蜡球致孔剂与热致相分离结合制备聚合物多孔支架的方法

摘要

本发明涉及腊球致孔剂与热致相分离相结合制备组织工程用聚合物多孔支架的方法。首先利用悬浮分散法制备石蜡微球，然后将石蜡微球与聚合物溶液混合，降低温度，使聚合物溶液发生相分离，采用冷冻干燥法去除溶剂，再采用沸腾正己烷洗涤或抽提除去石蜡微球，最终得到聚合物多孔支架。该方法集中了致孔剂法和热致相分离法制备聚合物多孔支架的优点，而且操作过程简单。所得聚合物多孔支架的大孔尺寸由致孔剂石蜡微球的尺寸决定，在大孔间的孔壁中还分布着热致相分离所产生的小孔。因此，本发明制备的聚合物多孔支架具有孔径可控、连通性好和孔隙率高的优点。

说明书

                         技术领域

本发明涉及组织工程用聚合物多孔支架的制备方法，具体说涉及腊球致孔剂与热致相分离相结合制备组织工程用聚合物多孔支架的方法。

                         背景技术

人体组织的缺损或功能衰竭为常见的疾病，严重影响了病人的身体健康和生存质量。对这些疾病的现代治疗方法之一是组织工程技术。组织工程的主要思路为将具有一定相关功能的活细胞接种于细胞外基质替代物上，这种替代物可为细胞提供一个空间结构，使细胞在上面生长。体外培养一定时期后形成细胞与替代物的复合物，再将所得复合物移植到体内受损组织处，以修复受损组织。组织工程中所用的替代物材料一般为可生物降解的人工合成聚合物支架材料或天然的生物大分子支架材料。

由于具有降解速度可控、力学性能优良和来源方便等优点，可生物降解的聚合物多孔支架材料在组织工程中得到了广泛应用。组织工程对于聚合物多孔支架微观结构的要求是：具有适当的孔径、较高的孔隙率和良好的孔连通性，以便于细胞的进入、营养物质的渗入和废物的排出。

目前组织工程用聚合物多孔支架的制备有多种方法，如非编织状纤维成形法、致孔剂法、相分离法、发泡法和三维印刷法等。其中致孔剂法和热致相分离法均具有操作方便，不需要特殊设备的优点。致孔剂法的原理为：将致孔剂与聚合物溶液混合，去除溶剂后再将致孔剂滤出形成多孔支架材料。热致相分离法的原理为：将聚合物溶液降温至其分相点以下，使聚合物溶液分为富含聚合物和富含溶剂的两相，然后淬冷，将相区的形态固定，最后将溶剂相去除，得到多孔支架材料。对于致孔剂法，其优点是多孔支架的孔径可以通过控制致孔剂的粒径来控制。然而单纯利用致孔剂法，为了得到具有良好孔连通性的支架，存在着制备过程冗长的缺点，且孔隙率较低。对于热致相分离法，其优点是所获得的多孔支架具有良好的孔连通性，然而具有孔径不易精确控制，尤其是较难获得大尺寸孔径的缺点。

                         发明内容

本发明目的是为了得到具有合适孔径、高度孔隙率和良好孔连通性的组织工程用聚合物多孔支架，提出了蜡球致孔剂法和热致相分离法相结合制备组织工程用聚合物多孔支架的方法。

本发明的方法具体包括以下步骤：

(1)采用悬浮分散法制备粒径为50μm～700μm的石蜡微球；

(2)将得到的石蜡微球与浓度为0.01-0.5g/mL的聚合物溶液在15～55℃温度下，按0.5～3g石蜡微球/mL聚合物溶液的比例混合均匀，然后降低温度至-100～10℃，使聚合物溶液发生相分离；

(3)冷冻干燥，除去聚合物溶液中的溶剂，得到石蜡微球与聚合物的混合物；

(4)将上述石蜡微球与聚合物的混合物置于沸腾的正己烷中洗涤多次，或者利用索式抽提器将石蜡微球抽提除去；

(5)真空干燥，除去正己烷，得到聚合物多孔支架。

本发明中，悬浮法制备石蜡微球可以采用：将固体石蜡和浓度为1～100mg/mL的分散剂水溶液混合，固体石蜡/分散剂水溶液比为1～100g/100mL，加热至60℃～100℃，使石蜡变为液态，搅拌，将液态的石蜡分散为小液滴，待石蜡悬浮液的状态稳定后，快速倒入-5℃～10℃的冷水中淬冷，得到固体的石蜡微球。

