一种用于防治哮喘、慢支的药物组合物及其制备工艺

摘要

本发明涉及一种由中药材淫羊藿、蛇床子或它们的提取物组成的用于防治哮喘、慢支的药物组合物，以及获得主要含有淫羊藿总黄酮和蛇床子总香豆素等有效成分的药物组合物的制备工艺；本发明还涉及该药物组合物在预防和治疗支气管哮喘、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺疾病中的用途。

说明书

技术领域：

本发明涉及医药领域，尤其是涉及中药淫羊藿和蛇床子，特别是一种含有淫羊藿提取物和蛇床子提取物的防治哮喘、慢支的药物组合物及其制备工艺。

背景技术：

支气管哮喘(简称哮喘)是世界范围内严重威胁人们健康的常见病、多发病，在全世界发病率约为0.2～9.9％，且正以每年10％的速度递增；现约有1.55亿人患哮喘，德国有400万哮喘患者，日本有300万，西欧在过去十年中增长了一倍，美国则比80年代早期增加了60％；全球每年死于哮喘人数高达18万。我国哮喘的患病率，根据局部地区调查，约为0.5％～2.0％，也有报道高达5.29％的，全国有1000万～2000万患者，以青壮年和儿童居多；哮喘患者的死亡率将近0.4％，我国每年有近6.2万人次死于哮喘病的发作。其发病率及死亡率在世界范围内均呈上升趋势。哮喘不仅构成了公众健康问题，它使许多人失学、丧失工作能力和英年早逝。然而由于病因及发病机制不甚清楚，对于大多数患者虽然能够有效控制症状，但对部分患者而言则疗效欠佳，更谈不上根治，因此，哮喘的防治任务仍十分艰巨与迫切。

在1995年WHO和美国国立心肺血液研究所发表的“全球哮喘防治的创议”中将哮喘定义为：哮喘是一种以嗜酸性粒细胞(EOS)、肥大细胞和T淋巴细胞参与为主的具有复杂免疫机制的气道变应性慢性炎症。以气道高反应性和气道重建为本病特征，且在慢性缓解期仍然存在。有多种炎性细胞、炎性介质、受体、细胞因子参与其炎症过程。

EOS是哮喘发病机制中最重要的炎症效应细胞，激活的EOS可以释放碱基蛋白(MBP)、阳离子蛋白(ECP)、过氧化物酶(EPO)及神经毒素(END)，它们具有很强的细胞毒性，可引起气道上皮损伤，产生和加重气道炎症，导致气道反应性增高。最近发现哮喘患者气道中EOS是中性粒细胞的50-100倍。且许多研究证实哮喘严重程度与外周、痰液、及支气管粘膜组织、支气管肺泡灌洗液(BALF)中EOS水平及其产物有关。

哮喘的发病与糖皮质激素受体(GCR)密切相关。糖皮质激素(GC)必须和GCR结合才能作用于效应细胞，影响参与哮喘发病的炎症细胞及细胞因子，哮喘患者GCR有异常变化，而且这种改变是原发的，其改变形式包括GCR数量减少，功能低下等异常。研究已证实，哮喘时外周血白细胞GCR数量减少，肺组织中GCR总结合力和亲和常数均下降。随着对糖皮质激素耐药病例的不断增加，对GCR的数量及功能与哮喘反复发作的密切关系也被肯定。

T淋巴细胞在哮喘发病中主要起着免疫调节作用，这种调节作用是通过它们分泌的细胞因子之间复杂相互作用而完成的。辅助T细胞(TH)分为TH₁和TH₂两种亚群，TH₁分泌白细胞介素-12(IL-12)、γ-干扰素(IFN-γ)等细胞因子，TH₂分泌白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)等细胞因子。IL-4在哮喘中的主要作用是诱导B细胞合成、调控IgE产生，诱导EOS的聚集，破坏气道组织，促进气道高反应性的形成；IL-5在控制EOS介导的气道炎症中起着核心作用；因此IL-4和IL-5是哮喘发病中最为关键的两种细胞因子。IL-12是刺激TH₁细胞分化的主要细胞因子，IL-12能够促TH₁细胞功能扩增并可抑制分泌的作用；IFN-γ能够抑制TH₂细胞分化、增殖及生成IL-4、IL-5等促哮喘发病的细胞因子。机体正常状态时，TH₁和TH₂细胞处于动态平衡，维持正常细胞免疫和体液免疫功能；哮喘发作时，TH₁细胞功能不足，TH₂细胞功能亢进，致使TH₁/TH₂比例失调，表明免疫功能紊乱在哮喘发病机制中起着重要作用。纠正TH亚群失衡，已成为哮喘治疗研究的重要方向。

哮喘是气道高反应性慢性炎症性疾病，气道重建是慢性哮喘气道最重要的病理改变特征。近年研究发现，多数支气管哮喘患者均有不同程度的气道壁结构改变，除炎性细胞浸润外，主要表现为上皮下胶原沉积以及气道平滑肌肥大、增生、基底膜增厚和玻璃样变，此种改变称为气道重建，由此可导致气流的不可逆阻塞和持续的气道高反应性，可能是顽固性哮喘的重要病理基础。

经典的哮喘治疗包括一线药物糖皮质激素，二线药物包括β₂受体兴奋剂、茶碱类药、白三烯受体拮抗剂。目前已知糖皮质激素是降低气道高反应性、消除气道炎症反应、抑制气道重建的最有效药物。哮喘作为一种慢性气道炎症性疾患，需要长期抗炎治疗，然而长期大量使用GC，使抑制肾上腺皮质功能、影响发育和骨质代谢等副作用不可避免；引发慢性肌病；诱发或加重感染；中枢神经系统功能紊乱；气道高反应性不能彻底消除；特别是停药后病情反跳，对控制哮喘复发的效果不确定等。β₂受体兴奋剂对平滑肌的舒张作用是肯定的，但当长期使用可使细胞膜β₂受体功能下调而降低疗效，同时出现心率失常、肌肉震颤、血糖升高等副作用；且有研究显示可加重气道反应性，使哮喘病情恶化；其临床长期使用的安全性已经受到怀疑。茶碱类药物在抑制炎性介质释放等方面有新的发现，但由于多种药物可干扰茶碱的消除；量效关系不易掌握，容易发生不良反应，甚至出现中毒；副作用较多；临床应用受到限制。值得注意的是：β₂受体激动剂和茶碱类药都缺乏有力的抗炎活性，故不能作为抗炎药物单独长期使用。而白三烯受体拮抗剂却有较好的抗炎、扩张支气管等控制症状的作用，不仅可以减轻夜间哮喘的发作，而且对阿司匹林敏感型哮喘也有疗效，治疗指数颇高；所以它可作为一线药物GC的替代治疗，用于轻度患者。但是白三烯受体拮抗剂仅对炎性介质白三烯起作用、抗炎谱相对较窄，所以尚不能完全替代激素的抗炎作用。从经济、疗效学角度看，目前在我国白三烯受体拮抗剂尚不能成为哮喘患者主要的单独用药，其主要的治疗价值可能在于与GC联合应用治疗中、重度哮喘。

近年来，某些抗胆碱药物、钙离子拮抗剂、钾离子通道激活剂、免疫调节剂、细胞因子调节剂、抗过敏药物等均显示对哮喘具有一定防治作用，但长期应用效果及安全性尚需进一步评价。

可见，近年来西药的治疗亦不甚满意，尚缺乏远期疗效好、价格低廉、副作用小的能够消除慢性炎症的药物。

哮喘、慢性支气管炎(简称慢支)属中医学咳嗽、哮、喘、痰饮、呷嗽、哮吼、上气、肺胀等疾病范畴。对其的认识可溯源到两千年前的《黄帝内经》，即有“喘息”、“喘鸣”的记载。隋·巢元方在《诸病源侯论·久咳逆上气候》中对本病反复发作的特点早有论述，谓之“定后复发，连滞，经久也”；何以至此，乃有“宿根”故也。正如《景岳全书·喘促》所言：“喘有宿根”；明·戴元礼在《秘传证治要诀》亦指出“宿有此根”。

中医学认为哮喘、慢支反复发作的夙根是痰、瘀，清·唐容川在《血证论》中指出“瘀血乘肺，咳逆喘促”；“盖人身气道，不可阻滞……，内有瘀血，气道阻塞，不得升降而喘”。《诸病源候论》中提出的“诸痰者，此由血脉壅塞，饮水积聚不消散”的观点表明血滞可以导致痰饮的形成，“痰挟瘀血”，伏于肺系，成为本病的夙根。但病机实质是“虚寒之体”，脾肾亏虚是哮喘、慢支屡发的基本病机。《景岳全书·痰饮》谈到“五脏之病虽俱能生痰，然无不由于脾肾。盖脾主湿，湿动则为痰；肾主水，水泛亦为痰。故痰之化无不在脾，而痰之本无不在肾，所以痰证非此则彼，必与二脏有涉”。要从根本上防治哮喘、慢支，必须除去内伏之痰、瘀，除了祛痰、瘀是很重要的一环外，还要除去内伏之痰、瘀得以滋生的原因，然宿痰、瘀非与身俱来，究其产生，与脾、肾功能失调有关，盖脾虚不运，肾阳不足，则伏痰不去、瘀血不化，每因外邪激动而搏击于气道，导致本病呈慢性反复发作状态。

