤或整数或整数组，但不除外任何其他的一个或多个步骤或整数或整数组。

本发明的其它特点将体现于下面的实施例，其旨在举例说明而不是限制本发明。

实施例1

A.制备BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆ TFA32

1.N，N′-二-t-Boc-L-赖氨酸(DBL)

将L-赖氨酸.HCl(1.83kg；10mol)溶解于氢氧化钠(880g；22mol)的水溶液(20L)中，并用叔丁醇(15L)稀释所获得的溶液。将二碳酸二叔丁基酯(4.48kg；20.5mol)在1小时内逐滴加入，在这段时间内，反应混合液成为乳状和温热的(30-35℃)。将混合物搅拌过夜以获得澄清的溶液。用石油醚(40-60℃)(2×10L)提取该溶液，并用饱和碳酸氢钠溶液(3×4L)提取有机相。将合并的水层冰浴冷却，并用1M KHSO₄溶液小心地酸化到pH 2。然后用乙醚(4×16L)提取混浊的混合物，用水(2×8L)洗涤合并的有机层，干燥(MgSO₄)以及在温度小于30℃的浴中浓缩，生成一定量的N，N′-二-t-Boc-L-赖氨酸，为非常粘的油。

2.N，N′-二-t-Boc-L-赖氨酸4-硝基苯基酯(DBLONp)

氮气氛下将二环己基碳二亚胺(DCC)(2-06kg；10mol)的乙酸乙酯溶液(5L)逐滴加入到在乙酸乙酯(15L)中的二-t-Boc-L-赖氨酸(DBL)(3.46kg；10mol)和4-硝基苯酚(NpOH)(1.39kg；10mol)的冰冷搅拌溶液中。在添加完成后，使混合物温到室温并搅拌过夜。然后过滤所得到的白色悬浮液，浓缩滤液得到黄色的固体残余物。残余物从乙醚中重结晶得到白色固体的N，N′-二-t-Boc-L-赖氨酸4-硝基苯基酯(产率约60％)。更多的产物之后能从母液中分离得到。

3.BHAlys.2HCl

将DCC(41.2g；0.2mol)的无水二氯甲烷溶液(200ml)加入到冰冷的DBL(69.2g；0.2mol)和二苯甲基胺(BHA)(36.65g；0.2mol)的二氯甲烷溶液(600ml)中。于0℃搅拌混合物30分钟，然后在室温下搅拌3小时。过滤所获得的悬浮液，滤液的tlc(石油醚/EtOAc，9∶1)显示无起始原料。用5％HCl，水，饱和碳酸氢钠和水洗涤滤液；然后干燥(MgSO₄)并浓缩得到泡沫。

在室温下将三氟乙酸(TFA)(400ml)加入到搅拌中的所述泡沫的无水二氯甲烷溶液(200ml)中。最初有剧烈的气体放出，其在约15分钟后停止；tlc(EtOAc)显示无原料存在。再搅拌溶液2小时，然后浓缩得到褐色的油。将该油溶解在无水乙腈(600ml)中，漩涡加入溶解在无水乙醇(约360ml)中的HCl气体饱和溶液。白色的固体马上开始结晶，混合物在室温下静置1小时以完成结晶。过滤混合物，用无水乙腈洗涤固体，然后干燥得到白色粉末的BHAlys.2HCl(产率约80％)。

4.BHAlyslys₂Boc₄

将三乙胺(39.5ml；0.283mol)加入到搅拌着的BHAlys.2HCl(54.4g；0.14mol)的无水DMF(300ml)溶液中。当加入DBLONp(262g；0.56mol)时，形成白色悬浮液，搅拌15分钟。混合物迅速变成黄色，搅拌3小时，加入三乙胺以保持混合物的pH值在8-9。

然后将反应混合物缓慢地加入到大量的剧烈搅拌的水中，混合物搅拌过夜。过滤收集沉淀，用水(3X)洗涤并干燥得到黄色的固体。将该固体粉末化，然后用乙醚连续洗涤，直到乙醚用NaOH水溶液处理后不显示黄色为止。剩余的固体干燥得到白色粉末的BHAlyslys₂Boc₄(产率约70％)。

5.BHAlyslys₂lys₄ Boc₈

将三氟乙酸(600ml)加入BHAlyslys₂Boc₄(116g；0.12mol)的无水二氯甲烷溶液(600ml)中，立即有剧烈的气体放出。搅拌溶液2小时，浓缩得到粘性的油。将油溶于无水DMF(500ml)，用三乙胺将溶液pH值调整到8-9。

然后加入DBLONp(460g；0.99mol)，室温下搅拌黄色溶液2天，定期用三乙胺调节pH值保持pH值在8以上。将反应物沉淀到水中，如上所述进行操作，得到白色粉末的BHAlyslys₂lys₄Boc₈(产率约100％)。

