法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2007-04-18
专利权的终止未缴年费专利权终止
专利权的终止未缴年费专利权终止
2006-01-18
授权
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2003-07-30
实质审查的生效
实质审查的生效
2003-05-14
公开
公开
发明领域
本发明涉及通过体内表达多糖修饰酶方式改造高等植物细胞壁多糖结构的方法。
技术背景、现有技术与本发明的区别特征
高等植物的细胞壁是由纤维素、主要有半纤维素聚合体形成的互相支撑的结构，果胶基质聚合物和球形及非球形蛋白构成。除了球形蛋白以外，所有的聚合物在细胞壁中都起着结构性作用。当细胞壁成熟时，形成交连、链间和链内连接，最后木质素沉积在细胞壁上，从而使细胞壁变得非常稳定，使其组分难于分离、消化和处理。
本发明涉及在体内控制复合细胞壁多糖的结构。在简单的细胞壁聚合物中，不含有半晶质的纤维素微纤维，这类聚合物是不同种类的聚合物，该聚合物是由非糖组分组成，如：蛋白质、木质素、木栓质和在表皮细胞壁中发现的腊质。半纤维素和果胶广义地描述了复合的细胞壁多糖，如果这种多糖中在某种特定物种或组织中含量特别高或有特别的作用，那么其名称在一定程度上可以表明其类别，例如，落叶松属树木中的阿拉伯半乳聚糖和谷类种子中的β-葡聚糖。本发明的内容中，从这类复合细胞壁多糖中排除在外的是那些不是结构组分但有其他作用的多糖，典型的是在种子萌发过程中贮藏量发生变化的碳水化合物，如：瓜尔豆中的半乳甘露聚糖和罗望子中的木葡聚糖。在禾本植物、苔类植物及其亲缘关系相近的种族的植物和维管植物中，半纤维素聚合物的类型和含量是不同的。Carpita和Gibeaut(1993)将非禾本植物型的细胞壁称为I型细胞壁，禾本植物型的细胞壁称为II型细胞壁。初级的I型细胞壁几乎都是由纤维素、半纤维素和果胶组成。在未分化的细胞中，主要的半纤维素聚合物是木葡聚糖(不要与上文提到的种子中存在的木葡聚糖相混淆)。
在II型细胞壁中，木葡聚糖是次要的半纤维素多糖(～5％)，与I型细胞壁相比果胶的含量也较低。许多种类的半纤维素多聚物，如：木聚糖、阿拉伯糖基木聚糖和葡聚糖构成II型细胞壁中半纤维素聚合物的其他成分。在本发明中，这些半纤维素聚合物是特别相关的，被用来改造II型细胞壁中的多糖结构。对于I型聚合物来说，本发明特别的使用基质聚合物，如果胶。
果胶由两个基本部分组成，如：一个基本的由半乳糖醛酸基(同型聚半乳糖醛酸，作为光滑区是已知的)组成的无支链聚合物和一个由鼠李糖基与半乳糖醛酸基交替形成的聚合物，后一种聚合物能被长的中性侧链(鼠李糖聚半乳糖醛酸I，带有“毛发”，作为毛发状区是已知的)所取代。果胶多糖构成双子叶植物细胞壁的30-50％(Carpita和Gibeaut 1993)，植物细胞壁的果胶基质是同型聚半乳糖醛酸(HGA)、鼠李糖聚半乳糖醛酸I(RG-1)和鼠李糖聚半乳糖醛酸II(RG-1I)聚合物的复杂混合物(Voragen等.1995)。HGA是一种无支链的、可被有差别地甲基酯化和/或酰化的1，4-α-D-半乳糖醛酸(GalA)残基。相关的未酯化的HGA长度(连接区)能使Ca2+与其他的HGA分子的相似区域交连，从而形成聚合物和能形成凝胶体的高级结构，但是，高度酯化的HGA降低了钙促凝胶化的能力。其他的凝胶化机制一般依赖于高的甲基酯含量。RG-1是1，2-α-L-鼠李糖(Rha)和1，4-α-D-GalA残基交连形成的支链杂聚物(Lau等1985)，其带有连接在RG-1主链的鼠李糖(Rha)残基上的、主要成分是1，4- -D-半乳糖(Gal)和/或1，5-α-L-阿拉伯糖(Ara)残基的中性侧链。