对哮喘、慢支的治疗，中医历来强调“发时治标，平时治本”，但治本之法各有不同，关于治本的认识有两段论述颇为精辟，一是清·王旭高指出“治之之法，在上治肺胃，在下治脾肾；发时治上，平时治下，此一定章程”；一是清·罗浩在《医经余论》中所言“经云：治病必求其本。脾不健运，皆由命门火衰，补火生土，则本中之本也；其次用补脾利湿，使痰不生，则本中之标也……平日只宜固本，发时暂用治标……”都强调治本以治脾肾为主。通过补肾健脾，可以温阳化气，蒸腾水液，血液畅通，杜绝痰、瘀生成之源；温肺固表，截外邪入侵之路，安有咳喘之屡发？其治法原理有四：1.补肾纳气防咳喘。肺主呼气，肾主纳气。肾气充盛，则吐故而纳新，吸入之气方能经肺之肃降而下纳于肾，故有“肺为气之主，肾为气之根”之说。若因先天不足或咳喘久发，肺气久虚，久病及肾则出现肾不纳气之证，正如宋·杨仁斋在《直指方》中曰“虚喘由真阳衰惫，肾气不得归元”所致，明·赵献可在《医贯·喘》中亦指出：“真气损耗，喘出于肾气之上奔……乃肾气不归元也”，较难治愈。肾气充足则可行主纳气之功，助肺主司呼吸之能。2.补肾健脾助先天后天。脾为后天之本，肾为先天之本，脾之健运，化生精微，须借助于肾阳的推动，故有“脾阳根于肾阳之说”，肾中精气也有赖于水谷精微的培育和补养，才能不断充盈和成熟，因此脾和肾在生理上是后天与先天的关系，它们是相互资助、相互促进；在病理上也相互影响，互为因果。在哮喘，肾虚与过敏体质、机体免疫失衡有关，通过补肾可以纠正这种体质；后天失养，则易生痰，并且不能濡养先天，因此，在哮喘慢性期治疗中，从患者的体质着眼，以图扶正固本，消除患者发病的体质缺陷。3.补肾健脾以杜绝痰瘀生成之源。在疾病慢性期既有脾肾亏虚的一面，又因脾肾亏虚，不能输布津液，运行血液，引起水液内停，血涩成瘀，此时应以补肾健脾为主，阳气旺盛，运行通畅，则痰去血活络通，诚如王旭高先生所云，“真阳旺而邪自退，所谓正治之良图”。4.补肾健脾则肺固外邪不能侵。通过补肾健脾可以增加抵抗力，防止复发或减少发作次数。

我们从中医症候学分析，认为气道高反应性、气道重建相当于本病的“夙根”，提出哮喘、慢支治疗较为棘手。所谓难治，并非指发作时止咳平喘无法，而是指止咳平喘后的疗效巩固以及再发作的防范；临床上患者屡止屡发的现象屡见不鲜就说明这一点。只有进行补肾健脾固本治疗，才能截除“夙根”，减少发作甚或根治本病。本发明正是补肾健脾法的代表应用。

本发明所采用的淫羊藿、蛇床子两味药早在《本经》中就有记载。方中淫羊藿辛甘温，入脾、肾经，《本草述》言其“辛能散结，甘能缓中，温能通气行血”，《医学入门》谓其“补肾虚，助阳”，《本草正义》认为其“专壮肾阳”，《得配本草》谓其“得覆盆、北味治三焦冷嗽”，可见它有温肾纳气、助阳止咳之功，以之为主药；蛇床子辛温，入肺、脾、肾经，《本草经疏》言其“苦能除湿，温能散寒，辛能润肾，甘能益脾”，《罗氏会约医镜》中说它能“去脾经之湿，补肾经之虚，益阳滋阴”，可温肾祛寒，健脾化痰为辅药，并引药入肺经，两者共奏补肾固本，健脾化痰，止咳平喘之功。

淫羊藿为小蘖科植物淫羊藿(心叶淫羊藿)、箭叶淫羊藿、巫山淫羊藿、柔毛淫羊藿或朝鲜淫羊藿的干燥地上部分。主要成分为黄酮类化合物，如淫羊藿甙、淫羊藿次甙A、宝藿甙-I、宝藿甙-II、宝藿甙-VI、朝藿定B、朝藿定C、大花淫羊藿甙C和大花淫羊藿甙F、淫羊藿定A，B，C等；还含有木脂素类、生物碱类、挥发油、VitE及其它。

现代药理表明，淫羊藿的生物效应极为广泛。有研究显示，淫羊藿能够抑制抗过敏反应，对于内源性儿茶酚胺、组织胺和乙酰胆碱有一定拮抗作用【李恒昌.淫羊藿对儿茶酚胺类的拮抗作用.中草药，1984，15(2)：26张罗修.免疫药理学.北京：人民卫生出版社，1990，218】。淫羊藿及其总黄酮具有较强的免疫调节作用，既能显著提高细胞免疫功能，又能促进B淋巴细胞的增生和转化，还可提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能。淫羊藿不仅能显著增强下丘脑-垂体-肾上腺-胸腺(HPAT)轴抑制模型大鼠的NK细胞活性和IL-2、IFN-γ水平，还具有提高“阳虚”模型小鼠NK细胞活性的功能。淫羊藿能够减轻外源性糖皮质激素造成的大鼠和临床患者的神经内分泌免疫学效应，提高肾上腺皮质功能，对HPAT轴具有明显的保护作用【蔡定芳，沈时谋，陈晓红等.仙灵脾减轻外源性糖皮质激素抑制神经内分泌免疫作用的临床与实验研究.中国中西医结合杂志1998；18(1)：4-7】。有研究报道，临床用单味淫羊藿药丸治疗慢支1066例，总有效率为74.6％，具有良好的祛痰止咳、抗炎平喘作用【恩施地区防治慢性支气管炎办公室。湖北卫生，1972；(7)：15】。此外，本品尚有良好的雄激素样作用、具有抗冠心病、抗血小板凝集、抗衰老、降血压、降血糖、降血脂、促进骨质生长等作用。

中药蛇床子为伞形科植物蛇床Cnidium monnieri(L.)Cuss.的干燥成熟果实。关于蛇床子的化学成分，绝大多数是具有一定生理活性的香豆素成分。主要包括：蛇床子素、蛇床定、欧芹属素乙、佛手柑内酯、元当归素、花椒毒素、花椒毒酚、白芷素、二氢山芹醇乙酸酯、异虎耳草素、哥伦比亚苷元，欧山芹素、2’-乙酰白芷素。蛇床子果实中除了含有香豆素类成分外，还有含量较高的挥发油。

现代药理表明：中药蛇床子具有多种生物活性，蛇床子总香豆素不仅具有明确的祛痰平喘、扩张支气管功效，还可对组胺、乙酰胆碱引起的整体豚鼠药物性喘息具有明显的保护作用，能较强地抑制肥大细胞脱颗粒，拮抗由组胺引起的支气管平滑肌收缩【陈志春，段晓波，方荣.蛇床子抗变态反应的研究.药学学报1988；23(2)：96-99崔树德.中药大全.哈尔滨：黑龙江科学技术出版社，1989：719陈志春，段晓波.蛇床子总香豆素止喘作用机理探讨.中国中药杂志，1990，15(5)：48-49陈志春，王凤翔，姜红，等.蛇床子总香豆素药理研究.中药通报1986，11(2)：50-53.】。实验证明，蛇床子素能增加豚鼠肺灌流量，其作用强于氨茶碱，说明本品具有较强的平喘作用和解痉作用；并且给每只小鼠灌服蛇床子总香豆素15mg，能明显增加小鼠体内酚红排除量，说明本品具有祛痰作用。蛇床子素具有免疫抑制作用，能够显著增加小鼠碳廓清指数、吞噬指数、脾指数，增加非特异性免疫功能，对迟发性超敏反应有明显的抑制作用【刘桦，蒋韵，韩英.蛇床子素对小鼠免疫药理作用的研究.中草药1997，28(9)：543-545】。蛇床子素和蛇床子总香豆素不仅能够增强肾阳虚小鼠的免疫功能【秦路平，王洪斌，张家庆，等.蛇床子素和蛇床子素总香豆素对肾阳虚小鼠免疫功能的影响.中国中西医结合杂志1997，15(9)：547-549】；而且可以提高肾阳虚大鼠血浆皮质酮、促肾上腺皮质激素、肾素、血管紧张素和醛固酮的浓度，具有保护和增强垂体-肾上腺皮质轴功能的作用【秦路平，张家庆，石汗平，等.蛇床子香豆素对肾阳虚模型大鼠腺垂体-肾上腺皮质轴功能的影响.中国中西医结合杂志1997，17(4)：227-229】。应用蛇床子总香豆素口服治疗哮喘及喘息性支气管炎患者118例，总有效率87.3％，具有良好的止喘效果【陈志春.蛇床子总香豆素的平喘疗效观察.中草药1988；19(9)：26-27】。另外，本品具有良好的雄激素样作用，在抗心率失常、抗骨质疏松、降血压、抗艾滋病、抗炎抑菌、抗肿瘤及抗诱变等方面均有作用。