6.BHAlySlyS₂1ys₄lys₈Boc₁₆

将三氟乙酸(1L)加入到BHAlyslys₂lys₄Boc₈(200g；0.106mol)的无水二氯甲烷溶液(1L)中，立即有剧烈气体放出。搅拌溶液2小时，浓缩得到粘油。将油溶解在无水DMF中，用三乙胺将溶液pH值调整到8-9.然后加入DBLONp(782g；1.67mol)，室温下搅拌黄色溶液2天，定时用三乙胺调整pH值保持pH值在8以上。将反应物沉淀到水中，如上所述进行操作，得到白色粉末的BHAlyslys₂1ys₄1ys₈Boc₁₆(产率约100％)。

7.BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆Boc₃₂

将三氟乙酸(1.6L)加入到BHAlyslys₂1ys₄1ys₈Boc₁₆(300g；0.081mol)的无水二氯甲烷混合物(800ml)中，立即有剧烈气体放出。搅拌溶液2小时，浓缩得到粘油。将油溶解在无水DMF(1.2L)中，用三乙胺将溶液pH值调整到8-9.然后加入DBLONp(1030g；2.21mol)，室温下搅拌黄色溶液2天，定时用三乙胺调整pH值保持pH值在8以上。将反应物沉淀到水中，如上所述进行操作，得到白色粉末的BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆Boc₃₂(产率约100％)。

8.BHAlyslys₂1ys₄1ys₈lys₁₆TFA₃₂

将三氟乙酸(168ml)一次性加入叔丁氧羰基(Boc)保护的聚赖氨酸核心BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆Boc₃₂(20g)的二氯甲烷悬浮液(350ml)中，环境温度下搅拌反应物14个小时。将反应混合物真空浓缩，溶解在水(200ml)中，冻干得到灰白色固体的BHAlyslys₂1ys₄1ys₈lys₁₆TFA₃₂(17.5g，83％)。

B.制备SPL 7013

(i)二钠-[1-(氧亚甲基-羧乙基)-3，6-萘-二磺酸]

将1-羟基-3，6-萘-二磺酸二钠(100g)溶解在二甲亚砜(250ml)中，并一次性加入二异丙基乙胺(60ml)。在30分钟的时间内加入溴乙酸乙酯(38ml)，在室温除湿下搅拌反应物14个小时。将反应物缓慢地倾入乙酸乙酯(2L)中以得到油性的残余物/胶。滗掉上清，加入额外的乙酸乙酯(1.5L)。将残余物研碎数次然后用丙酮洗涤得到褐色固态的二钠-[1-(氧亚甲基-羧乙基)-3，6-萘-二磺酸](97g，78％)。

(ii)1-(氧亚甲基-羧基)-3，6-萘-二磺酸

将NaOH水溶液(134ml)一次性加入到500ml的二钠-[1-(氧亚甲基-羧乙基)-3，6-萘-二磺酸](97g)水溶液中。室温下搅拌反应物14小时，然后将反应物通过IR120(酸形式)柱。冷冻干燥收集的级分得到褐色固态的1-(氧亚甲基-羧基)-3，6-萘-二磺酸(67g，83％)。

(iii)BHAlyslys₂lys₄lys₈lys₁₆[NH-CO-CH₂O-3，6-萘基-(SO₃Na)₂]₃₂-SPL 7013

将1-(氧亚甲基-羧基)-3，6-萘-二磺酸(47.85g)溶解在DMF(500ml)中，并一次性加入二异丙基乙胺(115ml)。将上述溶液加入到通过将六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧-三-吡咯烷-磷鎓(PyBOP；72g)一次性加入到BHAlyslys₂1ys₄1ys₈lys₁₆TFA₃₂(15.95g)的DMF(650ml)溶液中而制备成的溶液中。用DMF(100ml)漂洗滴液漏斗。室温下搅拌反应混合物14个小时，然后用水(10L)稀释。将溶液泵过1微米厚(depth)的滤器，并通过含10kD膜的Pall Filtron装置(Pall Gelman)。将所得溶液通过IR120(钠形式)柱，泵过0.22微米厚滤器并冷冻干燥得到灰白色固态的SPL-7013，产率75％。30℃，检测波长设定为240nm，ODS-EC 15cm×4.6mm HPLC柱上停留时间＝15分钟。利用详细描述如下的梯度洗脱，以每分钟1ml的流速洗脱样本。

  时间分钟    ％A    ％B    0    90    10    2    90    10    20    10    90    30    10    90    31    90    10

其中溶剂A＝在0.01M NH₄OAc中的0.015M TBAH，(pH 7.0)，溶剂B＝在MeOH中的0.015M TBAH。

SPL7013的质谱分析表明分子量为16，580±2道尔顿。对SPL7013分子式C₅₈₃H₅₇₇N₆₃Na₆₄O₂₈₇S₆₄预计的平均分子量是16，581.53。

C.SPL 7304的制备

按相似的方法，通过PyBOP偶联1-(氧亚甲基-羧基)-3，6-萘-二磺酸与聚酰胺型胺(PAMAM)树状体，generation 3(Starburst，Sigma-Aldrich Pty.Ltd.，Australia)制备SPL7304。

