用于胆固醇定量的试样预处理方法和以该方法对特定脂蛋白中胆固醇定量的方法

摘要

用于胆固醇定量的试样的预处理方法，其特征在于，在测定试样中特定脂蛋白中存在的胆固醇之前，先用以游离型胆固醇为底物的酶和必要时加入的反应促进物质作用于含有脂蛋白的试样；利用该预处理方法的特定脂蛋白中胆固醇的定量方法；使用该定量方法的用于胆固醇的试剂盒。根据该定量方法，基本上不必使用聚阴离子等，通过简便操作即可正确、高效率的定量测定特定级分中的胆固醇，适用于各种自动分析装置。

说明书

本案是母案申请号为00809286.9、申请日为2000年6月14日的分案申请。

技术领域

本发明涉及试样的预处理方法，用于以较少试样通过简单操作就可以正确、高效地分离定量存在于特定级分中的胆固醇，以及以此测定特定级分中胆固醇的方法。

背景技术

胆固醇等脂质，在血液中与脱辅基蛋白质一起形成脂蛋白。这类脂蛋白因物理性状的差别，分为乳糜微粒、极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)等。已知上述脂蛋白中，LDL是引起动脉硬化的病因物质之一，另外，HDL显示抗动脉硬化作用。

就是说，从流行病学方面来说，已知LDL中的胆固醇值与动脉硬化性疾病的发病频率呈正相关，而HDL中的胆固醇值与动脉硬化性疾病的发病频率呈免相关。因此，如今，广泛进行LDL或HDL中的胆固醇测定以预防或诊断缺血性心脏疾病。

作为LDL或HDL中胆固醇的测定方法，已知有例如将LDL或HDL通过超速离心与其它脂蛋白分离以后，测定胆固醇的方法，或者利用电泳分离之后进行脂质染色，测定发色强度的方法。不过这些方法操作都很复杂，无法处理大量检品，日常几乎难以应用。

目前，作为HDL中胆固醇的测定方法，临床应用的方法有沉淀法，是向检品中加入沉淀剂，使HDL以外的脂蛋白凝聚，然后离心去除，测定分离出的只含HDL的上清中的胆固醇。该方法与超速离心法和电泳法相比比较简便，但因为包括加入沉淀剂分离操作，需要比较多的检品量，而且产生分析误差的可能性也高，整个分析过程无法自动化。

另外，也讨论了以酶分别定量HDL中的胆固醇的方法。例如，在胆汁酸盐和非离子表面活性剂的存在下，进行酶反应的方法(特开昭63-126498号)。该方法在反应初期的酶反应与LDL中的胆固醇浓度成正比，然后的反应速度虽然利用于与HDL中的胆固醇浓度成正比的关系，但是无法区别HDL中的胆固醇和其它脂蛋白中的胆固醇的反应，存在正确性的问题。

已知有将HDL以外的脂蛋白先凝聚了以后，HDL中的胆固醇单独发生酶反应，然后酶失活同时再溶解凝聚，测定吸光度的方法(特开平6-242110号)。不过，该方法必须要至少添加3次试剂的操作，只适用于有限的自动分析装置，有通用性的问题。而且，再溶解沉淀的时候使用高浓度的盐等，对分析仪器有危害，无法满足试剂废弃的要求。

另外，已知有如下的HDL中胆固醇的测定方法，在第1反应中，在特殊的表面活性剂存在下，胆固醇氧化酶与胆固醇酯酶作用于HDL以外的脂蛋白，在与这些脂蛋白中的胆固醇优先反应之后，抑制对HDL以外的胆固醇的反应，测定HDL中的胆固醇(特开平9-299号)。但该方法与本发明有很大差异，表现在第1反应中，需要将HDL以外的脂蛋白的游离胆固醇以及酯型胆固醇转移到反应体系以外的特殊表面活性剂还有同时需要胆固醇氧化酶和胆固醇酯酶。

再者，日本专利第2600065号公开了组合使用沉淀HDL以外脂蛋白的沉淀试剂和胆固醇测定试剂，测定不沉淀的HDL中的胆固醇(HDL-C)的方法。实际上可以实施的方法是使用修饰的酶以及以硫酸化α-环糊精作为沉淀剂，因为沉淀剂的效果，生成的混浊对测定体系有妨碍，在测定精度上是存在问题的。