上述悬浮法制备石蜡微球的分散剂包括明胶、聚乙烯醇、聚乙二醇、十二烷基磺酸钠等常用的表面活性剂。根据所用表面活性剂溶液的浓度及石蜡用量的不同，所制备的蜡球粒径有不同的分布。采用国产标准筛对石蜡微球进行分级，将石蜡微球按粒径大小分为150μm以下、150～280μm、280～450μm和450～700μm等不同级份。通过控制石蜡微球的粒径、聚合物溶液的浓度以及石蜡微球的用量可得到不同孔径和孔隙率的聚合物多孔支架。

本发明中，所说的聚合物主要是但不限于聚乳酸(PLA)，包括聚乙醇酸(PGA)、乳酸—乙醇酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚氨酯(PU)、聚碳酸酯、聚酸酐、聚膦腈、聚羟基丁酸酯及其共聚物、胶原、壳聚糖等及上述聚合物的混合物和它们之间的共聚物，还包括上述聚合物的不同空间结构的产物，如左旋聚乳酸(PLLA)、右旋聚乳酸(PDLA)和内消旋聚乳酸(PD，LLA)。

本发明步骤(2)中，分相温度根据不同的聚合物溶液而不同。对于聚-L-乳酸的二氧六环溶液，分相温度在10～-20℃之间。

本发明通过将蜡球法与热致相分离法相结合，集中了两种方法的优点，得到了具有合适孔径、高度孔隙率和良好孔连通性的组织工程用多孔聚合物支架材料。本发明所制备的聚合物多孔支架的一个显著特征是大孔尺寸由致孔剂石蜡微球的尺寸决定，在大孔间的孔壁中还分布着热致相分离所产生的小孔，因此孔隙率高。本发明具有操作方便、孔径可控、孔连通性好、孔隙率高的优点。

                         附图说明

图1为利用蜡球致孔剂法与热致相分离法相结合制备的PLLA多孔支架的扫描电镜照片。蜡球粒径150～450μm，PLLA浓度0.06g/mL，蜡球用量1.3g/mL聚合物溶液。

图2a为直径小于150μm的石蜡微球的光学显微镜照片。

图2b为直径为150～280μm的石蜡微球的光学显微镜照片。

图2c为直径为280～450μm的石蜡微球的光学显微镜照片。

图3a为利用直径为150～280μm的石蜡微球所制备的PLLA多孔支架的激光共聚焦显微镜照片。PLLA浓度0.05g/mL，蜡球用量1.6g/mL聚合物溶液。

图3b为利用直径为280～450μm的石蜡微球所制备的PLLA多孔支架的激光共聚焦显微镜照片。PLLA浓度0.05g/mL，蜡球用量1.6g/mL聚合物溶液。

图3c为利用直径为450～700μm的石蜡微球所制备的PLLA多孔支架的激光共聚焦显微镜照片。PLLA浓度0.05g/mL，蜡球用量1.6g/mL聚合物溶液。

图4a为PLLA浓度0.04g/mL，蜡球用量1.6g/mL聚合物溶液的条件下所制备的PLLA多孔支架的扫描电镜照片。蜡球粒径：150～450m。

图4b为PLLA浓度0.05g/mL，蜡球用量1.6g/mL聚合物溶液的条件下所制备的PLLA多孔支架的扫描电镜照片。蜡球粒径：150～450μm。

图4c为PLLA浓度0.06g/mL，蜡球用量1.3g/mL聚合物溶液的条件下所制备的PLLA多孔支架的扫描电镜照片。微球粒径：150～450μm。

                       具体实施方式

通过下述实施例可更好地理解本发明，但这些实例并不用来限制本发明。

实施例1：聚-L-乳酸(PLLA)多孔支架的制备

采用悬浮法制备蜡球微粒。在一锥形瓶中，加入40g固体石蜡和200mL浓度为20mg/mL的明胶水溶液，加热至80℃，石蜡变为液态。利用电磁搅拌器进行搅拌，搅拌速度为200rpm，将液态的石蜡分散为小液滴。待石蜡悬浮液的状态稳定后，迅速倒入0℃的冰水中进行淬冷，得到固体的石蜡微球。采用国产标准筛对石蜡微球进行分级，获得粒径为150～450μm的石蜡微球。