D.SPL 7320的制备

按相似的方法，通过PyBOP偶联1-(氧亚甲基-羧基)-3，6-萘-二磺酸与聚甲基吖丙啶三十二烷胺(dotriacontaamine)树状体，generation4.0(DAB-Am-32，Sigma-Aldrich Pty.Ltd.，Australia)制备SPL7320。

实施例2

SPL 7013，SPL 7304和SPL 7320的生物活性

A.抗人免疫缺陷病毒的活性

使用的人免疫缺陷病毒株是HIV-1(IIIB)¹和HIV-2(ROD)²。平行地进行抗逆转录病毒活性和细胞毒性测定。这些试验基于已经被HIV感染然后暴露于不同浓度的试验化合物的MT-4细胞的存活。在MT-4细胞增殖5天后，通过基于四氮唑比色的溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑(MTT)方法在96孔微板上定量活细胞的数目³。

在所有的这些检测中，病毒输入(病毒感染复数，MOI)是50％细胞培养感染剂量(CCID₅₀)的0.01或100倍。50％抗病毒抑制浓度(EC₅₀)定义为保护50％病毒感染的细胞对抗病毒的致细胞病性所需要的化合物浓度。50％细胞毒性浓度(CC₅₀)定义为将模拟感染的(mock-infected)细胞的存活减少50％所需要的化合物浓度。＞符号用于表示仍发现无细胞毒性的化合物测试的最高浓度。几次独立试验的平均EC₅₀和CC₅₀值如上述定义表示。通常，各数值不偏离EC₅₀和CC₅₀值上下2倍以上。SI为抗病毒选择性指数CC₅₀/EC₅₀。

表：HIV活性

化合物病毒株EC50μg/mlEC90μg/mlCC50μg/mlSISPL-7013IIIB0.450.954＞125＞280ROD3.264.86＞50＞17SPL-7304IIIB0.15＞88＞652ROD0.8＞50＞63SPL-7320IIIB0.164＞88＞537ROD1.153＞50＞47

IIIB＝HIV-1

ROD＝HIV-2

EC₉₀＝减少病毒噬斑90％的有效浓度

(i)CD4依赖性和CD4非依赖性HIV传播抑制试验，HIV附着和融合，以及乳杆菌属生长抑制的方法

细胞和病毒：

HIV-1_IIIB，和HeLa CD4 LTR β-gal，GHOST X4/R5，及HL2/3细胞系获自NIH AIDS Research and Reference Reagent Program(Bethesda，MD)，并按推荐的进行保存。ME 180细胞获自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)。

测试材料的处理和保存：

除非主持者指定了可供选择的溶剂和贮存条件，化合物通常溶解在100％DMSO中，并贮存在-80℃直到测试。在制备成组织培养基中的工作溶液之前，冷冻的原液在室温下融化，在37℃预温15分钟并涡旋。在化合物稀释和处理的所有阶段，通过不透明的遮盖以及通过在不透明或琥珀色的组织培养器中进行贮存和稀释来保护化合物避光。另外，通过减少实验室内50％的所有荧光照明来控制室内和组织培养层流罩超静台的光暴露。在最高测试浓度的最终DMSO浓度为0.25％。

CD4-非依赖性HIV传播抑制测试：

将ME180细胞，一种CD4阴性、X4阳性的宫颈上皮细胞系维持在补充10％胎牛血清、谷氨酰胺和抗生素的RPMI 1640中。在测定前24小时，将ME180细胞用胰蛋白酶消化，洗涤和接种在96孔平底微量板中，密度为每孔2×10³细胞。在测试当天，用新鲜制备的丝裂霉素C(200μg/ml)在37℃处理被HIV-1的SK1临床分离株慢性感染的H9细胞(H9-SK1)60分钟。该丝裂霉素C浓度足以导致细胞死亡但允许病毒传播发生。在丝裂霉素C处理后，用组织培养基洗H9-SK1细胞3次。将测试化合物加入到ME180单层，随后加入2×10⁴H9-SK1细胞。将ME180细胞与H9-SK-1细胞以及测试材料共培养4小时，用PBS洗涤ME180单层3次以去除H9-SK1细胞。在测试开始后的24和48小时，再次用PBS洗孔3次以确保去除H9-SK1细胞，在无测试材料的培养基中继续培养。在共培养后六天，收集上清，用ELISA评价p24抗原表达。用XTT染料还原法评估细胞存活。在第一个测试中被判定为有活性的化合物添加或不添加粘蛋白进行再次测定。通过添加200μg/ml的猪粘蛋白(Sigma Chemical Co.，St Louis，MO)到传播反应而在有粘蛋白存在下进行测试。如上所述实施传播间隔和不置换粘蛋白或化合物的洗涤。所有的测定一式三份进行，测试材料1/2Log10系列稀释。

