获得抗原性聚集物的方法及其在制剂中的用途

摘要

本发明涉及获得聚集的抗原性结构的方法，其能够增强对全身和/或粘膜给予的聚集抗原的免疫应答，产生强的免疫应答，并涉及由应用所述方法产生的化学结构、由该结构获得的制剂及其用途。该方法描述了利用聚合剂、去脂剂或氧化剂或者能够释放颗粒的脂质的化合物及其异源聚集物，获得新的聚集的抗原性结构，其中随后利用分子排阻方法选择颗粒大小为30－500nm的聚集物。还可以在酵母内通过改变培育条件，形成聚集状态。产生的结构可与佐剂或在引入几种抗原的制剂中方便使用，其中就所获应答的免疫原性在所述成分之间存在协同作用。该制剂也可能包含稳定剂和保存剂。产生的抗原性结构可用于制药工业，作为人和兽医应用的预防或治疗使用的疫苗制剂，以及诊断系统的一部分。

说明书

本发明涉及医学学科，特别是新疫苗制剂的用途。

本申请发明的技术目的在于，开发制备聚集的抗原性结构的方法及其制剂，其能够增强通过全身或粘膜途径给予的现有抗原的免疫原性。

本发明描述的方法产生颗粒性抗原的聚集的抗原性结构，加入其它抗原、具有聚集、去脂或氧化性质的成分，然后选择30-500nm大小的聚集颗粒，聚合物方便地与佐剂形成制剂，有利于所得抗原组合物的免疫原性。

HBsAg是有效免疫原，是第一个广泛用于人类的候选疫苗，第一个被批准普遍使用的抗乙型肝炎重组疫苗。HbsAg蛋白质自我组装成22nm颗粒(Heerman KH，Gerlich WH，1991 Surface protein ofHepatitis B virus.A.McLachlan，ed.CRC Press，Boca Raton，Ann Harbor，Boston，London，p.109)。在小鼠模型中，详细研究了对HBsAg免疫应答的分子、细胞和遗传基础(Milich，DR.1987.Genetic and molecular basis for T-and B-cell recognitionof hepatitis B viral antigens.Immunol Rev.99：71)。先前已经研究了该表面抗原理化性质的变化是怎样影响其对MHC I类限制性T细胞的免疫原性。证明只有低剂量注射22nm颗粒状天然抗原或者无佐剂的去污剂变性的单体，才能产生有效的MHC I类限制性CTL应答(Schirmbeck，R.等人，1994.Eur J Immunol.24：1088)。还研究了通过热变性产生直径约1μm颗粒而得到的HBV表面抗原聚集物制剂的免疫原性。

体内抗原性加工的类型对初级T细胞应答效率以及所涉及T细胞的亚类范围具有根本影响。在呈递肽给MHC之中，显然MHC II类CD4+限制性T细胞和MHC I类CD8+限制性T细胞进行了可变加工(Germain，RN.等人，1993.Annu Rev Immunol.11：403)。已经描述了外源HBsAg颗粒加工以呈递MHC I类限制性表位的新的内体途径。在巨噬细胞而非其它细胞类型中加工该直径1μm的热变性外源HBsAg颗粒，并伴有抗原性肽从加工巨噬细胞回流。该外源性抗原MHC I类限制性肽产生过程已暂定为吞噬细胞途径。主要通过内吞作用加工天然22nm HBsAg颗粒，则通过吞噬细胞途径加工1μm聚集物。除了这两种HBsAg外源制剂体外加工的差别之外，如果没有佐剂，其体内I类CTL免疫原性显著不同。天然HBsAg颗粒免疫原性高，而变性的表面抗原聚集物免疫原性低(Schirmbeck，R.等人，1995.J Immunol 155：4676-4684).

