日本落叶松微体繁殖的茎诱导方法

摘要

本发明涉及林业科学中林木繁殖及植株再生技术，具体地说是一种日本落叶松微体繁殖的茎诱导方法。它选取日本落叶松无性系、不同年龄植株1年生的枝条为材料，取其腋芽，经不定茎形成、伸长生长、继代培养等，实现茎器官的再生。本发明为日本落叶松再生植株的形成提供了一种速度快、周期短、不受季节影响，且具有较高增殖效率的繁殖方法。

说明书

技术领域

本发明涉及林业科学中林木繁殖及植株再生技术，具体地说是一种日本落叶松微体繁殖的茎诱导方法。

背景技术

落叶松属松科(Pinaceae)中的落叶松亚科(Laricodeae)，本属种质资源丰富，据资料报道，金世界共有落叶松25个种及若干变种、杂种，其中17种分布在我国(文献1：王战(主编)，张颂云(副主编)，1992，中国落叶松林，北京：中国林业出版社，pp1-3)。它们分布广，遍及北半球的亚热带山区、温带山区及寒温带平原地区。落叶松具有适应性强、生长速度快、成林早、抗病虫害以及木材强度高、耐腐性强等优良品质，在工业上有广泛的用途并能作为重要的造纸原料。由于落叶松的上述特性，可作为大面积造林树种。

日本落叶松(Larix Kaempferi(Lamb)Carr.)原产于日本本州岛中部，迄今已在世界许多国家有了引种栽培，我国最早引种日本落叶松是在1884年，少量种植于青岛崂山。历经百年，引种范围已经扩大到北起黑龙江林口，南至湖南安化，东从青岛崂山，西至新疆哈密，但栽培区域主要集中在辽、吉、鲁、鄂、川、陕、甘等省。70年代和80年代进行的两次落叶松种间对比和日本落叶松种源联合实验表明，在我国降雨量500mm以上的温带山区和亚热带中高山区，日本落叶松同其他同属种相比，如长白落叶松(L.olgensis Henry)、华北落叶松(L.principis-rupprechtii Mayr.)、兴安落叶松(L.gmelini Rupr.)等，具有较大的生长优势(文献2：马常耕，王建华，1992，我国发展日本落叶松问题的探讨，落叶松种和种源的选择，北京：北京农业大学出版社，pp22-29)。但是由于日本落叶松种子年稀少，结实量少，种子不宜采集和发芽率低等弱点，利用天然的种子远远不能满足生产的需要，因此，人们对其进行了一系列的改良工作。国内日本落叶松的育种工作始于20世纪60年代，基本上经历了种和种源选择试验阶段、种子园阶段和无性系阶段，现已选育出一批具有优良性状的植株，但由于个体数量少，所以难于满足商品林业的需求。上世纪80年代中期，开始无性扦插技术的研究，幼树扦插以取得一定成绩，但成树的扦插问题仍尚未解决。因此，促使人们再探灯新的良种繁育途径。

微体繁殖作为现代生物技术的一个重要组成部分，具有速度快、周期短、不受季节影响、后代稳定性高的特点，现已取得了显著成绩，并在农业、林业、医药、遗传育种等方面得到广泛应用。落叶松微体繁殖主要集中于欧洲落叶松(L.decidua Mill.)和欧日杂种落叶松(L.×eurolepis)两个树种上，如：Bonga(文献3：J.M.Bonga，1982，Shoot formation in callusfrom the stalks of young female strobili of Larix deciduas，Can.J.Bot.，60(8)：1357-1359)从欧洲落叶松雌球果部分经愈伤组织形成枝，从幼嫩组织中形成不定芽；最重大的突破是Nagimani(文献4：R.Nagmani；J.M.Bonga，1985，Embryo in subcultured callus of Larix deciduas.Can.J.For.Res.，15(6)：1088-1091)利用雌配子体诱导形成的欧洲落叶松再生植株，Laliberte和Lalonde(文献5：A.Laliberte；M.Lalonde，1988，Sustained caulogenesis incallus cultures of Larix ×eurolepis initiated from short shoot buds of a12-year-old tree，Am.J.Bot.，75(6)：767-777)培养的杂种落叶松再生植株，以及Klimaszewska(文献6：K.Klimaszewska，1989，Recovery of somaticembryos and plantlets from protoplast cultures of Larix ×eurolepis，Plant CellReports，8(8)：440-444)得到的落叶松属中第一个体胚再生植株--杂种落叶松未成熟合子胚的再生植株。上世纪90年代，Ewald(文献7：D.Ewald，1998，Advances in tissue culture of adult larch，Vitro Cellular andDevelopmental Biology Plant，34(4)：325-330)等在成树的微体繁殖如诱导生根等问题上取得了突破性进展，发现材料在无激素的培养基上连续继代，或微嫁接，可使成年材料恢复幼年性状。迄今，虽然已经在欧洲落叶松的幼树微体繁殖中建立了持续微体繁殖体系，但它们或者繁殖率低，如Itahana利用了日本落叶松的顶芽(文献8：N.Itahana，1995，Manual for budculture of Japanese larch，Bulletin of the National Forest Tree Breeding Center，13：145-149)，而每个枝条仅有1个顶芽；或者仅注重科学问题，如Klimaszewska利用杂种落叶松进行的原生质体途径再生植株的试验(见文献6)，因此距离生产应用尚有相当距离。目前在我国，对日本落叶松的微体繁殖还没有相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种日本落叶松微体繁殖的茎诱导方法，它能够提高优良种质材料的增殖效率，满足商品林业生产对优良苗木的数量需求。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

