预防和治疗与血小板紊乱有关的出血性疾病的药用组合物

摘要

本发明涉及用于预防和治疗与血小板紊乱有关的出血性疾病的含有有效止血剂量的凝血因子VIII和/或冯维勒布兰德因子的药用组合物，该出血性疾病不是由凝血因子缺损或冯维勒布兰德因子缺损引起而是由循环血中血小板计数的降低或血小板功能异常引起的；以及治疗出血性疾病的方法，包括给患与血小板紊乱有关的出血性疾病的病人给予有效止血剂量的凝血因子VIII和/或冯维勒布兰德因子。

说明书

本发明的技术领域

本发明涉及用于治疗由血小板紊乱诸如血小板减少症和血小板功能障碍引起的出血性疾病的药物。更具体地说，本发明涉及用于治疗和预防由血小板紊乱引起的出血性疾病的药物，该药物含有作为活性成分的因子VIII(下文也称为“FVIII”)和/或冯维勒布兰德氏因子(下文也称为“vWF”)。

本发明背景

由于血管、血小板和凝血因子的功能正常才能形成止血。这些因素中的任何一种因素的功能减弱均可引起出血，而功能的极度减弱则引起过度失血，失血达到一定程度时甚至为危及生命。

存在于血液中的血小板在130,000到360,000/μl之间，能迅速聚集于血管受伤部位的周围，在止血过程中发挥着重要作用。当由于某些原因，血小板的止血功能不能正常发挥作用或血循环中的血小板数量减少(少于50,000/μl)时，可由此引发出血。在一些案例中(少于10,000/μl)，甚至可引起自发性出血并且由于大量出血而可能危及生命。近几年来不断增多的由抗癌的化疗导致的血小板减少症是一种严重的副作用。如何控制由血小板减少症引起的出血性疾病在癌症治疗中是一个重要的问题(J.Nishimura，Progress of Medicine 184：448-452，1998)。

根据发病机理，原则上将血小板减少症分成四类。第一类是由骨髓产生的血小板减少引起的，包括再生障碍性贫血、给予抗癌药后骨髓造血机能的抑制、以及正常造血器官的变更如急性白血病。第二类是由于血小板的增加被抗血小板抗体破坏，包括特发性血小板减少性紫癫(ITP)。这一类型也包括由药物性变态反应引起的血小板减少症和由怀孕时血小板血型不适配引起的新生儿血小板减少症。第三类是由血小板加速消耗而引起的，包括播散性血管内凝血(DIC)和血栓形成性血小板减少性紫癫(TTP)，其中大量的血小板在外周血栓形成处被消耗而引起血小板减少症。最后，第四类是由于血小板的异常分布引起的。在正常的成人中，骨髓新造的血小板向外周释放，但其中约有1/3被脾脏截留而不能进入外周循环。然而在肝硬化或脾肿大时，绝大多数新生的血小板均被脾脏截留。所以，尽管血小板在骨髓中产生，但不能充分地向外周循环提供血小板，由此引起血小板减少症(Y.Kurata，Sogo Rinsho 47：2742-2748，1998)。至于血小板功能异常，由血小板膜糖蛋白(GP)IIb/IIIa缺乏引起的血小板减少症和由GPIb缺乏引起的Bernard-Soulier’s综合征都是众所周知的。

由血小板紊乱引起的止血障碍导致出血增加，如同在小鼠鼻部区域和胃肠道的粘膜出血以及从伤口、溃疡或注射部位的渗血所示。血小板减少症中的出血是广泛的，因此在外科手术中和术后血小板减少症都是一个严重的问题。当血小板的数量降低到50,000/μl或以下时，甚至在只有数分钟的外科手术诸如拔牙术中，都有可能发生严重的出血。血小板数量更进一步降低到10,000/μl或以下，则可能在没有特殊情况诸如外科手术或外伤时也引起自发性出血，其中颅内出血经常可能是致命的。

近期，对于由血小板减少症或血小板功能异常引起的出血，输注血小板浓缩物是唯一的临床有效的治疗。实际上，给予血小板浓缩物基本上是使血小板数量在外科手术或活动性出血时能够达到50,000/μl或更多，或者在其它病例中使血小板能够达到20,000/μl或更多(Ministry of Health and Welfare，Pharmaceutical Affairs Bureau；theJapanese Red Cross Society：As to proper use of platelet preparations(正确应用血小板制剂))。

然而，当频繁给予大量血小板浓缩物时，使用的是源自多个供血者的血小板。因此，许多反复接受血小板输注的患者将产生针对被污染的白细胞上的HLA抗原、血小板或血小板的膜蛋白上的血小板血型抗原(blood-type antigens)的同种抗体，由于输注作用的减弱，而变得不能接受血小板输注。而且，不能完全否认血小板浓缩物有被引起输注后移植物抗宿主疾病(GVHD)的淋巴细胞污染或引起肝炎或艾滋病(AIDS)的病毒感染的可能性。此外，由于血小板浓缩物使用的有效期短至3到5天，有可能发生供货不足。因此，急需一种安全、易于处理止血并能够贮存的药物来代替血小板输注这种目前在用于由血小板减少症或血小板功能障碍引起的出血性疾病的唯一的治疗方法。