上述专利方法以论文发表在《生物试样分析》第19卷，第5期，305～320页，其中，报道了在用修饰的酶进行HDL-C测定时，仅修饰酶向反应体系中导入，就会造成正误差(与沉淀法相比，显示高值)，因此无法测定高脂血症患者血清中的HDL-C，为避免此现象，以1种聚阴离子硫酸化环糊精和氯化镁作为沉淀剂，测定了HDL-C。

为降低上述专利方法中沉淀剂所产生混浊的影响，有使表面活性剂共存的技术(特开平8-116996号)、使用抗体的技术(特开平9-96637号)、使用糖化合物(特开平7-301636号)等技术，上述无论任何一个都含有引起凝聚的试剂作为条件，基本上无法避免使用聚阴离子等沉淀剂。

最近本发明人等发现，通过利用只作用于特定脂蛋白的物质，不使用沉淀剂也可以正确定量特定级分中胆固醇的方法，提出了专利申请(特愿平9-244821号)。该方法与已有的沉淀法相比，具有极高的相关性，但是与沉淀法测定值的关系，与上述《生物试样分析》中所报告者具有同样倾向，为此，在医疗机构中为了获得与以往沉淀法有可比性的数据，要添加聚阴离子等。

但是，加入聚阴离子等，在测定体系中生成沉淀，有污染测定池等问题或者测定值波动等原因，这是不期望的，强烈要求从体系中排出沉淀物等。另外仅仅为了数据的一致而加入从测定原理是不必要的聚阴离子等，经济上也不合理，也需要解决。

因此，本发明的课题是提供本质上不必要聚阴离子等，通过简便的操作即可正确且高效率的定量测定特定级分中的胆固醇、适合各种自动分析装置的方法。

发明内容

本发明人等，对上述《生物试样分析》中所报告的利用只作用于HDL等特定脂蛋白的物质对特定级分中的胆固醇定量测定的值比沉淀法高的原因进行了研究，结论是非测定对象的HDL级分以外的脂蛋白(LDL、VLDL等)也会从表面或者其附近游离出少量游离型胆固醇，这是产生正误差的原因。因此，基于以上认识，发现，在脂蛋白实际上不变的条件下，预先消耗游离型胆固醇之后，再测定胆固醇，利用只作用于特定脂蛋白的物质进行定量测定的值就可以与沉淀法的值一致，由此完成了本发明。

就是说，本发明提供了一种定量胆固醇用试样的预处理方法，其特征在于，在测定试样中特定脂蛋白中存在的胆固醇之前，用以含有脂蛋白的试样中的游离型胆固醇为底物的酶作用。

另外，本发明提供了一种特定脂蛋白胆固醇的定量法，其特征在于，在以含有脂蛋白的试样中的游离型胆固醇为底物的酶作用以后，利用只作用于特定脂蛋白的物质测定特定脂蛋白中存在的胆固醇。

附图的简单说明

图1表示实施例1中本发明与沉淀法的相关关系，图2表示实施例2中本发明与沉淀法的相关关系。

图3表示实施例5中反应促进物质的效果。

实施发明的最佳方案

本发明中，在测定试样中特定脂蛋白中存在的胆固醇之前，作为预处理，首先用以含有脂蛋白的试样中的游离型胆固醇为底物的酶作用，消耗游离型胆固醇。

作为以游离型胆固醇为底物的酶，例如只要是胆固醇脱氢酶、胆固醇氧化酶等以游离型胆固醇为底物的酶即可。上述可以是来源于微生物、动物、植物等任何来源，而且也可以是通过基因工程制成的。此外有无化学修饰均可。上述酶用量一般为0.001单位～100单位/毫升，优选0.1单位～100单位/毫升。

对试样以含有脂蛋白的试样中的游离型胆固醇为底物，用酶作用的条件没有限制，只要是该酶的推荐条件即可。不过，在对试样以含有脂蛋白的试样中的游离型胆固醇为底物，用酶作用的阶段，应注意不发生酯型胆固醇转变为游离型胆固醇的反应。就是说，虽然有无胆固醇酯酶并非问题，但是应维持使其实际上不发生作用的条件。