CD4-依赖性HIV传播抑制测试：

实施CD4依赖性HIV传播抑制测试，基本上如CD4非依赖性传播测试所述，除了使用CD4阳性的GHOST(3)X4/5细胞系。这个细胞系来源于HOS(人骨肉瘤)细胞系，它是HIV共同受体和CD4表达阴性的。通过非选择性的逆转录病毒载体和带有潮霉素选择性标记的HIV-2 LTR hGFP构建体将该细胞系改造为表达T4(CD4)，R5和X4。如上CD4非依赖性HIV抑制测试所述，处理和培养细胞系，除了本测试中使用的是2.5×10⁴GHOST(3)X4/R5和5×10²丝裂霉素C处理过的H9/SK-1细胞。如上所述进行化合物的添加，丝裂霉素C处理以及传播后的洗涤以除去H9/SK-1细胞，以使两个抗病毒测试可比。在感染后24小时评价病毒复制，3次洗涤后，用ELISA测定细胞结合的p24，以确保在CD4存在下的单轮感染。化合物毒性和细胞存活用XTT染料还原法测定。

在第一个测试中被判定为有活性的化合物添加或不添加粘蛋白进行再次测定。通过添加在组织培养基中的200μg/ml猪粘蛋白(SigmaChemical Co.，St Louis，MO)到传播反应来进行有粘蛋白存在的测试。如上所述实施传播间隔和不置换粘蛋白或化合物的洗涤。所有的测试一式三份进行，测试材料1/2Log₁₀系列稀释。

乳杆菌试验：

卷曲乳杆菌和詹氏乳杆菌获自美国典型组织培养物保藏中心，并生长在乳杆菌MRS肉汤中(Difco，Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)。该培养基允许乳杆菌在厌氧条件下有效生长。制备杆菌原种并于-80℃下将其冻存于15％甘油中以用于敏感性检测。为了评价化合物对卷曲乳杆菌和詹氏乳杆菌生长的影响，用来自甘油细菌原种贮存的穿刺针接种10ml MRS培养基。培养物放置在Gas Pak CO₂袋中37℃下温育24小时。第二天将乳杆菌培养物稀释到670nm波长下OD值0.06。将化合物稀释并置入96孔平底板中，加入乳杆菌。将分别为1.25U/ml和1.25μg/ml高测试浓度的商购的青霉素/链霉素溶液作为阳性对照。板再次被放置在Gas Pak CO₂袋中37℃温育24小时，通过用moleculardevices读板机在490nm测定的光密度确定细菌的生长。所有的测定一式三份进行，从高测试浓度作6次1/2log稀释。

病毒附着测定

本测定设计为检测与细胞相互作用及阻断病毒附着的化合物，和/或与形成的附着/融合复合物相互作用的化合物。

用HeLa CD4 LTRβ-gal细胞进行附着测定。与所需的选择抗生素一起常规培养HeLa CD4 LTRβ-gal细胞。在测定开始前24小时，细胞被胰蛋白酶消化，计数，将1×10⁴细胞放置在0.2cm孔中无选择抗生素的培养基中。在第24小时除去培养基，将含化合物的培养基放置于细胞并在37℃下温育15分钟。然后将已知滴度的HIV IIIB株添加到培养孔中，继续温育1小时。在温育结束时，用培养基洗涤培养孔3次并继续培养40到48小时。

在测定结束时，除去培养基，按照生产商的使用说明(TropixGal-screen^TM，Bedford Mass)通过化学发光测定β-半乳糖苷酶的表达，通过单一步骤的化学发光方法，利用单一溶液裂解细胞和测定β-半乳糖苷酶活性。在姐妹板上用XTT染料还原法监测化合物毒性。所有的测试一式三份进行，测试材料1/2log₁₀系列稀释。1小时的病毒吸附间隔是足够短的，使得需要磷酸化成为其有活性的三磷酸形式(AZT-TTP)的AZT在该测定中是无活性的。

融合测定：

融合测定评价化合物阻断细胞与细胞融合的能力，该融合由HIV-1 Env和单独细胞上表达的CD4介导。本测定对于gpl20/CD4相互作用的抑制剂和X4共同受体抑制剂都是敏感的。首先，将5×10³HeLa CD4 LTRβ-gal细胞放置在微量板孔中，并温育过夜。第二天除去培养基，将HeLa CD4 LTRβ-gal细胞在含测定化合物的新鲜培养基中37℃下温育1小时。随后加入5×10³ HL2/3细胞，继续温育40到48小时。在40到48小时，用化学发光(Tropix Gal-screen^TM，Tropix，Bedford，MA)检测β-半乳糖苷酶表达。在姐妹板上用XTT染料还原法监测化合物毒性。所有的测定一式三份进行，测试材料1/2log₁₀系列稀释。