利用荧光偏振的其它研究提示，HBsAg颗粒组成为与蛋白质聚集物相互作用的脂双分子层(Sonveaux N.1995 Res Virol 146(1)：43-51)。

利用氯仿-甲醇(2∶1，v/v)50％1，1’，3，3’-四甲基脲(tetrametilurea)处理HBsAg，尽管释放其大部分脂质，但并不影响颗粒的形态完整性(其保持其平均直径)。去脂作用没有改变抗原性及HBsAg多肽组成(Neurath AR等人1978 Intervirology 10(5)：265-75)。

考虑到在生产过程的压力条件下(例如存在离液剂(chaotropicagents)、适当温度及高浓度溶液)不生成颗粒聚集物，综合利用免疫亲和以及分子大小排阻层析技术，已经研究了重组乙型肝炎表面抗原颗粒聚集物来源。研究分子排阻层析中导致对应HBsAg的峰值增大的因素，证明除HBsAg颗粒大小变动以外，存在颗粒聚集物(Tleugabulova D.1998 J Chromatogr B Biomed Sci Appl 707(1-2)：267-73，Tleugabulova D.1997 Chromatographia 45：317-320)。从而在对应获得大颗粒聚集物的组分中而非发现天然HBsAg蛋白质的组分中，得到聚集抗原，该文另一结果证实，该聚集物由22nm颗粒形成，其在SDS-PAGE中迁移为单体和二聚体，以及正确折叠的表面抗原(Tleugabulova D等人，1998 J Chromatogr B BiomedSci Appl 25；716(1-2)：209-19)。

发明内容

本发明目的之一是获得比产生其的抗原免疫原性更高的聚集的抗原性结构的方法。所述方法包括以下步骤：

A)选择目的抗原

B)在有利于聚集过程的培养基中加入一种或几种抗原的混合物，该培养基可包含具有聚集性能的化学剂、氧化剂或其它组分。

C)温育该混合物

D)利用截留这些分子大小的方法，例如分子排阻层析、渗滤和透析，选择30-500nm大小的颗粒聚集物。

E)通过加入选择的佐剂、也可能加入其它抗原、稳定剂剂和保存剂，混合步骤(C)选择的抗原性结构，制备制剂。

利用本发明方法可获得几种只包含HBV表面抗原的聚集物，也包括该表面抗原及其它来自任何病毒、细菌、单细胞或多细胞病原体的脂蛋白、脂肽或脂类的同源或异源抗原的组合。

根据本发明方法，步骤(B)所得的部分结构的抗原可通过疏水、静电或共价相互作用，加入乙型肝炎病毒表面抗原中，产生不同大小的聚集物。

获得抗原性结构的方法，使乙型、丙型肝炎或HIV核壳抗原与乙型肝炎病毒表面抗原聚集，病毒和细菌的抗原，例如灭活病毒或细菌性病原体如脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)的外膜蛋白质，也可聚集。

为获得聚集的抗原性结构，β-环糊精可用作促进去脂、膜结合以及该颗粒聚合的化学剂，其它化学剂为浓度10-50mM的铵盐，由铜和铁或其它可聚集的金属盐增强。

为此目的，本方法可共同或单独使用的具有自发聚集活性的其它成分为已证实对HBsAg具有聚集活性的同源或异源抗原，其中有病毒核壳抗原以及细菌外膜衍生物或病毒脂蛋白或疏水性包膜。还发现同样性质的佐剂有利于HBsAg聚集以及HbsAg与其自身的聚集。

一般说来，本发明方法可通过形成疏水性相互作用、静电或共价连接，根据所选成分，温育10分钟至一周时间，使HBsAg聚集或者HBsAg与其它抗原或佐剂聚集。

通过分子大小排阻方法进行聚集物的分离，其中包括分子排阻层析、透析、渗滤或可截留30-500nm分子大小的其它方法。

我们还表明，尽管有可能通过非变性方法(最高温度28℃)产生约1μm大小的聚集物，与Schirmbeck得到的相类似(Schirmbeck，R.等人，1995.J Immunol 155：4676-4684)，但在评价体液应答和DTH时，它们免疫原性仍较低。已经证明只有以明矾为佐剂的30-500nm大小的聚集物颗粒，产生的IgG水平显著高于天然抗原对照，另外显示DTH和IgG2a应答显著增强。所有这些证明其后通过分子排阻层析选择抗原的重要性。此种性能差异可能由抗原或目的抗原不同呈递和或加工所造成。

