与过氧化物酶产生化学发光的改进化合物

摘要

公开了包括C－C双键的新颖化合物，在该双键的一个碳原子取代了两个含硫原子的基团。该化合物用于通过与过氧化物酶和过氧化物的反应，快速产生化学发光的方法和组合物。在过氧化物酶和过氧化物产生的酶的测定中，和在采用酶标记特定结合对的测定中，这样产生的化学发光可以用作可检测的信号。

说明书

相关申请的相互参考

本申请是申请人如下在先未决U.S.申请系列的部分连续：2001年12月20日提交的Nos.10/029222和2002年7月25日提交的10/205,050。

发明领域

本发明涉及与过氧化物酶和过氧化物反应，以产生化学发光的化学发光化合物和组合物。具体而言，本发明涉及包含新颖乙烯酮二硫缩醛化合物的改进组合物，该化合物与过氧化物酶和过氧化物反应以生产可见的化学发光。本发明进一步涉及在免疫测定、核酸探针测定和其它特定结合配对物测定中，检测过氧化物酶和检测过氧化物酶标记的特定结合对的测定方法。

发明背景

过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRP)通常用作生物分子和其它感兴趣分析物如药物、激素、类固醇的酶联测定中的标记物或标签，和和癌症标记物。这些酶的化学发光检测，为测量样品中酶数量或酶标记分析物或分析物的标记特定结合对数量提供安全，方便和灵敏措施。已经开发其它化学发光反应方案以量化特定过氧化物酶的水平。

a.化学发光过氧化物酶底物

在碱性条件下，氨基取代的环状酰基酰肼如公知的鲁米诺和异鲁米诺与H₂O₂和过氧化物酶催化剂(如辣根过氧化物酶，HRP)反应，具有光的发射。此反应已经用作H₂O₂检测和过氧化物酶分析方法的基础。已知鲁米诺的杂环类似物如8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3，4-d-哒嗪-1，4(2H，3H)二酮(M.Ii，等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.，193(2)，540-5(1993))，哒嗪并喹喔啉酮(U.S.专利No.5,324,835)和1，3-二取代吡唑并[4’，3’∶5’，6’]吡啶并-[2，3-d]-吡嗪二酮(Y.Tominaga等人，TetrahedronLett.，36，8641-4(1995))，与过氧化物酶和过氧化物反应以生产化学发光。当由过氧化物酶和过氧化物氧化时，化学发光的其它酰肼化合物是羟基取代的邻苯二甲酰肼(U.S.专利No.5,552,298)。

申请人的U.S.专利Nos.5,491,072、5,523,212和5,593,845公开了化学发光N-烷基9，10-二氢化吖啶羧酸酯、硫代酸酯和二磺酰亚胺，它们在与过氧化物和过氧化物酶反应时生产光，用于检测过氧化物酶和用于测定。PCT申请(WO94/02486)描述了螺旋9，10-二氢化吖啶与过氧化氢的化学发光反应。反应由于辣根过氧化物酶的加入而增强。

总称为荧光素的生物来源的各种化合物由过氧化物酶氧化(概述于L.J.Kricka和G.H.G.Thorpe，概述于化学发光免疫测定和分子应用，K.Van Dyke和R.Van Dyke，eds.，CRC Press，Boca Raton，1990，77-98页)。当不采用过氧化氢时，酶用作氧化酶。

某些酚化合物在与过氧化物酶氧化时，生产化学发光。作为例子，连苯三酚B-1和红棓酚B-2在Kricka和Thorpe中引用，出处同上，以及香豆素类型化合物香豆素、繖形酮和七叶苷(D.Slawinska，J.Slowinski，J.Biolumin.Chemilumin.，4，226-30(1989))；间苯三酚B-3(M.Halmann等人，Photochem.Photobiol.，30，165-7(1979))；和乙酰氨基酚(acetaminophen)B-4(K.Schmitt，G.Cilento，Photochem.Photobiol.，51，719-23(1990))。

在氧气或过氧化物和过氧化物酶存在下，报导可生产弱化学发光的其它各种化合物是合成的含席夫碱聚合物((R.Zoulik等人，Coll.Czech.Chem.Commun.，60，95-103(1995))；在呫吨染料存在下，有或没有过氧化氢的吲哚-3-乙酸(S.Krylov，A.Chebotareva，FEBS，324(1)，6-8(1993))；酪氨酸、色氨酸和氯丙嗪(M.Nakano，J.Biolumin.Chemilumin.4，231-40(1989))和MCLA B-8 M.(Mitani等人，J.Biolumin.Chemilumin.9，355-61(1994))，它们具有以下所示的各自结构B-5到

没有一个以上参考文献公开了现公开的化合物的由过氧化物酶的化学发光氧化。

b.烯醇与HRP的反应.

一系列文章描述了可烯醇化醛的过氧化物酶催化的空气氧化(H.Gallardo等人，Biochim.Biophys.Acta，789，57-62(1984)；W.J.Baader等人，Biochem.，Ed.，14(4)，190-2(1986)；I.Nantes等人，Photochem.Photobiol.，63(6)，702-8(1996))。认为在与醛的平衡中，反应性底物为少量的烯醇形式。醛的反应由磷酸烯醇酯催化，但磷酸烯醇酯自身并不消耗。参考文献教导的是磷酸烯醇酯并不与过氧化物酶反应以生产化学发光。向荧光能量受体的能量传递增加光发射(M.T.Grijalba等人，Photochem.Photobiol.，63(6)，697-701(1996))。掩蔽为烯醇甲硅烷基醚(Baader，出处同上)或乙酸烯醇酯的醛用于偶合测定，其中在第一步骤中烯醇未被掩蔽以原位产生烯醇，该烯醇随后与过氧化物酶反应以产生化学发光(A.Campa等人，Photochem.Photobiol.，63(6)，742-5(1996))。

c.过氧化物酶增强剂.

已经采用许多增强剂以增加来自过氧化物酶与已知化学发光底物的反应的化学发光数量和持续时间，该底物包括上述鲁米诺和9，10-二氢化吖啶羧酸衍生物。这些包括苯并噻唑衍生物如D-荧光素、各种酚化合物如对碘苯酚、对苯基苯酚、萘酚和如在以下文献中所列的芳族胺：G.Thorpe，L.Kricka，在生物发光和化学发光中，New Perspectives，J.Scholmerich等人，Eds.，PP.199-208(1987)。用作由过氧化物酶的氨基取代环状酰基酰肼化学发光氧化的增强剂的其它化合物包括4-(4-羟苯基)-噻唑(M.Ii，出处同上)、公开于U.S.专利5,171,668的化合物组、2-羟基-9-芴酮、和在U.S.专利5,206,149中公开的羟基取代苯并噁唑衍生物组和描述于U.S.专利5,629,168所述的某些苯基硼酸化合物。没有一个上述参考文献公开了本发明化合物由单独的过氧化物酶或与增强剂一起使用的化学发光氧化。

d.通过表面活性剂的化学发光过氧化物酶反应的增强.

使用聚合物和单体表面活性剂，在过氧化物酶催化的反应中生产的化学发光的增强在本领域是已知的。可以通过影响一个或多个步骤的结果，如通过增加发射体的荧光量子产率，通过增强在激发态产生的产物分子百分比，通过抑制竞争副反应而增加进行化学发光反应的分子分率，或通过促进酶催化剂的作用而进行。关于聚合物和单体表面活性剂对化学发光反应的影响，没有清楚或一致的模式。不可能预测那种表面活性剂化合物，如果有的话，可增强从特定工艺的化学发光而仅可以由真实试验确定。

阳离子聚合物表面活性剂聚-N-乙基-4-乙烯基-溴化吡啶鎓，由带负电荷的胰岛素-过氧化物酶共轭物完全抑制鲁米诺的化学发光反应，并且当使用天然酶时减少化学发光到更小的程度(S.B.Vlasenko等人，J.Biolumin.Chemilumin.，4，164-176(1989))。

公布的日本专利申请No.JP06,242,111和文章(R.Iwata等人，Anal.Biochem.，231，170-4(1995))公开了非离子表面活性剂和脱脂乳在鲁米诺变成更低背景发射的化学发光过氧化中或增强信号/噪声的用途。

没有一个上述参考文献公开了本发明化合物由过氧化物酶的化学发光氧化或采用表面活性剂的化学发光增强。

e.使用HRP的测定.

在采用化学发光检测，使用鲁米诺或异鲁米诺作为底物的酶免疫测定和DNA杂交测定，酶辣根过氧化物酶发现广泛的用途。使用HRP共轭物和增强鲁米诺化学发光检测的市售试剂盒是可获得的。化学发光过氧化物酶测定也公开于上述U.S.专利5,491,072，5,523,212和5,593,845。没有参考方面公开了使用本发明化合物作为底物的化学发光过氧化物酶测定。

f.新化学发光过氧化物酶底物.

新类别的化学发光过氧化物酶底物由申请人在它们的先前U.S.专利5,922,558，和公布的PCT申请No.WO99/14220中公开。这些申请的公开内容在此完全引入。尽管这些公布文献的公开内容描述了类属于本发明化合物的杂环化合物类别，在从与过氧化物酶和过氧化物源的反应中产生光中，本发明化合物出乎意料地优异。

g.苯并二噻富瓦烯.

