一种制备人载脂蛋白基因重组蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种人载脂蛋白ApoAIMilano二聚体肽的制备方法，它采用基因重组技术将人的ApoAIMilano基因克隆到表达载体上，构建成表达重组质粒，并转化进入大肠杆菌，组建成表达工程菌，经发酵、纯化工艺获得人ApoAIMilano蛋白，它可用于治疗急性动脉粥样硬化斑块形成而导致的心绞痛、心肌梗死等冠状动脉综合症。

说明书

技术领域

本发明涉及基因重组技术，更具体是指采用基因重组技术将人的ApoAI_Milano基因克隆到表达载体上，构建成表达重组质粒，并转化进入大肠杆菌，组建成表达工程菌。通过经发酵、纯化工艺获得人ApoA1_Milano蛋白。

背景技术

动脉粥样硬化心血管疾病，如冠心病，中风等是中国和西方国家致死疾病中的头号杀手。在中国，据1998年统计数字，动脉粥样硬化心脑血管疾病发病率占总人口的5％以上，即有6千万人。在美国为43％，8千万人。二十世纪90年代以来，医学界发现降低血清总胆固醇水平可以防止动脉粥样硬化形成，降低动脉粥样硬化心血管病发病，发展和死亡。目前世界上降低血清总胆固醇的药只有抑制内源性胆固醇的合成的HMG-CoA还原酶抑制剂，即他汀类药。他汀类药具有防止动脉粥样硬化斑块扩大的作用，但是他汀类药不能清除积聚在血管内壁及动脉粥样硬化斑块内的胆固醇，不能使血管内壁动脉粥样硬化斑块消失。更不能治疗由动脉粥样硬化斑块形成引起的急性心血管疾病，如心肌梗死、心绞痛等高死亡率疾病。目前治疗由动脉粥样硬化斑块形成引起的急性心血管疾病的唯一手段是心脏外科手术，如冠状动脉搭桥术，导管术和支架扩张术。由于这些外科治疗手段仅有短期缓解病症的局限性，手术高危险性和复发率高的缺陷，所以医学界在过去几十年中一直在寻求一种“高效药物”的解决办法。那么，清除动脉粥样硬化斑块内胆固醇和消除动脉粥样硬化斑块的“高效药物”是什么呢，医学界发现是高密度脂蛋白(HDL)。HDL能刺激沉积于血管壁和血管壁动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞/泡沫细胞内胆固醇酯水解。并将水解的非酯化胆固醇从泡沫细胞转运至肝脏分解。从而去除了动脉粥样硬化赖以形成的基础。鉴于HDL具有在治疗急性动脉粥样硬化心血管病方面的突破性作用，和其巨大的市场应用和经济价值，近年来，欧美国家的许多医学研究所，大学及制药公司都把治疗急性和慢性动脉粥样硬化心血管病药的研究和开发转到升HDL药上来。其中治疗急性动脉粥样硬化心血管病药尤为迫切。这是国际上抗动脉粥样硬化心血管病药研究和开发的趋势。然该药目前任是世界空白。目前全世界具有开发此药能力，并且正在开发此药的制药公司仅局限在屈指可数的几家巨头公司，如英国的Glaxo-SmithKlain，美国的Pfizer，Merck & Co和Esperion生物技术公司等。

目前世界上有非常好的治疗一般动脉粥样硬化心血管疾病和高血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)药，即控制内源性胆固醇合成的HMG-CoA还原酶抑制剂，“他汀”类药。但没有治疗急性动脉粥样硬化心血管病，如心肌梗死、心绞痛药。急性动脉粥样硬化心血管疾病的发病基础主要是由高血清低密度脂蛋白(LDL)携带的胆固醇(LDL-C)在血管壁内集聚，引起动脉粥样硬化斑块的形成。他汀类药的治疗局限性在于只能防止胆固醇进入血管壁，不能清除积聚在血管壁及动脉粥样硬化斑块内的胆固醇，更不能消除血管内壁动脉粥样硬化斑块。

