可育抗病植物体细胞杂种的制备方法

摘要

本发明提供一种可育抗病植物体细胞杂种的制备方法，是采用紫外线照射对供体亲本中的DNA进行消减和通过植物不对称原生质体融合的方法将目的基因从野生种转移到商用作物中，使受体和供体的原生质体融合率达100％，使融合原生质体的植株再生能力提高，并使体细胞杂种具有可育性和抗病性，通过紫外线对供体原生质体照射处理能避免未与受体原生质体融合的细胞的分裂以及细胞团的形成。本发明的方法可广泛地应用于抗病性农作物新品种的选育，对提高农作物的品质、减少农药的使用、降低农业生产成本和保护环境有着重要的意义。

说明书

1、技术领域

本发明涉及一种生物工程技术，具体地说是一种可育抗病植物体细胞杂种的制备方法。

2、技术背景

在过去几十年时间里，涉及植物原生质体融合的技术，例如原生质体分离、原生质体融合诱导、原生质体培养等技术，经历了很大发展。通过原生质体融合的方法，植物体细胞杂种在许多远缘种间实现。在农业应用方面，原生质体融合被用作克服远缘种间有性杂交障碍、重组远缘种间细胞核和细胞质遗传物质的一种可能的途径。然而，远缘种间体细胞杂种通常存在诸如重组染色体组不相容性、不育性等遗传问题。

3、发明目的

本发明的目的是提供一种可育抗病植物体细胞杂种的制备方法。

本发明的目的是按以下方式实现的，为了克服植物体细胞杂种的遗传缺限，采用对融合亲本一方的DNA的消减和植物不对称原生质体融合技术将目的基因从野生种转移到商用作物中，植物不对称原生质体融合技术可使植株再生和生根能力提高，使体细胞杂种具有可育性和抗病性。另外，通过紫外线对供体原生质体照射处理能避免未与受体原生质体融合的细胞的分裂以及细胞团的形成。

在不对称体细胞杂交中，离子射线包括Υ和χ光射线被通常用作消减供体DNA的方法。研究表明，致死剂量的Υ和χ光射线对供体DNA的消减是有效的，当使用剂量在一定范围内增加时，体细胞杂种中供体DNA的量显著或极显著地降低。然而，当剂量的增加超过一定极限时，供体DNA量不会进一步下降。进一步而言，从“Υ和χ光射线融合”获得的体细胞杂种在绝大多数情况下含有比期望多得多的DNA。因此，这些体细胞杂种的不对称性很低，并表现出极低的可育性。

紫外线照射可消减不对称原生质体融合中供体的DNA，通过试验表明，使用紫外线照射比使用Υ射线照射使植物细胞DNA断裂成更多的片断。紫外线照射导致供体拟南芥染色体片断的丢失而不是像Υ和χ光射线那样导致整条染色体的丢失，上述结果初步预示了紫外线在植物不对称体细胞杂交领域的潜在利用价值。离子射线和紫外线对植物细胞DNA的调整都是有效的，但是，紫外线主要以化学方式影响DNA，而离子射线则以物理方式影响DNA。因此，通过“紫外线融合”可能会获得与“Υ和χ光射线融合”在遗传特性上不同的体细胞杂种。

本发明的可育抗病植物体细胞杂种的制备方法是采用紫外线照射对供体亲本中的DNA进行消减和通过植物不对称原生质体融合将目的基因从野生种转移到商用作物中，植物不对称原生质体融合可使植株再生和生根能力提高，使体细胞杂种具有可育性和抗病性，通过紫外线对供体原生质体照射处理能避免未与受体原生质体融合的细胞的分裂以及细胞团的形成。

在本发明的可育抗病植物体细胞杂种的制备方法中，原生质体的制备方法是取受体下胚轴和供体叶片，分别切碎，加入纤维素酶液，培养12小时，然后经多次离心，洗涤，制备出纯净的原生质体，然后用紫外线对叶肉原生质体进行照射处理备用。