描述了具有如下结构的苯并二噻富瓦烯的合成(K.Akiba，K.Ishikawa，N.Inamoto，合成，12，861-2(1977))。不知道关于它用作化学发光过氧化物酶底物的能力的信息。

发明概述

本发明的目的是提供包含化合物的改进组合物，该化合物与过氧化物酶和过氧化物反应，以提供化学发光和用于过氧化物酶的检测。

本发明的具体目的是提供改进化合物和包含它们的组合物，其中改进化合物具有如下通式：

该化合物包含在双键的一个末端取代有两个硫原子的碳-碳双键，两个硫原子每个连接到另一个基团R¹或R²上，且双键的另一末端形成包含氮原子的多环杂环体系的一部分。

包含本发明化合物的组合物优选引入增强剂化合物，用于促进在本发明化合物与过氧化物酶反应时生产的化学发光，和改进本发明的分析效用。

本发明的进一步目的是提供采用本发明化合物和组合物，在与过氧化物酶和过氧化物反应时，快速产生化学发光的方法。

本发明的仍然另一个目的是提供在免疫测定，核酸探针测定，蛋白质印迹测定，DNA印迹测定和其它测定中，其由采用用于分析物检测的酶标签的一般已知方法进行，用于检测过氧化物酶和共轭物的化学发光组合物和方法。通过检测过氧化物酶和共轭物和将因此生产的化学发光与分析物的存在或数量相关，测定因此在这样的测定中用于检测分析物。

附图简述

图1是将HRP数量与在1.5min时由100μL实施例7中所述试剂发射的化学发光强度联系的图，该试剂包含在室温下触发的化合物14。在白色微量反应板的孔中，通过向10μLHRP溶液中加入100μL试剂而引发化学发光发射，HRP溶液包含1.4×10^-16-1.4×10^-20摩尔酶。术语S-B表示以相对光单位(RLU)，在HRP存在下，对于在HRP不存在下的背景化学发光(B)修正的化学发光信号(S)。为了比较，对于在15min时测量的参考化合物1，也显示其在S-B和HPR数量之间的关系。

图2是将HRP数量与在1.5min时由100μL实施例8中所述试剂发射的化学发光强度联系的图，该试剂包含在室温下触发的化合物27。为了比较，对于在15min时测量的参考化合物1，也显示在S-B和HPR数量之间的关系。

图3是显示来自如下反应的化学发光随时间变化的图：在25℃下，3.5×10^-16摩尔HRP与100μL包含实施例11中所述化合物26的试剂反应。相对化学发光随时间的变化展示比指定为参考化合物2的结构相似化合物，化学发光的更快速产生。

图4是显示来自如下反应的化学发光随时间变化的图：在25℃下，3.5×10^-16摩尔HRP与100μL包含实施例12中所述化合物27的试剂。

图5是通过HRP-标记的抗体，在PVDF膜上采用化学发光试剂组合物，从β-半乳糖苷酶的蛋白质印迹测定的x射线胶片图象。采用包含化合物1的本发明试剂或，为了比较，采用包含在U.S.5,922,558中描述的化合物参考化合物1的试剂，检测分别包含5000，1000，180，30和5pg蛋白质的β-半乳糖苷酶稀释度。在各自检测试剂中的11min培育之后，将膜曝光于X射线胶片5s。

图6显示通过HRP-标记的抗体，在PVDF膜上采用化学发光试剂组合物，从β-半乳糖苷酶的蛋白质印迹测定的x射线胶片图象。采用包含化合物27或化合物37的本发明试剂，检测分别包含5000，1000，180，30和5pg蛋白质的β-半乳糖苷酶稀释度。

图7显示通过HRP-标记的抗体，在硝基纤维素膜上采用含有化合物46的化学发光试剂组合物，从β-半乳糖苷酶的蛋白质印迹测定的x射线胶片图象。如图所示，容易在如两小时期间内，检测分别包含5000，1000，180，30和5pg蛋白质的β-半乳糖苷酶稀释度。

图8是将HRP数量与由100μL实施例22中所述试剂发射的化学发光强度联系的图，该试剂包含在室温下触发的化合物52或53。

优选实施方案的描述

定义：

烷基-包含1-20个碳的支链，直链或环烃基团。在此使用的低级烷基表示包含至多约8个碳的那些烷基。

亚烷基-二价烷基链基团。

烯基-包含至少一个C-C双键并包含2-20个碳的支链，直链或环烃基团。在此使用的低级烯基表示包含至多约8个碳的那些烯基。

炔基-包含至少一个C-C三键并包含2-20个碳的支链或直链烃基团。在此使用的低级炔基表示包含至多约8个碳的那些炔基。

分析物-其存在或数量要在样品中由测定测量的物质。分析物包括有机和生物分子，对于这些分子存在具有特定结合亲合力的特定结合配对物。示例性分析物非限制性地包括单链或双链DNA、RNA、DNA-RNA络合物、寡核苷酸、抗体、抗体片段、抗体-DNA嵌合体、抗原、半抗原、蛋白质、凝集素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素和生物素。其它示例性分析物也包括氧化物酶和过氧化物酶。

芳基-包含1-5个碳环芳族环的含芳族环基团，它可以由1个或多个不是H的取代基取代。

卤素-氟、氯、溴或碘原子。

杂烷基-单价烷基链基团，其中至少一个非末端碳原子由氮、氧或硫原子替代。

杂亚烷基-单价亚烷基链基团，其中至少一个非末端碳原子由氮、氧或硫原子替代。

发光的-当被激发到电子激发态时，能够发射光。当从单激发态衰变时，光可以发射为荧光或当从三重激发态衰变时，光可以发射为磷光。

过氧化物-包含O-O键的化合物，优选过氧化氢或过氧化氢的络合物如脲过氧化物、过硼酸盐或过碳酸盐。

样品-包含或被认为包含一种或多种要分析的分析物的流体。由化学发光反应方法分析的典型样品是生物样品，包括体液如血液、血浆、血清、尿、精液、唾液、细胞溶解物、组织提取物等。其它类型的样品包括食物样品和环境样品如土壤或水。

特定结合对-显示相互结合亲合力的两种物质。例子包括抗原-抗体、半抗原-抗体或抗体-抗体对、互补寡核苷酸或多聚核苷酸、抗生物素蛋白-生物素、链霉抗生物素-生物素、激素-受体、凝集素-碳水化合物、IgG-蛋白质A、核酸-核酸结合蛋白质和核酸-抗核酸抗体。

取代的-表示基团上至少一个氢原子由非氢基团的替换。应当注意的是在提及取代的基团时，除非另外清楚地说明，指的是可以存在多个取代点。

已经发现以下通式I的化合物与过氧化物和过氧化物酶反应，以产生具有意外的优异性能的化学发光。本发明的乙烯酮二硫缩醛化合物具有通式I：

其中R¹和R²每个都是除所需的满足基团中原子价数的必须数目H原子以外，还包含1-约50个非氢原子的有机基团，并且其中R¹和R²可以结合在一起以形成环。基团R¹和R²可包含1-约50个选自C、N、O、S、P、Si和卤素原子的非氢原子，但更优选1-约20个这样的原子。R¹和R²的优选基团包括烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳烷基和取代芳烷基。更优选是烷基、取代烷基、芳基、和取代芳基。可以采用各种数目和在碳链或环上的选定位置，引入H原子以外的取代基，如离子基团或极性基团，以改性化合物的性能或提供合成的方便。这样的性能包括，例如，化学发光量子产率、与酶反应的速率、光发射的最大强度、光发射的持续时间、光发射的波长、在反应介质中的溶解度。赋予水溶性的优选基团是磺酸盐基团-SO₃^-、硫酸盐基团-OSO₃^-、膦酸盐基团-PO₃^-、磷酸盐基团-OPO₃^-2、羧酸盐基团-COO^-和铵盐基团-NR₃⁺和鏻盐基团-PR₃⁺。允许与另一个分子，如特定结合配对物的共价偶合的一个或多个基团也可以包括为R¹和R²上的取代基。示例性的具体取代基非限制性地包括烷氧基、芳氧基、羟基、卤素、氨基、取代氨基、羧基、烷氧羰基、羧基酰胺(carboxamide)、氰基、和磺酸盐基团。

当结合R¹和R²在一起以形成环时，环优选为5-30个原子并包括选自如下的另外碳和/或氧原子：亚烷基链、杂亚烷基链和包含双键的不饱和链。链中的碳原子可以由以上关于基团R¹和R²描述的非氢原子取代。优选的环大小为5-7个原子。

在优选的实施方案中，结合R¹和R²以完成六元环，该六元环在环上取代有至少一个上述水溶性赋予基团Z。在另一个实施方案中，Z基团反而连接到基团R³上。通过连接R¹和R²形成的环也可以是稠合到第二个环上的5-7元环如苯并-稠环。同样优选至少一个水溶性赋予基团Z取代在一个稠环上或在基团R³上。示例性结构如上所示。

在本发明化合物中，基团R³是除要求满足基团中原子价数要求的必须数目H原子以外，包含1-50个非氢原子的有机基团，非氢原子选自C、N、O、S、P、Si和卤素原子。更优选R³包含1-20个非氢原子。有机基团优选选自烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳烷基和取代芳烷基。R³的更优选基团包括取代或未取代的C₁-C₄烷基、取代或未取代的苯基或萘基、和取代或未取代的苄基。当取代时，示例性取代基非限制性地包括烷氧基、芳氧基、羟基、卤素、氨基、取代氨基、羧基、烷氧羰基、羧基酰胺、氰基、和磺酸盐和磷酸盐基团。一种优选的R³基团是取代有至少一种水溶性赋予基团的烷基或杂烷基。

可以采用各种数量和在杂环上的选择环或链位置，引入取代基，以改性化合物的性能或提供最终化合物的合成方便。这样的性能非限制性地包括化学发光量子产率、与酶反应的速率、光发射的最大强度、光发射的持续时间、光发射的波长、在反应介质中的溶解度。基团R⁴-R¹¹，它们可以相同或不同，每个都是取代基，该取代基可包含1-50个选自C、H、N、O、S、P、Si和卤素原子的原子，和该取代基允许产生光和可非限制性地包括烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳氧基、卤素、氨基、取代氨基、羧基、烷氧羰基、羧基酰胺、氰基、和磺酸盐和磷酸盐基团。优选R⁴-R¹¹选自氢、卤素、烷氧基、氨基、或由一个或两个烷基或芳基取代的氨基。优选组的化合物含有作为氯的R⁵，R⁶，R¹²或R¹⁰之一，和R⁴-R¹¹的其它是氢原子。

邻近基团对，即，R⁴和R⁵，或R⁵和R⁶，或R⁶和R⁷，或R⁸和R⁹，或R⁹和R¹⁰，或R¹⁰和R¹¹可一起结合为包括至少一个5或6元环的碳环或杂环体系，该5或6元环稠合到带有环外双键的环上。当存在另外的稠环时，优选另外的稠合苯环使获得的化合物为苯并9，10-二氢化吖啶衍生物。

