芯吸介质在消除基于光学衍射的生物传感器的清洗步骤中的应用

摘要

本发明提供了一套价廉和灵敏的系统以及一种检测介质中分析物的方法。该系统包括：一个衍射增强元件，例如官能化的微球，它经修饰后能与目标化合物结合。另外，该系统包括聚合物膜，它可包括金属涂层，在其上印有特异性预定图案的对分析物具特异性的受体。最后，该系统包括芯吸介质，它使该系统为单步系统，免去了任何附加冲洗步骤的必要性，当将目标分析物直接或用衍射增加元件连到聚合物膜的选择区域时，通过分析物的物理尺寸和所定义的精确位置，发生透射和/或反射光的衍射。所产生的衍射图如全息图可容易地被目测到或任选地用传感器件观测到。

说明书

技术领域

本发明属于在介质中检测分析物的领域，本发明更特别涉及能够指示出介质中存在的分析物的基于光学衍射的传感器的制作方法。

发明背景

有许多系统及装置可以用来检测在不同介质中的多种分析物。大多数系统和装置相对昂贵，且需要专门训练的技术工作者来进行试验。在许多实例里，如果能快速廉价地测定分析物是否存在便非常有利。所需的是可以方便廉价地制造并能够可靠、灵敏地检测包括较小分析物在内的分析物的生物传感器系统。

Sandstrom等〔24 Applied Optics(应用光学)472，1985〕描述了使用一种硅光学基质，以一层一氧化硅和一层硅形成介电薄膜。他们指出，膜厚度的变化可改变光学基质的性质，从而产生与膜厚度相关的不同颜色。膜厚度与观察到的颜色相关，光学基质上的膜则产生可观察到的颜色变化。作者并且指出可以用一数学模型对颜色变化进行定量，并且“用此计算机模型进行的计算表明：使用多层结构时仅仅得到极少的光学效能……但表面的生物层使这种结构的反射波发生极小改变，因为光学性质主要取决于多层结构中的界面。对于检测生物层的最灵敏系统是单层涂层，而在大多数其它应用中可以额外加一层介电膜。”

Sandstrom等随即指出金属上由金属氧化物形成的载片(Slide)有一些缺点，而且金属离子的存在在大多数生物化学应用中是有害的。他们指出，理想的表面介电膜是2-3nm厚度的二氧化硅，它是当一氧化硅层在室温环境中沉积时而自发形成的，并且40-60nm的一氧化硅层上的70-95nm的二氧化硅层可以用在玻璃或塑料基质上。他们同时描述了一氧化硅的楔形物是如何形成的：选择性刻蚀一氧化硅，用二氯二甲基硅烷处理二氧化硅表面，及施加抗原和抗体生物层。由这种楔形结构，他们可以使用偏振光椭圆率测量仪来测量膜的厚度，并指出“最大反差见于约65纳米的区域，在此干涉色由紫变蓝。”他们指出，这样的一个系统有足够高的灵敏度，可以检测到固定化抗体上结合的蛋白抗原。他们总结道，“这种设计对很宽范围的应用都足够灵敏，材料如玻璃、硅、硅氧化物都是化学惰性的，均不会对研究的生化反应造成影响。使用以上计算方法可以针对不同应用设计最合适的载片。载片可以制造，其质量可由工业方法保证，且两种设计目前都可由商业途径得到。

授予Kumar等人的美国专利5,512,131描述了一种包括带有金属涂层的聚合物基质的器件。一层具分析物特异性的受体层印模在经涂覆的基质上。这种器件在印模过程中使用，或作为转换件。当分析物与此器件结合时产生衍射图案。像光谱仪一类的可视设备便可接下来用于测量存在的衍射图案。

但Kumer等描述的这种器件也有几个缺点。一个缺点是，需用一个外加的可视设备来观测任何衍射图案。由于需要可视设备，而仅用眼睛观察不可能测定一种分析物的存在，Kumer等的这种器件不能测试很多样品。另外，这种器件不能检测较小的分析物，因为这些分析物不产生足够的衍射图案。

美国专利5,482,830(Bogart等)描述了一种包括具有旋光的表面(显示响应于照射其上的光的第一颜色)的基质。该第一颜色定义为发射光的光谱分布。所述基质还显示第二颜色，其与第一颜色不同(具有与存在于第一颜色中的组合不同的光波长组合，或具有不同的光谱分布，或具有与在第一颜色中存在的不同的一种或多种波长的强度)。当分析物存在于表面时，响应于相同的光，呈现第二颜色。颜色间的改变可以用仪器测量，或用肉眼观察。这种灵敏检测优于上述的Sandstrom和Nygren的器件，并且该器件的用途可商品化且有竞争力。

但Bogart等的专利所述方法和器件同样存在一些缺陷。一是器件造价高昂。器件存在的另一问题在于难以对薄片上放置的不同层进行控制，以获得可靠的读数。

另外，美国专利申请第08/68499和08/991844号介绍了用来检测分析物的具有自组装单层的生物传感器，所述两篇专利申请在此全文引入作为参考。但是，因这些较小的分析物不能产生足够的可观测到的衍射图案，这些生物传感器目前对检测较小的分析物缺乏必要的灵敏度。