以上述游离型胆固醇为底物的酶，如有必要，可以使用辅酶，作为辅酶，例如可以使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸等。上述酶可以单独使用或2种以上组合使用，其使用量因酶而异，没有特别限制，不过使用量为0.001单位～100单位/毫升，优选0.1单位～100单位/毫升。

本发明中使用的以游离型胆固醇为底物的酶，如上所述对其来源没有限制，浓度等可按照满足期望性能、操作性等适当选择。因此，例如为在一定时间内完成预处理，可以增加酶的量，反之，为了节约酶，延长预处理时间即可。

不过，在以自动分析仪进行测定的前提下的检查试剂的情况，需要同时满足两种要求。也就是说，有时候要求利用少量酶在短时间内结束预处理。在这种情况下，通过使选自以下组的反应促进物质共存，使用以游离型胆固醇为底物的酶进行预处理，无需延长预处理时间，就可以降低酶的量，获得期望的性能。

为达到上述目的而利用的反应促进物质例如，氟灭酸、甲灭酸、2，2′，6′，2″-三联吡啶、惕各酸、梭链孢酸、醋酸倍他米松、莫能菌素、洛伐他汀等(反应促进物质的盐或反应促进物质的金属衍生物(铝衍生物等)存在时与其一样)。其中，氟灭酸和甲灭酸为已知非甾体抗炎药，梭链孢酸和莫能菌素是已知抗生素。

上述化合物作为反应促进物质使用时，应分别考虑其性质，测定体系的pH、离子强度、混在物的种类、浓度等，适当选择浓度等。

反应促进剂的使用浓度可以通过与测定体系的条件相同的实验加以确定，一般来说，氟灭酸的时候，为0.01～100mM左右，梭链孢酸的情况下，为0.01～10mM左右，甲灭酸、2，2′，6′，2″-三联吡啶、醋酸倍他米松的情况下，0.01～5mM左右，莫能菌素、洛伐他汀的情况下0.01～1mM左右，惕各酸的情况下，1～500mM左右。

通过使用上述反应促进剂，可以将以游离型胆固醇为底物的酶的用量降低到几分之一到几十分之一。而且也可以在同一酶量下缩短反应时间。

上述以游离型胆固醇为底物的酶(以及必要时的反应促进剂)进行的预处理时，以不损害进一步测定的特异性、调整酶的作用为目的，或者在特定脂蛋白不发生凝聚的范围内，可以使用其它酶(对脂蛋白有实际影响者除外)或盐、用于调整pH的缓冲剂、表面活性剂(对脂蛋白有实际影响者除外)、防腐剂、白蛋白等蛋白质、抗体、抗生素、皂甙、凝集素、聚阴离子等对特定脂蛋白具有亲和性的试剂。

因此，本发明中，作为用于测定试样中特定脂蛋白中存在的胆固醇的预处理剂，可以利用含有以下构成成分者。

(必要成分)

例如胆固醇脱氢酶、胆固醇氧化酶等以游离型胆固醇为底物的酶。

(任意成分)

例如氟灭酸、甲灭酸、2，2′，6′，2″-三联吡啶、惕各酸、梭链孢酸、醋酸倍他米松、莫能菌素、洛伐他汀等反应促进物质。

(其它成分)

例如NAD等辅酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、心肌黄酶、抗坏血酸氧化酶等其它酶；胆酸等酸、盐，用于调节pH的缓冲剂，对脂蛋白没有实际影响的表面活性剂，防腐剂，白蛋白等蛋白质，抗体，抗生素，皂甙，凝集素、聚阴离子，4-氨基安替比林等偶合剂，Trinder试剂等氢供给体等氧化体系发色试剂，吩嗪偏硫酸盐等电子受体类，硝基蓝四唑等还原体系发色试剂。