此外，本发明方法预知，所得结构吸附佐剂，如明矾或钙盐、油质或者其它商业使用的佐剂。也可能在最终制剂中添加其它抗原以及稳定剂和保存剂。

本发明另一目的在于，根据前述方法获得的聚集的抗原性结构，其有利于提高所得制剂的免疫原性，并有利于免疫系统分化识别(differential recognition)所涉及的表位。所述聚集的抗原性结构特征在于存在乙型肝炎病毒表面抗原，其单独存在或与其它抗原形成聚集物共同存在。这些其它抗原为脂蛋白或疏水性抗原，其中有HBcAg，另外具备有利于其间通过疏水连接形成聚集状态的固有特性。其它疏水性病毒衣壳和脂蛋白抗原显示了这种能力，其中有丙型肝炎病毒、人类乳头状瘤病毒以及HIV 1和2的核壳抗原，此外还有脑膜炎奈瑟球菌蛋白脂质体囊泡外膜以及一些病毒包膜抗原。

在本发明的抗原性结构目的中，包括HBsAg与疏水性佐剂的结合，其可能是通过前述相同方法获得的聚集物的一部分。一般而言，本发明的抗原性结构可根据所述方法和至少一种颗粒特性，通过聚集至少一种、两种或多种疏水性颗粒而获得，并且应该如实施例所述可由电子显微镜观察到。这些结构的聚集以一般方式有利于免疫调节、分化识别和免疫原性增强。考虑到本发明抗原性结构物的这些特征，有可能利用其合理设计通过全身或粘膜途径预防和治疗人和兽的疫苗，并用于诊断系统。

利用获得此类抗原的方法所得到的新制剂具有以下优点：增强了免疫原性、在聚集过程中共俘获新佐剂、免疫调节剂和抗原的能力。

可根据接种途径和所免疫的物种，按0.01至高达10mL的量使用本发明方法获得的制剂，最终疫苗制剂中的抗原剂量在0.001-1mg之间变化。

实施例

实施例1.利用环糊精获得乙型肝炎病毒表面抗原聚集的疫苗制剂的制备

利用具有消除颗粒中脂质活性的化合物可控处理22nm天然抗原获得颗粒，在此情况下，使用浓度高于1mg/mL的环糊精。根据其浓度，温育时间为24小时至7天。该实验中使用的温育温度为28℃，尽管已经观察到更高或更低温度也可能获得聚集物。尽管氧化作用和脂质减少，温度是有利于部分去脂作用的因素。随后利用凝胶过滤和电子显微术分析不同的聚集物，发现其大小由几十纳米直至颗粒由于太大而沉淀。离心去除沉淀残留物之后，根据其大小选择抗原，进行免疫化学分析，证明脂质水平相对蛋白质水平下降。经HPLC表明，这些聚集物在存储期间具有高度稳定性。利用5-100mg/mL β-环糊精于20-37℃可控处理抗原1-240小时，可获得有可能以后选择免疫化学分析的洗脱时间的粒度范围。

然后该聚集抗原吸附到终浓度0.002-0.1mg/mL的明矾，用于免疫原性分析。

不同时间和温度下与环糊精温育的变化涉及加入免疫调节化合物，例如脂多糖和皂苷，作为吸附明矾的最终聚集物的一部分，制备最终的疫苗制剂。

实施例2.利用氧化剂制备乙型肝炎病毒表面抗原聚集物的疫苗制剂

在标准抗原中加入氧化性化学物质，有可能在可控的时间、温度和浓度条件下，按与环糊精相同的方式进行去脂作用。9-44mM过硫酸铵(ammionium peroxi-disultate)盐可使22nm抗原颗粒形成去脂抗原，通过颗粒融合增加大小。利用凝胶过滤选择最适大小。利用明矾进行La佐剂吸附。

按实施例1相同方式，聚集物在温育过程中有可能包括不同量的其它佐剂和免疫调节剂。

实施例3.制备通过改变酵母的温育条件而得到的超颗粒状化学结构的疫苗制剂

颗粒天然得自巴斯德毕赤(Picchia pastoris)酵母菌株，在纯化过程中通过其物理化学特性选择抗原。抗原制备方法要经受超过100小时的长期培养时间以及氧化压力条件。通过对凝胶过滤各峰样品进行脂质和蛋白质分析，证明该方法通过加强细胞内氧化条件有可能使一部分抗原保持22nm颗粒大小的天然状态，而主要部分聚集并去脂。最后利用TSK G5000柱通过HPLC凝胶过滤分离该组分。此物质高达实际上扔掉的总抗原的10％。利用与普通抗原相似的条件，进行明矾佐剂吸附。