使用的一些商业侧流技术利用了乳胶珠技术。这些技术目前用于绝大多数的市售家用诊断试剂盒(如妊娠和排卵试剂盒)中。这些试剂盒采用带颜色的珠子，它们积聚在所定义的“捕获区间”，一直到数量上达到肉眼可见。但是对于许多分析物，这些系统缺乏必需的检测灵敏度，因为若达到肉眼可见的情况，必须结合在捕获区间内的乳胶珠数量要远远大于所需的在同样大小区间引起衍射的数量。理论上，所需要的珠子数目比本发明的传感器多约2-3倍。

具有自组装单层并利用微粒技术的生物传感器已被用于检测较小分析物，在美国专利09/210,016中对此作了描述，在此全文引入该文献作为参考。但是，这些生物传感器需要多步制造，这样便增加了使用此类传感器时的难度及费用。

所需的生物传感器系统应是易于并以低成本生产的，且能够对分析物、包括对较小分析物进行可靠和灵敏的检测。

发明概述

本发明提供了一种便宜且灵敏的系统和方法，用于检测介质中存在的分析物。本发明采用一种新的途径，即，使用“衍射增强元件”如微粒来减少使用衍射诊断器件时所包括的步骤。这种途径包括：使用芯吸介质(wicking agent)来除去未结合的标记微粒及样品中任何残余液体。这样，所述芯吸介质避免了任何附加的冲洗步骤的必要性，这些冲洗步骤对于使用者而言是麻烦或更困难的。另外，可在芯吸介质的中心钻出一个小孔(如3/32英寸)，这样一旦芯吸掉样品及多余颗粒时，使用者可以通过小孔立即检查衍射图像而不必移去芯吸介质。芯吸介质的实例包括硝化纤维素膜、醋酸纤维素膜及玻璃微纤维结构等。

另外，可以改变膜的孔径来控制芯吸速率及芯吸力。这可以影响检测装置的准确度，且可被利用来创建一个一步型器件。为实现这个目标，这种一步型器件由基质如gold/MYLAR上的接触印记的捕获抗体(capture antibody)组成，然后将标记粒子预干燥到其表面上。另外，将钻去了小孔的小孔径膜(如0.45微米的硝化纤维素)放置在所述器件的最上面，至此装置设计完成。使用者可简单地将样品(如血清或血液)加入并测试，然后一旦芯吸发生时观察衍射图像产生。小的孔径使芯吸作用延迟得足够长，从而使得温育(如抗原-抗体产生相互作用所需要的温育)充分。另外，在芯吸介质圈的周边，用一可侵蚀的试剂也延迟芯吸作用。所述试剂最终会溶解或衍生，所以这使芯吸作用在一个特定时间段之后发生。

与现有的价格低廉的系统比较，本发明系统的灵敏度要高许多。本发明的系统能检测从低到高分子量的分析物、微生物以及流体样品中的DNA或RNA物种。更具体而言，本系统能检测激素、类固醇、抗体、药物代谢物和甚至核酸等等。这是对美国专利申请08/768449和08/991844中所描述的基于光学衍射的传感技术的一个显著扩展。

本发明使用了衍射增强元件，如乳胶微球，它对检测较小分析物起到帮助作用。通常来讲，当分析物在生物传感器上结合对于分析物具有特异性的受体之后，分析物会衍射或反射透射光，从而产生衍射图形。若分析物较大，衍射图像能肉眼可见。但是，一些分析物太小，以致看不到产生的衍射图形。通过使用衍射增强元件，这种带有特异于分析物的受体材料的生物传感器便可用来检测这些较小的分析物。所用的这些衍射增强元件能与分析物结合，继而结合了分析物的元件再与生物传感器相结合。这样，当光透射通过或被生物传感器反射出时，这种元件增强了分析物产生的衍射图形，使所得到的衍射图案可被肉眼观察到。

本发明也使用了接触印记图案化的(patterned)、对分析物有特异性的受体的方法。这种对分析物有特异性的受体具有与之结合的接受材料。根据所用的受体，这种接受材料对特定分析物或分析物类具有特异性。接触印记的方法对产生用于本系统的传感器件是有用的。这些方法完全公开于美国专利申请08/707456和08/769594中，两篇均在此全文引入作为参考。但是，因为这些方法与自组装单层相关，为了印记对分析物具特异性的受体材料，所述方法需如下所述作轻微改动，因为上述材料不自组装。

图案化的、对分析物具特异性的受体层使得其上带或不带衍射增强元件的分析物通过对分析物具特异性的受体的模式可受控地放置。本发明中由此产生的生物传感器件使用步骤是：首先将生物传感器件暴露于混有衍射增强元件的样品介质(其中可以含或不含所选的分析物)。然后，经适当时间温育，光(如激光或其它点光源)透射进膜或从膜上反射出。如果分析物存在于介质中并且被结合(直接结合或与衍射增强元件一起结合)到图案化的对分析物具特异性的受体层的受体上，光则被衍射从而产生可视图像。换方之，所述带有分析物和/或结合于其上的衍射增强元件的对分析物具特异性的受体层能够产生光学衍射图案，其不同依赖于对分析物具特异性的受体层中的受体与目标化合物的反应。光可以处于可见光谱，且可从膜上反射出或透射进膜，而分析物可以是任何与对分析物具特异性的受体层反应的化合物或粒子。光可以是点白光源或在可见区域中的单色电磁辐射。尽管可见光为所需光源，本发明也可以利用与检测器相连的非可见点光源，如近红外光。所述膜的厚度与微粒粒径可作调整，以适合于非可见光光源。另外，本发明还直接在基质上或在金或其它合适的金属或金属合金上为特异性识别分析物的受体层提供了可变通的基体。