本发明中，通过上述预处理消耗了脂蛋白中的游离型胆固醇以后，可以测定试样中特定脂蛋白中存在的胆固醇。

作为测定试样中特定脂蛋白中存在的胆固醇的方法，只要是可以只作用于特定脂蛋白的物质、测定该脂蛋白中存在的胆固醇的方法，可以利用任何方法。

该方法例如特开平11-56395号公开的以选自聚氧乙烯亚烷基苯基醚和聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚的表面活性剂作为只作用于特定脂蛋白的物质，在其存在下，添加测定胆固醇用酶试剂，测定脂蛋白之中，高密度脂蛋白中的胆固醇优先与胆固醇测定用试剂反应的时间内该胆固醇的反应量。

其中，前者的聚氧乙烯亚烷基苯基醚的市售品的例子有EmulgenA-60(花王公司)等，后者聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚的市售品例如Emulgen B66(花王公司)。

另外，作为其他方法，可以使用《生物试样分析》，19卷，第5期第305页～320页公开的使用修饰酶作为只作用于特定脂蛋白的物质的方法。该文献的方法中，为抑制HDL以外脂蛋白级分的反应，需要使用硫酸化α-环糊精和氯化镁，不过利用本发明的预处理方法，无需使用这些物质。

测定特定脂蛋白中存在的胆固醇的方法，除利用只作用于特定脂蛋白的物质以外，也可以采用常规胆固醇的测定方法用的试剂。作为所用的试剂中所含的成分，例如，胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、胆固醇脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、心肌黄酶、过氧化物酶等酶，发色剂，辅酶，电子受体，蛋白质(白蛋白等)，防腐剂，表面活性剂，盐，酸，调节pH的缓冲剂等。

上述成分中，作为表面活性剂，可以使用离子型或者非离子型表面活性剂，例如聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯缩合物、聚氧乙烯烷基醚硫酸盐、烷基苯磺酸盐、胆酸盐类等。该表面活性剂的用量因化合物而异，没有特别限制，优选0.0001～5％、更优选0.001～5％。

作为缓冲剂，没有限制，可以使用Good′s缓冲剂、磷酸、Tris、邻苯二甲酸盐等常规物质。另外，其用量没有特别限制，为0.005M～2M，优选0.01～1M。

根据本发明定量测定特定脂蛋白级分中胆固醇的方法，典型的，首先向测定试样中添加只作用于游离型胆固醇的预处理剂，然后，添加胆固醇定量试剂(以下称为定量试剂)，包括只作用于特定脂蛋白的物质以及常规胆固醇测定方法所用的试剂，混合，测定特定脂蛋白级分中的胆固醇量。

其具体例，例如有在检品中混合胆固醇脱氢酶和辅酶(NAD)，然后添加含有胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶等的胆固醇测定试剂的方法；在检品中混合胆固醇脱氢酶和NAD，然后添加含有胆固醇酯酶等的胆固醇测定试剂的方法；检品和胆固醇酯酶与过氧化物酶、4-氨基安替比林或者过氧化氢酶等混合之后，添加含有胆固醇脂酶等的胆固醇测定试剂的方法；检品和胆固醇氧化酶与过氧化物酶、4-氨基安替比林等混合之后，添加含有胆固醇脂酶、胆固醇脱氢酶、NAD等的胆固醇测定试剂的方法；但不限于此。

作为测定特定脂蛋白级分中胆固醇的方法，可以采用任何公知的酶测定法，例如组合使用酶试剂胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的方法，组合使用胆固醇酯酶和胆固醇脱氢酶的方法等。

本发明中，预处理反应第1反应中所使用的酶与定量方法第2反应测定胆固醇中所用的酶可以相同也可以不同。或者第1反应中使用过量酶，将其用于第2反应也可以。重要的是消耗指蛋白表面存在的少量游离型胆固醇(第1反应，预处理反应)，然后在只作用于所要测定的特定脂蛋白的酶作用的状态下，定量测定构成该脂蛋白的大部分胆固醇(游离型胆固醇+酯型胆固醇)即可。

另外，添加上述测定胆固醇用酶试剂后，最终检测胆固醇的方法没有特别限制，例如可以利用过氧化物酶与色原体、心肌黄酶或电子受体与还原系发色试剂再组合进行的吸光度分析，直接检测辅酶或过氧化氢的方法。辅酶也可以用辅酶循环系统扩增。