在本发明范围内的具体化合物非限制性地包括：

基团R¹-R³的优选结合包括化合物，其中R¹和R²的一个或两个都包括取代有磺酸盐基团或磷酸盐基团的烷基，和R³是苯基、取代苯基、苄基或取代苄基。当仅有一个磺酸盐或磷酸盐取代的烷基存在时，R¹或R²的另一个优选是烷基或苄基。

同样考虑在本发明类别化合物范围内的是一些实施方案，其中R¹或R²或两者都结合到9，10-二氢化吖啶环的最近位置，即R⁴或R¹¹以闭合另外的环。

在仍然另外的实施方案中，氮原子结合到9，10-二氢化吖啶环的最近位置R⁷或R⁸，以闭合另外的5-7元环和R¹和R²独立地选自烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳烷基，和1-20个碳原子的取代芳烷基，并可以结合在一起以形成5-30个原子的环，或R¹或R²或两者都结合到9，10-二氢化吖啶环的最近位置，以闭合另外的环。说明性结构包括：

通式I的乙烯酮二硫缩醛化合物，包括以上所示的那些，与过氧化物和过氧化物酶的反应，产生快速达到非常高强度的化学发光。最大光发射在一分内或更短时间内达到和保持恒定几分钟。没有其它已知的化学发光过氧化物酶底物这样快速地产生高强度化学发光。此动力学行为是不可预料的，与在上述U.S.专利No.5,922,558中公开的结构相关化合物的化学发光时间变化情况形成对比。例如，公开与HRP反应的具有如下通式的化合物：

在7min内达到最大化学发光强度。本发明化合物如此快速达到稳定的最大光强度的能力，使得它们比其它化合物更适于目前要求的快速高产量测定。

本发明化合物出乎预料地在至少5-10.5的pH范围内显示高稳定性，允许它们在酸和碱pH值两者下配制和使用。通式I化合物的缓冲水溶液在室温下显示延长的贮存稳定性和在4℃下长时间稳定。带有水加溶基团的通式I化合物的溶液可以在它们的工作浓度下制备且不要求共溶剂。已经制备增强的试剂配方，其允许在pH5-6下的灵敏检测，pH5-6是辣根过氧化物酶的最优活性pH。

制备通式I化合物的方法包括根据以下两种方案，锂硅烷化合物或磷叶立德对合适羰基化合物的亲核加成(F.A.Carey，A.S.Court，J.Org.Chem.，37，1926-29，(1972))。

在另一种方法中，通过与双(二烷基铝)二硫酚试剂的反应，将酯转化成乙烯酮二硫缩醛，如在E.J.Corey和A.P.Kozikowski，TetrahedronLett.，925-8(1975)中公开的那样和如下所示。

在仍然另一种方法中，将活性亚甲基的阴离子与CS₂反应并且将二硫代羧酸酯与包含R¹基团的试剂R¹-LG反应，以形成二硫代酸酯。后者工艺的例子公开于I.Shahak和Y.Sasson，Tetrahedron Lett.，4207-10(1973)。将二硫代酸酯转化成烯醇化物并且与通式R²-LG的试剂反应。典型的离去基团包括卤素，如氯，溴和碘，磺酸盐如甲磺酸盐和对甲苯磺酸盐和三氟甲磺酸盐，羧酸盐如乙酸盐和苯甲酸盐，特别是当X是酰基时，在该情况下X-LG会是酸酐、硫酸盐如硫酸二甲酯，和其它基团如咪唑、三唑和四唑、马来酰亚胺、琥珀酰亚氨基氧基(succinimidoxy groups)。

方法A

方法B

方法C

方法D

以上的方法D涉及作为反应性芳基化种的苯炔中间体的产生。例如可以通过采用强碱如仲丁基锂或LDA的溴化苯化合物的处理，原位产生苯炔中间体(M.Watanabe等人，Chem.Pharm.Bull.，37(1)，36-41(1989))。

另一种合成方法包括衍生自苯并二硫杂环戊二烯的磷叶立德与吖啶酮化合物的反应。程序和条件一般描述于上述Akiba等人的参考文献以及描述于K.Ishikawa，K.Akiba和N.Inamoto，Tetrahedron Lett.，41，3695-3698(1976)。

本发明的化合物和组合物用于通过与过氧化物酶的反应，生产化学发光的方法。本发明化合物与过氧化物酶和过氧化物在缓冲水溶液中的反应，容易产生可检测到的可见化学发光。光强度在室温下快速地达到最大水平，典型地在约1分钟内。任选在增强剂存在下进行反应。

在生产化学发光的优选方法中，化合物I与过氧化物酶，过氧化物和增强剂，在pH为约8-10的碱性缓冲剂中反应，以产生连续化学发光信号，该信号在酶和化合物I的反应时开始。可以通过引入非离子表面活性剂而增加分析灵敏性，这在以下更详细讨论。

在从化合物I与过氧化物酶的反应产生光的优选方法中，在5℃-50℃，优选20℃-40℃的温度下，在缓冲水溶液中，在约5-10.5，优选7-10的pH下进行反应。在1μM-20mM，优选10μM-5mM的浓度下使用化合物I。酶可以是游离过氧化物酶或过氧化物酶共轭物。

本发明的化合物典型地在100-200nm宽的发射谱带内生产光，它在电磁光谱的近紫外到可见光区域的波长下显示最大强度。最大强度的典型波长λ_max在350-500nm范围内。设想带有共价连接荧光团的通式I化合物可进行分子内能量传递，导致在更长波长下从荧光团激发态的发射。

多于一种通式I的化合物可同时用于由过氧化物酶作用产生光的方法。在一些情况下可能有利的是同时反应两种或多种通式I的化合物与过氧化物酶。当两种或多种化合物具有不同的发光或物理性能时，可能需要这两者的结合以产生具有如下特性的发光反应：其不容易通过使用任何一种化合物达到。在化合物I之间不同的发光和物理性能的例子包括发射光谱，光发射的持续时间，酶转换，到最大值的发射增加速率，疏水性/亲水性和溶解度。

过氧化物组分是能够与过氧化物酶反应的任何过氧化物或烷基氢过氧化物。优选的过氧化物包括过氧化氢、脲过氧化物、和过硼酸盐。

可进行化学发光反应的过氧化物酶包括乳过氧化物酶、微过氧化物酶、髓过氧化物酶、卤过氧化物酶、如钒溴过氧化物酶、辣根过氧化物酶、霉菌过氧化物酶如木素过氧化物酶和来自Arthromycesramosus的过氧化物酶和在白腐真菌中产生的Mn依赖性过氧化物酶，和大豆过氧化物酶。其它过氧化物酶模拟化合物是已知的，该化合物不是酶但具有过氧化物酶的类似活性，包括铁络合物和Mn-TPPS₄(Y.-X.Ci等人.，Mikrochem.J.，52，257-62(1995))，该化合物催化鲁米诺的化学发光氧化，清楚地被认为在此处的过氧化物酶意义的范围内。

过氧化物酶和生物分子的共轭物或络合物也可用于产生化学发光的方法，唯一的条件是共轭物显示过氧化物酶活性。可以共轭到一个或多个过氧化物酶分子上的生物分子包括DNA、RNA、寡核苷酸、抗体、抗体片段、抗体-DNA嵌合体、抗原、半抗原、蛋白质、凝集素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素和生物素。包括或引入过氧化物酶的络合物如脂质体、胶束、泡囊和聚合物，它们用于连接到生物分子上，也可用于本发明的方法。

某些增强剂化合物向反应混合物中的引入促进酶的反应性。包括在这些增强剂中的是酚化合物和芳族胺，已知这些化合物增强其它过氧化物酶反应，如描述于Thorpe&Kricka和Ii等人的上述参考文献和描述于U.S.专利Nos.5,171,668和5,206,149，该参考文献在此引入作为参考。公开于U.S.专利5,512,451和在此引入作为参考的取代和未取代的芳基硼酸化合物和它们的酯和酸酐衍生物，也考虑为在用于本发明的增强剂范围内。优选的增强剂包括但不限于：对苯基苯酚、对碘苯酚、对溴苯酚、对羟基肉桂酸、对咪唑基苯酚、对乙酰氨基酚(acetaminophen)、2，4-二氯苯酚、2-萘酚和6-溴-2-萘酚。也可以采用多于一种上述那些种类增强剂的混合物。

发现可有效增强本发明化合物化学发光生产的另外增强剂是具有如下通式的吩噁嗪和吩噻嗪。

和

在吩噁嗪和吩噻嗪增强剂的氮原子上取代的R基团包括1-8个碳原子的烷基、和由磺酸盐或羧酸盐基团取代的1-8个碳原子的烷基。优选的增强剂包括3-(N-吩噻嗪基)丙磺酸盐、3-(N-吩噁嗪基)丙磺酸盐、4-(N-吩噁嗪基)丁磺酸盐、5-(N-吩噁嗪基)戊酸盐和N-甲基-吩噁嗪和相关类似物。

本发明化学发光试剂中的非离子表面活性剂添加剂用于加溶的目的。非离子表面活性剂向使用过氧化物酶产生化学发光的反应中的加入，可导致关于过氧化物酶分析灵敏性的改进。用于本发明实施的非离子表面活性剂通过例子包括聚氧乙烯化烷基酚、聚氧乙烯化醇、聚氧乙烯化醚和聚氧乙烯化山梨醇酯。

当本发明的某些化合物与过氧化物酶和过氧化物反应时，阳离子表面活性剂，包括季铵盐化合物如CTAB，有利于增加发射的化学发光水平。例如，当在反应混合物中包括CTAB时，根据本发明来自如下所示的化合物11反应的光强度增加20倍以上。

本发明的反应在溶液如含水缓冲剂中进行，含水缓冲剂可与如下固体载体的表面接触：由过氧化物酶涂敷的珠状物、管、膜或微孔(microwell)板。合适的缓冲剂包括能够保持pH在约5-约10.5范围的通常使用的缓冲剂，例如磷酸盐、硼酸盐、乙酸盐、碳酸盐、三(羟甲基氨基)甲烷、甘氨酸、麦黄酮、2-氨基-2-甲基-1-丙醇、二乙醇胺等。在此方面实施本发明的优选方法由特定所需用途的要求确定。

