一种判断肿瘤细胞对顺铂敏感度的方法

摘要

本发明涉及一种判断肿瘤细胞对顺铂敏感度的方法。方法是通过检测患者肿瘤细胞中的UBF含量和用顺铂后的细胞IC50值来判断肿瘤细胞对顺铂的敏感程度的。本发明方法可作为指导临床上合理使用顺铂的依据。

说明书

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种判断肿瘤细胞对顺铂敏感度的方法。

背景技术

UBF(Ustream binding factor，上游转录因子)是5.8S，18S，28S rRNA转录和表达所必需的转录因子，和转录因子SL1一起识别rRNA的启动子。UBF是一个具有RNA聚合酶I特异性的核仁磷蛋白，含有DNA结合和转录的区域。它的DNA结合区域与rRNA启动子序列的特异性结合是由几个HMG BOX来进行调控的。UBF也作为核仁组织区域的自身抗原(NOR-90)，用自免病人的抗血清可检测到。

由于rRNA的转录活性与细胞增殖的活性，所以，UBF的表达情况直接影响细胞增殖的活性。

顺铂Cis-platin(又简称为CDDP)是为无机金属——铂的络合物，在体内能与DNA结合，形成交叉键，从而破坏DNA的功能不能再复制，为一细胞周期非特异性药物。它具有很广的抗瘤谱，可用于食道癌、肺癌、鼻咽癌、膀胱癌、宫颈癌、前列腺癌、恶性淋巴瘤、软组织肉瘤、头颈部肿瘤及睾丸肿瘤等。但由于癌症患者的个体差异，许多癌症患者对于顺铂有一定的耐药性，因此，盲目使用顺铂，会对病人机体产生损害。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是根据顺铂抑制肿瘤的机理，提供一种判断顺铂对肿瘤细胞敏感度的方法，作为指导临床上合理使用顺铂的依据，以避免盲目用药。

本发明公开的判断顺铂对肿瘤细胞敏感度的方法是通过检测患者肿瘤细胞中UBF含量和IC₅₀值来判断肿瘤细胞对顺铂的敏感程度的。

本发明测定UBF含量的方法为：提取细胞的总蛋白至少100μg，按照常规方法进行Western实验。

本发明所述的IC₅₀(50％inhibition concentration)是指抑制细胞增殖50％的药物浓度，其测定方法为以无菌PBS为溶剂将药物浓度配制到0.2-10mM，加入细胞上清液中，24小时后，洗去上清，细胞在无药物的环境中再生长24小时，用常规MTT法进行测定药物顺铂对此细胞的半有效抑制浓度。本发明所述的顺铂IC₅₀指药物为顺铂时的IC₅₀。

本发明人经一系列试验证实：UBF与肿瘤细胞生长和增殖有密切关联，而顺铂与细胞DNA结合的产物可通过抑制细胞内UBF的表达来抑制肿瘤细胞的生长，因此通过对用药前后UBF含量的测定可反映肿瘤细胞对顺铂的敏感程度，即顺铂治疗肿瘤的有效性。

本发明经下述实验证明，顺铂是通过抑制细胞内UBF的表达来抑制肿瘤细胞的生长：

1、考察UBF含量有明显差异的肿瘤细胞对顺铂敏感程度的不同

选取几种高度表达UBF的肿瘤细胞和不表达(或低度表达)UBF的细胞进行比较，测试各自的顺铂IC₅₀值。结果显示，高度表达UBF的肿瘤细胞的顺铂IC₅₀值远远低于不表达(或低度表达)UBF的细胞的顺铂IC₅₀值。

2、考察增加细胞内的UBF表达导致细胞对顺铂敏感程度的变化

选取几乎不表达UBF的细胞，将UBF基因转染进此细胞内，分别测定经此处理的细胞与未经此处理的细胞的顺铂IC₅₀值。结果显示，转染过UBF基因的细胞的顺铂IC₅₀值明显小于未经此处理的细胞的顺铂IC₅₀值。

3、考察抑制细胞内的UBF表达导致细胞对顺铂敏感程度的变化

选取经过UBF反义核苷酸处理和未经过UBF反义核苷酸处理的同一种细胞(此细胞可表达UBF)，测试各自的顺铂IC₅₀值。结果显示，经过UBF反义核苷酸处理的细胞的顺铂IC₅₀值大大高于未经过UBF反义核苷酸处理的细胞的顺铂IC₅₀值。

上述的“UBF反义核苷酸”是与体内UBF基因互补的一小段核苷酸序列，通常含有20个左右的核苷酸，由于序列的互补性，它可以与UBF基因特异结合，阻断UBF基因的功能。主要是影响UBF基因的转录和/或翻译，抑制该基因编码的蛋白质的表达。

本发明通过检测患者肿瘤细胞中UBF含量的不同可提示肿瘤细胞对顺铂的敏感程度，当细胞的顺铂IC₅₀值较小时，说明顺铂对该肿瘤细胞具有较强的抑制作用，提示临床使用顺铂来治疗肿瘤效果较好。反之，当细胞的顺铂IC₅₀值较大时，说明顺铂对该肿瘤细胞抑制作用较弱，应寻找其他更有效的药物，避免盲目用药。