分析两种抗原，证明HBsAg在涉及各种脂质大量丢失的过程中聚集，两种抗原的磷脂如下表所示：通过硅胶分离的HBsAg磷脂(PL)的组成

ng PL/μg蛋白质HBsAg(50-500nm)HBsAg 22nm总磷脂285.6±81.91225.3±256.8(**)卵磷脂(Phosphatidilcholine)109.4±47.6779.3±168.3(**)溶血卵磷脂(Lysophosphatidilcholine)20.0±12.773.5±26.1(**)磷脂酰乙醇胺(Phosphatidilethanolamine)52.8±13.3183.7±54.3(**)磷脂酰丝氨酸(Phosphatidilserine)28.8±11.178.4±26.0(**)磷脂酰肌醇(Phosphatidilinositol)25.3±10.174.7±18.8(**)结合HBsAg的磷脂48.8±10.741.1±7.7(NS)

此实施例证明，正常氧化和去脂处理后，可获得新的超颗粒状抗原。这些聚集物的稳定性将取决于在颗粒去脂过程中(可暴露疏水区，颗粒间蛋白质在暴露巯基(sulphydril groups)时聚合)发生的聚集过程。

实施例4.评价聚集的HBsAg的免疫原性

为了评价实施例3所获的聚集HBsAg的免疫原性(明矾吸附或在PBS中(为粘膜途径))，进行免疫程序：第0、14和28天接种，第42天后眼窝(retro-orbital)取血，通过鼻内或肌内途径免疫10-15周龄的雌性Balb/c小鼠。在本实施例末的表中列出每只小鼠的剂量，结果如图1A所示，HbsAg聚集物如图1B所示。

利用Student检验对结果进行统计分析，p＜0.05认为差异显著。

此实验证明，利用粘膜或全身途径免疫时，在同样条件下有可能产生比普通抗原更高的抗HBsAg IgG应答。在同一图形中比较了DTH应答的效果(条形)，该聚集的变体也显著较高。

免疫组如下表所示：

A-     5μg HBsAg去脂(50-500nm)/PBS 1X                  IN

B-     10μg HBsAg去脂(50-500nm)/PBS 1X                 IN

C-     5μg HBsAg普通(22nm)/PBS 1X                      IN

D-     5μg HBsAg去脂(50-500nm)/明矾0.5mg/mL            IM

E-     5μg HBsAg普通(22nm)/明矾0.5mg/mL                IM

实施例5.抗HBsAg IgG应答的动力学为了研究抗HBsAg IgG应答的动力学，免疫10组雌性10-15周龄Balb/c小鼠。所用程序为：第0、2和18周接种，4、6、8、10、12、14、16、20周免疫前取血。测试组如下表所述：1-5μg HBsAg普通(22nm)/明矾                                 IM2-5μg HBsAg普通(22nm)/PBS 1X                               IM3-5μg HBsAg去脂(实施例3)/明矾0.5mg/mL                      IM4-5μg HBsAg去脂(实施例3)/PBS 1X                            IM5-5μg HBsAg去脂(实施例1)/明矾0.5mg/mL                      IM6-5μg HBsAg去脂(实施例1)/PBS 1X                            IM7-5μg HBsAg去脂(实施例1)/明矾0.5 mg/mL                     IM8-5μg HBsAg去脂(实施例1)/PBS 1X                            IM9-5μg HBsAg去脂(实施例1)/明矾0.5mg/mL                      IM10-5μg HBsAg去脂(实施例1)/PBS 1X                           IM

第5和6、7和8、以及9和10组的抗原是通过不同浓度环糊精温育不同时间，形成不同聚集度而获得的。

DTH实验在以下天数进行测定：1(1，3)，2(1’，3’)，3(1”，3”)和5(1，3)