发明内容：

本发明的目的在于提供了一种用于防治哮喘、慢支的药物组合物，所述的药物组合物由淫羊藿、蛇床子或它们的提取物组成。

本发明的目的还在于提供了一种用于防治哮喘、慢支的药物组合物。所述的药物组合物包括淫羊藿总黄酮和蛇床子总香豆素，进一步的，所述的淫羊藿总黄酮和蛇床子总香豆素占所述的药物组合物的重量百分比在5～70％之间。

本发明的目的还在于提供了所述的淫羊藿、蛇床子提取组合物的制备工艺，所述的工艺是：1.将淫羊藿和蛇床子粉碎后，将两者充分混合，淫羊藿和蛇床子的总量比在0.3～3∶1之间，用50％～95％的有机溶剂(甲醇或乙醇)，优选的有机溶剂为乙醇，最优选的有机溶剂为70％的乙醇，在静态或动态下，回流或加热提取，优选的为回流提取，提取溶剂量为生药重量的6～15倍，优选的为生药重量的8～12倍，最优选的为生药重量的10倍，提取时间1～2小时，可重复提取2～3次。2.然后滤去药渣，滤液在常压或减压、动态状态下浓缩，再离心或过滤(包括常压、减压、微滤、超滤等)除去沉淀；滤液继续浓缩，直至有机溶剂全部收回，再加适量水，超声处理使其混悬，得样品液。3.样品液上大孔吸附树脂，生药量与树脂量的比例在0.3～5∶1之间，树脂型号可以选择DA201，D101，D100，D1400，D4020，HPD-300，HPD-400，LD605，AB-8，NKA-9，NKA-12型号等，其中AB-8吸附量、解吸率、产品纯度、收率均较其它树脂为高，最为优选。4.以水冲洗不吸附的杂质，再用50％～95％浓度的有机溶剂(乙醇或甲醇)洗脱，洗脱量约为树脂体积的5～10倍，洗脱溶剂优选的为乙醇，最优选的以70％乙醇为最好。5.收集液浓缩，经真空干燥或冷冻干燥成干粉，或将收集液直接喷雾干燥成型，以上制备的干粉，为黑褐色固体物质，不吸潮，味苦。其中所含的淫羊藿总黄酮和蛇床子总香豆素约为总重量的50％以上。

通过上述方法获得的提取物纯度高，有效成分可大大富集，稳定性强；其清除多糖、蛋白质等杂质的效果明显好于其他各种方法。在工艺制备过程中按照实施例2中的含量检测方法进行质量控制。

本发明的目的还在于提供了所述的药物组合物在制备预防和治疗支气管哮喘、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺疾病的药物中的应用；在所述的药物组合物中，还可以添加药学上可接受的安全的辅料或载体；进一步的，所述的药物组合物的剂型为药剂学及食品学上认可的任何一种剂型。

为深入研究本发明防治哮喘、慢支的固本原理，本发明根据国内外报道的方法加以改进，分别建立了过敏性豚鼠哮喘模型、大鼠和小鼠的慢性哮喘模型及大鼠慢支模型，并设立多个剂量组，糖皮质激素(必可酮或地塞米松)、白三烯受体拮抗剂(孟鲁司特)阳性对照组。采用密度梯度细胞分离法、放射性配基结合分析法、放射免疫法、酶联免疫法等方法，借助分子生物学、免疫组化等手段，运用直接或间接导致气道炎症、气道高反应性、气道重建的各类指标，分析各组模型动物呼吸困难和跌倒潜伏期，气道阻力、肺顺应性，BALF中EOS、低密度嗜酸粒细胞(HEO)的数量及百分比，外周血白细胞及肺组织中GCR，血浆皮质酮，BALF中IL-4、IL-5、IFN-γ、IL-12含量的变化，哮喘及慢支模型大鼠气道组织的改变。结果显示，本发明对以上指标均有不同程度的改善作用，它不仅可以降低大鼠气道阻力，降低EOS、HEO的含量；提高肺顺应性，GCR、皮质酮的含量；而且能够纠正TH₁/TH₂比例失衡，防止气道增厚等损害；最终能够降低气道高反应性，抑制气道重建，进而在以EOS浸润为主的慢性气道炎症中发挥重要作用。主要从以下方面进行阐述：

1.对气道炎症和嗜酸性粒细胞的影响

自从近年强调支气管哮喘是一种由活化T淋巴细胞和EOS浸润的慢性非特异性呼吸道炎症以来，关于EOS浸润呼吸道的机制以及呼吸道EOS的.活化过程和特征就一直是国内外研究哮喘发病机制的重心和热点。

参与气道炎症反应的细胞，包括EOS、肥大细胞、中性粒细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞、气道上皮细胞及血小板等。它们释放多种炎症介质，如组胺、白三烯、血小板活化因子(PAF)等。其中，EOS是引起气道炎症和气道高反应性的最为关键的细胞，哮喘时EOS增多且与疾病严重程度密切相关。EOS含有许多碱性颗粒与哮喘发病有关，主要有ECP、MBP、EPO和EDN，特别是ECP和MBP对气道上皮都有明显的细胞毒作用，引发或加重气道炎症及气道高反应性；随着对EOS的深入研究，发现EOS存在密度差异，HEO较正常密度的EOS有更强的细胞毒性，更长的存活时间和更强的氧化代谢功能，产生更多的过氧化物和炎性介质，是一种“活化”状态的EOS，HEO能更好地反映哮喘的严重程度。

在本发明中，观察了各组慢性哮喘大鼠气道组织在光镜下的改变及BALF中EOS、HEO的变化。结果显示，模型组大鼠血管及各级支气管周围大量炎性细胞浸润，其中以EOS为主、同时伴有淋巴细胞及少量的中性粒细胞，严重者可见有脱落的上皮细胞；同时BALF中EOS和HEO计数明显增加。而本发明大剂量组肺组织中血管周围及支气管各层组织中炎性浸润明显减轻、EOS和HEO数值明显下降(P＜0.01)，与西药对照组无明显差异(P＞0.05)；尤以中西医结合组疗效最为突出，接近正常水平；本发明小剂量组气道炎症减轻，EOS降低明显(P＜0.05)，HEO略有下降，但无统计学意义(P＞0.05)。以上结果表明，本发明通过减少EOS数量，阻止EOS在气道炎症局部的粘附、聚集、趋化和活化，从而减轻气道炎症、降低气道高反应性，有利于减轻哮喘症状、减少复发。

2.对糖皮质激素受体和血浆皮质酮的影响

现代医学认为，哮喘是由多种细胞参与的慢性非特异性气道炎症，以气道高反应性和气道重建为特征，因此减轻气道炎症、降低气道高反应性和预防哮喘发作成为哮喘治疗的重点，糖皮质激素(GC)以其强大的抗炎作用而成为治疗哮喘的第一线药物，但GC需要与GCR特异性结合才能发挥其免疫机制和抗炎作用。

体内外实验表明GC对GCR具有降调节作用。因此，GCR的下降必然会引起靶细胞对GC敏感性和反应性的降低，GC的效应必然减弱，使其难以发挥出应有的抗炎作用。研究显示哮喘患者外周血白细胞GCR水平低于正常对照组，且哮喘越严重，这种受体水平的下降越明显；而且哮喘患者病程和发病年龄与GCR水平亦有密切关系，哮喘患者不论发作期还是慢性缓解期其GCR水平均低于正常，但外源性哮喘GCR降低比内源性哮喘更明显，有显著性差异。

需要指出的是，在哮喘防治中，长期应用尤其是滥用GC所造成的皮质功能抑制是一个重要的临床问题，研究内源性皮质功能与哮喘间的关系以及寻找调节皮质功能的药物是非常必要的。有资料显示，哮喘机体内源性GC水平偏低或因其受体功能缺陷而造成体内GC相对不足是哮喘发作及恶化的重要原因，也是临床上首选GC来控制哮喘发作的依据。

我们的研究发现大鼠在多次、间歇激发所致慢性哮喘后，模型组外周血白细胞和肺组织的GCR显著减少(分别为P＜0.01和P＜0.05)；西药组及中西药结合组的GCR同模型组相接近，比正常组减少明显，具有统计学差异(分别为P＜0.01和P＜0.05)；而用本发明大、小剂量治疗后均有显著升高(分别为P＜0.01和P＜0.05)；其中经中药大剂量组治疗者，GCR结合位点高于正常组，表明本发明具有上调GCR的功能。