选取不同林龄的日本落叶松无性系1年生枝条为材料，取其腋芽，经不定茎形成、伸长诱导，及继代培养等过程，实现茎器官的再生；具体可按如下步骤操作：

1)材料的采集及预处理：

采集时间为入冬至初春芽苞萌动前或萌动时，取样前将枝条水培至芽苞放亮，水温为室温；

2)培养基的制备：

(1)用常规方法制备改良MS、WPM或SH培养基，其中WPM或SH对茎诱导生成效果明显；

(2)分装培养基并进行高压蒸汽灭菌，冷却后备用；

3)接种腋芽：

将水培后芽苞发亮的枝条流水洗涤，剪下腋芽，无菌条件下灭菌，WPM或SH作为茎诱导培养基，其中附加植物生长调节物质，培养基中接种腋芽，进行不定茎的生成；其中所剪下的腋芽尺寸为0.5～1cm；

4)不定茎的伸长生长：

将生成的不定茎转接于附加了植物生长调节物质和促进物的改良MS培养基中，培养室温度为22～28℃，光强为2000～3000lux，光/暗周期为14～20h/4～10h，历时25～30天，完成茎器官的再生；其中所述光/暗培养周期以16h/8h为最佳；为诱导生根或保存材料，在步骤4)后可进行继代培养，促进不定茎材料的幼化。

本发明所述生长调节物质分别为：细胞分裂素中的玉米素(Zea)、六苄基嘌呤(BA)，生长素中的萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)和/或吲哚丁酸(IBA)，这些对茎诱导中的抽枝率和茎伸长效果明显；所述促进物为活性炭(AC)；

所述附加的植物生长调节物质和促进物用量为：BA 0.1～0.5mg/l、Zea0.01～0.5mg/l、NAA 0.01～0.1mg/l、IBA 0.1～0.5mg/l、IAA 0.5～1.0mg/l；促进物AC 0.5～10.0g/l；

不定茎的生成阶段，培养基中附加植物生长调节物质的最佳组合为：WPM+Zea+IAA、SH+Zea+IAA；不定茎的伸长生长阶段，培养基中附加植物生长调节物质和促进物的最佳组合为：MS+NAA+IBA+AC。

本发明具有如下优点：

1.微体繁殖速度快。由生物学特性所决定，落叶松苗木经过13～15年的营养生长期才能进入开花结实的生殖生长阶段，其后代的优良性状还需不少于1/3生命史(30～40年)的时间方可表现出来，并作出选择(约需8～12年)，但此时植株的无性繁殖能力已显著下降，常规的扦插繁殖技术尚未有效解决恢复生根能力的问题。本发明通过微体繁殖的腋芽、不定茎形成及伸长的诱导完成后，对诱导伸长的茎进行继代培养的方法促进了成龄材料恢复幼年生长特性，是提高组织抽枝和生根率的一条十分有效的途径，其与自然状态下采取种子繁殖或扦插繁殖的常规方法相比，利用本发明的方法，可使优良苗木种群的实现周期可缩短一半以上。

2.微体繁殖繁殖效率高。与现有技术仅利用顶芽进行繁殖相比，本发明利用了母树1年生枝条外植体的大量腋芽，可繁育出大量子代幼苗，在技术成熟条件下，以80m²的小型实验室配合必要育苗设施为例，可年产20万株以上，并且繁殖过程可不受自然季节影响(需人工设施条件保障)，能满足商品林业生产对优良苗木的数量需求。

3.完善了日本落叶松遗传改良的技术路线。经过多年实践，日本落叶松已确立了“有性创造、无性利用”的遗传改良路线，但选择育种、杂交育种仅能获得的少量优良种苗，采用本发明能够充分利用少量的优良种苗，通过快速增殖培养过程，形成大批量的无性繁殖材料，从而完善了日本落叶松良种化进程中的一个主要技术环节，满足了商品林业生产上对优良苗木的数量需要。