由本发明方法发射的光可以由任何合适的已知措施如发光计、x射线胶片、高速摄影胶片、CCD照相机、闪烁计数器、化学光量计或目测进行测定。每种检测措施具有不同的光谱灵敏性。人眼睛对绿光最敏感，CCD照相机显示对红光的最大灵敏度，具有对UV-蓝光或绿光的最大响应的x射线胶片是可获得的。检测设备的选择由如下方面的应用和考虑所支配：成本，方便，和是否要求产生永久记录。

本发明化学发光方法的重要用途是在通过在由化学发光反应的测定程序中，用于检测分析物的存在或数量。方法包括如下步骤：接触怀疑包含分析物的样品与本发明的化学发光化合物，过氧化物和过氧化物酶的来源，检测在定性方法中产生的光和，如果需要定量，将产生的光数量与分析物的数量联系。可以容易地通过采用已知数量的分析物构造标定曲线，从而辩别光强度和分析物数量之间的关系。化合物I典型地在约10^-5M-约10^-2M，优选约10^-4M-约10^-3M的浓度下使用。当在溶液中检测时，过氧化物酶优选小于约10^-9M。由化学发光反应方法分析的典型样品是体液如血液、血浆、血清、尿、精液、唾液、CSF等。

可以由本发明方法测定的分析物包括过氧化物酶，在该情况下可不必加入另外的过氧化物酶，过氧化物酶抑制剂，和各种类别有机和生物分子，这些生物分子可以由过氧化物酶标记或可以通过酶标记的特定结合配对物而特定检测。酶可以作为分析结合化合物上的标签直接引入。或者分析物结合化合物可以直接结合以至少一种用于分析物结合化合物的酶标记特定结合物质。或者分析物结合化合物可以由至少一种第二特定结合物质标记，该第二特定结合物质然后结合到用于第二特定结合物质的酶标记结合配对物上。

本发明也涉及本方法在测定程序中，通过通式I化合物与过氧化物酶的化学发光反应，用于检测过氧化氢的用途，其中产生的光数量与存在的过氧化物的存在或数量相关。对化学发光测定领域技术人员来说显然本发明的方法可用于检测氧化物酶和脱氢酶。通过氧气的还原和它们天然底物的氧化，这些酶产生过氧化氢。这样产生的过氧化氢然后可进一步在它产生的同时或在随后的步骤中，与本发明的化合物I和过氧化物酶反应以产生光。然后将产生的光的性能与氧化物酶或脱氢酶的数量联系。另外氧化物酶或脱氢酶可作为对生物分子的共轭物或在分析物测定中的特定结合对的一元而存在。

用于生产化学发光的通式I化合物与过氧化物酶的反应，构成检测过氧化物酶存在或数量的快速而灵敏的方法。因此通过测量由样品与通式I化合物反应产生的光的数量或强度，可以使用本发明方法确定样品中过氧化物酶存在或数量。这样的测量可以在，如检测哺乳动物血液过氧化物酶活性以作为法庭调查中的证据中发现用途。

过氧化物酶活性的化学发光测量的第二个应用领域是在酶抑制剂的检测和测量中。例如，过氧化物酶抑制剂包括氰化物、硫化物和高浓度过氧化氢。通过在通式I底物的存在下，测量包含过氧化物酶的样品活性，产生可检测的产物和抑制剂的数量，而进行抑制剂数量或特性，如抑制常数K_i，或抑制半衰期t_1/2的测量。酶和化学发光化合物的反应在抑制剂存在下和不存在下进行，和比较结果以确定抑制剂的存在或数量。抑制剂的影响可具有三种效果的任何一种或多种，光强度的降低，光强度增加的较慢速率或在光发射开始之前的延迟周期。

由于反应由过氧化物酶催化，非常少量的酶足以产生可检测数量的光。已经达到小于1amol(1×10^-18mol)的灵敏度。检测这样少量过氧化物酶的能力，使得本发明的化学发光技术适于使用酶联测定的许多类型分析物的分析，其可检测在样品中以少量或在有限大小样品中存在的少量分析物。在此类型的测定中，过氧化物酶共轭到特定结合对的一元。例子是化学发光酶联免疫测定，如ELISA。用于实行免疫化学步骤的各种测定格式和协议在本领域是已知的和包括竞争性测定和夹层测定两者。可以采用本发明的化合物和方法测定这样形成的可检测标记的结合对。当可检测标签是过氧化物酶时，直接检测它。当可检测标签是另一个特定结合对的一元，如半抗原时，首先反应它的结合配对物与过氧化物酶的共轭物，然后根据本发明的方法检测过氧化物酶。可以采用连接到本领域已知的固体表面或载体上，或在溶液中游离，或包围在活体组合体如脂质体中的酶标记物种，进行测量，在脂质体的情况下，溶解剂用于溶解脂质体和游离可检测的酶。

另一种示例性用途是由蛋白质印迹技术的蛋白质检测。采用特定初次抗体和酶标记二次抗体，二次抗体确认和结合到初次抗体上，检测包含蛋白质分析物的样品。由使用本发明化合物的化学发光，作为使用本发明试剂的化学发光测定，检测标签酶。此技术的变化如使用生物素化抗体和抗生物素蛋白-HRP，认为在能够使用本发明方法进行的测量范围内。    

通过使用酶标记核酸探针，本发明的化合物也用于核酸的检测。示例性方法包括溶液杂交测定、在DNA印迹中的DNA检测、由RNA印迹的RNA、DNA序列测定、DNA指纹分析、菌落杂交和噬菌斑抬高(plaque lift)，它们的进行对于本领域技术人员是公知的。为采用这些方法与本发明化合物一起使用，过氧化物酶用作标签。过氧化物酶可以存在为与探针寡核苷酸或俘获寡核苷酸的直接共轭物，或它可以通过使用本领域已知方法的间接关联措施而引入。

除上述抗原-抗体以外，半抗原-抗体或抗体-抗体对，特定结合对也可包括互补寡核苷酸或多聚核苷酸、抗生物素蛋白-生物素、链霉抗生物素-生物素、激素-受体、凝集素-碳水化合物、IgG-蛋白质A、核酸-核酸结合蛋白质和核酸-抗核酸抗体。

在另一方面，本发明涉及通过与过氧化物酶的反应而生产化学发光的试剂组合物，该组合物包括pH为约5-约10.5的含水缓冲剂，浓度为0.01-10mM的通式I化合物和浓度为0.01-10mM的过氧化物。任选组合物进一步包括至少一种增强剂，其数量足以增强化学发光，优选介于0.001-10mg/mL。组合物也可任选包括浓度介于0.01-10mg/mL的表面活性剂。

通过与过氧化物酶的反应而生产化学发光的优选试剂组合物包括pH介于约7.5-约9的含水缓冲剂，浓度为0.01-10mM的通式I化合物，浓度为0.01-10mM的过氧化物，浓度为0.001-10mg/mL的增强剂和数量足以增强化学发光，优选介于0.001-10mg/mL的表面活性剂。配制剂可进一步包括浓度为0.01-10mM的螯合剂如EDTA。

为更完全描述本发明的各种方面，给出以下实施例，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。

实施例

1.乙烯酮二硫缩醛的合成.

制备如下化合物。

化合物   R^4-11   R³ R¹            R²

  1       -        Ph    Me              Me

  2       -        Me    Me              Me

  3       -        Ph    苄基            苄基

  4       -        Ph    CHPh₂          CHPh₂

  5       -        Ph       -(CH₂)₃-

  6       -        Ph    Me              正辛基

  7       -        Ph    Me              Ph

  8       -        Ph    Me              CH₂COOEt

  9       -        Ph    Me              异丙基

  10      -        Ph    Me              2-羟丁基

  11      -        Ph    Me              (CH₂)₃SO₃Li

  12      -        Ph   (CH₂)₃SO₃Li  (CH₂)₃SO₃Li

  13      -        Ph    正辛基          (CH₂)₃SO₃Li

  14      -        Ph    Me              (CH₂)₃SO₃Na

  15      -        Me    Me              (CH₂)₃SO₃Na

  16      -        Ph    Me              (CH₂)₃I

  17      6-OMe    Ph    Me               Me

  18      6-OMe    Ph    Me              (CH₂)₃SO₃Na

  19      6-Cl     Ph    Me               Me

  20      -        Ph    Me               CH₂Ph

  21      -        An    Me               Me

  22      -        An    Me              (CH₂)₃SO₃Na

  23      -        Np    Me               Me

  24      -        Np    Me              (CH₂)₃SO₃Na

25    6-OMe  Me                 Me       Me

26    -      CH₂Ph             Me       Me

27    -      CH₂Ph             Me      (CH₂)₃SO₃Na

28    -      CH₂-p-C₆H₄Cl   Me       (CH₂)₃SO₃Na

29    -      CH₂-p-C₆H₄OMe  Me       (CH₂)₃SO₃Na

30    -      CH₂-p-C₆H₄Cl   Me        Me

31    -      Ph                 Me       (CH₂)₃N⁺(Et)₃I^-

32    -      CH₂Ph             Et       (CH₂)₃SO₃Na

33    -      CH₂Ph             Pr       (CH₂)₃SO₃Na

34    -      Ph                 Me       (CH₂)₃OPO₃Na₂

35    -      Ph                 Me       (CH₂)₁₁OPO₃Na₂

36    -      Ph                 C₁₁H₂₃ (CH₂)₃OPO₃Na₂

37    -      CH₂Ph             Me       (CH₂)₃OPO₃Na₂

38    -      CH₂Ph             CH₂Ph   (CH₂)₃SO₃Na

39    -      CH₂Ph             CH₂Ph   (CH₂)₃OPO₃Na₂

Me＝甲基，Et＝乙基，Pr＝正丙基，Ph＝苯基，Np＝2-萘基，An＝对茴香基(4-MeOPh)，除非另外说明R⁴-R¹¹是H。化合物3，4和6作为双键异构体的混合物获得。这些化合物的每一种在本发明中产生化学发光。

2.N-芳基9，10-二氢化吖啶前体的制备.

