用微传递技术在聚合物活性表面图案化固定生物大分子的方法

摘要

本发明公开的用微传递技术在聚合物活性表面图案化固定生物大分子的方法是先把生物大分子选择性“装入”聚二甲基硅氧烷印章的微井中，再在其表面形成一层冷凝水，利用印章与改性聚合物膜压紧后微井中原有的水以及接触区域横向扩散的水使生物大分子重新溶解，从而以溶液的形式与表面基团发生化学反应，实现在聚合物活性表面图案化固定生物大分子。本发明工艺简单灵活，重复性好，所获得的微图案具有很高的对比度和牢固度。同时对印章表面性质和微井深度要求较低，是一种简单廉价的图案化固定生物大分子的有效方法，尤其适用于具有较低反应活性的生物分子/活性表面体系。本发明在基于细胞的生物器件构建、组织工程以及细胞生物学基础研究等领域具有良好的应用前景。

说明书

                            技术领域

本发明涉及用微传递技术在聚合物活性表面图案化固定生物大分子的方法。具体说是把聚二甲基硅氧烷(PDMS)印章表面阵列微井中“盛装”的蛋白类生物大分子溶液传递到聚合物活性表面使其与表面活泼基团的反应能在溶液状态下进行从而更方便地实现蛋白类生物大分子在聚合物表面的图案化固定。

                            背景技术

随着现代生物技术的发展，生物大分子的图案化固定已引起了广泛关注。在聚合物材料表面图案化固定生物大分子和细胞对特定的生物学检测、基于活细胞的生物传感器构建以及人工神经网的修复都具有重大实用价值。目前，采用微接触印刷技术能够在金、玻璃、硅以及聚合物等表面通过物理吸附的方式实现生物大分子的图案化固定。但存在易脱附和稳定性差的缺点。如何实现生物大分子图案的牢固固定是目前需要解决的问题。

聚合物材料因其良好的物理性能和化学性能成为生物大分子图案化固定的理想基材。在聚合物表面可方便地引入各种反应基团，通过共价键合的方式实现生物大分子的牢固性固定。传统的反应性微印刷技术可方便地实现生物小分子的图案化牢固性固定。但为避免溶剂横向扩散造成的“污染”，一般要求移印前吹干模板或保留极少量溶剂，或要求反应时间短。这对非液态的生物大分子与表面活泼基团的反应是不利的，特别是对低反应活性的生物大分子/活性表面体系。

                            发明内容

本发明的目的是提供一种用微传递技术在聚合物活性表面图案化固定生物大分子的方法。

本发明的方法是先把生物大分子选择性“装入”聚二甲基硅氧烷(PDMS)印章的微井中，然后再在其表面形成一层冷凝水，利用印章与改性聚合物膜压紧后微井中原有的水以及接触区域横向扩散的水使生物大分子重新溶解，从而以溶液的形式与表面基团发生化学反应，实现在聚合物活性表面图案化固定生物大分子。具体包括以下步骤：

1)用常规的化学改性或等离子体改性方法改性聚合物，在聚合物表面引入能与生物大分子反应的羟基、羧基、氨基基团；

2)制备表面含微井的PDMS印章，并在其有微井的一面浸涂0.1～20mg/ml浓度的生物大分子溶液，用氮气流缓缓吹干；

3)取上述聚合物薄膜一片压印于印章表面0.1～10小时，压力10～200g/cm²，以选择性移走吸附在微井之间区域的生物大分子；

4)把印章在-18～0℃温度下保持0.1～5分钟，再在20～37℃温度下，相对湿度为50～99％的环境中静置0.1～5分钟，在其表面形成一层冷凝小液滴；

5)在0～100℃下，立即将此印章压印于步骤1)所得的改性聚合物表面0.1～10小时，压力10～200g/cm²，优选温度4～50℃；

6)揭起印章，用生物大分子相应pH值的缓冲液或水溶液冲洗，浸泡24小时后吹干，即得到生物大分子的微图案。

本发明中，所述的聚合物是可通过化学改性或等离子体改性在其表面产生能与生物大分子反应的活性基团的聚合物，如聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(D-乳酸)(PDLA)、聚己内酯(PCL)、聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚氨酯(PU)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)等。