P24抗原ELISA

ELISA试剂盒购自Coulter Electronics，根据生产商的指导进行对上清或细胞结合的p24抗原的检测。对于细胞结合的p24，通过在25到50μl Coulter供应的病毒裂解缓冲液中裂解孔内容物而产生溶胞产物，1轮冻/融后对其进行检测。全部p24抗原测定在样本系列稀释后进行以保证吸光度在标准p24抗原曲线的线性范围内。用生产商提供的标准物和指导生成标准曲线。利用Molecular Devices Vmax platereader在450nm通过分光光度分析得到数据。利用Molecular DevicesSoft Max软件包从光密度值计算出最终的浓度，并表示为pg/ml p24抗原。

细胞存活和化合物细胞毒性的XTT染色：

通过测定含细胞与化合物但不含病毒的复制微量板中四氮唑染料XTT(2，3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-5-[(苯基氨基)羰基]-2H-四氮唑氢氧化物)的还原来确定测试材料的TC₅₀值。在代谢活性细胞中的线粒体酶NADPH氧化酶将XTT代谢为可溶性甲产物，这允许快速定量分析细胞存活和化合物细胞毒性。每天制备XTT溶液，为1mg/ml的PBS贮液。吩嗪硫酸甲酯(PMS)溶液制备为15mg/ml的PBS溶液，并贮存在-20℃避光。在使用前即刻将PMS用PBS按1∶100稀释并且每毫升加入40μl的XTT溶液以制备成XTT/PMS原液。将50微升的XTT/PMS加入到板的每个孔中并将板在37℃温育4小时。4小时温育是经验性确定的，以使得每个测定指定数目的细胞的MTS染料还原在线性反应范围内。用板密封器(adhesive plate sealer)取代板盖，密封的板倒转几次以混合可溶性甲产物，并用Molecular Deviees Vmax 96孔板规格的分光光度计在450nm读板。

数据分析

将硫酸葡聚糖(阳性)和葡聚糖(阴性)用作CD4依赖性和CD4非依赖性HIV传播抑制测定的对照。将磺酸染料芝加哥天蓝用作为附着和融合测定的阳性对照⁴。商购的青霉素(10,000U/ml)链霉素(10.0mg/ml)溶液用作乳杆菌敏感性测定的阳性对照。对于每种化合物，适当地通过线性回归计算IC₅₀(抑制病毒复制或传播50％的浓度)，ID₅₀(抑制乳杆菌50％生长的浓度)，TC₅₀(造成细胞存活减少50％的浓度)及治疗指数(TI∶TC₅₀/IC₅₀或ID₅₀)。

CD4依赖性和CD4非依赖性传播测定的结果

           CD4-非依赖性            传播测定            (μg/ml)              CD4-依赖性           传播测定(μg/ml)化合物  Exp.#粘蛋白  IC₅₀  TC₅₀    TI  IC₅₀  TC₅₀  TI硫酸葡聚糖    1  -  0.316  ＞100  ＞316    2  -  1.1  ＞50  ＞46  0.158  ＞50  ＞316    2  +  0.16  ＞50  ＞309  0.158  ＞50  ＞316葡聚糖    1  -  ＞100  ＞100  -    2  -  ＞100  ＞100  -  ＞100  ＞100  -    2  +  ＞100  ＞100  -  ＞100  ＞100  -SPL7013    1  -  0.76  ＞100  ＞132    2  -  28.5  ＞100  ＞3.5  0.39  ＞100  ＞256    2  +  1.1  ＞100  ＞90.9  0.49  ＞100  ＞205SPL7304    1  -  ＜0.3  ＞100  ＞316    2  -  5.0  ＞100  ＞20  0.89  ＞10  ＞112    2  +  2.8  ＞100  ＞36  0.65  ＞100  ＞153SPL7320    1  -  ＜0.3  ＞100  ＞316    2  -  0.8  ＞100  ＞125  0.68  ＞100  ＞147    2  +  0.8  ＞100  ＞125  1.15  ＞10  ＞87

乳杆菌属测试的结果

     化合物    单位  卷曲乳杆菌(ID₅₀)詹氏乳杆菌(ID₅₀)  评注  膏霉素/链霉素    稀释¹    1∶150,00   1∶180,000对照化合物    SPL7013    μg/ml      ＞100      ＞100    SPL7304    μg/ml      ＞100      ＞100    SPL7320    μg/ml      ＞100      ＞100

¹青霉素和链霉素的起始浓度分别为1.25U/ml和1.25μg/ml。

附着和融合抑制测定的结果

       附着测定(μg/mls)       融合测定(μg/ml)化合物  IC₅₀  TC₅₀    TI  IC₅₀  TC₅₀  TI芝加哥天蓝  0.66  ＞10    ＞15  0.79  ＞10  ＞12  0.09  ＞10    ＞111  0.62  ＞10  ＞16SPL7013  0.57  ＞100    ＞175  0.71  ＞100  ＞141SPL7304  ＜0.32  ＞100    ＞312  ＜0.32  ＞100  ＞312  0.036  ＞1    ＞2778  0.56  ＞1  ＞178SPL7320  ＜0.32  ＞100    ＞312  0.49  ＞100  ＞204  0.049  ＞1    ＞2041