附图说明

图1A为本发明实施例1中的茎诱导培养基，示刚接种的腋芽。

图1B为本发明实施例1中诱导生成的不定茎。

图1 C为本发明实施例1中完成茎器官再生的不定茎，黑色示培养基中附加了活性炭。

图2A为本发明实施例2中茎生成过程中的腋芽。

图2B为本发明实施例2中伸长生长过程中的不定茎。

图3A为本发明实施例3中完成不定茎诱导生成过程的样品。

图3B为本发明实施例3中完成不定茎伸长生长过程的样品。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例详述本发明。

实施例1

选取日本落叶松的无性系植株，以初春芽苞萌动前的1年生枝条外殖体为材料，取其腋芽、不定茎形成、伸长诱导，及继代培养，实现茎器官的再生；具体操作如下：

1.材料的采集及预处理

选取辽宁省抚顺县五龙林场种子园的日本落叶松朝85号无性系，树龄12年，采集1年生树冠中部枝条，采集时间为初春芽苞萌动前，此时芽苞苞鳞由无光泽的暗棕色或暗褐色转变为有光泽的淡棕色或淡褐色，4℃下保存，取出后常温水培两周，至芽苞发亮时止，备用。

2.制备培养基

1)制备常规的WPM培养基，其组成成分的剂量为：Ca(No₃)₂·4H₂O556mg/l、NH₄NO₃ 400mg/l、K₂SO₄ 990mg/l、KH₂PO₄ 170mg/l、CaCl₂·2H₂O96mg/l、MgSO₄·7H₂O 370mg/l、FeSO₄·7H₂O 27.8mg/l、Na₂EDTA·2H₂O37.3mg/l、H₃BO₃ 6.2mg/l、ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/l、MnSO₄·4H₂O 22.5mg/l、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/l、CuSO₄·5H₂O 0.25mg/l、肌醇100mg/l、甘氨酸2.0mg/l、盐酸硫胺素1.0mg/l、烟酸0.5mg/l、盐酸吡哆醇0.5mg/l、琼脂6000mg/l；

再制备改良MS培养基，其组成成分的剂量为：KNO₃ 950mg/l、NH₄NO₃825mg/l、KH₂PO₄ 170mg/l、CaCl₂·2H₂O 220mg/l、MgSO₄·7H₂O 370mg/l、FeSO₄·7H₂O 27.8mg/l、Na₂EDTA·2H₂O 37.3mg/l、H₃BO₃ 6.2mg/l、ZnSO₄.7H₂O8.6mg/l、MnSO₄.4H₂O 22.3mg/l、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/l、KI 0.83mg/l、CuSO₄·5H₂O 0.025mg/l、CoCl₂·6H₂O 0.025mg/l、肌醇100mg/l、甘氨酸2.0mg/l、盐酸硫胺素0.1mg/l、烟酸0.5mg/l、盐酸吡哆醇0.5mg/l、琼脂6000mg/l。

2)分别将两种培养基分装、高压蒸汽灭菌，冷却后备用。

3.接种腋芽

将水培后芽苞发亮长出腋芽的枝条分割成1～2cm的小段，流水中洗涤后，浸入75％乙醇溶液中消毒1分钟，取出枝条小段上尺寸为0.5～1cm的腋芽，剥离包被在腋芽上的鳞片，腋芽投入0.1％升汞或3％过氧化氢溶液消毒10～30分钟，然后无菌水冲洗数次；所述WPM培养基中附加植物生长调节物质：Zea 0.5mg/l、IAA 1.0mg/l，将灭好菌的腋芽转接于制备好的装有所述WPM培养基的三角瓶内，每瓶内接3～6个腋芽，诱导不定茎的生成。

图1A为茎诱导培养基，表示刚接种的腋芽；图1B示已完成茎的生成。

4.不定茎的伸长生长

在所述改良MS培养基中加入NAA、IBA和AC，加入的剂量为：NAA0.1mg/l、IBA 0.3mg/l、AC 1.0g/l，再将步骤3中诱导生成的＞2cm的不定茎从WPM培养基中取出，放在无菌水中，切去试材老化的底部或愈伤组织，接种于盛装有改良MS培养基的三角瓶中，每瓶接3～5个不定茎，进入不定茎伸长生长阶段。

诱导不定茎生成和伸长的培养条件为：培养室温度23℃，光强2,000lux，光暗周期16h/8h，分别经过30天，完成茎器官的再生。

图1C为完成茎器官再生的不定茎，黑色表示附加的活性炭。

5.为诱导生根或保存材料，可进行继代培养，促进不定茎材料的幼化。继代接种前，切除不定茎基部的褐化部分，继代间隔时间1～2个月，重复步骤4。转入生根时，停止不定茎的继代培养。