ApoAI是HDL的主要功能和结构蛋白成分，也是HDL结合和转运胆固醇的主要作用因子。ApoAI蛋白有一个变异体，它为ApoA1_Milano。ApoA1_Milano是科学家从一意大利人群中分离到的。该蛋白变异体具有高出ApoAI数倍的结合胆固醇的能力。动物试验显示ApoAI-milano能快速缩小和消除血管壁内动脉粥样硬化斑块。美国Esperion生物技术公司的一期和二期临床试验结果显示其疗效良好。目前已发表的与ApoA1_Milano有关的专利有5篇。

ApoAI_Milano是一种人体内的载脂蛋白，由243个氨基酸组成，其基因全序列为732bp，该蛋白质的等电点在5.16-5.60(J.of Biological Chemistryvol.269，No.51，1994、Nuclear acids Research vol.12，No.9，1984.)。国际上已有专利报道制备ApoAI_Milano的方法，采用的是基因融合、大肠杆菌分泌表达的形式。由于ApoAI_Milano是一种易于被降解的蛋白分子，所以他们在基因构建上采取基因的5’-端融合了一段IgG结合的Protein A序列，这样表达的蛋白是一种融合蛋白，表达出来后可避免被降解，又可通过亲和层析易于被纯化。在融合DNA片段的结合部位他们还设置了一个能被酸水解的位点，分泌则利用大肠杆菌Omp A信号肽，表达后分泌到培养基中的蛋白通过IgG亲和层析可获得融合蛋白，再通过酸处理去掉IgG结合的Protein A肽段，得到成熟的ApoAI_Milano蛋白分子(US5876968)。该方法的不足在于采用IgG亲和层析会使得IgG脱落污染样品，由于IgG本身是蛋白质，这就会造成样品异源蛋白的污染，影响样品的纯度，要去除则十分麻烦，去除不干净容易造成样品用于人体产生过敏反应。

本发明描述了ApoA1_Milano重组蛋白制备的过程及体外试验结果。本发明还描述了ApoA1_Milano重组蛋白治疗急性动脉粥样硬化心血管疾病中的应用。

发明内容

本发明目的是提供一种克服现有技术存在缺点的人载脂蛋白ApoAI_Milano的制备方法。

本发明的另一目的是A poAI_Milano在治疗心血管疾病中的应用。

本发明采用的是多聚组氨酸融合基因、大肠杆菌胞内高表达的形式(发酵罐表达已达到1.0-1.3g/L)表达。采用多聚组氨酸(6xHis)融合基因可起到保护表达出来的蛋白不被降解，并且表达出来的蛋白可通过螯合亲和层析方式容易地被纯化。在多聚组氨酸与ApoAI_Milano蛋白之间我们也设置了可通过酸被水解的位点，使纯化后的表达蛋白经酸处理后去掉多聚组氨酸小肽。螯合层析的介质是商品化的鎳介质(Ni-NTA)，层析中介质上的鎳离子也会脱落混入样品中，但只要在纯化的样品中加入螯合剂(如EDTA)就可将鎳去除，简单、方便。