在本发明的可育抗病植物体细胞杂种的制备方法中，不对称原生质体的融合方法是：将下胚轴原生质体和叶肉原生质体以1∶1.2的比例混匀。用吸管将混合原生质体悬浮液滴附于5cm直径的培养皿底部，每个培养皿7滴，静置10分钟，对培养皿底部的每滴混合原生质体悬浮液加60μl 40％聚乙二醇溶液，静置5分钟，将培养皿中液体去掉，向培养皿中加入13.3％聚乙二醇溶液1.5ml，静置5分钟，去掉培养皿中液体，再向培养皿中加1.5ml 6.7％聚乙二醇溶液，静置5分钟，去掉液体备用。

在本发明的可育抗病植物体细胞杂种的制备方法中，可育抗病植物体细胞杂种的培育方法是：用1/2培养基洗涤已经融合的原生质体两次，然后再向培养皿中加2ml 1/2培养基，将培养皿放入25℃黑暗培养箱进行培养，经3-5天的培养，细胞壁恢复并开始第一次细胞分裂，此时加入400μl 2/2培养基，将培养皿置于0.65W/m²漫射光、25℃、16小时光周期的条件下培养，然后每隔3天加一次2/2培养基，大约经过15天培养，16个细胞或略大的细胞团形成，此时将培养物转入固体培养基3/10，将培养皿置于0.65W/m²荧光、25℃、16小时光周期的条件下培养。再经过约1个月的培养，小愈伤组织形成，此时将小愈伤组织移栽到4/1培养基中，7-10天后，将长大的愈伤组织移栽到5/1培养基中，经过约一个月的培养，再生小苗在5/1培养基上形成，将再生小苗移栽到不含荷尔蒙的MSO培养基上，使其长成正常苗，然后再移栽到MS+NAA培养基上使其生根，用5/1+培养基将再生植株制备成多个克隆苗。

4、实施方式

本发明的方法是以甘蓝为受体、以野萝卜为供体进行不对称原生质体融合。

原生质体的制备：

取受体下胚轴和供体叶片，分别切碎，加入纤维素酶液，培养12小时。然后经多次离心，洗涤，制备出纯净的原生质体备用。

不对称原生质体融合：

用254nm紫外线对供体野萝卜原生质体进行照射处理。将紫外线照射后的叶肉原生质体和下胚轴原生质体以1.2∶1的比例混匀，用吸管将混合原生质体悬浮液滴附于5cm直径的培养皿底部，每个培养皿7滴，静置10分钟。对培养皿底部的每滴混合原生质体悬浮液加60μl 40％聚乙二醇溶液，静置5分钟，将培养皿中液体去掉。向培养皿中加入13.3％聚乙二醇溶液1.5ml，静置5分钟，去掉培养皿中液体。再向培养皿中加1.5ml 6.7％聚乙二醇溶液，静置5分钟，去掉液体。

可育抗病植物体细胞杂种的培育：

用1/2培养基洗涤已经融合的原生质体两次，然后再向培养皿中加2ml 1/2培养基，将培养皿放入25℃黑暗培养箱进行培养。经3-5天的培养，细胞壁恢复并开始第一次细胞分裂，此时加入400μl 2/2培养基，将培养皿置于0.65W/m²漫射光、25℃、16小时光周期的条件下培养。然后每隔3天加一次2/2培养基。大约经过15天培养，16个细胞或略大的细胞团形成，此时将培养物转入固体培养基3/10，将培养皿置于0.65W/m²荧光、25℃、16小时光周期的条件下培养。再经过约1个月的培养，小愈伤组织形成，此时将小愈伤组织移栽到4/1培养基中。7-10天后，将长大的愈伤组织移栽到5/1培养基中。经过约一个月的培养，再生小苗在5/1培养基上形成。将再生小苗移栽到不含荷尔蒙的MSO培养基上，使其长成正常苗，然后再移栽到MS+NAA培养基上使其生根。用5/1+培养基将再生植株制备成多个克隆苗。

以上操作所用各种溶液及培养基如下：

(1)40％聚乙二醇溶液：聚乙二醇1550 40g；葡萄糖5.4g；CaCl₂·2H₂O 0.735g，加蒸馏水至100ml，PH＝7.0。

(2)13.3％聚乙二醇溶液：聚乙二醇1550 13.3g；葡萄糖1.801g；山梨糖醇1.21g；CaCl₂·2H₂O 0.985g，加蒸馏水至100ml，PH＝7.0。