为使本发明方法容易实施，优选采用适用本目的的用于定量测定特定脂蛋白中胆固醇的定量用试剂盒。

上述试剂盒可以按照以上说明容易地设计，例如以游离型胆固醇为底物的酶，代表性的使用胆固醇氧化酶、胆固醇脱氢酶场合的试剂盒分别表示如下：

[胆固醇氧化酶时的试剂盒]

(甲)由以下试剂(1)和(2)构成的测定特定脂蛋白中胆固醇的胆固醇定量用试剂盒。

(1)第1试剂，含有胆固醇氧化酶和消耗过氧化氢的物质(有时候还含有反应促进物质)

(2)第2试剂，含有只作用于特定脂蛋白的物质，胆固醇酯酶和发色剂。

(乙)由以下试剂(1)和(2)构成的测定特定脂蛋白中胆固醇的胆固醇定量用试剂盒。

(1)第1试剂，含有胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶和消耗过氧化氢的物质(有时候还含有反应促进物质)，

(2)第2试剂，含有只作用于特定脂蛋白的物质和发色剂。

(丙)由以下试剂(1)、(2)和(3)构成的测定特定脂蛋白中胆固醇的胆固醇定量用试剂盒。

(1)第1试剂，含有胆固醇氧化酶和消耗过氧化氢的物质(有时候还含有反应促进物质)，

(2)第2试剂，含有只作用于特定脂蛋白的物质，

(3)第3试剂，含有胆固醇酯酶和发色剂。

上述试剂中，所谓消耗过氧化氢的物质，是指消耗胆固醇氧化酶和胆固醇反应所得的过氧化氢，使之消失的物质。例如，过氧化氢酶、4-氨基安替比林等偶合剂、含有Trinder试剂等氢供体的氧化还原体系发色试剂等。

其中，4-氨基安替比林和Trinder试剂等氢供体与这些组合，与过氧化氢反应发色，用作上述(2)或(3)的发色剂。不过，作为本发明预处理工序所用的试剂(1)，优选只用偶合剂或者氢供体之一，通过非发色反应消耗过氧化氢。当然，也可以进行发色反应，调整测定值(从试剂(2)或试剂(3)的发色值中减去试剂(1)的发色值，进行调整)。

[胆固醇脱氢酶时的试剂盒]

(丁)由以下试剂(1)和(2)构成的测定特定脂蛋白中胆固醇的胆固醇定量用试剂盒。

(1)第1试剂，含有胆固醇脱氢酶和辅酶(有时还含有促进反应物质)

(2)第2试剂，含有只作用于特定脂蛋白的物质，胆固醇酯酶。

(戊)由以下试剂(1)和(2)构成的测定特定脂蛋白中胆固醇的胆固醇定量用试剂盒。

(1)第1试剂，含有胆固醇脱氢酶和辅酶(有时还含有促进反应物质)

(2)第2试剂，含有只作用于特定脂蛋白的物质，胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶、过氧化物酶和发色剂。

(己)由以下试剂(1)和(2)构成的测定特定脂蛋白中胆固醇的胆固醇定量用试剂盒。

(1)第1试剂，含有胆固醇脱氢酶、辅酶和胆固醇酯酶(有时还含有促进反应物质)

(2)第2试剂，含有只作用于特定脂蛋白的物质。

(庚)由以下试剂(1)和(2)构成的测定特定脂蛋白中胆固醇的胆固醇定量用试剂盒。

(1)第1试剂，含有胆固醇脱氢酶、辅酶和胆固醇酯酶(有时还含有促进反应物质)

(2)第2试剂，含有只作用于特定脂蛋白的物质，胆固醇氧化酶、过氧化物酶和发色剂。

(辛)由以下试剂(1)、(2)和(3)构成的测定特定脂蛋白中胆固醇的胆固醇定量用试剂盒。

(1)第1试剂，含有胆固醇脱氢酶和辅酶(有时还含有促进反应物质)

(2)第2试剂，含有只作用于特定脂蛋白的物质

(3)第3试剂，含有胆固醇酯酶。

(壬)由以下试剂(1)、(2)和(3)构成的测定特定脂蛋白中胆固醇的胆固醇定量用试剂盒。

(1)第1试剂，含有胆固醇脱氢酶和辅酶(有时还含有促进反应物质)