上述步骤3)所说的压印于印章表面的聚合物薄膜是与步骤1)相同的聚合物，可以是未经过改性的聚合物，也可以是经过改性的聚合物。选择性移走生物大分子是指把印章突起部分与压印的聚合物薄膜相接触区域的生物大分子转移掉而保留微井内的生物大分子。

发明中制备表面含微井的PDMS印章，是先通过常规的“光刻”技术构建一个含有微米级柱状突起的底模，再在此底模表面浇注PDMs预聚物，加热交联固化后揭起制得的。一般是在平整洁净的玻璃或硅表面旋涂紫外型光刻胶，再在具有特征图案的光掩模板下紫外光曝光，显影，制得含有微米级柱状突起的初始模板，然后以此做底模，再在其上浇注PDMS预聚物和交联剂的混合物，加热固化后揭起制得的，一般固化温度40～100℃，时间6～24小时。

本发明中，所述的生物大分子是指蛋白类生物大分子及其衍生物，包括白蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、多聚赖氨酸、胶原以及明胶等。步骤2)所说的生物大分子溶液是指其相应pH值的缓冲液溶液或水溶液，如白蛋白的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液、明胶的PBS溶液，胶原或壳聚糖的0.3％的乙酸溶液等。

对于用本发明方法得到的生物大分子的微图案，可以用激光共聚焦显微镜(CLSM)或荧光显微镜进行检测其存在，为便于观察，这时所用生物大分子可事先用荧光染料如荧光素、罗丹明等标记。

采用本发明方法，通过调节PDMS印章中微井的直径和间距可以获得相应大小和间距的生物大分子微图案。调节冷凝水的量可以控制生物大分子微图案的质量，而冷凝水量可从冷凝时间和相对湿度两个因素来调节。

本发明工艺简单灵活，重复性好，所获得的微图案具有很高的对比度和牢固度，是一种简单廉价的图案化固定生物大分子的有效方法。采用“吹干-转移-冷凝”的方法较方便地实现了生物大分子溶液在微井中的“盛装”。每一个微井成为一个微反应器，使得生物大分子与表面基团间的反应能够以与在溶液中进行的界面接枝反应相当的速率进行，同时又避免了溶剂横向扩散造成的图案“污染”。较之传统的反应性微印刷技术，本发明对印章表面亲疏水性和微井深度要求也较低，PDMS印章无须进行等离子亲水性处理，微井深度无须太深，用常规的“光刻”技术即可制得。本发明特别适用于在具有一般反应活性的聚合物表面图案化固定生物大分子。在特定的生物学检测、基于活细胞的生物传感器构建以及人工神经网的修复等领域具有良好的应用前景。

                            附图说明

图1是用微传递技术在改性聚合物活性表面图案化固定生物大分子的工艺流程图。图中1表示在PDMS印章有微井的一面浸涂0.1～20mg/ml生物大分子溶液；2表示用氮气流缓缓吹干印章；3表示在印章表面压印聚合物薄膜以选择性移走微井之间区域的生物大分子；4表示在印章表面形成冷凝水；5表示把印章压印于改性聚合物表面。6表示揭起印章并冲洗图案化固定了生物大分子的聚合物膜。

图2是发明中所用的表面含有阵列微井的PDMS印章的原子力显微镜照片。

图3(a)是用本发明方法在醛基化的聚己内酯表面(PCL-CHO)图案化固定的白蛋白(BSA)的激光共聚焦显微(CLSM)照片，白蛋白因异硫氰酸荧光素(FITC)的标记而显示亮色；(b)是(a)对应的荧光强度分析。

图4是用本发明方法在醛基化的聚己内酯(PCL-CHO)表面图案化固定白蛋白前后PDMS印章的CLSM照片，其中(a)是图案化固定前的，(b)是图案化固定后的。白蛋白因FITC的标记而显示亮色。

图5(a)是用已有的反应性微印刷技术在PCL-CHO表面图案化固定的白蛋白(BSA)的CLSM像，白蛋白因FITC的标记而显示亮色；(b)是(a)对应的荧光强度分析。

图6是用本发明方法在醛基化的聚己内酯(PCL-CHO)表面图案化固定白蛋白时，因冷凝水量不适导致的缺陷图案，其中(a)为冷凝水不足时得到的圆环形图案，(b)为冷凝水过量时导致的图案“污染”。