本发明提供的金或其它金属上的特异性识别分析物的受体层适合于批量生产。本发明所用的生物传感器可被作为一次检测分析物的器件生产，或可被设计为多次检测器件。本发明的生物传感器可用来检测(1)与药物条件相联系的抗原或抗体，(2)衣物如尿布中的污染物，和(3)微生物造成的污染。

在本发明的另一实施方案中，特异性识别分析物的受体层可掺入特定系列的微生物所需的营养物。这样，通过首先使本发明中的生物传感器和加入其中的营养物接触，然后如果有必要的话在适于所结合的微生物生长的条件下对所述生物传感器进行温育，可检测出非常低浓度的微生物。这种微生物可以生长，直到有足够多的微生物来形成衍射图案。

参阅以下对公开实施方案的详细描述，本发明的这些以及其它特征和优点会更加明显。

附图简述

图1示意了可同时测量介质中几种不同分析物的生物传感器。

图2为接触印记的对分析物具特异性的受体层的示意图。

图3为在MYLAR(购自Courtaulds Performance Films(CanogoPark，CA))上蒸发的金的原子力显微图。金层的平均粗度为3-4nm，最大粗度为9nm。

图4为SEM显微照片，示意了当分析物存在时衍射增强元件的图案化连结。

图5为使用芯吸介质来消除所需冲洗步骤的本发明的示意图。

图6为本发明的一步型产品设计示意图。

图7示意了光源通过芯吸介质的孔进行照射从而检查衍射图像。

详细描述

本发明包括一种制作生物传感器件的改进方法。本发明可以用来制作更加灵敏的生物传感器件，且可用于检测至目前为止只能用昂贵装置方能检测到的较小分析物。可以检测的分析物包括但不限于：激素、蛋白质如抗体、类固醇、药物代谢物、核酸、微生物如细菌、酵母、真菌和病毒。与以前的器件不同，通过本发明制作的那些器件可允许检测出介质中极小量及尺寸的分析物，且分析速度快，仅耗时数分钟。另外，不需要信号部件或附加电子元件。

本发明中，生物活性材料以特定的图案模式沉积在金属(如金)表面上，以便当目标化合物结合到表面时产生衍射全息图像。典型地，与目标分子特定性反应的抗体以一定的图案模式印记到涂覆了金属的表面。

在一种实施方案中，本发明包括了一种制作一步型器件的方法。该方法包括预干燥标记好的衍射增强元件或微粒(如用感兴趣的过敏原进行标记)到模式化表面，然后在使用前将芯吸介质盘放置在其上。所述器件随后通过被置放在所述芯吸介质的切孔区域中的顶部而暴露到试验流体中(如血清或血液，含特异性识别过敏原的IgE)。孔径和芯吸介质的适当选择可使芯吸作用适于所需的温育时间。如0.45微米孔径的硝化纤维素可以使0.3毫米直径微粒的稀释血清的芯吸作用延缓8-12分钟；这样使诊断器件有了充足工作时间。

在本发明另一实施方案中，本发明包括在芯吸介质圈的外缘使用可侵蚀的试剂来初步抑制芯吸作用发生。这种试剂可以是防止芯吸作用发生的疏水材料，但它应最终能够溶解或能衍生掉，从而经过一特定时间段再允许芯吸作用进行。这个时间段将与期望的温育时间段相当。

本发明改进了所述生物传感器件的使用方法，以使其对终端用户更加简易。它使用芯吸介质如硝化纤维素，来移去未结合的衍射增强元件及多余流体，从而消除了冲洗步骤的必要。这样便极大简化了免疫测定途径，因为冲洗常常是最烦琐的步骤。所述检测系统同样独特于商品化免疫测定系统，因为所述结合现象可在曝光时产生简单的全息图像。这样，全息图像的出现或已存在的全息图像的改变便会示出一个正响应(positive response)。透射光衍射形成的图案可以是任何形式，包括但不限于由于分析物结合到接受材料而产生的一种图案到另一种图案的变形。在特别优选的实施方案中，分析物接触到本发明的生物传感器件后一小时内，衍射图像便消失到不能察觉的程度。

在与分析物和/或元件相互作用时产生光衍射的衍射光栅应该具有最小频率的入射光波长。对于极小的分析物，可利用对小分析物具特异性的衍射增强元件粒子来进行间接检测。一个可检测小分析物的实施方案包括用特异性地结合感兴趣的分析物的受体材料对元件粒子如乳胶珠进行涂覆。

多种方法可用来连接受体材料到衍射增强粒子上。这些方法包括但不限于：简单物理吸附到疏水粒子上(例如将蛋白结合到聚苯乙烯粒子上)；使用蛋白A或蛋白G连接物这行结合；使用抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白—生物素连接物进行结合；或使用共价连接来结合。本发明的优选实施方案是使用碳化二亚胺连接蛋白质的受体到羧化的微粒上。也同样可以采用本领域技术人员所熟知的其它连结方法。

本发明使用的衍射增强元件粒子包括但不限于玻璃、纤维素、合成聚合物或塑料、乳胶、聚苯乙烯、聚碳酸酯、细菌或真菌细胞等。粒子优选是球形，但所述粒子的结构和空间构型对本发明而言并不重要。例如，所述粒子可以是薄片、椭球形、立方体等。所期望的粒径直径范围为约0.1微米到100.0微米，期望是在大约0.1微米到1微米之间。元件粒子的组成对本发明也不重要。优选地，介体与增强元件间的折光率之差为0.1至1.0。更优选地，介体与增强元件间的折光率之差为0.2至0.7。