通过9，10-二氢化吖啶和卤代芳族化合物，优选芳基碘或芳基溴的钯催化偶合，制备化合物N-苯基9，10-二氢化吖啶，N-(4-甲氧基)苯基9，10-二氢化吖啶和N-(2-萘基)9，10-二氢化吖啶。例如，溴苯，4-溴茴香醚和2-溴萘可用于偶合反应。使用在文献中一般已知的方法，使用从叔膦和钯化合物如PdCl₂或Pd(OAc)₂形成的钯催化剂，进行钯催化的步骤。

3.代表性合成程序.

化合物1的合成.在-78℃下，向在THF(150mL)中从二异丙胺和正丁基锂制备的LDA溶液(37mmol)中，加入在THF(50mL)中的N-苯基9，10-二氢化吖啶(9.00g，35mmol)。在-78℃下搅拌混合物1hr。然后加入CS₂(2.35mL，39mmol)。在-78℃下1hr之后，允许反应缓慢升温到室温(1hr)。当加入MeI(2.86mL，46mmol)时，再次将反应混合物冷却到-78℃。在加料之后，除去干冰浴并在室温下继续反应2hrs。然后在真空下蒸发反应混合物并将残余物进行柱色谱法分析(己烷/CH₂Cl₂7∶1)，得到9.21g为黄色结晶固体的甲基N-苯基-9，10-二氢化吖啶-9-二硫代羧酸酯。收率76％。¹H NMR(CDCl₃)：d 2.54(s，3H)，6.02(s，1H)，6.37(d，2H)，6.92(t，2H)，7.07(t，2H).7.35-7.43(m，4H)，7.53(m，1H)，7.64(m，2H).

在-78℃下，向在THF(30mL)中的LDA溶液(1.1mmol)中，加入在THF(5mL)中的二硫代酸酯(0.347g，1mmol)。在-78℃下搅拌混合物1hr。然后在-78℃下通过注射器加入MeI(0.10mL，1.6mmol)。将获得的混合物在室温下搅拌过夜。在真空下的溶剂脱除之后，将残余物在硅胶上进行色谱分析(己烷/EtOAc20∶1)，得到0.317g为淡黄色固体的化合物1(88％收率)。¹H NMR(CDCl₃)：d 2.37(s，6H)，6.52(d，2H)，7.07-7.18(m，4H)，7.41(d，2H)，7.57(m，1H)，7.67(m，2H)，7.97(dd，2H).

也由类似的程序，从相应的二硫代酸酯中间体，使用LDA或NaH作为碱，制备化合物2，6，8，9，10，16，17，19，20，21，23，26，和30。

化合物2.收率80％。¹H NMR(CDCl₃)：δ2.29(s，6H)，3.48(s，3H)，7.01-7.09(m，4H)，7.30(m，2H)，7.82(dd，2H).

化合物6.收率29％。¹H NMR(CDCl₃)：δ0.88(t，3H)，1.20(br，10H)，1.49(m，2H)，2.32(s，3H)，2.71(t，2H)，6.47(t，2H)，7.04-7.10(m，4H)，7.36(d，2H)，7.54(m，1H)，7.64(m，2H)，7.90(dd，1H)，7.96(dd，1H).

化合物8.收率63％。¹H NMR(CDCl₃)：δ1.19(t，3H)，2.25(s，3H)，3.56(s，2H)，4.08(q，2H)，6.49(d，2H)，7.03-7.12(m，4H)，7.38(d，2H)，7.55(m，1H)，7.65(m，2H)，7.93(dd，1H)，8.00(dd，1H).

化合物9.收率83％。¹H NMR(CDCl₃)：δ1.21(d，6H)，2.32(s，3H)，3.22(m，1H)，6.44-6.50(m，2H)，7.04-7.12(m，4H)，7.35(d，2H)，7.54(m，1H)，7.64(m，2H)，7.85(dd，1H)，8.03(dd，1H).

化合物10.收率65％，使用1，2-环氧丁烷作为烷基化剂。所得到数据为¹H NMR(CDCl₃)：δ0.86(t，3H)，1.38(p，2H)，1.74(br，1H)，2.37(s，3H)，2.49(dd，1H)，3.02(dd，1H)，3.30(m，1H)，6.51(dd，2H)，7.03-7.16(m，4H)，7.35(d，2H)，7.55(t，1H)，7.62(t，2H)，7.92(dd，1H)，8.00(dd，1H).

化合物16.收率96％。¹H NMR(CDCl₃)：δ2.35(s，6H)，6.51(m，2H)，7.08(m，4H)，7.43(dd，1H)，7.60(m，2H)，7.93(m，4H)，8.00(d，1H)，8.12(d，1H).

化合物17.收率49％。¹H NMMR(CDCl₃)：δ2.31(s，6H)，3.67(s，3H)，5.99(d，1H)，6.43(dd，1H)，6.63(dd，1H)，7.00-7.11(m，2H)，7.36(d，2H)，7.52(m，1H)，7.63(m，2H)，7.80(d，1H)，7.93(dd，1H).

化合物19.收率90％。¹H NMR(CDCl₃)：δ2.29(s，3H)，2.40(s，3H)，6.37(d，1H)，6.48(m，1H)，6.97(t，1H)，7.01-7.17(m，3H)，7.36(d，2H)，7.54(m，1H)，7.64(m，2H)，7.73(m，1H).

化合物20.收率86％。¹H NMR(CDCl₃)：δ2.20(s，3H)，3.94(m，2H)，6.52(m，2H)，7.00-7.16(m，4H)，7.25(m，5H)，7.37(d，2H)，7.58(t，1H)，7.68(t，2H)，7.80(dd，1H)，7.93(dd，1H).

化合物21.收率96％。¹H NMR(CDCl₃)：δ2.30(s，6H)，3.92(s，3H)，6.50(d，2H)，7.00-7.15(m，6H)，7.28(d，2H)，7.87(dd，2H).

化合物23.收率84％。¹H NMR(CDCl₃)：δ1.89(p，2H)，2.35(s，3H)，2.77(t，2H)，2.90(t，2H)，6.48(t，2H)，7.01-7.13(m，4H)，7.37(d，2H)，7.54(m，1H)，7.64(m，2H)，7.86(d，1H)，7.95(d，1H).

化合物26.收率94％。¹H NMR(CDCl₃)：δ2.30(s，6H)，5.29(s，2H)，6.87(d，2H)，7.06(t，2H)，7.13-7.20(m，4H)，7.27-7.35(m，3H)，7.88(d，2H).

化合物30.收率90％。¹H NMR(CDCl₃)：δ2.32(s，6H)，5.25(s，2H)，6.83(d，2H)，7.10(m，4H)，7.19(d，2H)，7.12(d，2H)，7.91(d，2H).

二硫代羧基化的另外程序.在-78℃下，在氩气下，向在THF(800mL)中的N-苄基9，10-二氢化吖啶(43.8g)溶液中，加入67mL的2.5M n-BuLi溶液。将混合物在-78℃下搅拌3小时，除去冷却浴并继续搅拌另外30min。将溶液再次冷却到-78℃和加入10.65mL的CS₂。在-78℃下1hr之后，允许反应缓慢升温到室温(1hr)。加入甲基碘(29.71g)，在室温下继续反应过夜。然后在真空下蒸发反应混合物并将残余物溶于CH₂Cl₂。溶液通过短二氧化硅栓塞和蒸发溶剂留下橙色固体，其从热乙酸乙酯结晶(10mL/g固体)。

化合物3的合成.在-78℃下，向在THF(60mL)中的LDA溶液(11.0mmol)中，加入在THF(20mL)中的N-苯基9，10-二氢化吖啶(1.285g，5.0mmol)。在-78℃下搅拌获得的混合物1h。加入CS₂(0.33mL，5.5mmol)。在-78℃下30min.之后，允许反应缓慢升温到室温(1h)并搅拌30min。当加入苄基溴(1.67mL，14mmol)时，将反应冷却到-78℃。在-78℃下20min之后，允许反应升温并在室温下搅拌1.5h。在整理之后，在二氧化硅上的色谱分析(己烷/EtOAc20∶1)得到1.565g的3(61％收率)。¹H NMR(CDCl₃)：δ3.90(s，4H)，6.42(d，2H)，6.97(t，2H)，7.09(t，2H)，7.18-7.3 0(m，12H)，7.5 5(m，1H)，7.62-7.71(dd，4H)ppm.

相似地制备化合物4和25。

化合物4.收率26％。¹H NMR(CDCl₃)：δ5.95(s，4H)，6.38(d，2H)，6.88(t，2H)，7.07(t，2H)，7.12(d，2H)，7.21-7.30(m，20H)，7.40(d，2H)，7.53(m，1H)，7.61(m，2H).

化合物25.收率16％。¹H NMR(CDCl₃)：δ2.28(d，6H)，3.44(s，3H)，3.86(s，3H)，6.54(d，1H)，6.63(dd，1H)，7.00-7.08(m，2H)，7.29(m，1H)，7.72(d，1H)，7.87(d，1H).

相似地，在THF中，以44％收率，通过相应二硫代羧酸酯与1，3-二碘丙烷的烷基化制备化合物5。¹H NMR(CDCl₃)：δ2.16(p，2H)，2.90(t，4H)，6.44(d，2H)，6.99-7.10(m，4H)，7.38(d，2H)，7.54(m，1H)，7.64(m，2H)，7.71(dd，2H).

通过采用丙磺酸内酯，烷基化二硫代羧酸酯或二硫代羧酸烷基酯，制备每种包含一个或两个丙磺酸盐基团的化合物11，12，14，15，18，22，24，27，28，29，32，33和38。

化合物11(收率98％)。¹H NMR(CD₃OD)：δ1.92(p，2H)，2.26(s，3H)，2.67(t，2H)，2.81(t，2H)，6.41(t，2H)，6.90-7.10(m，4H)，7.37(d，2H)，7.57(t，1H)，7.67(t，2H)，7.87(d，2H).