(ii)SPL7013，SPL7304和SPI7320抗HIV-1 RoJo及SIV 89.6pd的活性

方法

病毒

人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)株RoJo是一种低传代儿科分离株，来自Southern Researeh Institute(SRI)的实验室。SHIV 89.6pd获自SRI的Mark Lewis，原种生长在人PBMCs中用于进行抗病毒测定。

PBMC的分离和促增生(blasting)

利用ficou hypaque梯度分离从正常肝炎和HIV阴性供体中获得外周血单核的细胞(PBMCs)。简而言之，抗凝血用不含Ca⁺⁺和Mg⁺⁺的Dulbecco′s磷酸缓冲盐水(PBS)1∶1稀释，在50ml离心管中铺层到14ml的淋巴细胞分离介质上。离心管600xg离心30分钟。轻轻地从所得界面吸出分成条带的PBLs，随后通过低速离心用PBS洗涤2遍。将单核的细胞计数，通过台盼蓝染料排斥测定存活，并将细胞按1×10⁶细胞/mL重悬在补充15％FBS(热灭活)，2mM L-谷氨酰胺，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，和10μg/mL庆大霉素及2μg/mL植物凝血素(PHA)的RPMI 1640培养基中。在37℃，5％CO₂培养细胞48到72小时。温育后，离心收集细胞，洗涤并重悬在补充15％FBS(热灭活)，2mM L-谷氨酰胺，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，和10μg/mL庆大霉素及20U/mL重组IL-2(R & D Systems，Minneapolis，MN)的RPMI 1640中。在培养基中包含IL-2是为了维持由PHA促有丝分裂刺激启动的细胞分裂。细胞在IL-2中培养72小时，然后用于病毒攻击。

PBMC测定：

将已经用PHA和IL-2促增生的来自最少两个供体的人外周血单核的细胞计数，用台盼蓝染料排斥测定存活，并等比例混合。使用合并的供体以最小化在个体供体之间观察到的变异，这种变异来自于初级淋巴细胞群的HIV感染以及对PHA和IL-2的总体反应方面的量和质的差异。将细胞按1×10⁶细胞/mL重悬在补充15％胎牛血清(热灭活)，2mM L-谷氨酰胺，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，和10μg/mL庆大霉素及重组IL-2(20U/mL，R & D Systems，Minneapolis，MN)但不含酚红的RPMI 1640中。然后将50微升的细胞按SouthernResearch Institute的Infectious Disease Research department制定的标准格式分布到96孔圆底微量培养板的内60个孔中。每板含有细胞对照孔(只有细胞)，病毒对照孔(细胞加病毒)，和试验孔(药物加细胞加病毒)。将系列稀释的化合物加入到微量板中，随后加入适当的预先滴定的HIV-1或SHIV-1株。所有样本测定一式三份，复制板不含病毒用于确定化合物毒性。

每孔的终体积是200μl。将测定物在潮湿大气，37℃，5％CO2温育6天，之后收集上清用于RT活性的分析，利用MTS染料还原分析姐妹板的细胞存活。还在显微镜下观察孔并记录下任何的异常。

细胞存活的MTS染色：

在测定结束时，用可溶性的基于四氮唑的染料MTS(CellTiterReagent Promega，Madison，WI)对测定板进行染色，以确定细胞存活和定量化合物毒性。代谢活性细胞的线粒体酶将MTS代谢为可溶性的甲产物，这允许快速定量分析细胞存活和化合物细胞毒性。该试剂为单一稳定溶液，在使用前无需制备。在PBMC测定终末，每孔中加入20μl MTS试剂，在37℃温育4小时。用板密封器取代板盖，密封的板倒转几次以混合可溶性的甲产物，并用Molecular DevicesVmax读板机在490nm分光光度法读板。

逆转录酶测定

在无细胞的上清中测定逆转录酶活性。将氚标记胸苷三磷酸(NEN)(TTP)以5Ci/mL重悬在蒸馏水中。制备Poly rA和oligo dT原液并保存在-20℃。每天制备新鲜的RT反应缓冲液，它由125μl1.0M EGTA，125μl dH₂O，110μl 10％SDS，50μl 1.0 M Tris(pH 7.4)，50μl1.0M DTT，和40μl 1.0M MgCl₂组成。按2份TPP，1份poly rA：oligodT和1份反应缓冲液的比例将这三种溶液混合在一起。将10微升的该反应混合物置入圆底微量板中，加入15μl含病毒的上清并混合。将板温育在37℃的水浴中，且用固体支持物以防止板浸没，温育60分钟。反应后，将反应体积点到DE81纸上，在5％磷酸钠缓冲液中洗5次，每次5分钟；在蒸馏水中洗2次，每次1分钟；在70％乙醇中洗2次，每次1分钟，然后干燥。将Opti-Fluor O加到每个标本，利用Wallac 1450 Microbetaplus液体闪烁计数器定量掺入的放射性。