聚合物膜上的对分析物具特异性的受体层包含接受材料如抗体，它将特异性地与分析物上的抗原决定部位结合，此抗原决定部位与用于结合到所述粒子的抗原决定部位不同。所以，对于检测小分析物如病毒粒子，介体首先对衍射增强元件粒子如乳胶粒子(病毒粒子与之结合)暴露。然后，对衍射增强元件粒子任选地进行冲洗，并使其对聚合物膜(带有包含病毒特异性抗体的分析物特异性受体层)暴露。抗体随即结合在元件粒子上的病毒粒子上，从而像固定受体到膜上一样固定元件粒子。因为被结合的元件粒子可引起可见光的衍射，从而形成衍射图像，说明液体中有病毒粒子的存在。另外聚合物膜上可以包含一层金属涂层，分析物特异性受体层便可以位于膜的金属化表面上。

另外，分析物可以通过首先将包含带有分析物特异性受体层(它含抗体)的聚合物膜的生物传感器暴露到含分析物的介体中，继而使分析物结合到分析物特异性受体层物质上而被检测到。然后，含衍射增强元件粒子的悬浮液与其上结合了分析物的传感器件进行接触。粒子随即结合到分析物上。因为结合的元件粒子可以引起可见光的衍射，形成衍射图像，指示出液体中有分析物的存在。

在另一优选实施方案中，生物传感器、衍射增强元件粒子和含有分析物的介体可以被同时混合。这样便导致上述结合步骤的合并。一些分析物在结合到基质上之前会首先与衍射增强元件粒子结合。其它分析物却首先结合到基质上然后再与元件粒子结合。当点光源通过传感器照射时便形成衍射图像，指示出液体中分析物的存在。

最后，在一较简单的实施方案中，作为制备的一部分，衍射增强元件粒子在生物传感器上预干燥。在使用过程中，含有分析物的介体被放置在生物传感器表面。若分析物存在，这便会引起粒子的再悬浮，而它们便与膜上的图案化受体区域相结合。

使用本发明，考虑可被检测到的分析物包括但不限于：细菌；酵母；真菌；病毒；原生动物；或与这些微生物有特异性的抗原；风湿症因子；抗体，包括但不限于IgG、IgM、IgA和IgE抗体；癌胚抗原；A族链球菌抗原；病毒抗原；与自身免疫病症相关的抗原；过敏原；肿瘤抗原；B组链球菌抗原；HIVI或HIVII抗原；或对这些或其它病毒的宿主响应(抗体)；对RSV特异性的抗原或病毒的宿主(抗体)；单个抗原；酶；激素；多糖；蛋白质；脂类；碳水化合物；药物或核酸；沙门氏菌(Salmonella species)；假丝酵母菌(Candidaspecies)，包括但不限于白色念珠菌(Candida albicans)和念珠菌属(Candida tropicalis)；沙门氏菌；脑脊膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitides)型A、B、C、Y和W亚型135、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、大肠杆菌(E.coli)K1、B型流感嗜血菌(Haemophilusinfluenza)；从微生物衍生出的抗原；半抗原、滥用药；治疗药物；环境试剂；肝炎特异性抗原。

本发明的另一实施方案中，特定类别的微生物所需的营养物可以加入到分析物特异性受体层中。这样，通过首先使本发明中的生物传感器与加入其中的营养物接触，然后在适宜结合的微生物生长的条件下对生物传感器进行温育，极低浓度的微生物可以被检测出来。使微生物生长，直至有足够多的生物体来形成衍射图像。当然在一些情况下，在图案化单层上无营养物的情况下，微生物存在或其繁殖得足够多，也可形成衍射图像。

本发明的一部分是分析物特异性受体物质，它可以缩微印记到聚合物膜上，继而可以与感兴趣的分析物特异性地结合。因此，受体物质定义为特定性结合对的一部分，包括但不限于：抗原/抗体，酶/底物，低聚核苷酸/DNA，螯合剂/金属，酶/抑制剂，细菌/受体，病毒/受体，激素/受体，DNA/RNA，或RNA/RNA，低聚核苷酸/RNA，和这些种类与任何其他种类的结合体，及这些种类与无机类的相互作用体。另外，当使用金属化聚合物膜时，分析物特异性受体物质可以缩微印记到膜的金属化表面上。

结合到附着层的受体物质以其特异性结合感兴趣的一种或多种分析物的能力来表征。可用作受体物质的各种物质只受选择性地(相对于样品)结合分析物的物质类型的限制。可被包括在受体物质总类中的物质亚类包括：毒素，抗体，抗原，激素受体，寄生虫，细胞，半抗原，代谢物，过敏原，核酸，核物质，自身抗体，血蛋白，细胞碎片，酶，组织蛋白，酶底物，辅酶，神经递质，病毒，病毒粒子，微生物，蛋白，多糖，螯合剂，药物及特异性结合对的任何其它成员。以上所列仅包括许多不同材料中的一些，它们可以被涂在附着层上来产生一个薄膜分析系统。不管选择的感兴趣的分析物是什么，设计的受体物质都是要结合感兴趣的分析物。在优选实施方案中，当感兴趣的分析物被夹在受体物质和衍射增强元件之间时，配置和安排生物传感器件来提供肉眼可观测的响应于点光源透射的图像。