利用Student检验对结果进行统计分析：p＜0.05认为差异显著。

此实验证实，不同聚集度的去脂HBsAg具有各自不同的免疫学特性。尽管根据实验结果的抗体表观动力学表现，强免疫原性与高聚集度的变体相对应，但强免疫原性以及DTH应答并不对应于大抗原，而是对应于中等抗原大小。然而观察到明矾佐剂免疫组的DTH应答较之PBS抗原免疫组显著升高，中等大小聚集抗原组升高较大，第56天达到最大。图2a显示第56天所有免疫组的各自滴度。该图还显示第22周的5天中进行的DTH实验结果，右腿使用20g HBsAg，左腿PBS，接种量20μL。按照左右腿直径的差别，其余各组的应答与第3组比较也显著下降，如实施例3所述，接种明矾佐剂的中等聚集水平HBsAg，得到第3组。值得考虑的是，后者实施例证实，就所识别的HBsAg表位而言，超颗粒状结构物的识别较广，表明此类结构物性能较好。尽管大部分时间内，第5-10组的抗天然HBsAg反应性类似于天然HBsAg免疫，但也获得了抗聚集抗原中其它表位的较强应答，参见实施例8、图4。

实施例6.评价IgG1/IgG2a的比例

为了研究是否由于其TH1/TH2应答的联系而存在IgG1/IgG2a比例的变化，测试实施例4免疫程序中D和E组血清的抗IgG1和IgG2a抗体水平。利用第42天所取血清进行分析。与明矾佐剂的普通HBsAg相比，超颗粒状抗原(50-500nm)免疫组的IgG2a抗体水平显著增强，高达IgG1/IgG2a的比例接近1(图4)。

同明矾一起免疫的普通HBsAg组的IgG1/2a比例比中等大小的去脂HBsAg组高6.2倍。由此实验可得出结论，表面抗原的不同呈递不仅导致所激发的IgG类型数量上而且质量上的变化，IgG亚类形式的变化与细胞应答增强有关，证实了DTH评价的结果。

实施例7.研究不同抗原性变体免疫小鼠的血清的抗天然HBsAg反应性

利用根据实施例1、2和3获得的去脂抗原免疫小鼠之后，其血清反应性与用普通抗原免疫的小鼠血清相比较。由实验结果观察到，不同变体免疫的小鼠的血清中产生的免疫应答对普通HBsAg(22nm)的反应性不同，普通抗原免疫的小鼠的血清的反应性较大，而去脂程度不同，对HBsAg的反应性也不同。利用高度氧化的变体免疫的小鼠的血清，即使针对其自身免疫原的滴度高，但并不识别HBsAg，证明不同免疫原产生的抗体的识别不同，并证明该新产生的结构的不同的抗原性性质。因此分析实施例5的结果时应考虑到尽管后三种聚集抗原变体获得的抗天然HBsAg应答相似，但也针对不为天然HBsAg免疫所识别的其它HBsAg蛋白质表位产生应答。

实施例8.不同抗原变体免疫的小鼠的血清对线性表位的识别

为了比较由实施例2所述氧化变体获得的超颗粒状HBsAg所产生的抗体的识别作用，在包含线性HBsAg序列(S区)的纤维素膜上进行定位，合成了37条12个氨基酸的肽，每条重叠6个氨基酸，直至完成全部蛋白质序列。

根据Ronald Frank方法(Frank，R.1992 Tetrahedron 48：9217-9232)，在纤维素膜上进行表位定位。按1/100稀释度分析血清样品。

利用普通抗原以及相同抗原的不同聚集变体接种的小鼠的血清结果证明两种抗原之间的线性识别方式不相似，得出结论为，HBsAg及其聚集变体表面上B表位的呈递不同(图4)。

实施例9.HBsAg和核壳抗原之间形成聚集物。免疫学评价。

两种包含0.1mg/mL HBsAg和HBcAg的等体积制剂于4℃温育过夜，然后由TSK G6000 HPLC分子排阻层析获得聚集物。这些聚集物的一个样品利用电子显微术可视化技术处理，另一样品用于免疫学评价，分别利用两种抗原以及经电子显微术证实的聚集物，通过鼻内接种进行Balb/c小鼠的免疫程序(图5A)。