本发明的原理是：

植物组织培养最基本的原理在于植物细胞具“全能性”，即一个细胞含有个体植物生长发育的整套基因。日本落叶松茎诱导的关键是生长调节物质种类和浓度、基本培养基和附加促进物的选择以及环境条件的合理控制。其中，细胞分裂素和生长素对芽的诱导和生长发育均起重要作用。一般认为，器官分化的倾向取决于内源细胞分裂素和生长素的平衡，为达到这种平衡，根据不同植物外植体中原有的内源激素水平，需补加一定量的生长调节物质。茎的诱导和生长发育实质上就是细胞的分裂和伸长，在促进细胞分裂方面，细胞分裂素是胞质分裂的触发物，它对于有丝分裂、核分裂和RNA合成是必需的，生长素则是影响DNA的加倍和有丝分裂；在促进细胞伸长方面，有实验表明，六苄基嘌呤具有增强细胞内能量代谢，加速胞内物质的合成和运输，提高细胞壁的渗透性，维系细胞扩大生长所需膨压的作用。活性炭在培养基中多是无选择性吸收，它既能吸收经高压灭菌产生的有害物质，也能吸收植物生长调节类物质和组培过程中细胞的代谢物质，因而选择最适含量也是茎诱导的关键。总之，组织培养的过程，归根到底就是在特定时期促进特定基因的表达，调节特定蛋白质的合成，从而影响整个细胞的分裂、分化过程。

依据其生理作用，本发明对日本落叶松不定茎诱导和不定茎生长进行了培养基、生长调节物质、附加促进物的选择试验，在选出的WPM、SH、改良MS三种基本培养基上，分别添加了不同种类、不同浓度的细胞分裂素、生长素和活性炭，结合适宜的培养条件下，来完成日本落叶松茎的诱导再生。

结果：在供试的270个腋芽中，有48.15％的腋芽完成茎器官的再生。

实施例2

与实施例1不同之处在于：

1)选取28年树龄的日本落叶松无性系38号植株，3月采集冬芽饱满的1年生枝条为材料；

2)制备培养基SH，培养基成分为：KNO₃ 2500mg/l、NH₄H₂PO₃ 300mg/l、CaCl₂·2H₂O 200mg/l、MgSO₄·7H₂O 400mg/l、FeSO₄·7H₂O 15.0mg/l、Na₂EDTA·2H₂O 20.0mg/l、H₃BO₃ 5.0mg/l、ZnSO₄·7H₂O 6.0mg/l、MnSO₄·4H₂O10.0mg/l、Na₂MoO₄·2H₂O 0.1mg/l、KI 1.0mg/l、CoCl₂·6H₂O 0.1mg/l、肌醇1000mg/l、、盐酸硫胺素5.0mg/l、烟酸5.0mg/l、盐酸吡哆醇0.5mg/l、琼脂6000mg/l。

3)接种腋芽

在所述SH培养基中附加植物生长调节物质：Zea 0.2mg/l、IAA 0.5mg/l，将灭好菌的腋芽转接于制备好的装有所述SH培养基的三角瓶内，每瓶内接3～6个腋芽，诱导不定茎的生成。

图2A为处在茎生成过程中的腋芽。

4)诱导不定茎的伸长

所述改良MS培养基中加入NAA 0.5mg/l、IBA 0.1mg/l及AC 10.0g/l；

诱导不定茎的生成培养条件为：室温度28℃，光强3000lux，光暗周期18h/6h；诱导不定茎的伸长培养条件为：培养室温度26℃，光强2500lux，光暗周期20h/4h，分别经过25～30天，完成茎器官的再生。

本实施例无继代培养步骤。

结果：在供试的128个腋芽中，有47.06％的腋芽完成茎器官的再生。

图2B为处在茎伸长生长过程中的不定茎。

实施例3

重复进行实施例1和实施例2的试验，培养基和培养条件分别同上述，附加的生长调节物质在茎诱导阶段为BA 0.1mg/l或Zea 0.01mg/l或NAA0.01mg/l，在茎伸长阶段为IBA 0.3mg/l、NAA 0.1mg/l及AC 10g/l，4月初取样。在供试的181个腋芽中，有80.06％的腋芽完成茎器官的再生。图3A、3B、3C、3D示上述两个实施例重复试验的结果，其中图3A为本实施例1的生根培养基，图3B和3C为实施例1的验证结果，图3D为本实施例2的验证结果。

图3为本实施例中的不定茎，表明单独使用本发明中适宜剂量的BA或Zea或NAA也能够完成茎的诱导(图3A)，完成茎器官的再生(图3B)。

本实施例无继代培养步骤。