化合物12(收率68％)。¹H NMR(CD₃OD)：δ1.99(p，4H)，2.73(t，4H)，2.91(t，4H)，6.42(d，2H)，6.97-7.06(m，4H)，7.38(d，2H)，7.55(t，1H)，7.67(t，2H)，7.89(dd，2H).

化合物14(收率53％)。¹H NMR(CD₃OD)：δ1.88(p，2H)，2.22(s，3H)，2.63(t，2H)，2.78(t，2H)，6.37(t，2H)，6.90-7.05(m，4H)，7.32(d，2H)，7.52(t，1H)，7.63(t，2H)，7.83(d，2H).

化合物15收率94％。¹H NMR(CD₃OD)：δ1.87(p，2H)，2.21(s，3H)，2.64(t，2H)，2.81(t，2H)，3.45(s，3H)，6.90-7.09(m，4H)，7.24(m，2H)，7.79(m，2H).

化合物18收率84％。¹H NMR(CD₃OD)：δ1.93(m，2H)，2.26(s，3H)，2.69(m，2H)，2.82(m，2H)，3.61(s，3H)，5.91(dd，1H)，6.39(t，1H)，6.62(m，1H)，6.90-7.08(m，2H)，7.37(d，2H)，7.57(t，1H)，7.68(t，2H)，7.79(dd，1H)，7.90(dd，1H).

化合物22收率90％。¹H NMR(CD₃OD)：δ1.91(p，2H)，2.26(s，3H)，2.67(t，2H)，2.80(t，2H)，3.90(s，3H)，6.46(t，2H)，6.99(m，2H)，6.07(m，2H)，7.18-7.29(m，4H)，7.86(d，2H).

化合物24收率78％。¹H NMR(CD₃OD)：δ1.95(p，2H)，2.29(s，3H)，2.70(t，2H)，2.83(t，2H)，6.44(dd，2H)，7.03(m，4H)，7.40(dd，1H)，7.59(m，2H)，7.90(d，2H)，8.01(m，3H)，8.16(d，1H).

化合物27收率83％。¹H NMR(CD₃OD)：δ1.85(p，2H)，2.22(s，3H)，2.59(t，2H)，2.80(t，2H)，5.32(s，2H)，6.88(d，2H)，6.98(m，2H)，7.10(m，4H)，7.20-7.27(m，3H)，7.83(dd，2H)

化合物28收率87％。¹H NMR(CD₃OD)：δ1.85(p，2H)，2.22(s，3H)，2.60(t，2H)，2.80(t，2H)，5.30(s，2H)，6.86(d，2H)，6.96-7.17(m，6H)，7.27(d，2H)，7.80-7.87(dd，2H).

化合物29收率91％。¹H NMR(CD₃OD)：δ1.85(p，2H)，2.22(s，3H)，2.61(t，2H)，2.80(t，2H)，3.74(s，3H)，5.25(s，2H)，6.82(d，2H)，6.89-7.02(m，6H)，7.13(t，2H)，7.80-7.87(dd，2H).

化合物32.¹H NMR(CD₃OD)：d 1.14(t，3H)，1.89(p，2H)，2.63(t，2H)，2.72(q，2H)，2.83(t，2H)，5.32(s，2H)，6.90(m，2H)，6.99(m，2H)，7.09-7.26(m，7H)，7.83(d，1H)，7.89(d，1H).

化合物33.¹H NMR(CD₃OD)：δ0.82(t，3H)，1.46(m，2H)，1.92(p，2H)，2.68(m，4H)，2.83(t，2H)，5.32(s，2H)，6.91(m，2H)，6.97(m，2H)，7.1-7.25(m，7H)，7.86(t，2H).

化合物38.¹H NMR(CD₃OD)：δ1.9(p，2H)，2.6(t，2H)，2.8(t，2H)，3.93(s，2H)，5.31(s，2H)，6.9(m，3H)，7.2(m，13H)，7.6(d，1H)，7.8(d，1H).

化合物7的合成.在-78℃下，向在THF(30mL)中的LDA(2.5mmol)溶液中，加入在THF(10mL)中的甲基N-苯基9，10二氢化吖啶-9-二硫代羧酸酯(0.347g，1.0mmol)。在-78℃下1h之后，允许反应升温到-20℃然后加入溴苯。在加料之后允许反应缓慢升温和在室温下搅拌反应3h。真空脱除溶剂，随后进行色谱分析(己烷/EtOAc20∶1)得到0.255g化合物7(60％收率)。¹H NMR(CDCl₃)：δ2.20(s，3H)，6.45(d，1H)，6.53(d，1H)，6.92(t，1H)，7.03-7.24(m，4H)，7.33-7.47(m，6H)，7.56(m，1H)，7.66(m，2H)，7.87-7.94(m，2H).

化合物13的合成.通过与1-碘辛烷的反应，将N-苯基9，10二氢化吖啶-9-二硫代羧酸酯转化成正辛基硫代酸酯。在-78℃下，向在THF(70mL)中的LDA(4.48mmol)溶液中，加入在THF(20mL)中的正辛基N-苯基9，10二氢化吖啶-9-二硫代羧酸酯(1.90g，4.26mmol)。在-78℃下搅拌获得的混合物1h。然后加入在THF(10mL)中的1，3-丙磺酸内酯(0.78g，6.39mmol)。在-78℃下45min之后，允许反应升温到室温并进一步搅拌3h。溶剂的脱除得到固体残余物，将该残余物溶于最小体积的CH₂Cl₂并采用己烷沉淀。重复程序直到溶液不在TLC板上显示荧光组分。在真空中干燥之后，获得2.270g为淡黄色粉末的13。收率93％。¹H NMR(CDCl₃)：δ0.84(t，3H)，1.13-1.40(m，12H)，2.02(q，2H)，2.68(t，2H)，2.77(t，2H)，2.90(t，2H)，6.42(dd，2H)，6.94-7.08(m，4H)，7.34(d，2H)，7.56(m，1H)，7.67(m，2H)，7.86(d，1H)，7.92-(d，1H)。

化合物31的合成.在室温下搅拌在CH₂Cl₂(5mL)中的化合物16(0.250g，0.49mmol)与三乙胺(9mL)2.5天。在真空中除去挥发物。将残余物溶于最小量的CH₂Cl₂并采用醚沉淀。重复此程序直到洗涤物不显示荧光组分。在真空中干燥之后，获得0.140g为淡黄色固体的化合物31，收率47％。¹H NMR(CD₃OD)：δ1.06(m，9H)，1.71(m，2H)，2.32(s，3H)，2.91-3.08(m，10H)，6.37(d，1H)，6.51(d，1H)，6.98-7.18(m，4H)，7.25(d，2H)，7.59(m，1H)，7.67(m，2H)，7.82(d，1H)，8.02(d，1H).

化合物35的合成.向在THF(80mL)中的甲基N-苯基9，10二氢化吖啶-9-二硫代羧酸酯(1.735g，5.00mmol)溶液中，加入NaH(0.460g，在矿物油中的60％悬浮液，11.5mmol)。在室温下搅拌获得的混合物3h。然后加入在THF(20mL)中的11-溴十一碳烷-1-醇(1.633g，6.50mmol)。在过夜搅拌之后，将4mL的MeOH加入到反应混合物中以分解过量NaH。在真空脱除溶剂得到残余物，在硅胶上色谱分析残余物(己烷/EtOAc4∶1)，得到为糖浆的11-羟基十一烷基乙烯酮二硫缩醛衍生物，2.550g，收率98％。

¹H NMR(CDCl₃)：δ1.19-1.60(m，19H)，2.32(s，3H)，2.70(t，2H)，3.64(m，2H)，6.46(t，2H)7.05(m，4H)7.35(d，2H)，7.54(m，1H)，7.64(m，2H)，7.88(dd，1H)，7.95(dd，1H)ppm.

在0℃下，向以上制备的化合物(2.55g，4.92mmol)在CH₂Cl₂(60mL)中的溶液中，加入吡啶(0.52mL，6.40mmol)随后加入POCl₃(0.60mL，6.40mmol)。在除去冰浴以允许反应升温到室温(30min)之前，反应在0℃下继续1h。然后在吡啶(3.18mL，39.4mmol)中加入3-羟基丙腈(1.35mL，19.7mmol)。在搅拌过夜之后，在分液漏斗中采用水洗涤反应混合物。将有机相在Na₂SO₄上干燥，蒸发并在硅胶(EtOAc)上色谱分析残余物，以得到双(氰乙基)磷酸酯衍生物，2.70g，收率79％。¹HNMR(CDCl₃)：δ1.19-1.50(m，16H)，1.71(m，2H)，2.31(s，3H)，2.70(t，2H)，2.79(t，4H)，4.13(q，2H)，4.38(q，4H)，6.45(t，2H)，7.05(m，4H)，7.35(d，2H)，7.54(m，1H)，7.64(m，2H)，7.88(dd，1H)，7.94(dd，1H)ppm.

在丙酮(40mL)中，采用1M NaOH(7.68mL，7.68mmol)处理2.70g(3.84mmol)被保护的磷酸酯，进行氰乙基保护基团的水解过夜，得到2.36g化合物35(96％收率)。¹H NMR(CD₃OD)：δ1.08-1.34(m，16H)，1.56(m，2H)，2.25(s，3H)，2.64(t，2H)，3.79(q，2H)，6.42(d，2H)，6.95-7.09(m，4H)，7.31(d，2H)，7.58(m，1H)，7.69(m，2H)，7.84(d，1H)，7.89(d，1H).

以相似的方式制备化合物34，36和37，36从十一烷基二硫代酸酯开始。

化合物34 ¹NMR(CD₃OD)：δ1.77(p，2H)，2.24(s，3H)，2.85(t，2H)，3.79(q，2H)，6.39(t，2H)，6.94-7.07(m，4H)，7.32(d，2H)，7.56(m，1H)，7.67(m，2H)，7.83(dd，1H)，7.89(dd，1H).

化合物36¹H NMR(CD₃OD)：δ0.88(t，3H)，1.09-1.35(m，18H)，1.87(p，2H)，2.66(t，2H)，2.90(t，2H)，3.84(q，2H)，6.40(m，2H)，6.94-7.08(m，4H)，7.31(d，2H)，7.56(m，1H)，7.67(m，2H)，7.82(d，1H)，7.95(d，1H).