数据分析

提供了IC₅₀(抑制病毒复制50％)，TC₅₀(细胞存活减少50％)，与治疗指数(TI，IC₅₀/TC₅₀)。将AZT用作各测定的相关的阳性对照化合物。

以下的表中总结了实施的抗病毒评价的结果：

化合物在PBMCs中抗病毒活性的总结

化合物        HIV-1 RoJo感染的PBMCs             (μg/ml)        SHIV 89.6pd感染的PBMCs               (μg/ml)  IC₅₀    TC₅₀    TI    IC₅₀    TC₅₀    TISPL7013  6.1    ＞100    ＞16    0.25    ＞100    ＞400SPL7304  13.2    ＞100    ＞7.6    0.92    ＞100    ＞109SPL7320  2.6    ＞100    ＞39    0.29    ＞100    ＞345AZT(μM)  0.005    ＞1    ＞200    0.002    ＞1    ＞500

B.抗疱疹病毒HSV-1和HSV-2的活性

(i)病毒噬斑减少测定

一般方法

测定中使用的是HSV标准株G(HSV-2)和F(HSV-1)。6孔板的病毒输入是100pfu/孔。在病毒生成减少测定中使用HSV敏感细胞系Vero细胞。将一种上皮细胞系Hela-229细胞用于细胞毒性测定。

通过改良的噬斑减少试验确定化合物的抗病毒作用。

用PBS洗涤汇合的细胞，随后用HSV(100pfu/孔)在37℃下感染1小时，每10分钟倾斜1次。除去病毒接种物后，用PBS洗涤感染的细胞，并用含0.5％甲基纤维素的培养基(等体积的1％甲基纤维素与2X培养基混合)覆盖细胞。对于HSV-2感染，细胞在37℃下温育2天，而HSV-1感染则温育3天。当噬斑足够大时，用10％福尔马林固定细胞10分钟。随后用0.5％结晶紫染色噬斑10分钟。用自来水洗涤去除染料并在通风橱中干燥。然后计数噬斑。

所有的数据来自于一式两份试验。将测试孔的平均噬斑计数与对照孔的平均噬斑计数进行比较。

计算EC₅₀(令接种物噬斑计数减少50％的浓度)。在相同的细胞系中平行地进行抗病毒活性和细胞毒性测定。50％细胞毒性浓度(CC₅₀)定义为将模拟感染细胞存活减少50％所需的化合物浓度。

感染前处理方法

从6孔板中汇合的Vero细胞去除培养基，并用1ml PBS洗涤。每个孔中加入1ml含浓度为0，0.01，0.03，0.1，0.3，1，3，10，和30μg/ml化合物的培养基，在37℃温育1小时。

在细胞与树状体预温育后，然后用100pfu/孔的HSV-1或HSV-2感染细胞。将感染物在37℃下温育1小时，每10分钟倾斜1次。除去接种物后，用1.5ml的用2×培养基稀释的0.5％甲基纤维素覆盖感染细胞用于噬斑测定。

处理感染的细胞

用PBS洗涤汇合的Vero细胞。然后用100pfu/孔的HSV-1或-2在37℃下感染细胞1小时。去除病毒接种物后，用PBS洗涤感染的细胞1次，并用含浓度为0，0.03，0.1，0.3，1，3，10，30和100μg/ml树状体的0.5％甲基纤维素覆盖细胞。在37℃温育细胞2天(HSV-2)或3天(HSV-1)用于噬斑测定。

树状体的细胞毒性

通过泵从24孔板中汇合的Hela-229细胞中去除培养基。然后用1ml PBS洗涤细胞1次。在每个孔中加入含浓度为0，100，500和1000μg/ml树状体的培养基。将细胞在37℃培养箱中温育2天。在培养结束时，去除培养基并用PBS洗涤细胞。随后在每个孔中加入500μl的0.01％中性红(在PBS中)，37℃温育30分钟。然后去除染料，用每孔1ml的PBS洗涤细胞2次。在每个孔中加入500μl 50％乙醇和1％冰醋酸的PBS溶液并在室温下120-150rpm轻轻摇晃下温育15分钟以提取染料。将来自每孔的100μl提取的染料加入到96孔板中，用ELISA读板机读出550nm的吸光度。

抗HSV-1和HSV-2活性的表

化合物处理EC₅₀(μg/ml)CC₅₀(μg/ml)SPL-7013PT/HSV-20.61＞1000SPL-7013PT/HSV-10.93＞1000SPL-7013INF/HSV-23.59＞1000SPL-7013INF/HSV-14.59＞1000SPL-7304PT/HSV-20.4＞1000SPL-7304PT/HSV-13＞1000SPL-7304INF/HSV-254.4＞1000SPL-7304INF/HSV-150.4＞1000SPL-7320PT/HSV-20.6＞1000SPL-7320PT/HSV-12.2＞1000SPL-7320INF/HSV-233.3＞1000SPL-7320INF/HSV-116.4＞1000