本发明是应用RT-PCR技术从人源细胞-HepG2中首先制备出人ApoAI的基因片段，然后再通过PCR直接位点突变的方法制备成ApoAI_Milano基因，该基因先亚克隆到pMD-T载体上，进行基因的DNA序列测定，测定结果完全正确后再将基因从pMD-T载体上切下，克隆到表达载体pMZG上，构建成表达重组质粒。该构建的表达ApoAI_Milano的重组质粒转化进入大肠杆菌宿主细胞SG13009，组建成表达工程菌。表达工程菌在发酵罐中发酵是通过30℃培养到OD₆₀₀＝9-10，升温至37℃，并加入诱导试剂IPTG，通过9小时的诱导后停止发酵，收获菌体。收获的菌体经高压匀浆泵破菌后进行0.22μ的超滤膜过滤除去菌体残渣，再经分子截留为300KD的超滤膜过滤除去核酸等大分子杂质，最后以分子截留为8000Da的超滤膜超滤浓缩蛋白溶液后进行鎳螯合柱亲和层析纯化ApoAI_Milano蛋白。收集的鎳螯合柱上洗脱下来的ApoAI_Milano蛋白峰溶液调pH至2-2.5进行酸水解，在25℃下水解16-20小时，再鎳柱螯合层析，收集蛋白峰溶液中加入CuCl₂作为氧化剂于室温下处理20小时左右，加入EDTA螯合剂进行透析，使得单链的ApoAI_Milano在这种处理下形成二聚体肽。纯化得到的ApoAI_Milano蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测及体外活性检测和单克隆抗体检测。

附图说明

图1.人ApoAI_Milano基因的PCR引物

图2.人ApoAI_Milano基因5’-端上游的联结接头

图3.人ApoAI_Milano表达质粒pMZG-3质粒结构图

图4.人ApoAI_Milano表达后的SDS-聚丙烯酰胺电泳结果，考马斯亮兰染色。箭头所指为人ApoAI_Milano表达产物电泳条带

图5.人ApoAI_Milano单克隆抗体检测结果。上图为标准曲线，下图为样品测试曲线

图6.人ApoAI_Milano表达产物的体外生物学活性脂结合实验结果。红线代表诱导前细胞提取物的测试结果；黑线代表诱导后细胞提取物的测试结果

图7a.pH4.5洗脱收集的人ApoAI_Milano蛋白峰液SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱

图7b.pH4.5洗脱收集的人ApoAI_Milano蛋白峰液SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的Western Blotting图谱

图8.图中1为标准分子量蛋白，自上而下是：97KD、64KD、42KD、31KD、20KD、14KD；2是人Apo AI_Milano蛋白的单分子肽，28KD；3是人ApoAI_Milano蛋白的二聚体肽，56KD

图9.纯化的人ApoAI_Milano的体外生物学活性脂结合实验(随着游离脂的逐渐被结合、减少，OD值随之下降)

具体实施方式1、材料

(1)限制性内切酶、Taq酶、T₄DNA连接酶、T₄多聚核苷酸激酶及DNA分子量标准分别购自TaKaRa公司、Promega公司和晶美公司。

(2)菌种与质粒：JM103、DH5α、SG13009为本实验室保存，BMH71/18购自Promega公司，pMD-T购自TaKaRa公司，pMZG为本实验室构建。

(3)DNA片段和PCR引物由上海生化细胞研究所合成。

(4)试剂：抗人ApoA1单克隆抗体购自Chemicon Interational Inc.，Tris和SDS购自AMRESCO，Ni-NTA Agarose构自invitrogen。2、方法

(5)ApoAI_Milano基因DNA片段制备

A.HepG2细胞的总RNA提取：HepG2细胞培养至1×10⁶细胞数，在超静工作台内倾去细胞培液，用0.9％的生理盐水洗涤一遍，加入1ml的Trizol试剂(Life Technologies产品)，剧烈振荡，转移至1.5ml的小离心管中，加入0.4ml的氯仿，剧烈振荡后于12500rpm离心5分钟，将上清转移至一根新的无菌1.5ml的小离心管中，加入等体积的重蒸酚，剧烈摇振后将上清转移至一根新的无菌1.5ml的小离心管中，再加入等体积的酚/氯仿(V/V＝1∶1)，同样剧烈摇振后将上清转移至一根新的无菌1.5ml的小离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后于室温放置5分钟，而后以12500rpm离心15分钟，倒去上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两遍，然后于超静工作台内敞口放置1小时，挥发掉乙醇，加入50-100□1的灭菌去离子水溶解沉淀，并于分光光度计中以260nm测定其浓度。