(3)6.7％聚乙二醇溶液：聚乙二醇1550 6.7g；葡萄糖0.9g；山梨糖醇1.511g；CaCl₂·2H₂O 1.22g，加蒸馏水至100ml，PH＝7.0。

(4)1/2培养基(1升)：B5元素；B5维生素；酪蛋白水解盐150mg；CaCl₂·2H₂O 875mg；山梨糖醇45.5g；甘露糖醇45.5g；葡萄糖2.5g；核酸糖-D 125mg；植物生长激素2，4-D 0.5mg；植物生长激素NAA 0.2mg；细胞分裂素BAP 0.2mg，PH＝5.8-6.0。

(5)2/2培养基(1升)：B5元素；B5维生素；酪蛋白水解盐150mg；蔗糖20g；葡萄糖2.5g；核酸糖-D 125mg；植物生长激素2，4-D 0.5mg；植物生长激素NAA 0.2mg；细胞分裂素BAP 0.2mg，PH＝5.8-6.0。

(6)3/10培养基(1升)：B5元素；B5维生素，酪蛋白水解盐150mg；蔗糖30g；植物生长激素2，4-D 0.5mg；植物生长激素NAA 0.2mg；细胞分裂素BAP 0.2mg；(Difco Noble)琼脂10g，PH＝5.8-6.0。

(7)4/1培养基(1升)：MS元素；B5维生素；酪蛋白水解盐150mg；蔗糖30g；植物生长激素NAA 0.02mg；细胞分裂素BAP 2.0mg；(Difco Noble)琼脂10g，PH＝5.8-6.0。

(8)5/1培养基(1升)：MS元素；MS-维生素；酪蛋白水解盐150mg；细胞分裂素BAP 1.0mg；赤霉素GA3 0.04mg；蔗糖30g；(Difco Noble)琼脂10g，PH＝5.8-6.0。

(9)MSO培养基(1升)：MS元素；MS-维生素；蔗糖30g；(Difco Noble)琼脂10g，PH＝5.8-6.0。

(10)MS+NAA培养基(1升)：MS元素；MS-维生素；蔗糖30g；植物生长激素NAA 0.2mg；(Bacto)琼脂10g，PH＝5.8-6.0。

(11)5/1+培养基(1升)：MS元素；MS-维生素；蔗糖30g；酪蛋白水解盐0.15g；植物生长激素NAA 0.1mg；细胞分裂素Zeatin 5mg；(Difco Noble)琼脂10g，PH＝5.8-6.0。

再生植株核DNA含量的测定及倍性鉴定：

本发明采用流动细胞测量仪Partec Cell Analyzer CA-II(德国Partec GmbH公司生产)对再生植株的核DNA含量进行测定。测定方法由Partec公司提供。将0.5cm²新鲜叶片在核分离溶液HR-A中切碎，然后立即用30μm滤网过滤。过滤液静置5分钟，此时通过滤网加入2ml核染色液HR-B。把悬浮液放在流动细胞测量仪上进行测定。融合亲本被用作对照。通过比较再生植株和亲本的核DNA相对含量，计算出再生植株的倍性。

RAPD和AFLP DNA指纹鉴定：

RAPD PCR的操作按照Dorokhov和Klocke提供的方法，每个反应用40ng样本DNA。所用引物为美国Operon公司生产，分别为OPA-01(CAGGCCCTTC)、OPA-04(AATCGGGCTG)、OPA-15(TTCCGAACCC)和OPA-19(CAAACGTCGG)。所用PCR循环机为英国Grand Instruments公司生产的Autogene II。所用PCR循环程序为：(1)94℃ 3分钟、36℃ 0.5分钟、72℃ 1分钟，共1个循环；(2)94℃ 0.3分钟、36℃ 0.5分钟、72℃ 1分钟，共43个循环；(3)94℃ 0.3分钟、36℃ 0.5分钟、72℃ 10分钟，共1个循环。扩增产物在2％琼脂糖凝胶上走平行电泳，然后用溴化乙锭染色并照相。