本发明描述

在这种情况下，本发明的发明者进行了研究，以便开发用于治疗和预防由血小板紊乱引起的出血性疾病的药物。结果，令人吃惊地发现，当将纯化的FVIII和/或vWF给予血小板减少症的动物活体时(迄今为止还从未尝试过该方法)，可以改善其低下的止血能力。考虑到这些因素，本发明的发明者期望可以将FVIII和/或vWF用作一种治疗和预防由血小板减少症或血小板功能障碍引起的出血的药物，因此完成了本发明。

插图简述

图1是表示含有因子VIII的本发明的药用组合物在血小板减少症动物中的效果的直方图。

图2是表示含有冯维勒布兰德因子的本发明的药用组合物在血小板减少症动物中的效果的直方图。

实现本发明的最佳方式

FVIII首先在肝脏合成并以0.1μg/ml的浓度存在于血浆中，在凝血因子中其水平是最低的。在血循环中，FVIII与vWF形成复合物以保护蛋白免遭蛋白酶如激活的蛋白C的水解作用(Fay，P.J.等，J.Biol.Chem.266：2172-2176，1991)。已知FVIII的先天性缺乏如血友病A，由于凝血障碍出现严重的出血症状。源自血液或通过基因重组技术制备的FVIII浓缩制剂已被用于血友病A患者的止血处理。

在凝血途径中，FVIII的功能不是作为蛋白酶而是作为辅因子起作用，故具有极度增强由激活的因子IX对因子X的有限水解作用(激活作用)的催化速率的活性。FVIII由下列域组成：“A1”(氨基酸1到329)与因子V或血浆铜蓝蛋白同源；“A2”(氨基酸380到711)；“A3”(氨基酸1640到2019)；“C1”(氨基酸2020到2172)与discoidin植物血凝素同源；“C2”(氨基酸2173到2332)；以及“B”(氨基酸712到1648)域。FVIII还含有两个称作“a1”(氨基酸331到372)和“a2”(氨基酸1649到1689)的酸性序列，后者的功能是作为vWF的结合位点。通过由凝血酶的有限蛋白水解作用可释放结合型vWF，之后形成游离的FVIII时，此时产生FVIII辅因子的活性，并且当通过限制性蛋白水解作用将分子内的Arg372-Ser373的键切割后，增强了该活性(Eaton，D.等，Biochemistry25：505-512，1986)。

vWF以大的多聚分子存在，其分子量在500,000到高达20,000,000之间，其中两个到数十个单一的亚基单位互相结合在一起，每一个亚基单位由2050个氨基酸残基组成，其分子量大约为250,000。vWF在其不同的识别位点与各种胶原在内皮下交互作用。当其与胶原结合后，vWF通过剪刀应力切变改变其空间结构，以暴露血小板GPIb的结合位点并因此与血小板结合(Ruggeri，Z.M.等，J.Clin.Invest.99：559-564，1997)。

当血小板移动到牢固结合在胶原上的vWF上时，通过在血小板GPIa-IIa和胶原之间在内皮下或通过vWF或纤维粘连蛋白中的RGD序列在激活的血小板GPIIb-IIIa和粘附蛋白之间在内皮下形成牢固的结合使血小板发生粘附。此外还已知vWF在下一步血小板聚集中发挥重要作用。总之，通过在受伤的血管壁上的胶原和血小板之间或血小板相互之间的粘附分子的功能，vWF在血小板粘附和聚集中发挥着重要作用。因此，vWF缺乏的病人(冯维勒布兰德氏病)由于血小板粘附和聚集障碍而表现为出血。此外，vWF在循环血中也作为FVIII的载体蛋白起作用。

用于本发明的FVIII和vWF可以通过该领域已知的任何方法制备，包括从人血中分离或应用基因重组技术。用于本发明的FVIII和vWF优选纯化的。

可通过下述方法从血中制备FVIII。例如，从通过在低温下融化新鲜冷冻的人血浆所获得的低温沉淀，用含有抗-vWF的单克隆抗体或抗-FVIII的单克隆抗体的柱子进行亲和层析可制备纯化的FVIII(Rotblat，F.等，Biochemistry 24：4294-4300，1985)。

另一方面，可通过下述方法从血中制备vWF。例如，可通过从冷冻沉淀物中经阳离子交换层析纯化vWF/FVIII复合物，接着通过用高盐浓度的凝胶过滤分离vWF来制备，该冷冻沉淀物通过在低温下融化新鲜的冷冻人血浆来获得(Weiss，H.J.等，Science 182：1149-1151，1973)或通过应用对纯化的vWF的抗-vWF单克隆抗体进行亲和层析纯化vWF(Fulcher，C.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：1648-1652，1982)。