结果证明，通过鼻内途径的两种聚集抗原的混合物可以增强对HBsAg的应答(图5B)。该图中各组如下表所示：1-10μg HBsAg/PBS 1X                                       IN2-10μg HBsAg/乙酰化甘露聚糖(acemannan)3mg/mL              IN3-10μg HBsAg/10μg HBcAg/PBS 1X                           IN4-10μg HBsAg/明矾0.5mg/mL                                 SC

如果使用其它病毒衣壳抗原，例如丙型肝炎病毒和HIV，制备该混合物，则得到类似结果。

附图简述图1.(A)3个剂量程序(0、2、4周)。第6周取血。前三组经鼻内途径接种50μL。剩余两组连同明矾经肌内途径接种100μL。(B)聚集的HBsAg。(标尺：200nm)图2.3个剂量程序(0、2、18周)。各组经肌内途径接种100μL。第8周的抗体值(图2a)。第22周进行DTH测定。图2b表示第1和3组在5天内的DTH值。图2c表示程序期间滴度升高的动力学。图3.与图1相同的3个剂量程序(0、2、4周)。分析第6周取得的D组和E组血清。两组连同明矾经肌内途径接种100μL，D组为去脂HBsAg(50-500nm)，E组为相同剂量的普通HBsAg。图中表示两组中各小鼠IgG1/IgG2a比值的几何平均值和区间。图4.在包含线性序列的纤维素膜上定位HbsAg S区重叠肽。分析1/100稀释度的混合血清：1，HBsAg(普通)；2，HBsAg(聚集)；(3-5：利用聚集抗原免疫获得的单克隆抗体(MAbs)；3，克隆6；4，克隆7；5，克隆8)；6，无关血清；7，MAb(Hep1)。四种颜色深度代表针对该肽的应答。空白：阴性应答，浅灰：弱阳性应答，深灰：阳性应答，黑色：强阳性应答。图5.(A)电子显微镜检查HBsAg聚集物和HBcAg，居中较高电子密集区颗粒对应HBcAg，其它为HBsAg。

(B)2个剂量程序(0、14天)。分析第26天的血清。

                序列表<110>CENTRO DE INGENIERIA GENETICA Y BIOTECNOLOGIA<120>获得抗原性聚集物的方法及其在制剂中的用途<130>AGREG<140>PCT/CU01/00009<141>2001-09-29<150>2000-0279<151>2000-12-01<160>37<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>1Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu  1               5                  10<210>2<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>2Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly  1               5                  10<210>3<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>3Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg  1               5                  10<210>4<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>4Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln  1               5                  10<210>5<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>5Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp  1               5                  10<210>6<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>6Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu  1               5                  10<210>7<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><22l>肽<222>(1)..(12)<400>7Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys  1               5                  10<210>8<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>8Gly Gly Ser Pro Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln  1               5                  10<210>9<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>9Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His  1               5                  10<210>10<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>10Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro  1               5                  10<210>11<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>11Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr  1               5                  10<210>12<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>12Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg  1               5                  10<210>13<211>12<212>PRT<213>Hepatica americana<220><22l>肽<222>(1)..(12)<400>13Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu  1               5                  10<210>14<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>14Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys  1               5                  10<210>15<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>15Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val  1               5                  10<210>16<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>16Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly  1               5                  10<210>17<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>17Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro  1               5                  10<210>18<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>18Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Thr  1               5                  10<210>19<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>19Leu Ile Pro Gly Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro  1               5                  10<210>20<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>20Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr  1               5                  10<210>21<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>21Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Asn Ser  1               5                  10<210>22<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>22Pro Ala Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys  1               5                  10<210>23<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>23Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp  1               5                  10<210>24<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>24Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile  1               5                  10<210>25<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>25Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp  1               5               10<210>26<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>26Pro Ile Pro ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu  1               5                  10<210>27<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>27Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val  1               5                  10<210>28<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400> 28Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser  1               5                  10<210>29<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>29Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val  1               5                  10<210>30<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>30Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu  1               5                  10<210>31<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>31Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu  1               5                  10<210>32<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>32Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Ala Ile Trp Met Met  1               5                  10<210>33<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>33Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser  1               5                  10<210>34<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>34Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser  1               5                  10<210>35<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>35Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu  1               5                  10<210>36<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>36Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu  1               5                  10<210>37<211>12<212>PRT<213>Hepatica americana<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>37Leu Leu Pro Ile Phe phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile  1               5                  10