B.PCR制备ApoAI_Milano基因片段：采用TaKaRa公司的试剂盒进行反转录和PCR反应。

2xBca 1^stBuffer               10μl

25mM MgSO₄                   4μl

10mM dNTP Mixture              1μl

Rnase Inhibitor(40^u/μl)      0.5μl

Oligo dT primer(50μM          1μl

上述提取的总RNA                1μl

BcaBest Polymerase(22u/μl)    1μl

Rnase Free H2O to              20μl

将上述的内容物在200μl的小管子里轻轻混匀后置于PCR反应仪中，以下列条件进行反应：

65℃                  1分钟

30℃                  5分钟

15分钟内逐渐升温到65℃后，

65℃                  15分钟

98℃                  5分钟

5℃                   5分钟

反应结束后再以下面的条件进行PCR反应：

25mM MgSO4          6μl

5xBca 2^nd Buffer     16μl

30□MβPrimer         1μl

30□M B Primer        1μl

上述的反转录混合物            20μl

Bca-optinized Tag(5u/μl)     0.5μl

灭菌去离子水                  55.5μl

将上述内容物轻轻混匀后以下列条件再进行PCR循环：

94℃                 45秒

56℃                 1分钟

72℃                 2分钟

进行30个循环后再72℃反应10分钟。

第二对引物A和II以同样的方式进行PCR反应。

(2)表达载体pMZG的构建

构建的表达载体pMZG含有：tac启动子、lac I抑制蛋白基因、t₀转录终止子、Amp^r青霉素抗性筛选基因、colE I复制顺序。

A.tac启动子是由trp启动子和lac启动子杂合而成，其前半部分由trp启动子的前半部分组成(-35区)，后半部分由lac启动子的后半部分组成(-10区)，启动受lac I基因表达产生的抑制蛋白所抑制。杂合后的tac启动子较之trp启动子或lac启动子的启动效率要高得多。Tac启动子是从pDS质粒上经Sca I和sph I双酶解后获得。

B.t₀终止序列为5S rRNA的基因终止信号，出自大肠杆菌rmB操纵子终止序列，是一个强的终止信号，也来自pDS质粒。

C.lac I抑制蛋白基因、Amp^r青霉素抗性筛选基因、colE I复制序列均来自pUC18质粒。

将pDS质粒经Sca I和Sph I双酶切，切出1.2kb大小的带有tac启动子的DNA片段，pDS质粒再经Hind III和Xba I双酶解，切出862bp带有t0终止序列的DNA片段；将pUC18质粒用Sca I和Sph I双酶解，获得带有Ampr青霉素抗性筛选基因DNA段、colE I复制顺序DNA段以及lac I抑制蛋白基因段约1.8kb的DNA片段。而后得到的1.8kb的DNA片段首先与从pDS质粒经Sca I和Sph I双酶解得到的1.2kb的DNA片段连接，连接后的线性DNA片段再用Hind III酶切，然后直接与来自pDS质粒经Hind III和Xba I双酶解获得的862bp的DNA片段相连接，由此制备出基因表达载体。

(3).ApoAI_Milano表达质粒pMZG-3的构建及工程菌组建

采用PCR技术制备的两段基因片段：β-B，A-II(引物序列见图1)。β-B片段5’-端设计有Sph I限制性内切酶序列，3’-端设计有SalI限制性内切酶序列；A-II片段5’-端设计有Sal I限制性内切酶序列，3’-端设计有hind III限制性内切酶序列。A-II片段中有一个密码子CGC改换成了TGC(Arg→Cys)。在Apo AI_M基因的上游，我们设计了一段SD序列及方便表达后纯化的6xHis融合序列，并在融合序列之间设置了酸水解位点以为纯化蛋白除去融合肽(设计序列见图2)。PCR制备的两段基因片段首先亚克隆到pDM-T载体上，转化JM103宿主细胞，培养后挑取菌落提取质粒进行限制性内切酶酶切鉴定，再将酶切鉴定正确的重组质粒进行DNA序列测定。测定的结果与文献报道完全一致。将正确的ApoAIMilano两段基因片段以SphI/Sal I、Sal I/Hind III限制性内切酶分别从pMD-T载体上切下，再将表达载体pMZG用Sph I、HindIII限制性内切酶消化后按下列方式进行拼装连接，构建重组表达质粒：