可将每一种这样制备的FVIII和/或vWF用适当的稳定剂通过冷冻干燥储存，以确保最大水平地保存FVIII和/或vWF的活性。作为替代，可将FVIII和/或vWF的溶液冷冻保存。根据本发明，将FVIII和/或vWF作为活性成分与本领域已知的合适的赋形剂组合，配制成用于治疗和预防由血小板紊乱引起的出血性疾病的药物。

可将本发明的药物给予患有因血小板减少症或血小板功能障碍引起出血性疾病的任何患者。

尽管FVIII的有效剂量可依赖例如病人的年龄、疾病的症状和严重程度而变化，基于FVIII的凝血活性，应用5到400U/Kg(体重)，优选50到100U/Kg(体重)的FVIII后可预期出现止血效果。FVIII最适合以单次给药(大剂量)或通过静脉内滴注给予。

对于vWF，尽管其有效剂量可依赖例如病人的年龄、疾病的症状和严重程度而有变化，基于利托菌素辅因子(Rcof)的活性，应用10到400U/Kg(体重)的vWF后预期可以以剂量-依赖方式产生止血效果。vWF最适合以单次给药(大剂量)或通过静脉内滴注给予。

为使FVIII和/或vWF用于治疗和预防由血小板紊乱引起的出血性疾病，可将FVIII或vWF各自单独给予或两者联合给予或可替代性地给予具有足够效果的FVIII/vWF复合物。

通过下面提到的实施例更详尽地解释本发明。制备实施例

通过在低温下融化新鲜的冷冻人血浆制备低温沉淀物，将其溶解后，可以进行阳离子交换层析并将沉淀分级以提纯FVIII/vWF复合物。然后，在350mM氯化钙的存在下，用Sephacryl S-500进行凝胶过滤，使FVIII和vWF互相分离并使FVIII和vWF各自分离。

实施例

下述实施例证明，给予FVIII和/或vWF对于由血小板减少症引起的出血有止血效果。实施例1本发明的药用组合物(含因子VIII)在血小板减少症动物模型中的效果

本实施例采用如通过给予抗癌药引起的血小板减少症所示建立的模型进行(Kuter，D.J.等，Blood 85：2720-2730，1995)。认为所用的模型是适合于评估由血小板减少症引起的出血的。使体重180到230g的雄性Wistar大鼠背部皮下接受12.5mg/Kg的抗癌药“白消安”(商品名)，引起血小板减少症疾病。14天后血小板计数达到最低时，将所述动物用戊巴比妥麻醉、固定背部、在尾部用叶片刀(cutter blade)切割3mm直径的切口以使其出血。将流出的血液用滤纸吸收并用血红蛋白定量测定和估测流失的血量。当正常大鼠具有约600,000/μl的血小板而其流失的血量在112.2±61.0μl时，测试动物的血液流失随着血小板计数降低而增加，当血小板计数降至1,000±1,000/μl时，流失量可高达1202.8±188.3μl。

使大鼠患上血小板减少症并给予人FVIII，该因子是基因重组的FVIII(由BAYER(拜尔)药厂生产的“KOGENATE”(商品名))，并且在检测开始前10分钟，基于凝集活性计，按10和20U/Kg通过外颈静脉给予该因子。同样，给予500μg/Kg的人FVIIa并检测。结果概括于表1和图1中。

与对照动物相比，按照剂量依赖方式给予FVIII之后，患有血小板减少症的大鼠的血液流失量明显减少。在给予FVIII(20U/Kg)的动物中，一个动物在观察的30分钟内表现为完全止血并且其出血量与正常大鼠一样低。在给予高剂量(500μg/Kg)的FVIIa组中也观察到出血量的减少，FVIIa的止血效果公开于日本专利公布号80783/1995中。然而，给予FVIII的止血效果超过F VIIa的效果。

                                     表1

    组别 动物数 30分钟内有止血的动物数  平均失血量    (μl)对照组^*FVIII 10 U/KgFVIII 20 U/KgFVIIa5 00μg/Kg    5    4    4    4            0            0            1            0    1202.8    662.7    311.5    924.2^*：生理盐水实施例2本发明的药用组合物(含冯维勒布兰德因子)在血小板减少症动物模型中的效果：

本实施例按实施例1所述进行。

使大鼠患上血小板减少症(血小板水平：1,000±1,000/μl)并在检测开始前10分钟，基于Rcof的活性通过外颈静脉以40、80和160U/Kg给予人vWF。同样，给予500μg/Kg的人F VIIa并检测。结果概括于表2和图2中。

与对照动物相比，按照剂量依赖方式给予vWF之后，血小板减少症的大鼠的血液流失量明显减少。在给予vWF的动物中，约半数在30分钟内观察到完全止血。在给予高剂量(500μg/Kg)的FVIIa组中也观察到出血量的减少，FVIIa的止血效果公开于日本专利公布号80783/1995中。然而，给予vWF的止血效果超过FVIIa的效果。

                                    表2

    组别 动物数 30分钟内有止血的动物数  平均失血量    (μl)对照组^*vWF40U/KgvWF80U/KgvWF160U/KgFVIIa500μg/Kg    5    4    4    4    4            0            1            2            2            0    1202.8    1030.4    644.2    528.4    924.2^*：生理盐水