本发明中，由于采用必可酮吸入，进入血循环很少，且很快被代谢灭活，故血浆皮质酮水平主要反映内源性GC水平。模型组大鼠血浆皮质酮水平明显降低，并没有出现因对抗刺激而相应的升高，可能是因为经多次、间歇激发哮喘之后，内源性皮质酮慢性消耗所致。与模型组相比，西药组与中西药结合组皮质酮含量轻度上升，但无统计学意义(P＞0.05)；而用本发明大、小剂量治疗后，血浆皮质酮水平升高(分别为P＜0.01和P＜0.05)，其中中药大剂量组明显高于正常组(P＜0.01)。说明大鼠下丘脑-垂体-肾上腺功能尚未完全受到抑制，表明本发明对大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴有保护作用。

在防治哮喘的研究中，目前尚未发现任何西药可以提高哮喘时GCR数量，本发明不仅能上调GCR，而且可提高内源性皮质酮，改善肾上腺皮质功能；从而使得内源性GC可以更好地发挥作用，充分说明了本发明防治哮喘的固本原理，显示了中医药预防哮喘发作的优越性。

3.本发明对TH₂/TH₁模式的影响

许多研究表明TH细胞功能的失衡在支气管哮喘和其它过敏性疾病中起重要作用。根据产生的细胞因子的不同，以TH₁分泌的IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-β等细胞因子可引起细胞免疫应答，这种引发的免疫应答称TH₁优势应答；以TH₂分泌的生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等细胞因子可引起体液免疫应答，称为TH₂优势应答。TH₁型和TH₂型细胞因子互相抑制彼此表型的分化和功能，即TH₂优势应答下调TH₁应答，反之亦然。近来研究发现还存在第三类TH细胞即TH₀细胞，可产生TH₁和TH₂两类细胞所产生的细胞因子。哮喘的发生与TH₁/TH₂功能失衡，特别是TH₂优势应答密切相关，由TH₂分泌的细胞因子与B淋巴细胞、肥大细胞和EOS发生特异性反应，继而导致气道炎症和气道高反应性的发生。

IL-4和IL-5在哮喘发病多个环节中居中心地位。IL-4是TH₂细胞分泌的一种促进B细胞分化、增殖且刺激B淋巴细胞产生IgE的绝对必需因子。IL-4不仅可促进淋巴细胞的增殖活化、使TH₀细胞向TH₂类细胞分化，而且还是巨噬细胞活化因子。IL-4可提高血管细胞粘附分子VCAM-1的表达，诱导内皮细胞对EOS的粘附作用，使EOS选择性地聚集于气道，最终使EOS对气道损害加重，导致气道炎症及气道高反应性。IL-5是特异作用于EOS的细胞因子，它对EOS具有选择性地调节作用，从而在哮喘的发病中占有极其重要的位置。IL-5可促进EOS骨髓终末分化、抑制EOS的凋亡、延长成熟EOS的生存、上调EOS对上皮细胞的粘附作用，对EOS的产生、趋化、聚积、活化等功能具有强有力的影响；能够显著增加EOS的浸润、细胞毒性和炎性介质释放，造成损伤效应及气道高反应性。有研究提示IL-5可能比EOS计数更能特异地反映哮喘气道炎症程度。此外，IL-5还可协助IL-4促进B细胞激活并产生IgE，当IL-5与IL-4同时用于刺激B细胞时，B细胞合成IgE的能力可比单用IL-4时增加9～14倍。免疫病理学机制将哮喘分为三个阶段：初期致敏阶段，包括过敏原刺激、诱导T淋巴细胞活化、IL-4产生、IgE合成和效应细胞释放介质；第二阶段为慢性过敏性炎症阶段，以TH₁/TH₂细胞比例降低、产生IL-5和EOS活化、聚集为特征；由慢性炎症引起的气道重建是哮喘气道炎症发展最后阶段，从中可以看出IL-4、IL-5在哮喘发病中起的重要作用。

IL-12主要由TH₁细胞、巨噬细胞分泌，不仅是最为强大的诱导T淋巴细胞特别是活化的T细胞和NK细胞产生IFN-γ的细胞因子，也是免疫早期诱导内源性TH₁细胞发育调节因子，对维持TH₁/TH₂平衡起关键作用。IL-12可通过促进TH₀细胞分化为TH₁细胞，诱导分化后的TH₁细胞产生大量的IFN-γ抑制IL-4合成，激发机体的TH₁型细胞的优势应答；还能够抑制EOS数目增多、TH₂类细胞因子的表达和TH₂型细胞的优势应答。IFN-γ和IL-4是一对相互拮抗的细胞因子，在许多方面与IL-4具有对抗作用。IgE是哮喘变应性炎症的基础，肥大细胞是哮喘气道炎症反应的重要效应细胞，IFN-γ不仅能够抑制IgE合成和肥大细胞生长；还能抑制TH₂细胞的分化和活化，减轻EOS的浸润。此外，IFN-γ具有很强的抗病毒感染作用，而病毒感染被认为与哮喘发作，特别是儿童哮喘发作密切相关。

本发明中，与模型组相比，孟鲁司特组对IL-4、IL-5、IFN-γ水平有改善作用(P＜0.05)。地塞米松组IL-4、IL-5含量均明显降低(P＜0.01)，IFN-γ水平明显提高(P＜0.01)，IL-12水平轻度提高(P＜0.05)，明显强于孟鲁司特组；然而两者对IL-12的改善作用均明显低于本发明组(P＜0.01)。用本发明治疗后，BALF中IL-4、IL-5含量明显降低(P＜0.01)，IFN-γ、IL-12水平明显提高(P＜0.01)，疗效最为理想。充分表明本发明通过提高TH₁亚群功能，抑制TH₂优势应答，纠正TH₁/TH₂功能失衡，恢复正常的免疫功能状态，提高机体抗病毒感染的能力，控制哮喘的气道炎症和气道高反应性，起到防治哮喘的作用。这可能是该方治疗哮喘、预防哮喘发作的重要免疫学机制。

4.对哮喘大鼠气道重建的影响

哮喘是一种气道炎症性疾病，慢性持续哮喘患者的气道病理改变以气道EOS、肥大细胞和T淋巴细胞浸润及包括上皮下基底膜增厚、气道平滑肌肥大、增生在内的组织重建即气道重建为特征。气道重建因能加重哮喘气流阻塞和气道高反应性，已引起人们的重视。气道重建主要是气道壁的增厚，应用高分辨率CT检测可发现，约90％的哮喘病例出现气道壁增厚。其特有改变是包括III型、V型胶原和纤维连接蛋白(Fn)在上皮下沉积。

本发明通过较长时间反复吸入卵白蛋白，建立了大鼠慢性哮喘模型，结果显示哮喘模型组大鼠气道腔明显变小，气道壁明显增厚，气道壁胶原和Fn明显增加，证明大鼠哮喘模型存在气道重建。而本发明的组织学观察显示其气道腔明显大于模型组，与正常组和地塞米松组接近，气道壁无明显增厚，胶原和Fn明显少于模型组，提示本发明能够抑制大鼠哮喘模型的气道重建过程，防治由于气道重建而引起的不可逆气流阻塞。这可能是本发明治疗哮喘的重要机制之一。

5.对慢支大鼠模型支气管和肺组织病理形态学的影响

慢支和肺气肿是老年人的常见病和多发病，其中吸烟是重要的危险因素之一。慢支的早期表现为气道炎症细胞浸润，后期为细胞外基质沉积在气道壁导致细支气管壁的增厚和气道重建。慢支是气道受到慢性炎症反复刺激的结果，转化生长因子β1(TGF-β1)在其中发挥着重要作用。TGF-β1是一种多功能生长因子，具有促进成纤维细胞(FB)增殖、诱导结缔组织合成等功能，因其强烈的促纤维增生作用，TGF-β1不仅是慢支、而且也是哮喘气道重建的关键调控因子。许多细胞如FB、巨噬细胞、上皮细胞和EOS等都可合成和释放TGF-β1，反过来，TGF-β1又能促进FB增殖，促进FB合成胶原形成放大效应；气道增厚的程度、上皮下FB的数量与TGF-β1表达有平行关系。而FB是气道粘膜下的主要结构之一，其可产生胶原等胞外基质导致气道狭窄，气道炎症，致使疾病慢性化和永久化；因而阻断TGF-β1对FB增殖和胶原合成的机制，对于慢支、哮喘的治疗意义重大。

本发明通过吸烟诱发建立慢支和肺气肿动物模型的方法，观察本发明对支气管及肺组织病理形态学的影响。结果显示：慢支模型组气道周围可见大量淋巴细胞、中性粒细胞等慢性炎细胞浸润，支气管管腔增大，管壁大量纤维组织增生，增厚明显，部分上皮细胞坏死脱落，肺泡有不同程度的纤维化；TGF-β1表达显著增强。正常组大鼠气道粘膜完整，支气管管壁壁薄、管腔空，粘膜无炎症细胞浸润；上皮细胞和少量的间质细胞可见很弱的TGF-β1表达。经各治疗组治疗后，小剂量组气道可见少量淋巴细胞、中性粒细胞浸润，支气管粘膜上皮不完整，少量上皮细胞坏死脱落，支气管管壁增厚，纤维组织增生；TGF-β1减少。中剂量组少量纤维组织胞润，支气管粘膜上皮完整，支气管管腔无明显扩张，管壁无明显增厚；TGF-β1明显减少。尤以大剂量组与西药组疗效最佳，气道周围无明显炎症细胞浸润，气道粘膜无肿胀，气道腔无狭窄；与正常组相类似。提示本发明及地塞米松均有较好的抗纤维化作用，且本发明成剂量依赖性，剂量越大、疗效越好，从而抑制慢支气道重建的发生。