化合物37 ¹NMR(CD₃OD)：δ1.75(m，2H)，2.24(s，3H)，2.89(t，2H)，3.83(q，2H)，5.35(s，2H)，6.92(d，2H)，7.01(t，2H)，7.15(m，4H)，7.29(m，3H)，7.88(m，2H).

4.化合物39的合成.

通过如下合成方法制备化合物39。N-苄基9，10-二氢化吖啶的阴离子与CS₂在THF中在-78℃下的反应，允许反应缓慢升温到室温(1hr)，随后加入苄基溴，得到N-苄基9，10-二氢化吖啶的苄基二硫代酸酯。采用NaH处理此二硫代酸酯在THF中的溶液并在室温下搅拌获得的混合物。然后加入3-溴丙-1-醇(1.633g，6.50mmol)且反应进行过夜。根据化合物35合成相关而描述的方法，磷酸化这样形成的乙烯酮二硫缩醛。

5.从乙烯酮二硫缩醛的化学发光的增强.

在测试方案中测试几种增强剂，该测试方案涉及反应辣根过氧化物酶与增强剂，过氧化物，EDTA和化合物1或14在包含Tween 20的缓冲剂中的溶液。测定峰值光强度。优选的增强剂是2-萘酚、6-溴-2-萘酚、对羟基肉桂酸，1，6-二溴-2-萘酚、7-甲氧基-2-萘酚、4-苯基苯酚、3-(N-吩噻嗪基)丙磺酸盐、3-(N-吩噁嗪基)丙磺酸盐、4-(N-吩噁嗪基)丁磺酸盐、5-(N-吩噁嗪基)戊酸盐和N-甲基-吩噁嗪。

6.采用化合物1的HRP化学发光检测.

通过反应三份100μL等分试样与10μL范围为1.4×10^-15-1.4×10^-20摩尔的HRP，测试包括如下物质的试剂组合物的化学发光产生：0.01M三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH7.0，0.5mM脲过氧化物，0.1mM对苯基苯酚，1mM的EDTA，0.025％的Tween 20和5×10^-5M化合物1。光产生在混合时随着发生并在约1min内达到最大强度。在整个测试范围内，化学发光强度对酶数量的log-log图是线性的。

7.采用化合物14的HRP化学发光检测.

通过反应三份100μL等分试样与10μL范围为1.4×10^-16-1.4×10^-20摩尔的HRP，测试包括如下物质的试剂组合物的化学发光产生：0.025M三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH8.0，2.5mM脲过氧化物，4mM对羟基肉桂酸，0.5mM的EDTA，0.1％的Tween 20和3×10^-4M化合物14。光产生在混合时随着发生并在约1min内达到最大强度。图1中显示在化学发光强度和酶数量之间的关系。为了比较，对于具有如下通式的参考化合物1，也显示在S-B和HRP数量之间的关系：

参考化合物1

在10μL包含1.4×10^-15-1.4×10^-19摩尔酶的HRP溶液加入到100μL试剂之后15分钟，测量参考化合物的结果，该试剂包括0.055M三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH8.6，0.25mM脲过氧化物，0.05mM对苯基苯酚，0.5mM的EDTA，0.0125％的Tween 20和3.3×10^-4M的参考化合物1。

8.采用化合物27的HRP化学发光检测.

通过反应三份100μL等分试样与10μL范围为1.4×10^-16-1.4×10^-20摩尔的HRP，测试包括如下物质的试剂组合物的化学发光产生：0.025M三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH8.0，2.5mM脲过氧化物，4mM对羟基肉桂酸，0.5mM的EDTA，0.1％的Tween 20和3×10^-4M化合物27。光产生在混合时随着发生并在约1min内达到最大强度。在图2中显示在1.5min化学发光强度和酶数量之间的关系，以及如上所述对于参考化合物1在15min的结果。

9.信号强度的比较.

通过反应100μL等分试样与3.5×10^-16摩尔HRP，测试包括如下物质的试剂组合物的化学发光产生：0.01M三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH8，0.5mM脲过氧化物，0.1mM对苯基苯酚，1mM的EDTA，0.025％的Tween 20和5×10^-5M下表中除称为参考化合物1以外的每种化合物。参考化合物1的试剂配方包括0.05M三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH8.6，0.25mM脲过氧化物，0.05mM对苯基苯酚，0.5mM的EDTA，0.0125％的Tween 20和3.3×10^-4M的参考化合物1。为了比较，对于参考化合物1和2提供数据。

         化合物                        信号/背景

         参考化合物1                   53

         参考化合物2                   325

         1                             8060

         2                             953

         11                            849

         13                            7626

         14                            688

         26                            5200

         27                            533

 

         参考化合物1                   参考化合物2

10.信号强度的比较.

通过反应100μL试剂组合物的等分试样与3.5×10^-16摩尔HRP，比较由化合物14，和27-29每一种产生的最大信号，试剂组合物包括0.025M三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH8，2.5mM脲过氧化物，4mM对羟基肉桂酸，0.5mM的EDTA，0.1％的Tween 20和3×10^-4M测试化合物。每种试剂在约1分钟内达到最大光强度。

       化合物         信号/背景

       14             2491

       27             6933

       28             6717

       29             6621

       38             26000

11.使用乙烯酮二硫缩醛26的化学发光时间变化情况.

通过反应100μL等分试样与3.5×10^-16摩尔HRP，测试包括如下物质的试剂组合物的化学发光产生：0.01M三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH8.0，0.5mM脲过氧化物，0.01mM对苯基苯酚，1mM的EDTA，0.025％的Tween 20和5×10^-5M化合物26。相对化学发光时间变化情况在图3中显示并展示比称为参考化合物2的结构相似化合物更为快速的化学发光产生。使用实施例1中所列的其它乙烯酮二硫缩醛的化学发光时间变化情况显示相似的快速增加。

12.使用乙烯酮二硫缩醛27的化学发光时间变化情况.

通过反应100μL等分试样与3.5×10^-16摩尔HRP，测试包括如下物质的试剂组合物的化学发光产生：0.025M三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH8.0，2.5mM脲过氧化物，4mM对羟基肉桂酸，0.5mM的EDTA，0.1％的Tween 20和3×10^-4M化合物27。相对化学发光时间变化情况在图4中显示并且展示化学发光的快速产生，以及比先前实施例试剂所产生的更高信号水平。

13.使用乙烯酮二硫缩醛底物的蛋白质印迹.

根据在U.K.Laemmli，自然(伦敦)，227，680(1970)中描述的程序，使用PVDF膜，进行作为测试抗原的β-半乳糖苷酶的蛋白质印迹测定。β-半乳糖苷酶标准范围为5000-5pg。包含化合物1的检测试剂允许检测在1分钟之内进行。图5展示在11min之后，采用5秒曝光的β-gal检测。为了比较，使用含有描述于U.S.5,922,558的化合物参考化合物1的试剂的蛋白质印迹结果，产生更低强度的化学发光并要求更长时间的曝光，以达到更大丰度带的相同图象。此外，本发明的试剂能够成像1pg或更低丰度带，该谱带不能采用包含参考化合物的试剂成像。

14.使用另外乙烯酮二硫缩醛底物的蛋白质印迹.

根据实施例13，使用包含化合物27或化合物37和增强剂和过氧化物的检测试剂，进行β-半乳糖苷酶的蛋白质印迹测定。图6展示在60min之后，采用使用化合物27的1min曝光，和使用化合物37的8min之后的1min曝光的β-gal检测。

15.另外的乙烯酮二硫缩醛.

制备如下化合物。

化合物     R^4-11   R³                  R¹                 R²

40          -        CH₂-p-C₆H₄OH       CH₃                 CH₃

41          -        CH₂Ph                 CH₂-p-C₆H₄Cl    (CH₂)₃SO₃Na

42          -        Ph                     CH₂Ph              (CH₂)₃SO₃Na

43          -        CH₂Ph                (CH₂)₃OPO₃Na₂   (CH₂)₃OPO₃Na₂

44          -        CH₂Ph                (CH₂)₃OH           (CH₂)₃OPO₃Na₂

45          -        Ph                             -CH₂CH(OH)CH₂-

46          -        Ph                        -CH₂CH(O(CH₂)₃SO₃Na)CH₂-

47          -        CH₂Ph                    -CH₂CH(O(CH₂)₃SO₃Na)CH₂-

48    -    CH₂Ph                      -CH₂CH(O(CH₂)₃OPO₃Na₂)CH₂-

49    -    CH₂Ph                          -CH₂CH₂(OCH₂CH₂)₄-

50    -    (CH₂)₃O(CH₂)₃SO₃Na                  O-C₆H₄

51    -    CH₃                                      O-C₆H₄

52    -    CH₂ph                     (CH₂)₃OH   (CH₂)₃O(CH₂)₃SO₃Na

53    -    CH₂Ph                      CH₃         (CH₂)₃O(CH₂)₃SO₃Na

54    -    Ph                          CH₃         (CH₂)₃S(CH₂)₃SO₃Na

55    -    CH₂Ph                      CH₃         (CH₂)₃OSO₃Na

56    -    Ph                          CH₃         (CH₂)₃O(CH₂)₃SO₃Na

如在上述Akiba文章中所述，制备化合物51。

16.另外的合成和表征.

化合物40：¹H NMR(CDCl₃)：δ2.28(s，6H)，4.74(s，1H)，5.21(s，2H)，6.76(d，2H)，6.87(d，2H)，7.00(m，4H)，7.12(t，2H)，7.85(d，2H).

化合物41：¹H NMR(CDCl₃)：δ2.03(p，2H)，2.78(t，2H)，2.94(t，2H)，3.86(s，2H)，5.29(s，2H)，6.80-7.15(m，12H)，7.28(m，3H)，7.59(d，1H)，7.93(d，1H).