他们可以是单独的单元(β-D-Galp-(l(4))，也可以是聚合物，如阿拉伯半乳聚糖I和阿拉伯聚糖。其它形式的阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯半乳聚糖II主要和蛋白质(阿拉伯半乳聚糖蛋白质)相连。毛发的支链模式是种族(类)依赖的，RG-1的侧链可以通过羟基肉桂酸残基，如肉桂酸(Fry 1986)利用酯连接与其他的果胶分子交连。一般来说，同型聚半乳糖醛酸(HG)和鼠李糖聚半乳糖醛酸I(RG-1)共价连接，但是，光滑区和毛发状区延伸的恰当序列还没有确定。高度保守的RG-II分子有一个有侧链的同型聚半乳糖醛酸主链，该侧链富含各种不同的已知的糖和不同连接，其可通过硼酸二酯交连形成二聚体(O’Neill等1996)。
除了决定细胞壁的多孔性外，果胶聚合物还有其他的功能，包括调节细胞与细胞间的连接、细胞的膨胀(McCann和Roberts 1994)、细胞壁机械性能(Chanliaud和Gidley 1997)，作为信号分子的来源(寡聚糖素)(Cote和Hahn 1994)，还参与细胞的分化和器官形成(Satoh 1998)。
用于食品应用的果胶的实用性通过许多参数来衡量，包括其分子量、中性糖的含量、光滑区与毛发状区的比率、甲基和乙酰基酯化的程度，还包括同型聚半乳糖醛酸主链中酯基团的分布(Daas等1998，Braccini等.1999)，例如，如果只存在很少量的多毛发，就能促进同型聚半乳糖醛酸的Ca2+交连，于是形成了稳定性增强的凝胶。
在许多含量丰富的来源中，如马铃薯的块茎和产糖甜菜中，初级结构的果胶与苹果和柑橘类植物中的果胶相比，其在食用性上的质量较差，特别的，马铃薯果胶的毛发状区比率太高，且甲基酯化的程度太低(Ryden等.1990)，后者潜在地由采后起作用的果胶甲基酯化酶引起。关于内源酶活性的其他问题在于调整马铃薯的果胶结构需要拥有令人满意的胶凝化性质，以得到高质量的果胶。
已经从植物中提取几种对人细胞和组织有生理学影响的果胶制剂，并证实其能与人源大分子复合物发生生化相互作用(Paulsen2000)。例如，已经表明来源于毛发状区的化合物在体外可以和补给系统发生反应，因此，可以推断这些化合物可能履行免疫系统的功能(免疫调节)(Samuelsen等.1998，1999，Yamada和Kiyohara 1999)。但是，大量药学问题的产生应归因于活性物质差的性能。因此，不能控制果胶的结构使准确确定这些生化/生理活性物质的结构与活性的关系成为不可能。
对于制备果胶或作为一种改造多糖属性以适合于现有的和新的应用的方法，用酶处理果胶和其他植物细胞壁的观念，在过去20年里取得令人瞩目的成就。这些酶具体包括葡聚糖酶、木葡聚糖酶、纤维素酶、岩藻糖苷酶、木聚糖酶、内源多聚半乳糖醛酸酶(endo-PGs或EPGs)、果胶酯化酶、特异于不同种类带有乙酰基修饰的多糖的乙酰酯化酶、果胶裂解酶、外源多聚半乳糖醛酸酶和果胶酸盐裂解酶。一些新型的鼠李糖聚半乳糖醛酸酶、鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶、半乳聚糖酶、阿聚糖酶和相应的呋喃糖苷酶也引起一定的关注。α和β特异性酶都是引人注意的。比如使用半乳糖苷酶，一些α半乳糖苷酶的同功酶能消化半乳甘露聚糖，而独特的β特异的变体能使果胶半乳聚糖体发生解聚。上文列出的所有多糖修饰酶的作用情况是相似的。许多酶行使其本身的功能，或者通过人为选择以修饰藻类和微生物多糖，这些酶对于高等植物细胞壁也被认为是有效的，因为不同组成和来源的多糖具有相同的基本单元。