在一不锈钢模具中，将上述石蜡微球与浓度为0.06g/mL的PLLA/二氧六环溶液均匀混合，石蜡微球的用量为1.3g每毫升PLLA溶液。将上述混合物在-25℃下冷冻，使PLLA溶液发生相分离。同时由于二氧六环的熔点为10℃，混合物发生固化，变为固体。将固体混合物从模具中取出，冷冻干燥6小时去除二氧六环，得到石蜡微球和PLLA的混合物。然后利用沸腾的正己烷清洗，将石蜡微球抽提除去。反重复上述过程，以彻底除去石蜡。真空干燥以除去正己烷，最终得到PLLA多孔支架，如图1所示。由图可看出，多孔支架中既含有因石蜡微球被去除而产生的直径为150μm以上的大孔，在孔壁的内部也含有因热致相分离过程而产生的直径为20～30μm的微孔。所得到的多孔支架具有良好的孔连通性。

实施例2：聚-L-乳酸(PLLA)多孔支架孔径的控制

按照应用实例1中的方法制备石蜡微球，并利用国产标准筛将石蜡微球按粒径大小分为150μm以下、150～280μm和280～450μm不同级份，如图2a、图2b和图2c所示。

分别利用上述不同粒径的石蜡微球，按照实施例1中的方法制备PLLA多孔支架，其中PLLA溶液浓度为0.05g/mL，石蜡微球的用量为1.6g每毫升PLLA溶液。所得到的PLLA多孔支架的激光共聚焦显微镜照片分别如图3a、图3b和图3c所示。由图3可见多孔支架的孔径可通过控制石蜡微球的粒径方便地进行控制。

实施例3：聚-L-乳酸(PLLA)多孔支架的孔隙率和表观密度的控制

分别采用不同粒径的石蜡微球、不同的PLLA溶液浓度和不同的石蜡微球用量，并按照实例1的方法制备PLLA多孔支架。表1总结了各种不同条件下所制备的PLLA多孔支架的孔隙率和表观密度。由表1可看出，多孔支架的孔隙率和表观密度与石蜡微球的粒径无关，而受PLLA溶液浓度和蜡球用量的影响较大。较高的PLLA溶液浓度下，所得多孔支架的表观密度较大，孔隙率较低；石蜡微球用量越大，所得支架的表观密度越小，孔隙率越高。图4a、图4b和图4c为不同浓度的PLLA溶液和不同的蜡球用量所制备的PLLA多孔支架的扫描电镜照片。由图4可看出当采用较高的PLLA浓度和较低的蜡球用量时所得到的PLLA多孔支架较致密，而当采用较低的PLLA浓度和较高的蜡球用量时所得到的PLLA多孔支架较疏松。

表1为不同蜡球粒径、PLLA浓度和蜡球用量下所制备的PLLA多孔支架的表观密度和孔隙率表1

  蜡球粒径，    μm  PLLA浓度，    g/ml  蜡球用量，    g/ml  表观密度，    g/cm³  孔隙率，    ％  150～450    0.05    1.6    0.023    98.2  150～450    0.06    1.6    0.031    97.6  150～450    0.07    1.6    0.038    97.0  150～280    0.05    1.3    0.035    97.2  280～450    0.05    1.3    0.032    97.5  450～710    0.05    1.3    0.033    97.4  150～280    0.05    1.6    0.021    98.3  280～450    0.05    1.6    0.022    98.3  450～710    0.05    1.6    0.022    98.3  150～280    0.05    2.0    0.017    98.7  280～450    0.05    2.0    0.019    98.5  450～710    0.05    2.0    0.017    98.7