   β-B(500bp)            A-II(250bp)  Sph I＿＿＿＿＿Sal I    Sal I＿＿＿＿＿Hind III

         pMZG(3400bp)

Sph I＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿Hind III

                  ↓连接

              pMZG-3(4150bp)(重组表达质粒结构图见图3)。

重组质粒转化大肠杆菌SG13009受体菌(遗传背景为：F-his pyrD△lon-100rpsL)，组建成ApoAI_Milano的表达工程菌。(4).ApoAI_Milano表达工程菌的发酵

挑取培养皿中的单菌落于TB培养基中在空气摇床里于30℃培养过夜，第二天按2％比例接种于50L的发酵罐中(培养基内容：Na₂HPO₄ 0.6％，KH₂PO₄ 0.3％，NaCl 0.05％，NH₄Cl 0.5％，(NH₄)₂SO₄0.5％，MgSO₄ 0.2％，Glucose 0.6％，CaCl₂ 0.00111％，trace element0.5ml/L，Yeast extract 0.5％)，30℃培养到OD₆₀₀＝9-10，升温到37℃，并加入IPTG至终浓度为0.3mM，再培养9小时，终止培养。取培养液进行SDS-电泳检查，并采用单克隆抗体检测法测定表达量。SDS-电泳方法参见[分子克隆指南第二版，1998](5).ApoAI_Milano表达蛋白质的纯化

发酵液经0.45μm快速滤膜过滤收集菌体，菌体悬浮于0.1mol.的磷酸缓冲液，pH7.4，进行高压泵破菌。破菌后的溶液以0.22μm膜过滤除去菌体碎片后再以30KD分子截留膜超滤除去核酸等生物大分子杂质。最后以8000Da分子截留膜超过滤浓缩蛋白溶液。浓缩后的蛋白溶液加入盐酸胍至终浓度为6mol.，并用NaOH调节pH到8.0，而后上Ni-NTA柱(柱事先以0.1mol.NaH₂PO₄，0.01mol.Tris.Cl缓冲系统，pH8.0，6mol.盐酸胍溶液平衡过夜)进行螯合层析。样品上柱后以下列缓冲液进行洗脱：1)0.1mol.NaH₂PO₄，0.01mol.Tris.Cl，8mol.尿素，pH8.0；2)0.1mol.NaH₂PO₄，0.01mol.Tris.Cl，8mol.尿素，pH6.3；3)0.1mol.NaH₂PO₄，0.01mol Tris.Cl，8mol.尿素，pH5.9；4)0.1mol.NaH₂PO₄，0.01mol.Tris.Cl，8mol.尿素，pH4.5，收集pH4.5的洗脱峰溶液，用盐酸调pH到2-2.5进行酸水解，水解再室温下进行16小时以上，调节pH到8.0，进行二次Ni-NTA柱螯合层析，收集流过液，进行下一步处理。(6).二聚体肽的形成

上一步纯化得到的ApoAI_Milano蛋白相对于25mM的Tris-HCl缓冲液，pH9.0进行透析4小时以上，然后制备成浓度为3-5mg/ml的溶液，加入氧化型的谷胱甘肽(GSSG)至终浓度为3-5mM，再相对于25mM的Tris-HCl缓冲液，pH9.0(含有30-50mM的还原型谷胱甘肽(GSH))进行透析，24小时后取样检测二聚体的形成。(7).ApoAI_Milano蛋白的检测