本发明和已有技术相对照，无论是在组成、功能治疗，还是在制备工艺方面具有明显的优势。已有技术在组成上药味众多，治疗功能单一，制备工艺简单、无法进行质量控制。本发明仅由两味中药淫羊藿、蛇床子或它们的提取物组成；治疗适应症较广，具有可靠的防治哮喘、慢支和慢性阻塞性肺疾病的作用；经本发明工艺制备提取后的组合物疗效明显强于传统水煎法及单味药提取物疗效(具体见实施例3)；制备工艺不仅具有创新性、操作方便简单、重复性好、稳定性强等优点，而且能够进行质量控制、适合工业化大生产的要求。

本发明着眼于中医的整体观念，立足于辨证论治，结合现代医学知识，是多途径，多环节的综合防治方案。它既针对哮喘、慢支反复发作时虚寒之体这一根本，又针对痰、瘀之邪实，深寓补虚不忘实，扶正不碍邪，治病必求于本的思想；还具有抗过敏反应、减轻气道慢性炎症、降低气道高反应性、抑制气道重建的功效，对哮喘发病过程中的初起致敏、慢性炎症、气道重建三个重要阶段都有明显的拮抗和改善作用，充分显示出整体调节的可靠疗效。本发明具有强于白三烯受体拮抗剂，同激素相接近、甚或强于激素的抗炎效果，却没有两者的毒副作用；提示在哮喘的长期防治过程中，本发明在巩固疗效、控制复发、减少激素用量、撤销激素甚或替代激素方面，作用显著，充分体现了中医药自身的独特优势。与其它有治疗功效的经方、验方相比，具有药精力宏、疗效肯定、成本低廉、服用方便、无毒副作用等优点。本发明组方严谨，既符合中医理论，又符合现代医学哮喘发病新认识，临床使用具有重复性和普遍适用意义。

附图说明：

以下图表和照片中的A、B、C、D、E、F分别代表各具体实施例的组别。

图1：本发明的制备工艺流程图

图2：实施例3中本发明对过敏性哮喘豚鼠模型呼吸困难潜伏期及跌倒潜伏期的影响

图3：实施例4中本发明对大鼠慢性哮喘模型气道阻力的影响

图4：实施例4中本发明对大鼠慢性哮喘模型肺顺应性的影响

图5：实施例5中本发明对大鼠慢性哮喘模型EOS百分比的影响

图6：实施例5中本发明对大鼠慢性哮喘模型HEOS百分比的影响

图7：实施例5中本发明对哮喘大鼠慢性模型气道组织病理学结果：A-F组均为照片，HE染色，10×20倍

图8：实施例6中本发明对大鼠慢性哮喘模型外周血白细胞GCR的影响

图9：实施例6中本发明对大鼠慢性哮喘模型肺组织GCR的影响

图10：实施例6中本发明对大鼠慢性哮喘模型血浆皮质酮的影响

图11：实施例7中本发明对小鼠慢性哮喘模型IL-4的影响

图12：实施例7中本发明对小鼠慢性哮喘模型IL-5的影响

图13：实施例7中本发明对小鼠慢性哮喘模型IFN-γ的影响

图14：实施例7中本发明对小鼠慢性哮喘模型IL-12的影响

图15：实施例8中本发明对大鼠慢性哮喘模型气道壁胶原染色图像分析

图16：实施例8中本发明大鼠慢性哮喘模型肺组织胶原染色结果：A-D组均为照片，胶原染色，10×40倍

图17：实施例8中本发明对大鼠慢性哮喘模型气道壁Fn图像分析

图18：实施例8中本发明大鼠慢性哮喘模型肺组织Fn免疫组化结果：A-D组均为照片，Fn免疫组化染色，10×10倍

图19：实施例9中本发明对慢支大鼠模型气道组织病理HE染色结果：A-F组均为照片，HE染色，10×10倍

图20：实施例9中本发明对慢支大鼠模型气道组织TGF-β1免疫组化染色结果：A-F组均为照片，TGF-β1免疫组化染色，10×20倍

具体实施方式：

实施例1：本发明中药物组合物的提取实例

淫羊藿和蛇床子经过适当粉碎后，按2∶1比例充分混合，总共1000g，用70％乙醇(10倍量，1.5h；8倍量，1h)回流提取2次；然后滤去药渣，在减压状态下浓缩，再离心除去沉淀；减压回收溶剂后，再加适量水，超声处理使其混悬，得样品液。样品液上(已经预处理完毕)大孔吸附树脂AB-8，树脂用量500g，以水冲洗不吸附的杂质，再用70％乙醇洗脱；收集液浓缩，经接喷雾干燥，得到由淫羊藿总黄酮和蛇床子总香豆素为主要活性成份的干粉34.29g，收率为3.43％。

实施例2：淫羊藿甙、淫羊藿总黄酮、蛇床子素、蛇床子总香豆素的含量测定

2.1.淫羊藿甙和蛇床子素均购自中国药品生物制品检定所，以两者为对照品进行纯化研究和含量测定。

2.2.淫羊藿甙、淫羊藿总黄酮、蛇床子素三种含量测定参照2000年版《中华人民共和国药典》一部中药材含量测定项下的规定，分别采用高效液相色谱、紫外-可见分光光度法、薄层扫描色谱法。在实施例1中，淫羊藿甙为18.42％，淫羊藿总黄酮为41.1％，蛇床子素为7.3％。

2.3.蛇床子总香豆素的含量测定参照文献【张新勇，向仁德，张根元.酸碱法提取蛇床子总香豆素的工艺研究.中成药1999；21(1)：7-8】的方法加以改进，具体采用紫外-可见分光光度法进行。精密称取干燥的提取物10mg，以95％乙醇超声热溶解10min，过滤，滤液定容至50ml，然后吸取2ml置10ml量瓶中，以95％乙醇稀释至刻度，在322nm波长处测定吸收度，计算含量，在实施例1中，蛇床子总香豆素为13.8％。

实施例3：本发明对豚鼠过敏性哮喘的影响

3.1材料与方法

3.1.1动物分组：hartley豚鼠60只，体重230±20g，随机分成A模型对照组，B地塞米松组，C淫羊藿总黄酮(由上海中医药大学中药分析化学室提供，含量62.1％，收率为2.35％。)组，D蛇床子总香豆素(由上海中医药大学中药分析化学室提供，含量57.4％，收率为1.84％。)组，E本发明淫羊藿、蛇床子组合物(由上海中医药大学中药分析化学室提供，淫羊藿与蛇床子的比例为2∶1，10倍量水煎煮，每次1小时，共2次，除去药渣后滤液浓缩、干燥成粉；其中淫羊藿总黄酮的含量为5.34％，蛇床子总香豆素的含量为1.51％，收率为11.2％。)组，F本发明淫羊藿、蛇床子提取组合物(均为采用本发明的制备工艺，从实施例1中获得的药物，以下各实施例相同；简称为本发明)组，共六组。每组10只。

3.1.2造模方法：将5％卵蛋白生理盐水0.4ml肌肉注射各组动物大腿外侧，同时腹腔注射用4％氢氧化铝凝胶0.2ml致敏动物。

3.1.3给药方法：致敏后第11天给药，共5天。其中A组灌胃生理盐水，B组予地塞米松1mg/kg/天灌胃，C组灌胃淫羊藿总黄酮0.4g/kg/天(相当于生药17.02g/kg/天)，D组灌胃蛇床子总香豆素(相当于生药21.74g/kg/天)，E组灌胃经传统水煎后本发明淫羊藿、蛇床子组合物5g/kg/天(相当于生药44.64g/kg/天)，F组灌胃本发明0.4g/kg/天(相当于生药11.66g/kg/天)。末次给药后4小时将动物置于4L的密闭钟罩内雾化吸入2％卵蛋白生理盐水30s，关机后，记录各组动物出现呼吸困难、直至抽搐跌倒的时间及动物死亡率。

表1.本发明对豚鼠过敏性哮喘的影响(x±s)  组别  例数  呼吸困难潜伏期(s)  跌倒潜伏期(s)    死亡率(％)   A     10        81±15          122±29           70   B     10        247±49         337±54           0   C     10        153±34         214±51           30   D     10        137±43         223±49           40   E     10        141±39         217±53           30   F     10        227±45         304±67           10