通过上文的描述，我们能够看出多糖，如果胶，是细胞壁中非常复杂的组分，且对单个多糖的精细结构有了一个非常完全的了解。考虑到聚合物的复杂性，有许多酶参予到他们的降解中是不奇怪的，这也意味着要一个很大的“工具盒”来改造这些聚合物。
然而，修饰植物细胞壁多糖的常用方法主要是建立在采(集)后处理方法的基础上。于是用采后处理的方法来修饰果胶，首先从原料植物材料中提取果胶，接着进行修饰，从而产生具有用于既定用途所需要性质的修饰果胶。
相反，能够在体内修饰细胞壁多糖是有利的，例如果胶，通过修饰果胶的结构，如毛发状区的结构，这将开拓一个新的不同途径，由于技术和/或经济原因，通常认为这是不可能或不能实现的。所以，本发明的主要目标是控制活体植物中复合多糖结构，包括果胶结构，从而获得细胞壁多糖经过修饰了的与母本植物相关的具有新型的细胞壁多糖结构植物材料。此处所用术语“新型的多糖结构”和“新型的果胶结构”指的是具有新的排列和/或改变了的聚合物单糖结构封端比例的聚合物。在下文对测定连接模式的描述中，由于分子量降低(例如成熟过程中)，那些在数量上无关紧要的新的末端基团被忽略，且大小发生改变的聚合物在本发明中不被认为是一种新的结构。在测定单糖侧链和连接模式中，非糖取代基也被忽略，因此在优点上只有唯一的不同，如增加了甲基酯化的多糖也不能认为是一种新的结构。相应的，与现有技术相反，本发明如上文所述提供在体内生产的新的复合细胞壁多糖结构
在下文中(和在下文的实施例中)，在体内修饰复合的植物细胞壁多糖结构的可能性通过用马铃薯的果胶结构为例来证实，但这决不是将本发明限定到果胶或马铃薯，本发明适用于修饰大范围的细胞壁多糖，它适用于许多农作物物种和许多除块茎之外的植物部位(器官)。但在许多国家马铃薯是一种重要的农作物，这不仅仅是因为它能够原样消费(煮、烤等)或处理后消费(炸薯条、炸土豆片、做汤)，还因为它能提供能用于许多工业应用中的高质量淀粉。在马铃薯块茎中提取淀粉后，残余的大量副产品(如纤维和蛋白质)主要被用来作为动物饲料。然而，这些副产品中含有能够生产更高价值产品的成分。马铃薯的纤维组分是不同多糖的聚集体，它们一起形成细胞内容物的包装材料，即植物细胞壁。在这些多糖中，果胶可能是最主要的引人注意的聚合物，因为它是许多食品应用领域的公知胶凝剂(Visser和Voragen 1996，Daas等.1998)。
在本发明中，特别关注的是果胶的毛发状区，而不是例如带有酯基的同型聚半乳糖醛酸的修饰。毛发状区的数量决定了中性糖与糖醛酸的比例，当该比例高时，果胶的水结合能力也高。这在一些食品应用领域和非食品应用领域是有利的。当该比例低时，果胶结构接近柑橘类果胶的结构，这一般在食品工业领域是优选的。因此，降低中性糖与糖醛酸的比例对于提高马铃薯淀粉、产糖甜菜等产品的果肉副产品的价格是重要的。
因此，本发明的另一重要目标是通过基因修饰降低植物中果胶的毛发状区的比例，这除了有利于提高马铃薯果胶的胶凝性外，还有利于淀粉的提取工艺，以得到高产量的淀粉。
另一个目标是剪接和重新构建果胶的毛发状区，以使其适用于低粘性食物产品(例如：饮用性酸奶酪和相似的日用产品)。本发明中称为“自处理”块茎(或一般地称为自处理植物材料)的实施方式提供的另外一种技术能满足这种需求。“自处理”是指植物组织中断采后释放贮存在细胞中的酶的属性。这些释放的酶催化细胞壁材料的修饰，特别是容易回收有益的多聚或寡聚糖。该技术也可用于剪切的果胶聚合物和其低聚物的医药用途。
和使用降解酶修饰采后果胶聚合物结构不同，在体内的修饰还可以使用编码生物合成酶或合成酶复合体的组分的基因。应当理解上调或下调合成酶或修饰酶的活性将增加操作的选择。已经鉴定了几种修饰转移酶，证明它们可能在这方面是有用的(Perrin等.1999，Edwards等.1999，WO 99/60103)，这样的酶是本发明果胶修饰的候选酶。一些酶的核苷糖基会发生互变是公知的，基于定性的突变体(见下文)我们可以预见，编码这些酶的基因可以用于间接操纵果胶和其他细胞壁多糖的生物合成。然而，目前已经证实，编码用于采后处理果胶修饰的多糖修饰酶的基因是体内修饰果胶的优选工具。