                          具体实施方式

以下以具体实例对本发明作详细说明。

实例1本发明的用微传递技术在聚合物活性表面图案化固定生物大分子的方法，包括以下步骤：

1.制备表面带自由醛基的PCL膜：将PCL膜置于浓度为10％(wt)的己二胺的异丙醇溶液中，37℃下胺解10分钟，PCL表面因胺解而产生大量自由胺基。再把表面富含胺基的PCL膜放入2％的戊二醛溶液中，37℃下偶联反应30分钟，即制得表面富含自由醛基的PCL膜。此时膜因醛基化反应而呈现浅红色或橙红色。

2.制备表面含有阵列微井的PDMS印章：先用常规“光刻”技术制备一原始底模，即在一块干净的3×3cm²的载玻片表面以2000转/分钟的速度旋涂BP218紫外正型光刻胶，随后置于90℃的烘箱中烘30分钟，再在1000瓦的紫外灯、光掩模下旋转曝光150秒，然后于2％的NaOH溶液显影45秒，注意显影的均匀性。因所用光掩模含有微阵列的盲孔，最终制得的底模表面即含有相应的微阵列的突起柱。在此原始底模表面浇注PDMS预聚物，该预聚物已添加质量比10∶1的交联剂。60℃烘箱中交联固化12小时后揭起即制得PDMS软印章，其表面含有的对应尺寸的阵列微井可用原子力显微镜观察到(见图2)。

3.白蛋白(BSA)在微井中的选择性盛装：把异硫氰酸荧光素标记的白蛋白(FITC-BSA)配成浓度为1.0mg/ml的PBS缓冲液溶液，滴加一滴于上述PDMS有微井的一面，用玻璃棒来回赶匀，并用氮气流缓缓吹干。把一片PCL膜轻置于PDMS印章涂有FITC-BSA的一面，并用100g/cm²的压力压紧，室温下保持1小时。揭起PCL膜，吸附于微井之间区域的BSA就被转移掉了，只剩下盛装于阵列微井中的BSA。

4.冷凝水的形成：把此盛有BSA的PDMS印章置于-12℃的冰箱中冷却2分钟，再在相对湿度为80～90％的大气环境中(25℃)静置1分钟，即在其表面形成一薄层冷凝水。

5.把此印章迅速倒置于醛基PCL膜上，并用100g/cm²的压力压紧，室温下保持3小时。印章与醛基PCL膜压紧后微井中原有的水以及接触区域横向扩散的水使生物大分子重新溶解从而以溶液的形式与表面基团发生化学反应，每一微井成为一个微反应器。

6.轻轻揭起PDMS印章，用大量PBS缓冲液冲洗图案化固定了生物大分子的PCL膜，再在PBS中漂洗24小时，氮气吹干。

用激光共聚焦显微镜(CLSM)观察结果：图3a为用上述方法得到的BSA在醛基PCL膜表面的微阵列图案，b为该图案对应的荧光强度分析，说明用微传递方法

可获得很高的图案对比度，证实了微传递方法的有效性。图4的a和b分别为微传递前后的PDMS印章中的BSA图案，证实BSA已经从PDMS微井中完全传递到PCL膜表面。实例2

本例是与本发明的比较例。其它步骤同实例1，但改用已有的反应性微接触印刷技术图案化固定白蛋白。即在PDMS印章有微井的一面浸涂浓度为1.0mg/ml的FITC-BSA的PBS缓冲液溶液，并用氮气流缓缓吹干，迅速移印于醛基化的PCL膜上。压力、时间、温度及随后冲洗均同实例1。CLSM观察发现，用此方法得到的BSA图案(图5a)比用本发明得到的BSA图案要暗淡得多，其对应的荧光强度分析显示图案对比度也低的多(图5b)。实例3

其它步骤同实例1，但PDMS印章在相对湿度为80～90％的大气环境中(25℃)静置时间为0.1分钟或3分钟，观察其对图案质量的影响。发现前者因冷凝水不足形成了圆环形图案(图6a)，后者则因冷凝水过量而导致了图案“污染”(图6b)。这说明在用微传递方法图案化固定生物大分子时，在PDMS表面形成的冷凝水量对最终图案的质量有很大影响，过低或过高均将导致图案缺陷。