(2)第2试剂，含有只作用于特定脂蛋白的物质

(3)第3试剂，含有胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶、过氧化物酶和发色剂。

(癸)由以下试剂(1)和(2)构成的测定特定脂蛋白中胆固醇的胆固醇定量用试剂盒。

(1)第1试剂，含有胆固醇脱氢酶、辅酶和消耗辅酶反应产物的物质(有时还含有促进反应物质)

(2)第2试剂，含有只作用于特定脂蛋白的物质和胆固醇酯酶。

(十一)由以下试剂(1)和(2)构成的测定特定脂蛋白中胆固醇的胆固醇定量用试剂盒。

(1)第1试剂，含有胆固醇脱氢酶、辅酶和消耗辅酶反应产物的物质

(2)第2试剂，含有只作用于特定脂蛋白的物质，胆固醇酯酶和发色剂。

上述采用胆固醇脱氢酶的试剂盒中，所谓消耗辅酶反应产物的物质，是指消耗胆固醇、胆固醇脱氢酶和辅酶(例如NAD)反应所得的还原型辅酶(例如NADH)，使之转变为最初的辅酶的物质。例如，以乳酸脱氢酶和丙酮酸(底物)为例。上述试剂盒中，均添加试剂(1)生成辅酶的反应产物，其中，(丁)、(己)、(辛)、(癸)中，不消耗反应产物，直接在测定阶段测定与添加试剂(1)发色同样波长的光，由试剂(2)或(3)所得的发色值减去添加试剂(1)后的预处理阶段的发色值，可以对特定脂蛋白中的胆固醇加以定量。另外试剂(1)中，预先添加消耗反应产物的物质，消耗了反应产物以后，再添加试剂(2)或试剂(3)发色也可以。这种情况下，最好在试剂(2)或试剂(3)中配合降低消耗反应产物的物质的作用的物质。另外，试剂盒(戊)、(庚)、(壬)、(十一)中，测定的是与预处理发色波长不同的发色，不一定非要从测定值中减去预处理的发色值。

应予说明，前面所说的氟灭酸、甲灭酸、2，2′，6′，2″-三联吡啶、惕各酸、梭链孢酸、醋酸倍他米松、莫能菌素、洛伐他汀等反应促进物质的用途并不限于本发明的预处理方法(试剂)和利用此方法的本发明的定量测定特定脂蛋白中胆固醇的方法(试剂盒)。

在使用以游离型胆固醇为底物的酶的胆固醇定量方法中，例如，在组合使用胆固醇氧化酶、过氧化物酶、发色剂的游离型胆固醇定量方法或者组合使用胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶、过氧化物酶、发色剂的总胆固醇定量方法中，当然可以使氟灭酸等反应促进物质等共存，可以获得降低以游离型胆固醇为底物的酶(在此是胆固醇氧化酶)的使用量、缩短酶反应的反应时间等效果。

因此，参照本说明书中有关胆固醇的定量方法的记载(例如，选择表面活性剂，以特定脂蛋白为测定对象等)，可以更具体地建立期望的定量方法。

工业实用性

根据本发明，通过离心分离等机械预处理，无需使用聚阴离子等，可以以简便的操作高效率的定量测定特定级分中的胆固醇。因此，因为不会因聚阴离子等产生沉淀，不会污染测定装置(特别是测定池)，而且测定值的波动也不会发生，因此与以往的胆固醇测定方法相比为优。

如后面的实施例所示，即使对中性脂肪水平高的检品，也能获得与以往沉淀法相关性高的测定值，从不选择试样的方面是好的。

使用反应促进剂的情况下，可以少使用以预处理时的游离型胆固醇作为底物的酶。

因此，本发明的方法，可以以少的试样、通过简便的操作，对于广泛范围的试样也可以正确、特异性地测定，适用于各种自动分析装置，在临床检验领域是极为有用的。

实施例

以下举出实施例对本发明作进一步说明，但不对本发明构成任何限制。

实施例1

根据如下所示的本发明方法和沉淀法，对含有脂蛋白的30例血清检品进行定量，比较其测定值。

(本发明方法)