本发明判断肿瘤细胞对顺铂敏感度的方法，也可用于其他作用于UBF的抗肿瘤药物的筛选，指导临床针对不同的肿瘤选择疗效最好，特异性最强的抗肿瘤药物。

附图说明图1UBF表达量不同的细胞Western结果

其中1为肝癌细胞BEL-7404，2为胃癌细胞MKN45。图2不同肿瘤细胞的UBF含量差异导致对顺铂的IC₅₀差异

其中1为肺成纤维细胞HLF，2为肝癌细胞BEL-7404。图3增加细胞UBF表达量导致对顺铂的IC₅₀的变化

其中1为不表达UBF的肺成纤维细胞HLF，2为转染空载体的HLF细胞N1，3为转染UBF后的HLF细胞P1，4为转染UBF后的HLF细胞P2。图4抑制细胞UBF表达量导致对顺铂顺铂的IC₅₀的变化

其中1为UBF反义核苷酸AS处理后的肝癌细胞SMMC-7721；2为基因片段SE处理后的肝癌细胞SMMC-7721；3为基因片段SH处理后的肝癌细胞SMMC-7721；4为基因片段MI处理后的肝癌细胞SMMC-7721；5为没有经过任何处理的肝癌细胞SMMC-7721。

具体实施方式实施例1、UBF表达量不同的细胞Western结果

肝癌细胞株BEL-7404和胃癌细胞株MKN45由中科院上海细胞库提供。

细胞培养至少两天后，分别提取两种细胞的总蛋白，取100μg蛋白，使用抗UBF的单克隆抗体按常规方法进行WESTERN实验。以ACTIN作为对照。实验结果如图1。

实验结果以ACTIN为参照进行数据分析，可知，在两个细胞ACTIN含量相同的情况下，肝癌细胞BEL-7404中UBF蛋白含量为胃癌细胞MKN45的3.52倍。实施例2、考察UBF含量有明显差异的肿瘤细胞对顺铂敏感程度的不同

肝癌细胞株BEL-7404、肺成纤维细胞株HLF由中科院上海细胞库提供。

用同样的细胞培养条件培养上述两种细胞，并测定其顺铂IC50值。结果如图2

实验结果表明，UBF表达越高的细胞对顺铂的IC₅₀值越低，即UBF表达越高的细胞对顺铂的敏感程度越高，换而言之，用顺铂治疗UBF表达越高的肿瘤细胞，效果越好。实施例3、增加细胞UBF表达量导致细胞对顺铂敏感程度的变化

肺成纤维细胞株HLF由中科院上海细胞库提供；载体由Invitrogen公司提供。

制备UBF的PCR产物，用限制性内切酶NotI and Hsp92II对其消化，并克隆到pGEM-5Z(+)载体中(PCR和克隆的方法见《分子克隆实验指南(第三版)》)。

选取几乎不表达UBF的肺成纤维细胞株HLF，用含有UBF基因片段的载体分别转染到两瓶相同的HLF细胞(P1、P2)。同时将未插入UBF基因片段的空pGEM-5Z(+)载体转染至其HLF细胞作为对照(N1)。(转染的方法见《分子克隆实验指南(第三版)》)对上述三瓶细胞同时施以顺铂的作用，测定其顺铂IC₅₀值。结果如图3。

由于HLF细胞几乎不表达UBF蛋白，所以经过UBF质粒转染后的HLF细胞(P1、P2)其UBF的表达增加，而转染空质粒的HLF细胞(N1)几乎不表达UBF。对上述细胞施以顺铂后发现，表达UBF的细胞，其IC₅₀明显低于不表达UBF的细胞，也就是说增加细胞中UBF的表达，可增加细胞对顺铂的敏感程度。实施例4、抑制细胞UBF表达量导致细胞对顺铂敏感程度的变化

肝癌细胞株SMMC-7721由中科院上海细胞库提供；各个基因片段由上海Sangon公司合成。

选取UBF高表达的肝癌细胞SMMC-7721，设计UBF的反义核苷酸AS，对该细胞进行处理，同时随机设计三段基因片段SE，SH，MI作为对照，(四个序列见表1)也对SMMC-7721细胞进行处理，C表示阴性对照，即对SMMC-7721细胞不进行任何处理。处理方式：各个核苷酸序列(AS、SH、SE、MI)标记荧光素，并溶解在1M PBS中，制备出0.5-5μM的浓度。将各溶液分别加入SMMC-7721细胞的上清液中。

表1

  序列编号    序列的碱基排布    AS 5’-CTT CTC CGT TCA TCC TCC-3’    SE 5’-GGA GGA TGA ACG GAG AAG-3’    SH 5’-CCT CCT ACT TGC CTC TTC-3’    MI 5’-GGT GTC CGT TCA TCG ACG-3’

其中，AS是UBF基因的反向互补序列；SH与AS的各碱基数目一致，但碱基排布不同；SE是AS的反向互补序列；MI与AS相比，出现几个碱基的随机错配。

对上述细胞同时施以顺铂，测定其顺铂IC₅₀值。结果如图4。SMMC-7721本来为UBF高表达的肝癌细胞，用AS处理后就大大抑制了其UBF的表达。其他用SE、SH、MI处理的SMMC-7721，其UBF的表达几乎未得到抑制。对上述细胞施以顺铂后发现，UBF表达量明显降低的细胞，其IC₅₀值有明显增加，是其它细胞的2-4倍。也就是说降低细胞中UBF的表达，可降低细胞对顺铂的敏感程度。