在许多例子中，需要一种“阻塞剂”来阻止非特异性结合。术语“阻塞剂”在此是指附着在传感器表面的一种试剂，这样它“阻塞”或防止非分析物物质结合到表面(在图案化的或非图案化的区域)。阻塞步骤可以作为对已经进行接触印记的表面进行的后处理而完成“后阻塞”，它是用于用另一种硫醇充满非接触印记区域的标准技术。但是，本发明者发现“前阻塞”技术要优于后阻塞技术。在前阻塞技术中，基质表面用不含硫醇的阻塞剂进行预处理，然后进行接触印记。虽然不希望为任何理论所束缚，但从理论上讲，接触印记的物质(通常含硫)替代了物理吸附的阻塞剂，故而允许分析物特异性受体物质可以直接结合到基质表面。如果需要，也可以进行随后的后阻塞。所述阻塞剂可包括但不限于β-酪蛋白、白蛋白如牛血清白蛋白、一种非离子型表面活性剂(pluronic)或其它表面活性剂、聚乙二醇或其衍生物、聚乙烯醇、或以上各类化合物的衍生物、和其它本领域技术人员已知的阻塞剂。

包含感兴趣的分析物的基体可以是间质液、固体、气体或体液如粘液、唾液、尿液、排泄物、组织、骨髓、脑脊髓液、血清、血浆、全血、痰液、缓冲溶液、萃取溶液、精液、阴道分泌物、心包液、胃液、腹膜液、胸膜液、喉药签的吸取液或其它冲洗液等。感兴趣的分析物可以是抗原、抗体、酶、DNA片段、完整基因、RNA片段、小分子、金属、毒素、环境试剂、核酸，细胞质组分、伞毛或鞭毛组分、蛋白、多糖、药物或其它物质。例如，细菌的受体物质可特异性结合表面膜组分、蛋白或脂类、多糖、核酸或酶。标示细菌的分析物可以是糖或多糖、酶、核酸、膜组分、神经节苷脂或由细菌相关宿主产生的抗体。分析物的存在可以指示出传染性疾病(细菌性或病毒性)、癌症、过敏、其它医学紊乱或状况。分析物的存在可以指示出水或食物污染物或其它有害物质。分析物的存在可指示出药物滥用或可以监控治疗剂的水平。

可利用本技术的最常见的测定方案之一是免疫测定。但一般的考虑适用于核酸探针、酶/基质、和其它配体/受体等测定形式。对于免疫测定，抗体可用作受体物质和/或它可以是感兴趣的分析物。受体物质例如抗体或抗原在检测器件的附着层上必须形成稳定的活性层。若抗体是受体物质，抗体必须对感兴趣的抗原有特异性；且抗体(受体物质)必须与抗原(分析物)以足够的亲合力结合，以使抗原保留在测试表面。在一些例子中，分析物不是简单地结合受体物质，而是引起受体物质的可检测到的修饰作用发生。这种相互作用可以引起测试表面质量的增加或受体量的下降。后者的例子是降解酶或降解物质与特异性的固定化基质间的相互作用。在此例中，当与感兴趣的分析物相互作用前可观测到衍射图像，但若分析物存在，衍射图像将消失。对本发明来讲，结合、杂交或分析物与受体物质的相互作用发生的具体机制不重要，但可能影响用于最终检测方案的反应条件。

通常受体物质可被涂在基质层上。如果需要，通过附着层引入测试表面的自由官能团可用于将受体物质共价结合到测试表面上。

可用很多种技术将受体物质涂在基质层上。可通过下列方法用受体物质涂覆测试表面：以分立的阵列或图案涂覆溶液；喷雾，喷墨，接触印记或其它印记方法；或以某种图案印记阻塞物质，随后用受体物质进行全部浸涂或旋涂。选择的技术必须使所需的最小量的受体物质涂到大量检测表面，且在涂覆过程中保持受体物质的稳定性/官能性。这种技术还必须用非常均匀和可控的方式将受体物质涂于或粘附到附着层。

本发明中的生物传感器件利用在聚合物或金属化的聚合物膜(最好为透明或半透明)上接触印记图案化的具分析物特异性的受体层的方法、由此而产生的组合物以及这些组合物的用途。图案化的分析物特异性受体层使得分析物受体可被受控粘附(或结合)放置。术语“图案化的具分析物特异性的受体层”在此意味着在聚合物或金属化聚合物膜上以任何图案形式的分析物特异性受体层。这种生物传感器件还包括芯吸介质，它从分析物样品中移去任何残余液体，因此避免了任何附加冲洗步骤的必要性。

当其上具有图案化的分析物特异性受体层的膜暴露于能与分析物特异性受体层反应的分析物时，上述膜便会产生基于感兴趣的分析物与图案化的分析物特异性受体层的反应而不同的光学衍射图像。介体可以包含衍射增强元件粒子。介体可以是高表面张力的流体如水。光可以位于可见光谱，可以是从所述膜上反射出或透射入膜，而分析物可以是能与分析物特异性受体层反应的任何化合物。

在优选实施方案中，所述方法包括：将所述传感器件与含有衍射增强元件和潜在含分析物的被测样品接触；然后，使用芯吸介质从样品中移去未结合的标记粒子和任何残余液体。若样品中存在分析物，则当光透射进金属化聚合物膜(带有分析物特异性受体层)时，可见的衍射图像便形成了。