已经分离出几种表现出细胞壁修饰表型的突变的鼠耳芥(Arabidopsis)属。其中有一些受核苷酸糖库的水平的影响。仅仅一种现有的细胞壁突变体mur8可能是特异的果胶突变体，因为它缺乏鼠李糖(Reiter等.1997)，而mur1(缺乏海藻糖)和mur4(阿拉伯糖含量减少)(Mayer 1998)可能受其他的细胞壁多糖中的果胶的影响。然而，通过任意的可用方式产生这样的突变体在鼠耳芥属中容易处理，但在进行了相关的细胞壁多糖修饰的农作物植物中不易处理。
WO 91/08299公开了一种利用反义技术来抑制植物细胞中的基因产物产量，从而达到控制水果成熟的目的的方法。目标基因包括果胶酯化酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶和木聚糖酶。但并不涉及本文提供的在体内产生新的复合细胞壁多糖。
WO 99/07857公开了编码植物和转基因植物及其部分和改变了果胶酸盐裂解酶活性的其后代中的果胶酸盐裂解酶基因。虽然已经证明增强植物中果胶酸盐裂解酶的活性可以改变果胶，但是这种改变只是果胶聚合物的分子量的改变，并不能产生本文的新的果胶结构。
WO 93/13212公开了编码果胶酯化酶同功酶的DNA，将该DNA转化如马铃薯，可以降低果胶酯化酶的活性。
Sorensen等(1999)发表的标题为“通过在马铃薯中表达真菌内源性β-1，4半乳糖酶来修饰果胶”的文章表明，通过减小与RG-1中的鼠李糖残基连接的线状半乳聚糖的数量来修饰马铃薯果胶的毛发状区是有希望的，而且可以预计这些半乳聚糖能被来源于棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的真菌内源性半乳聚糖酶降解。这篇文章还报道生产了一些转基因植物，这些转基因植物的叶和块茎中表达半乳聚糖酶的基因是在颗粒束缚(Granule Bound)淀粉合成酶(GBSS)启动子或patatin启动子的控制之下。但是，半乳糖酶的表达对细胞壁多糖可能产生的影响既没有理论说明也没有试验说明。
因此，现有技术表明控制植物细胞壁的成熟进程是可能的，且这些处理能改变聚合物的分子量分布和取代基的修饰如甲基酯化。调节植物的成熟速度，就像植物的自然成熟一样控制植物的成熟是可能的。但在本发明中，这种改变并不被看作是新的细胞壁多糖结构。
一些工作者发现基因表达会对细胞壁的特性产生非常大的非特异性下游影响，但没有发展特异性技术。在了解了植物在生长过程中是活跃地用一种谨慎的调节方式调节细胞壁的新陈代谢的情况下，植物能够忍受除了加速或降低细胞壁新陈代谢自然进程的细胞壁再加工是令人惊奇的。但是现有技术中与成熟延迟有关的细胞壁新陈代谢的速率改变与本发明中所达到的程度有明显的区别，在现有技术中，当聚合物成分大部分保持不变时聚合物的酯化作用和分子量的改变占优势，而本发明提供了一种新的定点剪切复合细胞壁多糖的技术，从而在单糖分布和/或测定的，如甲基化分析的整个连键方式上提供高度可预测性的改变。
因此，本发明涉及新的定点、特异性地改造或修饰复合植物细胞壁多糖的技术。一般来说，该技术的好处在于以下四大方面：
1、改善农作物的农学特性
修饰植物结构.某些有选择对细胞壁新陈代谢的进程的干扰将影响细胞的分化、形态和生长，例如，通过修饰决定细胞分化方向和生长进程的重要的细胞壁成分可以构建自整枝植物。
繁殖能力.在种子的传播中细胞的分离是一个关键的生长步骤(WO 97/13865)，花粉的传播和花粉管沿着花柱中层的生长及生长进程都可以通过修饰细胞壁来改变。