AFLP的操作采用Keygene公司提供的方法，所用整套试剂由Gibco公司生产。在20对引物组合中筛选出4对用于本试验，它们分别是E-AAG/M-CAC、E-ACC/M-CTC、E-AGG/M-CAT和E-AGG/M-CAC。AFLP反应产物在94℃变性5分钟，然后在4％PAAG胶板上走垂直电泳，进行银染并照相。对RAPD和AFLPDNA指纹用RFLP Scan软件进行统计分析。

育性和抗性鉴定：

采用德国甘蓝品种Toskama为受体亲本，供体亲本为野萝卜品系Nero，它抗芜青花叶病毒病(TUMV)，根肿病(真菌Plasmodiophora Brassicae)和黑斑病(真菌Phoma lingam)，易感黑叶斑病(真菌Altemaria brassicicola和真菌Altemaria brassicae)。受体亲本易感上述所有病原。

再生植株的不同克隆被移入温室和大田进行育性和抗性鉴定。将开花植株的花粉用FDA染色，置于紫外线下用显微镜观察其活性，作为雄性育性的指标。对所有开花植株进行开放自然授粉。收获种荚和种子，进行统计分析。

抗TUMV鉴定所用病原取自甘蓝，在中国大白菜上进行繁殖。将TUMV感染的大白菜叶片在0.05M磷酸盐溶液中研磨粉碎以制备TUMV种苗。在3-4叶龄的再生植株克隆的叶片上撒上金刚砂粉，然后用玻璃刮铲将TUMV种苗擦到叶片上。接种4周后，被接种植株的病症被分级并记录下来，作为发病指数。同时，叶片病毒侵入量用DAS-ELISA方法进行测定。

抗真菌病害鉴定所用病原有Plasmodiophora brassicae、Altemaria brassicae、Altemaria brassicicola和Phoma lingam。在试管里生长4-6周的再生植株克隆苗被移栽到18-25℃、50-90％相对湿度、16小时光周期气候条件的温室。经过14天的适应性生长后，上述病原被接种到克隆苗上。Plasmodiophora brassicae的接种方法是，将2μl休眠孢子悬浮液(106孢子/ml)用微量吸管滴于克隆苗根部。Phoma lingam和Alternaria brassicae在蔬菜汁培养基上繁殖，Alemariabrassicicola在PDA培养基上繁殖。用3-5ml自来水淹没培养物并用玻璃棒刮培养基表层，将溶液用筛网过滤，所得滤液即为分生孢子悬浮液。把分生孢子悬浮液的浓度调整到104-105分生孢子/ml，接种到克隆苗上。接种后经过一定时间的培养，对克隆苗病症分十级(0-9级)进行记录。记录值的平均数即为发病指数(DI)。对于Plasmodiophora brassicae、Alternaria brassicae和Phomalingam，当DI≤1.0时即为抗病；对于Alternaria brassicicola，当DI≤1.5时为抗病。