PT＝感染前处理

INF＝处理感染的细胞

(ii)疱疹病毒-2，在动物模型中的效力

在小鼠(MS品系)模型中测定SPL-7013在预防生殖器HSV试验中的效力。在HSV-2感染前20秒，将15μl的100mg/ml或10mg/ml剂量的化合物滴入16只动物的阴道中。与对照相比，SPL-7013在所有测试动物中预防了感染和疾病。将相同数目的对照感染小鼠在3天内总死亡率作为测试的终点。

小鼠中HSV-2生殖道感染和疾病处理的表

浓度(mg/ml)动物数目           保护的动物疾病(％)感染(％)1001111/11(100％)11/11(100％1001212/12(100％)12/12(100％101211/12(97％)10/12(83％)PBS对照120/12(0％)0/12(0％)

所有动物在感染前20秒进行处理

C.人乳头瘤病毒(HPV)，人上皮细胞摄取的抑制

评价化合物抑制人乳头瘤病毒样颗粒结合及摄取进人上皮细胞系的能力。

化合物以6个稀释度范围进行测试，作为6b型人乳头瘤病毒的乳头瘤病毒荧光染料标记的病毒样颗粒(VLPs)的结合及摄取的抑制物。在SPL-7013存在下使VLPs结合并被摄取入上皮细胞。用流式细胞仪测定结合与摄取，对结合的抑制表示为相对于在缺乏抑制物下观察到的结合的百分比。在两个独立的测定中进行试验。

方法

细胞：人表皮样癌细胞系A431购自美国典型培养物保藏中心，第30代(CRL-1555，Batch F-13530)，并保存在含10％FCS的DMEM中。

根据标准的操作程序培养和纯化6b型人乳头瘤病毒VLPs。颗粒用荧光染料标记。

将化合物重新溶解在无菌水中使浓度达到5mM，在-20℃下冷冻之前新鲜地用于第一次测定。然后将化合物融化用于第二次测定。

摄取测定

用10ml PBS/EDTA(0.05％)在37℃下洗涤T75瓶中的A431细胞5分钟，然后用2ml胰蛋白酶在37℃下进一步处理5分钟。往细胞中加入DMEM/10％FCS(10ml)，在室温下1000xg离心细胞5分钟，然后按3×10⁵细胞/ml重悬在15ml管中的完全培养基中。在37℃培养细胞2小时且每20分钟倒转1次以允许细胞表面蛋白的重表达。

在室温下1000xg离心细胞5分钟，按3×10⁵细胞/100μl重悬于无血清的DMEM中，并将100μl的悬液置入1.5ml管中。将含以下6个稀释度的化合物的10μl PBS加入到细胞中：100μM，10μM，1.0μM，100nM，10nM，1.0nM。

在加入标记的VLPs(200ng)之前，将细胞与化合物在37℃温育30分钟。只将VLPs加入到细胞中作为阳性对照，细胞中加入VLPs但在冰上温育作为阴性对照。混合细胞并在37℃温育2小时。用1mlPBS洗涤细胞1次，并用FACS缓冲液固定(PBS/4％低聚甲醛)。用Coulter FACS机器进行分析。

分析

利用WinLisT分析结果。首先用前向/侧向散射分析细胞大小，并分选活细胞。生成该分选的平均荧光强度(MFI)并用于进一步的分析。摄取报告为相对于单独VLPs(100％)及与VLPs温育于冰上的细胞(0％)所观察到的结合的百分比。

结果

SPL-7013，在1μM观察到了对摄取的最大抑制(26％摄取)，在更高的浓度没有进一步的抑制。该化合物在1μM和10nM仍显示摄取抑制。在该点后随着SPL-7013浓度降低病毒摄取增加。

D.沙眼衣原体感染：SPL-7013在动物模型中的效力。

在沙眼衣原体感染前20秒，用15μL的100mg/ml SPL-7013溶液滴注上或下生殖道处理雌性小鼠(MS品系)。下生殖道感染定义为培养在攻击后3天或6天采集的阴道拭子标本分离到病原体。对于上生殖道感染的定义为培养在攻击后10天收集的上生殖道组织分离到病原体。用磷酸缓冲液PBS处理的小鼠作为对照。

对小鼠中沙眼衣原体生殖道感染的效应

                受保护未发生感染的动物

组oup      动物数目       时间        下生殖道(％)      上生殖道(％)

组1.

SPL-7013      16          -20秒         8(50％)^a         8(50％)

PBS           15          -20秒         1(7％)            2(13％)

组2.

SPL-7013      16          -20秒         6(38％)           8(50％)^a

PBS           16          -20秒         1(7％)            1(6％)

本领域技术人员懂得可以对这里宽泛描述的发明在不偏离本发明的精神和范围的前提下进行变更和改进，除了那些特别描述的。应理解本发明延伸到包括所有这些变更和改进。

参考文献：

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