病原体的入侵.病原性真菌和细菌通过产生一系列的破坏宿主细胞细胞壁结构的多糖降解酶入侵到植物组织。本发明提供一种改变细胞壁从而阻止渗透的方法。象信号分子一样，在病原体入侵过程中从细胞壁中释放所谓的寡聚糖，这些从细胞壁中释放的不同连接的寡聚糖产生一种新的细胞壁结构，于是改变了致病的过程。从而减少症状的产生。
2、改良植物产品
食用纤维.修饰细胞壁可以提高食用产品中的食用纤维的量，改变可溶的和不可溶的食用纤维的比例，其中后者跟很多健康问题有关。
结构.细胞壁构成蔬菜和水果的结构，在蔬菜和水果贮存中结构改变起着重要的作用。使用本发明的方法可以修饰结构和保藏时间。与保存有关的同时，本发明还提供了现有技术中描述的通过转基因修饰来补充控制成熟(加速和延迟)的技术。
材料特性.木材和纤维的结构特性依赖于植物解剖学、纤维细胞的几何学、次生壁的结构、木质化和多糖聚合物的构成。后者的植物材料原性可以通过利用本发明改造靶细胞的细胞壁加以改良。与医药材料、包被植入物的水胶体以及一些医药器械有关的特性包括水结合能力。如同本发明，通过修饰，如修饰果胶的结构，可以控制水结合能力(还可参见下文标题4的“剪切果胶”)。
提高副产品的价值.来源于纸产品或纤维制品、酿酒、淀粉或糖产品的纸浆是复合植物多糖的一种丰富的来源，该多糖达不到特定工业用途的标准，使用本发明构建农作物，从而使其成为具有更高价值的多糖来源从而升值。在下文中以果胶成分价格为例来说明。饲养型细胞壁的功能组分很大程度上决定其在家畜和家禽中的可消化性和氮利用率。特别是在非反刍动物中，如小猪和家禽中，细胞壁多糖的可消化性在饲料有效利用方面是一个限制因素。应用本发明的新技术，可以使饲料产品具有更优的可消化性，因此提高了动物的生长速度。在反刍动物中，增加多糖和细胞壁成分的可消化性将会影响蛋白质在瘤胃中的分解，因为在瘤胃中的微生物将会利用释放的糖类来代替蛋白质，这样在瘤胃中较少的蛋白质被分解，产生较少的氨，于是多糖和细胞壁组分可消化性性的增加会使蛋白质在瘤胃中免遭降解，因此更多的蛋白质成分在肠道中被吸收。这样，提高细胞壁组分和多糖的可消化性将增加蛋白质的利用率，减少瘤胃降解蛋白质而从瘤胃中释放的氨或氮。
3、改善加工特性
饮料的过滤性.植物材料的液化应用于果汁和酒制造中，如利用食品工业酶增加产量和防止过滤物的凝结，本发明在补充或替代这些措施和减少/除去某种在处理过程中导致麻烦的多糖成分是有用的。
麦芽糖的性质.在制备麦芽糖的过程中，淀粉被分解，然而颖果中只是特定的细胞壁β-葡聚糖能溶解，这样就可能导致有关啤酒是否澄清的问题。针对这个问题的大多数生物技术方法是构建能完全消化β-葡聚糖的酵母菌，利用本发明可以改善细胞壁中β-葡聚糖的加工性质。一般来说，是改良麦芽糖在制备过程中的加工方式，并改良终产品。
烘烤性.通常用富含对细胞壁多糖具有活性的木聚糖酶和葡聚糖酶的工程酶来修饰生面团的流变学性质。利用本发明的方法修饰了细胞壁多糖的起始材料，可以补充或代替加入工程酶的方法，另外对多糖和细胞壁组分进行其他的修饰，可以改善生面团的性质，提高其烘烤性。
纤维的浸渍.用工业酶处理或通过传统已知的作为浸渍法的“发酵”处理方法分离纤维，如亚麻。利用本发明，可以修饰与细胞壁的性质有关的纤维植物纤维或含有纤维的植物组织，其可以补充或代替这种方法。另外，利用本发明来还可改良(包括加工)其他用于制造纺织品植物纤维(棉花、大麻等)。
4、分离的多糖