^*P_AB＜0.01，P_AC＜0.01，P_AD＜0.01，P_AE＜0.01，P_AF＜0.01，P_CF＜0.01，P_DF＜0.01，P_EF＜0.01，P_BF＞0.05

如表1显示：与模型组相比，四组中药均能有效抑制豚鼠过敏性哮喘的发作，对过敏性哮喘潜伏期均有显著延长作用(P＜0.01)，且明显降低动物死亡率。而生药量应用最低的本发明组不仅明显优于经传统水煎后本发明淫羊藿、蛇床子组合物组(P＜0.01)，充分表明了制备工艺的科学性；而且显著强于两种单味药提取物组(P＜0.01)，疗效更佳，与地塞米松组相似(P＞0.05)。提示本发明可明显提高过敏性哮喘阈值，降低因吸入过敏原导致的死亡率，对过敏性哮喘有良好的预防和保护作用，充分显示了本发明的重要意义。

实施例4：本发明对哮喘大鼠气道阻力和肺顺应性的影响

4.1材料与方法

4.1.1动物分组：SD大鼠40只，雄性，体重200±20g，随机分为A正常对照组，B哮喘模型组，C必可酮治疗组，D孟鲁司特治疗组，E本发明治疗组五组，每组各8只。

4.1.2造模方法：采用吕国平【吕国平，崔得健，郭英红，等.介绍一种建立大鼠哮喘模型的实验方法.中华结核和呼吸杂志1995；18(6)：377-378】方法加以改进建立大鼠慢性期模型，各组大鼠(B、C、D、E)腹腔分左右分别注射卵蛋白生理盐水溶液(每ml含1.0mg卵蛋白，200mg氢氧化铝凝胶)和加热灭活的百日咳杆菌(6×109个/ml)各1ml。第15天开始，将大鼠每次12只(每组各2只)共置于一35cm×25cm×15cm大小的容器内，用超声雾化仪雾化吸入1％卵蛋白气溶胶20分钟激发，雾化流量为3ml每分钟；连续激发哮喘一周。间隔一周后，再按前法连续激发一周。A组用等量生理盐水替代氢氧化铝凝胶、卵蛋白及灭活百日咳杆菌进行腹腔注射及雾化吸入，A组和B组均胃饲生理盐水。各组分别于第二个激发期最后一天处死。

4.1.3给药方法：除正常组外，余各组分别于间隔期的第一天给药直至处死。C组予以必可酮喷雾吸入50ug/只/天；D组灌胃孟鲁司特5mg/kg/天；E组灌胃本发明0.6g/kg/天。A组和B组均灌胃生理盐水。

4.1.4检测方法：大鼠乌拉坦腹腔注射麻醉后，将其固定，剪开颈部皮肤，分离周围组织，暴露气管，再分离食道，在气管、食道上分别剪一小口，依次插入导管。气管导管与呼吸速率描记仪相连，测定潮气量和气体流速。食管导管远端置于食管胸腔中下段，插入深度以获得最大负压为准，近端与压力换能器相连接，测量食道胸腔段内以替代胸腔内压。信号输入微机，通过计算机处理，将潮气量、气流速度和食道内压换算成气道阻力和肺顺应性值。待数据稳定后开始采样。

4.2结果

4.2.1本发明对哮喘大鼠气道阻力的影响

表2：本发明对哮喘大鼠气道阻力的影响(x±s)

  组别         例数              气道阻力(cmH2O/ml/s)

   A             8                  0.2417±0.1414

   B             8                  0.7014±0.2643

   C             8                  0.2742±0.1549

   D             8                  0.4615±0.2124

  E                8                    0.3014±0.4157

^*P_AB＜0.01，P_BE＜0.01，P_BC＜0.01，P_BD＜0.05，P_CD＜0.05，P_DE＜0.05

4.2.2本发明对哮喘大鼠肺顺应性的影响

表3：本发明对哮喘大鼠肺顺应性的影响(x±s)

组别             例数             肺顺应性(ml/cmH20)

  A                8                1.6235±0.4321

  B                8                0.6128±0.2782

  C                8                1.5049±0.4632

  D                8                1.0943±0.3644

  E                8                1.3324±0.4147

^*P_AB＜0.01，P_BC＜0.01，P_BE＜0.01，P_BD＜0.05，P_CD＜0.05，P_DE＜0.05

气道阻力和肺顺应性测定是反映呼吸机械功能的常用方法。气道阻力主要是指气体通过呼吸道遇到的阻力，肺顺应性反映肺的弹性是否正常。支气管哮喘是气道慢性变应性炎症性疾病，哮喘时由于支气管粘膜水肿、炎症细胞浸润、分泌物增多、平滑肌痉挛等而导致官腔狭窄；因此气道阻力明显增加，肺顺应性明显减低。

如表2、表3所示：与正常组相比，模型组气道阻力明显增高(P＜0.01)，肺顺应性明显降低(P＜0.01)，可能与该模型肺组织、支气管及血管旁间质炎细胞浸润，官腔分泌物增多等炎症变化相关。与模型组相比较，孟鲁司特组可较好地改善上述指标(P＜0.05)；本发明与必可酮组组效果相似，均可明显改善气道阻力，肺顺应性两项指标(P＜0.01)；效果强于孟鲁司特组(P＜0.05)。

实施例5：：本发明对哮喘大鼠慢性期模型EOS，HEOS及肺组织形态学的影响

5.1材料与方法

5.1.1动物分组：SD大鼠60只，雄性，体重200±20g，随机分为A正常对照组，B哮喘模型组，C本发明小剂量治疗组，D本发明大剂量治疗组，E西药治疗组，F中西药结合治疗组六组，每组各10只

5.1.2造模方法：同实施例4，其中F组处理方法同C、D、E组。

5.1.3给药方法：除正常组外，余各组分别于间隔期的第一天给药直至处死。C组灌胃本发明小剂量0.2g/kg/天；D组灌胃本发明大剂量0.6g/kg/天；E组予以必可酮喷雾吸入50ug/只/天；F组灌胃本发明0.2g/kg/天和必可酮喷雾吸入50ug/只/天。A组和B组均灌胃生理盐水。

5.1.4检测方法：

肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞、低密度嗜酸性粒细胞的测定：

取2％戊巴比妥钠作腹腔注射麻醉大鼠，经腹主动脉放血后，分离气管，并做气管切开插管固定，用30ml 4℃无菌Hank’s液分3次轻轻冲洗支气管和肺泡后回收上清液，分装，-30℃冻存，作为待测样品；部分沉淀物沉淀物作细胞涂片，干燥后行瑞氏染色。收集细胞作细胞总数浓度、EOS直接计数、细胞涂片作分类计数。

其余沉淀细胞离心后重悬于比重1.070的Percoll液1ml中，备用于高低密度嗜酸细胞分离。利用梯度比重Percoll液(1.100、1.090、1.085、1.080)各1ml离心分离EOS。定义比重≤1.085的EOS为HEOS。计算出HEOS的绝对计数和百分比。

大鼠气道组织形态学观察：取肺组织，10％甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察。

5.2结果

5.2.1本发明对哮喘大鼠BALF中EOS、HEO计数及百分比的影响

表4：本发明对哮喘大鼠BALF中EOS计数及百分比的影响(x±s)

               细胞浓度组别    例数

                           EOS计数(×10⁷/L)   EOS百分比(％)

              (×10⁸/L) A       10       3.55±0.21    1.78±0.26       4.26±0.98 B       10       5.89±1.21    16.32±1.19      32.74±4.68 C       10       5.61±0.91    11.07±1.31      18.74±3.42   D      10       4.22±0.57         4.23±0.74        10.69±2.34   E      10       3.94±0.51         3.74±0.62        9.49±2.87   F      10       3.64±0.32         1.89±0.33        5.51±1.32

^*P_AB＜0.01，P_BC＜0.05，P_BD＜0.01，P_BE＜0.01，P_BF＜0.01

表5：本发明对哮喘大鼠BALF中HEO计数及百分比的影响(x±s)

组别   例数      HEO计数(×10⁷/L)   HEO百分比(％)

 A      10       0.242±0.039       13.21±3.37

 B      10       8.07±0.423        49.21±8.47

 C      10       4.82±0.312        44.21±9.26

 D      10       1.03±0.204        24.09±7.79

 E      10       0.724±0.126       20.63±6.13

 F      10       0.321±0.072       17.24±5.19

^*P_AB＜0.01，P_BC＞0.05，P_BD＜0.01，P_BE＜0.01，P_BF＜0.01

如表4、5所示：哮喘模型组与正常组相比BALF中EOS和HEO计数明显增加(P＜0.01)。与模型组相比，本发明小剂量组EOS降低明显(P＜0.05)，HEO略有下降，但无统计学意义(P＞0.05)。而大剂量组、EOS和HEO数值明显下降(P＜0.01)，与西药对照组无明显差异(P＞0.05)；尤以中西医结合组疗效最为突出，接近正常水平。