分析物存在于其中的介体可以是固体、凝胶状物、液体或气体。为了检测体液中的分析物，体液可以选自但不限于尿液、血清、血浆、脊髓液、痰液、全血、唾液、泌尿生殖器分泌物、排泄物提取液、心包液、胃液、腹膜液、胸膜液、阴道分泌物或喉药签的吸取液。考虑用于本发明生物传感器件中的最普遍的气体是空气。

在一种实施方案中，本发明考虑采用浸量尺形式，其中缩微接触印记的金属化膜被安装于浸量尺末端。使用时，浸量尺浸入到推测分析物可能存在的液体中。此液体也可包含衍射增强元件粒子。浸量尺可允许保持几分钟。移去浸量尺后，用芯吸介质来移去样品中未结合的标记粒子和其它残余液体。可从芯吸介质的中央钻出小孔，这样一旦样品和多余的粒子被芯吸掉，使用者可从小孔中迅速检查衍射图像而不必移去芯吸材料。光投射通过金属化膜，或用膜后的光观察膜。如果观察到衍射图像，则液体中存在分析物。

本发明的另一实施方案中，同样的基质上构置了多个分析物试样。如图1所示，几个缩微接触印记的膜20、25、30和35产生条10，每一个膜上都有一印记图案40。每一个缩微接触印记的膜15、20、25和30拥有对不同的分析物有特异性的不同受体物质。每一个印记膜15、20、25和30可包含芯吸介质阵列或条，以有助于条10的利用。可以看出本发明可以被规范为含许多不同的缩微接触印记膜的任何阵列，因而允许本发明中的生物传感器件的使用者仅使用一个单一测试来检测介质中多个分析物的存在，同时芯吸介质避免了任何附加冲洗步骤的必要性，该冲洗步骤对使用者很繁琐或造成更多困难。

分析物特异性受体层可以有许多种可能的载体。可以在许多种材料上发生简单的物理吸附，如在聚苯乙烯、玻璃、尼龙、或其它本领域技术人员所熟知的材料上。固定分析物特异性受体层的优选实施方案包括共价连结，如可能发生在硫醇或含二硫键的化合物与金之间的那种。典型的一个5至200纳米厚的金涂层承载在硅/二氧化硅片、玻璃或聚合物膜上。任选地，钛可用来作为金和载体间的粘附促进剂。在接触印记或浸入溶液的过程中，分析物特异性受体连接到金表面上。优选地，载体在MYLAR膜上含有金涂层。

图2列出了用于缩微接触印记的步骤。用高弹印模将分析物特异性受体“油墨”通过接触传送到金表面上；若印模已图案化，则形成图案化的分析物特异性受体层。印模是将聚二甲基硅氧烷(PDMS)浇铸到有所需图案的反转图案的母版上制备的。母版用标准光刻技术准备，或用具有微尺度表面特征的已有材料构造。

在典型实验步骤的优选实施方案中，光刻技术制造的母版放置于玻璃或塑料的有盖培养皿中，并将10∶1重量比的SYLGARD硅弹性体184和SYLGARD硅弹性体184固化剂(Dow Corning公司)的混合物倾泻其上。弹性体在室温下放置约30分钟，并减压脱气，然后在60℃下固化至少4小时，并轻轻从母版上剥离。弹性印模的“墨记”是通过将印模暴露到0.1至10μM的二硫键衍生抗体水溶液中完成，通常将印模表面浸入溶液中10秒至10分钟。将印模在室温下或通常暴露到空气或氮气中至干。墨记之后，印模敷到金表面。使用轻压以确保印模与表面完全接触。1秒至5分钟之后，印模从表面轻轻剥离。移去印模之后，冲洗表面并干燥。另外，用第二印模或通过将整个表面暴露给不同试剂，来使未印记区域的进一步衍生完成。随即，可进行暴露给蛋白质阻塞剂，如BSA或β-酪蛋白、或本领域中已知的其他试剂。

印模的弹性性质对所述方法的成功非常重要。聚二甲基硅氧烷(PDMS)经固化后是有充分弹性的，从而使印模与表面、甚至那些有明显起伏的表面有良好的正形接触；这种接触对受体到金膜的充分接触传递也是非常重要的。PDMS的弹性性质对于印模从母版上移走也非常重要；如果印模像母版一样刚性，硬化之后要想两种基质均不损坏而分离开印模和母版是很困难的。同时，PDMS也有足够的刚性来保持自身形状，甚至是亚微尺寸的特征。印模可持续使用，一块膜具可在一年内使用多于200次而没有效能上的明显降低。对于印模，使用印刷辊可以使印记操作连续进行。另外，如果能产生衍射需要的特征尺寸如小于等于100微米，也可喷墨打印期望的图案。

本发明方法和组合物将在下面详细描述。在此，所有引用的文献均作为参考全文引入。

任何塑料膜在本发明中均适用。优选金属涂层能沉积其上的塑料膜。这些包括但不限于以下聚合物：如聚对苯二甲酸乙二酯(例如MYLAR)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、丙烯腈-丙烯酸甲酯共聚物、赛璐玢、纤维素类聚合物如乙基纤维素、乙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、丙酸纤维素、三乙酸纤维素、聚乙烯、聚乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、离子交联聚合物(乙烯聚合物)聚乙烯-尼龙共聚物、尼龙、聚丙烯、甲基戊烯聚合物、聚氟乙烯和芳基聚砜。优选地，塑料膜的光学透明度大于80％。其它合适的塑料膜和其供给商可以从例如参考著作如Modern Plastics Encyclopedia(现代塑料百科全书)(Mcgraw-Hill出版公司，纽约1923-1996)中找到。