A.单克隆抗体测定：单克隆抗体检测发酵液中和纯化后的人ApoA1_Milano蛋白质含量。1)在96孔酶标板中预先包被上抗人ApoA1的单克隆抗体，再加入封闭液，37℃放置1小时后加入待测样品，在37℃反应1小时后加入酶标抗体，继续37℃反应，然后加入邻苯二胺试剂进行显色，最后于492nm波长处测定吸收光密度值。2)纯化后的人ApoAI_Milano蛋白质走SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移至硝酸纤维素膜上进行Western Blotting检测，检测方法按KPL公司试剂盒里的说明书中的进行。

B.体外磷脂结合试验：纯化后的产物体外脂结合试验是采用磷脂结合试验。将纯化后的人ApoA1_Milano样品与DMPC(Dimyristoylphosphatidylcholine)溶液24℃预热10分钟，然后按DMPC/样品＝5∶1混合(W/W)，每隔2分钟于325nm处测定其光密度吸收值，总测定时间为30分钟。

C.Western Blotting实验：纯化后的ApoAI_Milano蛋白经SDS-聚丙烯凝胶电泳后将胶片小心剥下，放置于转移装置中25伏，转移1小时。将转移后的硝酸纤维素滤膜在去离子水中略为漂洗一下，37℃封闭1小时；加入一抗，4℃，1小时；洗膜3次，加入二抗，4℃30分钟；洗膜3次，每次5分钟。用邻苯二胺于暗处显色，当出现肉眼可见的特异性条带后，用去离子水漂洗终止反应，拍照保存。

3.结果

(1).发酵菌体中表达产物的检测

A.SDS-电泳检测表达产物的分子量

诱导表达后的菌体取1毫升离心去上清，沉淀加入100微升的SDS-电泳上样缓冲液，100℃煮沸3分钟，室温静置15分钟，取10微升上样进行SDS-电泳。结果在分子量靠近30kd(28kd)处产生了明显的表达条带。(见图4)

B.单克隆抗体检测表达产物

诱导表达后的菌体取1毫升离心去上清，沉淀加入6M的盐酸胍(PH8.0)处理后体积较原体积放大一倍相对磷酸缓冲液透析过夜，然后采用ELISA方法进行单克隆抗体测定。测定结果证明表达产物能被抗人的Apo AI单克隆抗体所结合，表达产物是正确的(见图5)。

C.表达产物的磷脂结合试验

按上述方法处理的样品进行磷脂结合试验，测定其体外生物活性。测定的结果证明表达产物能与磷脂结合形成复合物，该生物学活性正是ApoAI生物学活性的特征，同样说明我们的表达产物是正确的(见图6)。

(2).表达产物纯化后的检测

 A.SDS-聚丙烯凝胶电泳检测纯化产物

表达产物纯化后进行SDS-聚丙烯凝胶电泳检测，检测到分子量为28KD的单一样品电泳条带(见图7a)，与ApoAI_Milano蛋白的分子量大小相符。

B.Western Blotting检测纯化产物

表达产物经SDS-聚丙烯凝胶电泳后转移至硝酸纤维素膜上进行Western Blotting检测，检测结果是在分子量28KD处的电泳蛋白条带被鼠抗人ApoAI蛋白的单克隆抗体所反应，出现了一条深的单抗显色条带(见图7b)，证明了纯化产物是ApoAI_Milano蛋白。

C.二聚体肽形成测定

纯化后的单链蛋白质经处理后(方法中的(6))，SDS-聚丙烯酰胺电泳检测已形成了分子量为56KD的聚合分子，证明位点突变已由Arg变为Cys，而经复性处理后两条蛋白链的Cys残基之间形成了二硫键，使两条蛋白链聚合在一起，变成了二聚体(见图8)。

D.纯化产物的生物学活性检测

纯化后的ApoAI_Milano蛋白进行体外脂结合生物学活性检测，其结果完全与ApoAI_Milano的生物学功能一致(见图9)。