5.2.2各组大鼠气道组织形态学观察结果：

由图7可知，正常组大鼠气道组织无异常的炎症改变。慢性哮喘模型组大鼠气道周围有大量的炎性细胞浸润，以嗜酸性粒细胞为主，同时伴有淋巴细胞及少量的中性粒细胞，肺泡扩张，细支气管壁出现裂隙，支气管壁不完整，有上皮细胞脱落，也可见支气管痉挛，管腔狭窄，腔内分泌物增加。本发明小剂量组较模型组炎症反应减轻；而大剂量组和西药对照组炎症反应轻微；中西药结合组气道组织基本上无炎症反应与正常组相类似。

实施例6：本发明对慢性哮喘大鼠外周血白细胞及肺组织GCR及血浆皮质酮的影响

6.1材料与方法：

6.1.1动物分组：同实施例5

6.1.2造模方法：同实施例5

6.1.3给药方法：同实施例5

6.1.4检测方法：

外周血白细胞GCR测定：采用放射性配基结合分析法。常规2％戊巴比妥纳麻醉后，剖腹，分离腹主动脉，用注射器(预先用10％EDTA湿润)抽取腹主动脉血9ml，立即注入合10％EDTA二钠0.2ml的抗凝管中，并同时加入工作浓度为1万u/ml的抑肽酶0.1ml，离心后，分离出血浆与细胞层，吸取血浆分装作待测样品。沉淀部分加3％Dextran T500，待细胞自然沉降，沉淀为红细胞。吸收富含白细胞的上清液，离心、用Hank’s液洗。得到为较纯净的白细胞。用Hank’s液(pH为7.4)调细胞浓度为1×10⁷/ml。每个标本分为二管：A管为总结合管，B管为非特异性结合管；A、B二管各为1ml细胞悬液。将每个标本A、B二管均加³H-Dex(20ul)。将B管再加2000倍非标Dex(20ul)。孵育、离心、混匀、冷却后，放入液闪瓶，测样品CPM值。根据CPM值，换算为每个细胞结合位点，进行统计学比较。

肺组织GCR测定(方法同上)：取肺组织3g用冰冷的生理盐水冲洗后，放入20ml的Tris缓冲液中。以细胞分散器粉碎，冰浴匀浆入离心管，冷冻离心后取上清液，即得胞浆液。总结合试管A中加入³H-Dex 50ul和胞液300ul。平行非特异管B中除上述两液外另加25ul非标记Dex。离心，取上清液0.4ml入液闪瓶内，加闪烁液，计数测放射性。由总结合减去非特异性结合即是特异性结合，用单点法求RT值。

血浆皮质酮的测定：放射免疫分析法。应用¹²⁵I-皮质酮放免试剂盒，按其说明的测定方法，经放射免疫分析仪测定待测标本放射性计数，并经计算机处理，将结果打印出来。

6.2结果：    

6.2.1.各组大鼠外周血白细胞及肺组织糖皮质激素受体结合位点

表6：本发明对哮喘大鼠外周血白细胞GCR特异性结合位点的影响(x±s)

  组别             例数          GCR结合位点(位点/细胞)

   A                10                 4327±879

   B                10                 2543±623

   C                10                 3214±624

   D                10                 4545±921

   E                10                 2216±574

   F                10                 2847±621

^*P_AB＜0.01，P_AE＜0.01，P_AF＜0.01，P_BE＞0.05，P_BF＞0.05，P_BC＜0.05，P_BD＜0.01，P_AD＞0.05

如表6所示，哮喘模型组外周血白细胞GCR结合位点明显低于正常组(P＜0.01)。与模型组相比，西药组结合位点轻度下降(P＞0.05)；中西药结合组轻度升高(P＞0.05)，但二者与正常组相比均有显著下降(P＜0.01)。本发明大、小剂量组的结合位点均明显提升(分别为P＜0.01和P＜0.05)。其中中药大剂量组的结合位点高于正常组，但无统计学意义(P＞0.05)。

表7：本发明对哮喘大鼠肺组织糖皮质激素受体RT值影响(x±s)

  组别           例数        GCR的RT值(fmol/mg蛋白)

    A             10              67.24±22.31

    B             10              54.23±21.07

    C             10              66.31±19.44

    D             10              85.04±27.43

    E             10              51.17±17.68

    F             10              58.71±21.03

^*P_AB＜0.05，P_AE＜0.05，P_AF＜0.05，P_BE＞0.05，P_BF＞0.05，P_BC＜0.05，P_BD＜0.01，P_AD＜0.01

如表7所示，哮喘模型组肺组织GCR的RT值明显低于正常组(P＜0.05)。西药组及中西药结合组的GCR同模型组相接近，比正常组减少明显，具有统计学差异(P＜0.05)。本发明大、小剂量组的RT值均明显升高(分别为P＜0.01和P＜0.05)。其中本发明大剂量组的RT值明显高于正常组(P＜0.01)。

6.2.2本发明对哮喘大鼠血浆皮质酮含量的影响

表8：本发明对哮喘大鼠血浆皮质酮含量的影响(x±s)

  组别           例数            血浆皮质酮含量(ng/ml)

   A              10                   247±57.2

   B              10                   123±42.2

   C              10                   198±49.6

   D              10                   354±84.7

   E              10                   144±39.7

   F              10                   167±44.8

^*P_AB＜0.01，P_BE＞0.05，P_BF＞0.05，P_BC＜0.05，P_BD＜0.01，P_AD＜0.01

如表8所示，哮喘模型组血浆皮质酮含量明显低于正常组(P＜0.01)。与模型组相比，西药组与中西药结合组皮质酮含量轻度上升，但无统计学意义(P＞0.05)；本发明小剂量组的皮质酮含量升高明显(P＜0.05)。本发明大剂量组的皮质酮含量明显高于正常组(P＜0.01)。

实施例7：本发明对小鼠慢性哮喘模型TH细胞因子的影响

7.1材料与方法

7.1.1动物分组：C57BL/6小鼠50只，雄性，体重20±2g，随机分为5组，A正常对照组、B哮喘模型组、C地塞米松治疗组，D孟鲁司特治疗组，E本发明治疗组，每组10只。

7.1.2造模方法：参照文献【Kumm F Asthma：immunopathology andimmunotherapy.New York：Springer-verlag Wien，1993：1-54和Anderson GP，Coyie AJ.TH₂ and‘TH₂-like’cells in allergy and asthma：pharmacologicalperspectives.Trends Phanm Sci，1994；15(9)：324-332】的方法加以改进，建立小鼠慢性哮喘模型：除正常对照组外，各组小鼠第1天腹腔注射卵蛋白生理盐水溶液(1mg的卵蛋白吸附于2mg氢氧化铝)0.1ml致敏。在致敏后第15～21天，每天将小鼠共置于一35cm×25cm×15cm大小的容器内，用超声雾化仪雾化通入1％卵蛋白气溶胶激发30分钟/天，雾化流量为3ml/分钟，连续激发哮喘一周。间隔一周后，再按前法连续激发一周。A组用等量生理盐水替代氢氧化铝凝胶、卵蛋白溶液进行腹腔注射及雾化吸入，A组和B组均胃饲生理盐水。各组分别于第二个激发期最后一天处死。

7.1.3给药方法：除正常组外，余各组分别于间隔期的第一天给药直至处死。C组予以地塞米松2mg/Kg/天；D组灌胃孟鲁司特10mg/kg/天；E组灌胃本发明1g/kg/天。A组和B组均灌胃生理盐水。

7.1.4检测方法：将取血后的小鼠固定于手术板上，在第二、三软骨环间剪一小口，将尖端磨平的7号针头进针0.5～1cm，以“0”号手术线结扎固定，用一次性1ml注射器(去针头)，每次抽Hank’s液0.5ml，缓慢注入小鼠支气管肺中，将回收的灌洗液注入冷冻管中，共进行3次灌洗，合在一起，约1.5ml，离心200g×5分钟，取上清液分装保存于-30℃低温冰箱待测。分别进行小鼠BALF中IL-4、IL-5、IFN-γ、IL-12测定(用小鼠检测试剂盒)

7.2.结果

各组小鼠BALF中IL-4，IL-5，IFN-γ，IL-12检测结果

表9：本发明对哮喘小鼠BALF中IL-4水平的影响(x±s)

  组别           例数          BALF中IL-4(pg/ml)

   A              10              14.23±2.04

   B              10              54.17±10.44

   C              10              17.23±3.33

   D              10              34.12±6.41

   E              10              24.42±3.87

^*P_AB＜0.01，P_BC＜0.01，P_BD＜0.05，P_BE＜0.01，P_CD＜0.01，P_DE＜0.05

表10：本发明对哮喘小鼠BALF中IL-5水平的影响(x±s)

组别              例数                 BALF中IL-5(pg/ml)

  A                10                     24.36±4.03

  B                10                     91.43±16.38

  C                10                     28.43±4.73

  D                10                     58.44±11.43

  E                10                     33.47±6.15

^*P_AB＜0.01，P_BC＜0.01，P_BD＜0.05，P_BE＜0.01，P_CD＜0.01，P_DE＜0.05

表11：本发明对哮喘小鼠BALF中IFN-γ水平的影响(x±s)