向3微升检品中加入300微升含有0.1单位/毫升的胆固醇脱氢酶(天野制药)、2.5mM的NAD和0.03％4-氨基安替比林的10mM磷酸盐缓冲液(第1试剂：pH8.5)(预处理)。约5分钟后，加入100微升由含有1％Emulgen B 66、1.3单位/毫升胆固醇酯酶(旭化成)、2单位/毫升胆固醇氧化酶(旭化成)、5单位/毫升过氧化物酶(东洋纺)和0.04％的二磺基丁基间甲苯胺的100mM MES缓冲液构成的胆固醇测定试剂(第2试剂)。

在添加第2试剂之前和添加后5分钟测定吸光度，根据其差求出血清检品中HDL胆固醇的浓度(2点法)。采用已知浓度的胆固醇血清作为校正用物质。以上操作使用日立7150型自动分析装置。

(沉淀法)

200微升HDLC2“第1”分级试剂(第1化学药品株式会社)与200微升检品混合。3000rpm离心分离10分钟。取上清50微升，混合3毫升由含有1％Triton X-100、1单位/毫升胆固醇酯酶、1单位/毫升胆固醇氧化酶、5单位/毫升过氧化物酶、0.04％二磺基丁基间甲苯胺和0.04％4-氨基安皆比林的100mM MES缓冲液(pH 6.5)构成的胆固醇测定试剂，37℃温育10分钟，于600纳米处测定吸光度，测定HDL中的胆固醇浓度。

(结果)

结果如图1和表1所示。

                                       表1

检品编号  沉淀法(mg/dl)本发明方法(mg/dl)检品编号  沉淀法(mg/dl)本发明方法(mg/dl)    123456789101112131415    733953545775515243585949447035    723952545871515043585951466538    161718192021222324252627282930    544560505838563529635133526547    544759525639553731605036516349

由该结果可见，本发明方法即使不使用聚阴离子等也与以往的沉淀法具有良好的相关性。

实施例2

将实施例1中的第1试剂中的胆固醇脱氢酶、NAD和磷酸缓冲液分别用5单位/毫升的胆固醇氧化酶(东洋纺)、5单位/毫升的过氧化物酶(东洋纺)和100mM的MES(pH6)代替，比较测定值。

(结果)

结果如表2和图2所示。

                                        表2

检品编号  沉淀法(mg/dl)本发明方法(mg/dl)检品编号  沉淀法(mg/dl)本发明方法(mg/dl)    123456789101112131415    733953545775515243585949447035    733852565774525044585751456937    161718192021222324252627282930    544560505838563529635133526547    544761505537563529615233526646

由该结果可见，本发明方法即使不使用聚阴离子等也与以往的沉淀法具有良好的相关性。

实施例3

使用实施例1和实施例2的试剂，测定中性脂肪水平不同的5个血清检品，与以往方法的测定值相比较。结果如表3所示。

                                 表3

  沉淀法值(mg/dl)实施例1方法的值(mg/dl)实施例2方法的值(mg/dl)中性脂肪值(mg/dl)  检品A检品B检品C检品D检品E    4749266037    4950276140    4949246136    198301742517428

由表3所示可见，根据本发明，即使对于中性脂肪水平高的检品也可以获得与以往方法同水平的测定值。

实施例4

实施例2的第1试剂中，将5单位/毫升的胆固醇氧化酶改变为以下表4的浓度和组合，进行实施例1同样的测定，其测定值与沉淀法和实施例2的方法(基准测定体系)进行比较。第2试剂使用与实施例1同样物质。结果如表5所示。

(试验用试剂组成)

                              表4

  试验体系    组成内容    基准ABCDEFGHI    胆固醇氧化酶(5单位/毫升)胆固醇氧化酶(1单位/毫升)氟灭酸                    +    胆固醇氧化酶(0.15mM)                       (1单位/毫升)甲灭酸                    +    胆固醇氧化酶(0.1mM)    (1单位/毫升)2，2’，6’，2”-三联吡啶 +    胆固醇氧化酶(0.5mM)                        (1单位/毫升)惕各酸                    +    胆固醇氧化酶(50mM)                         (1单位/毫升)梭链孢酸                  +    胆固醇氧化酶(0.1mM)                        (1单位/毫升)醋酸倍他米松              +    胆固醇氧化酶(0.2mM)                        (1单位/毫升)莫能菌素                  +    胆固醇氧化酶(0.2mM)                        (1单位/毫升)洛伐他汀                  +    胆固醇氧化酶(0.05mM)                       (1单位/毫升)