本发明的一种实施方案中，聚合物膜上有一金属涂层，其光学透明度介于约5％-95％之间。本发明中最好使用光学透明度约在20-80％间的塑料膜。本发明期望的实施方案中，聚合物膜有至少约80％的光学透明度，金属膜的厚度要能维持光学透明度大于约60％，这样的话透过的光才能引起衍射图像的产生。这相应于金属涂层的厚度为大约10纳米。但是，在本发明的其它实施方案中，金的厚度可以介于约1纳米到1000纳米间；例如，厚一些的金涂层(大于20纳米)仍适用于由反射光产生的衍射图像。

适用于沉积在膜上的优选金属为金。但，银、铝、铬、铜、铁、锆、铂和镍及它们的氧化物都可以被使用。

原则上讲，任何具有适当尺寸的波状(corrugation)的表面都可用作母版。缩微接触印记过程开始于适宜的起伏结构(reliefstructure)，弹性印模由该结构进行浇铸。这种“母版”模版可以由光刻技术或其它步骤制作，如市售的衍射光栅。在一种实施方案中，所述印模可由聚二甲基硅氧烷制作。

印模可以在空气中，或在能用于阻止受体物质额外扩散的流体中应用。对于大量或连续的印记过程，最好在空气中印记。

本发明的一种实施方案中，图案形成在金属化塑料聚合物(含分析物特异性受体层)上。压模过程之后，塑料上的金属化区域可以任选地被封闭，如用蛋白排斥剂如β-酪蛋白。

此发明在以下实施例中会进一步阐述，但这种说明并不限于其范围。正相反的是，可以清楚理解解决方案可能还有另外许多设计、改进、及其它等价方案。读完此描述后，其可以启发本领域技术人员而不偏离本发明的精髓。

实施例：实施例1：

用稀释于Stabil Guard(SurModics，Inc.；Eden Prairie，MN)中的5毫克/毫升的β-酪蛋白作为阻塞剂处理涂覆了金的MYLAR。然后用硫醇化的IgE的抗体(例如单克隆IgE抗体，如一种对IgE的C3-C4区域有特异性的)对酪蛋白处理过的膜进行接触印记，从而在10微米的圆上产生抗体的图案化x，y阵列。所述一步型器件的进一步准备包括将11微升与模混合的标记粒子(0.3微米粒子，与ALK Cat#512042结合，在稀释于StabilGuard稀释的5毫克/毫升的β-酪蛋白中悬浮)涂覆到所述表面上，然后在环境条件下使其干燥。随后，将带有3/32英寸直径的孔的0.45微米孔径的硝化纤维素盘放置在干燥的粒子上，从而完成诊断的准备工作。用由IgE加标的(IgE-spiked)血清(10微克/毫升IgE)组成的试样测试所述器件，所述试样是用6份磷酸盐缓冲液(pH8，离子浓度0.1M)进行过稀释的。用作阳性对照(positive control)的好的IgE源通常是多克隆源，它对宽范围的过敏原都有反应活性。用与对试样相同的方式进行稀释的未加标的血清测试对照物。测试包括将34微升的稀释血清放置在诊断器件上的硝化纤维素孔的中心之内。由于材料0.45微米的小孔径，芯吸作用的进行将被延迟，并通常是在加进稀释血清后的5-15分钟内发生。这个时间使得发生在分析物和诊断过程间的温育是充分的。如果希望芯吸作用的延迟较短(或无)，则可用较大孔径的材料作为芯吸介质。芯吸作用发生后，使用通过所述空进行照射的点光源(例如激光)来检测试样的衍射图像。衍射图像表明有分析物(例如，在本例中为模混合特异性IgE(mold mix-specific IgE))存在。实施例2：

用稀释于StabilGuard(SurModics，Inc.；Eden Prairie，MN)中的5毫克/毫升的β-酪蛋白作为阻塞剂处理涂覆了金的MYLAR。然后用硫醇化的促黄体生成激素(luteinizing hormone)的抗体(例如单克隆体)对酪蛋白处理过的膜进行接触印记，从而在10微米的圆上产生抗体的图案化x，y阵列。将样品接触60微升的以LH加标的BSA缓冲溶液。随后在促黄体生成激素的抗体(如一单克隆体，它识别不同于按图形排列的抗体的激素上的抗原决定部位)中马上加入20微升(浓度为10⁹或10¹⁰粒子/毫升)的含0.5微米粒子(与另一单克隆体结合)的悬浮液。在某些情况下，在温育中将试样加热至60℃；温育时间通常为5-15分钟。温育后，将中心带有孔(例如3/32英寸直径)的硝化纤维素盘(例如为8微米孔径)放置在试样和液体/粒子混合体的顶部。这使得未结合粒子和多余液体被芯吸作用除去，从而可用通过所述孔进行照射的点光源(例如激光)来检测试样的衍射图像。衍射图像表示分析物(在本例中为促黄体生成激素)的存在。实施例3：