  组别            例数      BALF中IFN-γ(pg/ml)

   A               10          129.17±40.12

   B               10          154.67±37.16

   C               10          536.71±117.38

   D               10          318.24±67.42

   E               10          587.11±109.77

^*P_AB＞0.05，P_BC＜0.01，P_BD＜0.05，P_BE＜0.01，P_CD＜0.05，P_DE＜0.01

表12：本发明对哮喘小鼠BALF中IL-12水平的影响(x±s)

  组别        例数          BALF中IL-12(pg/ml)

   A           10             290.74±67.76

   B           10             345.55±89.91

   C           10             417.55±107.78

   D           10             385.67±124.44

   E           10             673.76±154.22

^*P_AB＞0.05，P_BC＜0.05，P_BD＞0.05，P_BE＜0.01，P_CE＜0.01，P_DE＜0.01

如表9、10、11、12所示：在本发明中，与哮喘模型组相比，孟鲁司特组对IL-4、IL-5、IFN-γ水平有改善作用(P＜0.05)，地塞米松组BALF中IL-4、IL-5含量明显降低(P＜0.01)，IFN-γ水平明显提高(P＜0.01)，IL-12水平轻度提高(P＜0.05)；明显强于孟鲁司特组；然而两者对IL-12的改善作用均明显低于本发明组。应用本发明治疗后，BALF中IL-4、IL-5含量明显降低(P＜0.01)，IFN-γ、IL-12水平明显提高(P＜0.01)，疗效最为理想。

实施例8：本发明对大鼠慢性哮喘模型气道重建的影响

8.1材料与方法

8.1.1动物分组：SD大鼠，雄性，体重200±20g，共40只，随机分为A正常对照组，B哮喘模型组，C地塞米松，D本发明组四组，每组各10只

8.1.2给药方法：

8.1.3.模型建造：采用Palmans及Salmon【Palmans E，John CK，Romain AP.Prolonged allergen exposure induces structural airway changes sensitized rats.Am J Respir Crit Care Med 2000；161：627-635和Salmon M，Walsh DA，Koto H，et al.Repeated allergen exposure of sensitized Brown-morway rats inducesairway cell DNA synthesis and remodeling.Eur Respir J 1999；14：633-641】的方法加以改进：第一天B、C、D组大鼠腹腔注射1％卵蛋白生理盐水溶液1ml，右腿肌肉注射新鲜配制的10％氢氧化铝凝胶200mg。第8天重复腹腔注射1％卵蛋白1ml，右腿肌肉注射新鲜配制的氢氧化铝凝胶200mg。第15天起，将大鼠每次8只置于一35cm×25cm×15cm大小封闭容器内，用超声雾化仪器吸入1％卵蛋白气溶胶，持续30分钟，雾化流量为3ml/分钟，隔天一次。第25天起，吸入2％卵蛋白气溶胶，步骤同前。第35天吸入3％卵蛋白气溶胶，步骤同前。第45天吸入最后一次3％气溶胶。同时禁食。24小时后处死各组大鼠。A组用等量生理盐水代替氢氧化铝凝胶、卵蛋白进行腹腔注射及雾化吸入。

8.1.4给药方法：除正常组外，余各组分别于17天给药直至处死。C组予地塞米松5mg/kg/天肌肉注射；D组灌胃本发明0.8g/kg/天。A组和B组均灌胃生理盐水。

8.1.5检测方法：胶原染色步骤参照文献【龚志锦，詹茸洲.病理组织制片和染色技术上海：上海科学技术出版社.1994.51-70.】的方法改进，图像分析气道壁胶原含量。Fn免疫组化染色步骤用Envision System二步法，根据基因公司DAKO 1999年试剂目录提供的方法操作。图像分析气道壁Fn含量(吸光度A值×染色面积/气道总面积)。

8.2结果

8.2.1本发明中大鼠慢性哮喘模型气道壁胶原染色图像分析

  表13：本发明中气道壁胶原染色图像分析(x±s)

  组别         例数            胶原积分A值×面积

   A            10                 1286±509

   B            10                 2928±911 

   C            10                 1321±716

   D            10                 1382±574

^*P_AB＜0.05，P_BC＜0.05，P_BD＜0.05，P_CD＞0.05

8.2.2本发明中大鼠慢性哮喘模型肺组织胶原染色结果：

由表13、图16可知，哮喘模型组与正常组相比，支气管壁明显增厚，粘膜明显肿胀，胶原染色着色重，染色面积显著增大；本发明组与地塞米松组气道壁薄，腔空，粘膜完整，胶原染色着色浅，面积小，与正常组无差别。

8.2.3本发明中大鼠慢性哮喘模型气道壁Fn图像分析

  表14：本发明中气道壁纤维连接蛋白(Fn)图像分析(x±s)

   组别         例数            Fn染色面积/气道面积

    A            10                0.0887±0.0431

    B            10                0.2561±0.0869

    C            10                0.0978±0.0561

    D            10                0.0907±0.0614

^*P_AB＜0.01，P_BC＜0.01，P_BD＜0.01，P_CD＞0.05

8.2.4本发明大鼠慢性哮喘模型肺组织Fn免疫组化结果：

由表14、图18可知，正常组气道壁Fn很少，模型组气道壁中Fn含量明显增多，本发明组与地塞米松组气道壁Fn均无明显增加，同正常组相似。

实施例9：本发明对慢支大鼠模型支气管和肺组织病理形态学的影响

9.1材料与方法

9.1.1动物分组：SD大鼠60只，雄性，体重200±20g，随机分为A正常对照组，B慢支模型组，C本发明大剂量治疗组，D本发明中剂量治疗组，E本发明小剂量治疗组，F地塞米松治疗组六组，每组各10只。

9.1.2造模方法：大鼠慢支模型参考文献【施新猷主编.医学动物实验方法.北京：人民卫生出版社，1986.223-225】方法加以改进。将B、C、D、E、F组动物置于自制的吸烟箱中，每次用刨花、锯末、烟叶各50g，点燃熏烟，每次30分钟，每日2次，每周5天，连续2个月。正常组则置于无烟实验环境中饲养。

9.1.3给药方法：除A、B组外，余各组分别于造模结束后的第二天给药，共治疗21天。C组灌胃本发明大剂量0.8g/kg/天；D组灌胃本发明中剂量0.4g/kg/天；E组灌胃本发明小剂量0.2g/kg/天；F组灌胃地塞米松1mg/kg/天。A组和B组均灌胃生理盐水。

9.1.4.检测方法：治疗灌药3周结束后第2天，断头处死后，迅速剖取肺脏。右肺用10％甲醛固定，常规石蜡包埋，切片，用HE染色法，光镜下观察支气管与肺组织的形态变化；左肺组织进行TGF-β1免疫组化SABC染色，染色结果采用IMS彩色图像分析系统处理，以官腔阳性染色面积与相应整官腔面积之比及染色强度作为分析参数；每例样本阳性结果为细胞浆/细胞膜染成棕黄色或黄色。

9.2.结果

9.2.1大鼠慢支模型支气管与肺组织HE染色结果：

由图19可知，慢支模型组气道周围可见大量淋巴细胞、中性粒细胞等慢性炎细胞浸润，支气管管腔增大，管壁大量纤维组织增生，增厚明显，部分上皮细胞坏死脱落，肺泡有不同程度的纤维化。正常组大鼠气道粘膜完整，支气管管壁壁薄、腔空，粘膜无炎症细胞浸润。经各治疗组治疗后，小剂量组气道可见少量淋巴细胞、中性粒细胞浸润，支气管粘膜上皮不完整，少量上皮细胞坏死脱落，支气管管壁增厚，纤维组织增生。中剂量组少量纤维组织浸润，支气管粘膜上皮完整，支气管管腔无明显扩张，管壁无明显增厚。大剂量组与地塞米松组气道周围无明显炎症细胞浸润，气道粘膜无肿胀，气道腔无狭窄；与正常组相类似。

9.2.2.本发明对大鼠慢支模型肺组织TGF-β1表达的影响

表15各组大鼠肺组织TGF-β1表达

组别   例数  气管上皮细胞  气管平滑肌细胞  血管平滑肌细胞  肺泡巨噬细胞

  A    10         +               +               +             -

  B    10         +++             +++             +++           ++

  C    10         +               +               +/-           -

  D    10         ++              +               +             +

  E    10         ++              ++              ++            +

  F    10         +               +               +/-           -

9.2.3大鼠慢支模型TGF-β1免疫组化染色结果：

由表15、图20可知，正常组大鼠粘膜上皮细胞、少量的间质细胞可见很弱的TGF-β1表达。慢支模型组肺泡巨噬细胞和少量的间质细胞明显有阳性表达，粘膜上皮细胞及浸润的炎症细胞表达显著增强，支气管周围、血管周围结缔组织表达显著增强。小剂量组可见较强阳性表达。中剂量组细支气管周围有少量炎性细胞阳性染色，粘膜层有较少染色。中药大剂量组、西药组表达与正常组接近。