(结果)

                                       表5

检品沉淀法(mg/dl)                       试  验  体  系  (mg/dl)   基准     A       B       C       D       E       F       G       H       I    12345678910111213141516171819202122232425    80767571717169676665575654535251494745474239321840    77      72      77      68      76      74      74      74      74      7674      72      74      64      73      71      73      74      74      7372      70      72      66      71      70      70      70      71      7172      71      70      66      69      69      71      69      71      7270      70      69      61      68      67      68      70      69      7070      67      70      63      68      68      67      69      70      6866      63      66      61      65      65      65      64      65      6669      70      68      60      68      67      66      69      68      6865      65      65      59      65      64      63      65      65      6565      64      65      58      65      64      62      64      65      6358      56      57      54      57      56      57      57      58      5756      55      55      49      55      54      53      55      55      5555      54      55      50      54      53      53      53      54      5454      54      52      46      53      52      52      54      52      5353      52      51      47      52      51      49      52      51      5253      51      50      46      50      51      49      51      51      5150      48      48      44      47      48      47      48      48      4948      48      46      41      46      46      45      47      47      4746      48      44      38      46      43      45      47      47      4647      49      45      40      46      45      45      48      47      4744      44      43      39      43      42      41      43      44      4342      43      41      37      41      41      39      41      41      4135      36      33      31      36      34      32      34      34      3320      22      19      17      23      19      18      21      20      1942      42      41      38      45      41      40      41      42      41  相关系数斜  率截  距    -    0.996   0.990   0.998   0.992   0.995   0.997   0.997   0.994   0.995   0.9970.905   0.838   0.941   0.832   0.856   0.888   0.915   0.877   0.891   0.9175.6     8.7     2.6     3.4     7.5     4.6     2.8     6.3     5.7     4.1

由此结果可见，在比基准测定体系(实施例2)相比胆固醇氧化酶减少1/5的时候(实验体系A)，相关系数也有一定降低，切片值也有一定增加，在使用反应促进物质的情况下，即使胆固醇氧化酶的用量为基准测定体系的1/5也可以获得大致相同的结果，显然使用反应促进物中可以减少胆固醇氧化酶的使用量。

实施例5

调制如下表6记载的试剂(J～L)，其中均含有1.25单位/毫升的过氧化物酶(东洋纺)、0.01％4-氨基安替比林、0.02％二磺基丁基间甲苯胺、50mM NaCl，其中缓冲液的种类和pH、胆固醇氧化酶(东洋纺)和氟灭酸(Sigma)的浓度不同。

                     表6

试剂  ①缓冲液(pH)②胆固醇氧化酶，浓度③氟灭酸浓度J①50mM  Bis-Tris(pH 6.0)②0.5、1.0、2.5、5.0单位/ml③0、0.01、0.05、0.1mMK①50mM  PIPES(pH7.0)②0.5、1.0、2.5、5.0单位/ml③0、0.1、0.5、1.0mML①50mM  MOPS(pH8.0)②0.5、1.0、2.5、5.0单位/ml③0、1.0、5.0、10.0mM

向3微升血清检品中加入300微升试剂J～L，37℃下反应5分钟，然后于600纳米测定吸光度。以上操作采用日立7150型自动分析仪测定。

用试剂J～L测定4例血清检品。

试剂J～L均以5.0单位/毫升胆固醇氧化酶、0mM氟灭酸试剂下所得吸光度为100。计算各胆固醇氧化酶、氟灭酸浓度下的相对吸光度。

(结果)

4个检品的相对吸光度的平均结果如图3所示。图中胆固醇氧化酶以COD表示。

在各pH下，相对吸光度与氟灭酸呈浓度依赖性增加。确认，使用反应促进物质可以减少胆固醇氧化酶的用量。

反应促进物质也可以用于使用以游离型胆固醇为底物的酶测定游离型胆固醇的方法或者总胆固醇的测定方法。