用稀释于StabilGuard(SurModics，Inc.；Eden Prairie，MN)中的5毫克/毫升的β-酪蛋白作为阻塞剂处理涂覆了金的MYLAR。然后用硫醇化的IgE的抗体(例如亲合常数≥4×10¹⁰的单克隆体)对酪蛋白处理过的膜进行接触印记，从而在10微米的圆上产生抗体的图案化x，y阵列。然后使所述图案化的膜接触34微升的稀释人血清(例如国际酶种类编号8005)，该血清已用IgE加标。典型的血清稀释方法为一份加标的血清与两份磷酸盐缓冲液(pH7.2)混合。5分钟后，加入11微升的含与另一IgE单克隆体(例如单克隆IgE抗体，如一种对IgE的C3-C4区域有特异性的)结合的0.3微米粒子的悬浮液(通常浓度为10⁹或10¹⁰粒子/毫升)。10分钟后，将中心带有孔(例如3/32英寸直径)的硝化纤维素盘(例如为8微米孔径)放置在试样和液体/粒子混合体的顶部。这使得未结合粒子和多余液体被芯吸作用除去，从而可用通过所述孔进行照射的点光源(例如激光)来检测试样的衍射图像。衍射图像表示分析物(在本例中为全IgE)的存在。检测可达到低至1000纳克/毫升(为IgE在血清中的初始浓度)。实施例4：

用稀释于StabilGuard(SurModics，Inc.；Eden Prairie，MN)中的5毫克/毫升的β-酪蛋白作为阻塞剂处理涂覆了金的MYLAR。然后用硫醇化的B族链球菌(Group B Strep)的多克隆抗体对酪蛋白处理过的膜进行接触印记，从而在10微米的圆上产生抗体的图案化x，y阵列。随后，将所述图案化的膜与34微升的链球菌B抗原(Difco编号2979-50；Detroit，MI)溶液接触5分钟。随后，加入11微升的含与链球菌B的抗体结合的0.3微米粒子的悬浮液(通常浓度为10⁹或10¹⁰粒子/毫升)。10分钟后，将中心带有孔(例如3/32英寸直径)的硝化纤维素盘(例如为8微米孔径)放置在试样和液体/粒子混合体的顶部。这使得未结合粒子和多余液体被芯吸作用除去，从而可用通过所述孔进行照射的点光源(例如激光)来检测试样的衍射图像。衍射图像表示分析物(在本例中为链球菌B抗原)的存在。检测可达到低至10-100纳克/毫升。实施例5：

用稀释于StabilGuard(SurModics，Inc.；Eden Prairie，MN)中的5毫克/毫升的β-酪蛋白作为阻塞剂处理涂覆了金的MYLAR。然后用硫醇化的B族链球菌的多克隆抗体对酪蛋白处理过的膜进行接触印记，从而在10微米的圆上产生抗体的图案化x，y阵列。链球菌B细胞悬浮液(浓度介于9×10⁹-9×10³个细胞/毫升)首先用酶如色素肽酶(chromopeptidase)进行处理，该酶是用去离子水稀释至710单元/毫升。通常，通过将所述酶溶液和细胞悬浮液(例如，酶溶液/细胞为4∶3体积/体积比)进行混合，然后在37℃加热20分钟，来完成这一细胞提取步骤。使34微升的所得溶解细胞试样与所述图案化的膜接触5分钟。然后，加入11微升的含与链球菌B的抗体结合的0.3微米粒子的悬浮液(一般浓度为10⁹或10¹⁰粒子/毫升)。10分钟后，将中心带有孔(例如3/32英寸直径)的硝化纤维素盘(例如为8微米孔径)放置在试样和液体/粒子混合体的顶部。这使得未结合粒子和多余液体被芯吸作用除去，从而可用通过所述孔进行照射的点光源(例如激光)来检测试样的衍射图像。衍射图像表示分析物(在本例中为链球菌B细胞)的存在。检测可达到低至9×10³细胞/毫升。实施例6：

用稀释于StabilGuard(SurModics，Inc.；Eden Prairie，MN)中的5毫克/毫升的β-酪蛋白作为阻塞剂处理涂覆了金的MYLAR。然后用硫醇化的IgE抗体(例如单克隆体)对酪蛋白处理过的膜进行接触印记，从而在10微米的圆上产生抗体的图案化x，y阵列。然后使所述图案化的膜与34微升IgE加标的EDTA稀释人血浆(例如，Interstate Blood Bank，Inc；Memphis，TN)接触。通常血浆稀释比为1份加标血浆对3份pH7.2的磷酸盐缓冲液(pH7.2)。5分钟后，加入11微升的含与另一IgE单克隆体(例如单克隆IgE抗体，如一种对IgE的C3-C4区域有特异性的)结合的0.3微米粒子的悬浮液(通常浓度为10⁹或10¹⁰粒子/毫升)。10分钟后，将中心带有孔(例如3/32英寸直径)的硝化纤维素盘(例如为8微米孔径)放置在试样和液体/粒子混合体的顶部。这使得未结合粒子和多余液体被芯吸作用除去，从而可用通过所述孔进行照射的点光源(例如激光)来检测试样的衍射图像。衍射图像表示分析物(在本例中为全IgE)的存在。检测可达到低至1000-10000纳克/毫升(为IgE在血清中的初始浓度)。

本领域的技术人员可认识到，本发明可进行很多种改型和变化，而不偏离其范围。因此，上述实施例的详细描述仅是为了说明的目的，而并非以任何方式对权利要求中的本发明范围进行限制。