附图1为原生质体融合原理示意图；

附图2为植株再生能力与紫外线照射剂量的关系模型图；

附图3为不同倍性类型体细胞杂种的RAPD DNA指纹图(引物OPA-01)；

附图4为不同倍性类型体细胞杂种的RAPD DNA指纹图(引物OPA-04)  ；

附图5为不同倍性类型体细胞杂种的RAPD DNA指纹图(引物OPA-15)；

附图6为体细胞杂种不同倍性类型体细胞杂种的RAPD DNA指纹图(引物OPA-19)；

附图7为体细胞杂种与供体亲本野萝卜的相似性随紫外线照射剂量的提高而下降；即体细胞杂种的不对称性随紫外线照射剂量的提高而提高的柱形图；

附图8为体细胞杂种不同倍性类型细胞核测量图；

附图9为体细胞杂种的相对DNA含量随紫外线照射剂量的提高而下降的统计曲线图；

附图10为高倍性类型体细胞杂种在群体中所占比例随紫外线照射剂量的提高而下降的统计曲线图；

附图11为高不对称度体细胞杂种在群体中所占比例随紫外线照射剂量的提高而增加的统计曲线图；

附图12为不同倍性类型体细胞杂种的外观示意图；

附图13为不同倍性类型体细胞杂种所开的花的外形示意图；

附图14为CC+和CCCC+的花粉活力与CCCCRR和CCCCRRRR的花粉活力比较示意图；

附图15为体细胞杂种花粉活力随紫外线照射剂量的提高而增强的曲线图；

附图16为CC+的荚果与CCCC+的荚果的特征比较图；

附图17为体细胞杂种所结种子的外观特征照片；

附图18为抗芜青花叶病毒病的体细胞杂种在群体中所占比例随紫外线照射剂量的提高而下降的曲线图；

附图19为抗根肿病的体细胞杂种在群体中所占比例随紫外线照射剂量的提高而下降的曲线图；

附图20为抗黑斑病的体细胞杂种在群体中所占比例与紫外线照射剂量的关系曲线图；

附图21为抗黑叶斑病(Alternaria brassicicola)的体细胞杂种在群体中所占比例与紫外线照射剂量的关系曲线图；

附图22为抗黑叶斑病(Alternaria brassicae)的体细胞杂种在群体中所占比例与紫外线照射剂量的关系曲线图。

本发明的研究证明，紫外线照射对植物不对称原生质体融合供体DNA的消减是有效的。当紫外线照射剂量在一定范围内(0.000J/cm²-0.105J/cm²)提高时，融合原生质体的植株再生能力增强；体细胞杂种群体的倍数下降；体细胞杂种中供体DNA的含量下降，体细胞杂种群体的不对称度提高；体细胞杂种群体的可育性提高。

使用本发明的方法进行的试验中成功地将抗Tumv(芜青花叶病毒病)、抗Plasmodiophora brassicae(根肿病)和抗Phoma lingam(黑斑病)的基因从野萝卜转移到体细胞杂种中。另外，部分体细胞杂种还对Alternaria brassicae(黑叶斑病)和Alternaria Brassicicola(黑叶斑病)具有抗性，而供体野萝卜和受体甘蓝都不具备这些抗性。

使用本发明的方法进行的试验中首次获得完全可育的、高不对称度的、抗多种病害的体细胞杂种。其中已收获大量种子，可直接用作甘蓝育种的材料有：

品名    倍性           抗性

I01     CC+(二倍体)    抗Phoma lingam

I04     CCCC+(四倍体)  抗Phoma lingam抗TuMV抗Altemaria Brassicae

I49     CC+(二倍体)    抗Phoma lingam抗TuMV

I85     CCCC+(四倍体)  抗Phoma lingam抗TuMV抗Alternaria Brassicicola

III06   CC+(二倍体)    抗Phoma lingam抗TuMV

上述材料拥有全套甘蓝染色体，供体野萝卜的核DNA仅有片断嵌入甘蓝核DNA中，该系列体细胞杂种具有甘蓝的绝大部分遗传物质和性状，而仅具有野萝卜的少量遗传物质和性状，如抗性等，该系列材料的花粉活性均在70％以上。表1.植株再生能力随紫外线照射剂量在一定范围内的提高而提高Doses of UV radiation on the donor parent Raphanus sativus，calliinduced，regenerants obtained and capabliit of regeneration

  UV Dose Calli Regenerants Capability of Regeneration％  J/cm²                    (Regenerants/Calli) Experiments with lower doses  0.000   243   10               4.1  0.035   822   69               8.4  0.070   833   45               5.4  0.105   1399  144              10.3  Total   3297  268 Experiments with higher doses  0.210   207   0                0  0.315   338   0                0  0.420   455   0                0  Total   1000  0                0表2.RAPD和AFLP DNA指纹统计分析结果

所有被鉴定的样本均为体细胞杂种Results of RAPD and AFLP Fingerprinting-molecular difference of the different populations of regenerants.Similarity to receptor：bands of hybrldfrom receptor/total bands of receptor；Similarityto donor：bands of hybridfrom donor/total bands of donor；Rate of new bands：newbands of hybrid/total bands of hybrid.