化合物42：¹H NMR(CDCl₃)：δ1.82(p，2H)，2.60(t，2H)，2.75(t，2H)，3.83(s，2H)，6.29-6.36(m，2H)，6.80-6.85(t，1H)，6.90-7.03(m，3H)，7.12(s，5H)，7.22-7.25(d，2H)，7.48-7.63(m，4H)，7.78-7.80(d，1H).

化合物43：¹H NMR(D₂O)：δ1.77(p，4H)，2.88(t，4H)，3.69(q，4H)，5.30(s，2H)，6.98(d，2H)，7.06(m，4H)，7.18-7.29(m，5H)，7.88(d，2H).

化合物44：¹H NMR(CD₃OD)：δ1.70(p，2H)，1.88(p，2H)，2.78(t，2H)，2.92(t，2H)，3.15(t，2H)，3.85(q，2H)，5.29(s，2H)，6.90(t，2H)，6.98(m，2H)，7.08-7.26(m，7H)，7.74(d，1H)，7.95(d，1H).

化合物45的合成.在-78℃下，向在THF(250mL)中的LDA(30.8mmol)溶液中，加入在THF(20mL)中的N-苯基9，10-二氢化吖啶(3.86g，15.0mmol)。在-78℃下搅拌获得的混合物1.5hrs。然后加入CS₂(0.99mL，16.5mmol)。在-78℃下45min之后，允许反应升温到室温并在加入THF(130mL)中的[2-(1，3-二溴)丙氧基]-叔丁基二甲基硅烷(5.23g，15.8mmol)之前，进一步搅拌30min。在过夜搅拌之后，除去溶剂并将残余物进行柱色谱法分析(硅胶，己烷/CH₂Cl₂：1/2.5)。获得化合物45(6.15g)(81％收率)。采用TBAF的甲硅烷氧基解保护以85％收率得到45。¹H NMR(CDCl₃)：δ2.76(dd，2H)，2.82(br，1H)，3.19(dd，2H)，4.22(m，1H)，6.76(d，2H)，7.01-7.13(m，4H)，7.38(d，2H)，7.55(t，1H)，7.62-7.72(m，4H).

化合物46的合成.在氩气下，向在DMF(10mL)中的45(1.00g，2.57mmol)溶液中，加入氢化钠(0.108g，在矿物油中为60％，2.70mmol)。在约1hr和20min之后，获得透明溶液。然后加入3-丙磺酸内酯并在室温下搅拌混合物60hrs。通过在真空中除去DMF，将反应混合物浓缩到约3mL的体积。加入丙酮(7mL)以沉淀产物。在通过过滤收集固体之前，搅拌混合物20min。将固体采用丙酮(3×5mL)洗涤并干燥以得到1.12g粗产物。采用水和异丙醇的再结晶得到0.80g为淡黄色固体的纯46(58％收率)。¹H NMR(CDCl₃)：δ2.16(p，2H)，2.90(t，4H)，6.44(d，2H)，6.99-7.10(m，4H)，7.38(d，2H)，7.54(m，1H)，7.64(m，2H)，7.71(dd，2H).

化合物47.H¹ NMR(CD₃OD)：δ.03(2H，m)，2.87(4H，m)，3.08(2H，m)，3.62(2H，t，J＝6.5Hz)，4.00(1H，m)，5.26(2H，s)，6.81(2H，d，J＝8.2Hz)，6.94(2H，m)，7.07(4H，m)，7.21-7.29(3H，m)，7.65(2H，d，J＝7.5Hz).

化合物48.H¹ NMR(CD₃OD)：δ1.85(2H，m)，2.84(2H，m)，3.06(2H，m)，3.63(2H，t，J＝6.7Hz)，3.87(2H，m)，3.99(1H，m)，5.21(2H，s)，6.78(2H，d，J＝8.1Hz)，6.93(2H，m)，7.05(4H，m)，7.19-7.27(3H，m)，7.64(2H，d，J＝7.2Hz).P³¹NMR(CD₃OD)：d 10.27(s).

化合物49.H¹ NMR(CDCl₃)：δ2.92(4H，t，J＝7.1Hz)，3.51-3.63(16H，m)，5.27(2H，s)，6.85(2H，d，J＝8.7Hz)，7.02(2H，m)，7.11-7.16(4H，m)，7.25-7.30(3H，m)，7.93(2H，d，J＝7.5Hz).

化合物50.H¹ NMR(CD₃OD)：δ2.03(m，4H)，2.85(t，2H)，3.48(m，4H)，4.14(t，2H)，7.02-7.10(m，4H)，7.18-7.33(m，6H)，7.45(d，2H).

17.信号强度的比较.

通过反应100μL试剂组合物的等分试样与3.5×10^-16摩尔HRP，比较由化合物40-51每一种产生的最大信号，试剂组合物包括0.025M三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH8，2.5mM脲过氧化物，4mM对羟基肉桂酸，0.5mM的EDTA，0.1％的Tween 20，和1mM、0.3mM、0.15mM或0.05mM测试化合物。每种试剂在1-3分钟内达到最大光强度。

化合物         配方          信号/背景

40               1.0             4011

41               1.0             14000

42               1.0             9100

43               1.0             1121

44               1.0             5810

45               0.3             2102

46               1.0             13000

47               1.0             7228

48               1.0             4219

49               0.05            4853

50               0.3             1651

51               0.05            4264

52       0.15      5840

53       0.15      5742

54       0.15      2502

55       0.3       5408

化合物49和51较差地溶于含水配方。

18.使用乙烯酮二硫缩醛底物46的蛋白质印迹.

根据实施例13，但使用硝基纤维素膜和检测试剂，进行β-半乳糖苷酶的蛋白质印迹测定，检测试剂包括0.025M三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH8.0，2.5mM脲过氧化物，4mM对羟基肉桂酸，0.5mM的EDTA，0.1％的Tween 20，和1mM化合物46。图7展示在高达120min的各个时间点上具有优异的灵敏性的快速而方便的β-gal检测。

19.另外的化合物.

化合物52.1H NMR(CD₃OD)：δ1.59-1.70(m，4H)，1.95(m，2H)，2.72-2.83(m，6H)，3.18(t，2H)，3.34(t，2H)，3.45(t，2H)，5.29(s，2H)，6.91-7.02(m，4H)，7.09-7.25(m，7H)，7.82(d，1H)，7.88(d，1H)ppm.

化合物53.1H NMR(CD₃OD)：δ1.54(p，2H)，1.92(m，2H)，2.21(s，3H)，2.70-2.82(m，4H)，3.10(t，2H)，3.29(t，2H)，5.30(s，2H)，6.90-7.02(m，4H)，7.08-7.26(m，7H)，7.78(d，1H)，7.89(d，1H)ppm.

化合物56.1H NMR(CD₃OD)：δ1.60(p，2H)，1.93(m，2H)，2.27(s，3H)，2.71-2.82(m，4H)，3.14(t，2H)，3.32(t，2H)，6.43(t，2H)，6.98-7.10(m，4H)，7.32(d，2H)，7.57(m，1H)，7.69(m，2H)，7.82(d，1H)，7.92(d，1H)ppm.

20.化合物54的合成.

在氩气下，在RT下，将化合物16(0.500g，0.97mmol)和硫代乙酸钾(0.166g，1.45mmol)在DMF(10mL)中的混合物搅拌过夜。在真空中脱除DMF之后，将残余物由CH₂Cl₂吸收和通过硅胶垫。溶剂的脱除得到为泡沫状固体的0.46g的A。

在氩气下，将化合物A溶于MeOH(10mL)和THF(10mL)的混合物。向此溶液中，加入NaOMe(0.054g，0.97mmol)。将获得的混合物在RT下搅拌3hrs。然后用Dowex 50WX8-100离子交换树脂调节pH到5-6。将树脂滤出并将滤液蒸发到干燥。将残余物由丙酮吸收并通过硅胶垫。在溶剂的脱除之后，得到为泡沫状固体的0.41g的B。

B：¹H NMR(CDCl₃)：d 1.21(t，1H)，1.72(p，2H)，2.30(m，2H)，2.35(s，3H)，2.80(t，2H)，6.49(t，2H)，7.02-7.14(m，4H)，7.38(d，2H)，7.55(t，1H)，7.65(m，2H)，7.88(d，1H)，7.95(d，1H)ppm.

如上所述，在DMF中通过与丙磺酸内酯和NaH的反应，将化合物B转化为化合物54。

¹H MMR(CD₃OD)：δ1.59(p，2H)，1.92(p，2H)，2.22(t，2H)，2.27(s，3H)，2.45(t，2H)，2.73-2.85(m，4H)，6.43(dd，2H)，6.98-7.10(m，4H)，7.35(d，2H)，7.58(m，1H)，7.67(m，2H)，7.80(d，1H)，7.92(d，1H)ppm.

21.化合物55的合成.

在氩气下，将二硫代酸酯(1.00g，2.77mmol)和NaH(2.77mmol)在DMF中的混合物搅拌1hr。然后加入1，3-丙二醇环硫酸酯并在RT下将获得的混合物搅拌过夜。在脱除DMF之后，将残余物采用丙酮/醚(1∶3)洗涤并采用MeOH/2-丙醇再结晶，以得到1.40g的55(收率96％)。¹H NMR(300MHz，CD₃OD)：δ1.69(p，2H)，2.21(s，3H)，2.76(t，2H)，3.83(t，2H)，5.31(s，2H)，6.90(m，2H)，6.99(m，2H)，7.10(m，4H)，7.24(m，3H)，7.83-7.88(dd，2H)ppm.

22.采用化合物52和53的HRP的化学发光检测.

通过反应三份100μL等分试样与10μL范围为1.4×10^-16-1.4×10^-21摩尔的HRP，测试包括如下物质的试剂组合物的化学发光产生：0.025M三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH8.0，2.5mM脲过氧化物，4mM对羟基肉桂酸，0.5mM的EDTA，0.1％的Tween 20和3×10^-4M化合物52或53。光产生在混合时随着发生并快速达到最大强度。在峰值化学发光强度和酶数量之间的关系见图8。

以上的描述和实施例仅是说明性的而并不认为是限制性的。应理解可以修改具体化合物和没有专门公开的方法，而不背离本发明的精神和范围。本发明的范围仅由所附的权利要求限定。