  UV dose  J％cm²    Regenerants    in total RAPD(OPA 01，04，15，19)    AFLP(E-AGG/M-CAT) Numberof  Similarity  Similarity  Rate of new bands samples   to receptor to donor Number of  Similarity  Similarity  Rate of new bands samples    toreceptor  to donor  0.000  0.035  0.070  0.105    10    69    45    144 6         0.581       0.392       0.085 28        0.724       0.340       0.091 10        0.762       0.298       0.155 23        0.783       0.231       0.115 5          0.873       0.812       0.296 12         0.778       0.373       0.232 10         0.811       0.265       0.188 13         0.877       0.227       0.267表3.体细胞杂种的相对核DNA含量及倍性类型

Relative nuclear DNA content(peak position of regenerant/peak position of

receptor parent)and ploidy level

    UV dose    J％cm²  Regenerants  Regenerants  Relative Nuclear   Ploidy Level Frequency  In Total     Analyzed     DNA Content                            (meam)    0.000       0.035             0.070        0.105     10           9            2.71               CCRR         1                                               CCCCRR       3                                               CCRRRR       3                                               CCCCRRRR     2  69           49           2.61               CC           4                                               CCCC         7                                               CCRR         3                                               CCCCR        3                                               CCCCRR       2                                               CCRRRR       3                                               CCCCCC       1                                               CCCCCCCC     5                                               CCCCRRRR     9                                               Aneuploid    12  45           26           2.25               CCCC         19                                               CCRR         2                                               CCCCCC       1                                               CCCCRRRR     3                                               Aneuploid    1  144          63           1.89               CC           9                                               CCCC         52                                               CCCCCC       1                                               CCCCCCCC     1表4.紫外线照射剂量对体细胞杂种的倍性及倍性类型的影响Effect of UV on Ploidy Level and Type  UV Dose   J/cm²  0.000  0.035  0.070  0.105    n＝    9    49    26    63  Low   Ploidy Plants   High Ploidy Plants    nC Type Plants  nCmR Type Plants  No.   Percent％       No.      Percent％  1     11.1            8        88.9  14    28.6            35       71.4  21    80.8            5        19.2  61    96.8            2        3.2    No.   Prcent％  No.    Percent％    0     0         9      100    17    34.7％    32     65.3    20    76.9％    6      23.1    63    100       0      0Low ploidy plants：diploid and tetraploid.High ploidy plants：pentaploid，hexaploid，octoploid and aneiploid(all of the aneuploid＞pentaploid)nCmR type includes aneuploid since all of them have chromosomes from the donor.表5.不同倍性类型体细胞杂种的花粉活力及所结荚果和种子

Pollen Viability and Seeds Harvested

          Groups                  CCRR，CCRRRR，  CCCC+    CC+

                                  CCCCRRRR

Mean Percentage ofLiving Pollens  8.95％          71.06％  79.25％

                                  (n＝22)         (n＝35)  (n＝4)

pods                              65              1544     442

                                  (n＝2)          (n＝33)  (n＝5)

Seeds(shrivelled                  3seeds          6034     4182

seeds not included)               (n＝2)          (n＝33)  (n＝5)

Seeds/Pod                         0.05            3.91     9.46

             表6.体细胞杂种对5种病原的抗性Results of Resistance TestResistant to  TuMV                          Plasmodiophora     Phoma Lingam          Alternaria Brassicicola Ailernaria Brassicae

                                        BrassicaeUV Dose       Plants   ％    n＝   1/E405nm plants ％    n＝   Plants   ％    n＝    Plants ％    n＝        Plants ％    n＝J/cm20.000         5        62.5  8     2.99     6      85.7  7     6        85.7  7      0      0     7          0      0     70.035         8        33.3  24    1.43     5      14.7  34    32       94.1  34     2      5.9   34         5      14.7  340.070         2        7.1   28    1.05     3      15.0  20    15       75.0  20     0      0     20         4      20.0  200.105         13       12.4  105   1.30     9      11.8  76    63       82.9  76     5      6.6   76         4      5.3   76The donor parent is resistant to TuMV(Tumip Mosaic Virus)，Plasmodiophora Brassicae and Phoma Lingam，susce ptible to AlternariaBrassicicola and Alternaria Brassicae The receptor parent is susce ptible to all the pathogens tested