作为食物成分和添加剂的被剪切的果胶.通过本发明可以获得设计过的果胶，例如，从如上文所述的含有劣质果胶的植物材料中获得。一般来说，该技术的优点包括：能保持低粘性果胶的生理活性，酯分布的均一性，产生高分子量低粘性的产品，除去废水中的酸和制备分子量不降低的低酯果胶。其他优点还包括：工艺简单，高产量，高强度，利用便宜的原材料，反应条件温和，回收容易，低消耗，对环境的影响小和产物的质量高。另外，本发明技术还可以利用非精制的产品(例如，没有经过传统的大部分提取步骤的产品)，可以利用本发明的技术除去不需要的多糖和细胞壁成分，例如，产生非适口性的成分，从而提高低质量成分的组分质量。
作为医学材料和药物的剪切的果胶.已经检测了几种植物种中(其中的一些是外来植物)细胞壁多糖中的生物活性多聚和寡聚糖，包括果胶。本发明能对细胞壁多糖的聚合物结构进行有效的控制，例如设计农作物植物中的多聚和寡聚糖，使其具有生物活性。在糖制品厂、淀粉制品厂、啤酒厂等使用公知的处理步骤处理的好处包括：高效率、低消耗，优选一种或多种特定的农作物植物。
发明概述
本发明的第一方面涉及提供转基因植物材料的方法，其与野生型状态相比复合细胞壁多糖结构被修饰，该修饰至少涉及糖苷键形式和单糖分布中的一个，该方法包括以下步骤：(i)提供含有核苷酸序列的核酸构建体，该构建体转化到植物细胞中后，能导致至少一种靶细胞壁修饰酶的产量改变，(ii)用核酸构建体转化植物细胞，和(iii)于转化植物细胞中取得植物细胞培养物，植物组织或转基因植物，其中至少一种细胞壁多糖修饰酶的产量发生改变，于是获得转基因植物细胞、植物组织或植株，其与野生型的植株相对比，靶底物细胞壁多糖被修饰，具有的单糖分布中至少一种单糖的比例改变至少10％，或至少一种糖苷键的比例改变至少10％。
在这方面的一个实施方案中的核苷酸序列(在将构建体转化到植物细胞中，导致至少一种靶细胞壁多糖修饰酶产量改变)是编码一种酶的核苷酸序列，比如真菌或微生物来源的细胞壁多糖修饰酶，其能修饰实施方案中的目标细胞壁多糖，其中编码序列可操作性的与指导其表达的启动子连接。这种启动子可以来源于植物，如植物组织或在器官的特异性启动子，包括贮藏器官特异性启动子。在本文中，目的启动子是那些能指导马铃薯块茎中细胞壁多糖修饰酶的表达的启动子，包括选自颗粒束缚的淀粉合成酶(GBSS)启动子和B33启动子的启动子。
在另一个实施方案中，至少一种产量发生改变的靶细胞壁多糖修饰酶是一种内源酶，即在转化植物细胞中自然产生的酶，包括特别的方案，其中在将核酸构建体转化到植物细胞中导致至少一种靶细胞壁多糖修饰酶的产量变化的核酸序列是调节内源序列表达的序列，该内源序列编码能修饰靶细胞壁多糖的酶。作为该实施方案的一个实施例，调节编码能修饰靶细胞壁多糖的酶的内源序列表达的序列是编码反义序列的序列，该反义序列降低抑制剂的表达或减少内源靶细胞壁多糖修饰酶抑制剂的产生。在另一个实施例中，调节编码能修饰靶细胞壁多糖的酶的内源序列表达的序列重组后，导致一个新的或修饰过的启动子的插入，该启动子可操作性的与内源靶细胞壁修饰酶连接，所述启动子能指导细胞壁修饰酶编码序列的表达。
在以上方法的另一个实施方案中，将其构建体转化到植物细胞中导致至少一种靶细胞壁多糖修饰酶的产量改变的核酸序列通过重组，使能修饰靶细胞壁多糖的酶的内源编码序列表达，该酶定位到植物细胞中的特定区域，而在正常情况下该区域不存在这种酶。
在以上方法的有利实施方案中，核酸构建体是病毒载体，将其转化到植物细胞中后并不整合到细胞基因组中。
在以上方法的具体实施方案中，被细胞壁多糖修饰酶修饰的靶复合细胞壁多糖是果胶或半纤维性多糖。合适的果胶或半纤维素修饰酶包括内源性鼠李糖聚半乳糖醛酸水解酶、内源性鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶、内源性半乳聚糖酶(endo-galactanases)、内源性阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳糖苷酶，如β-半乳糖苷酶、木糖苷酶和外源性半乳糖醛酸酶及其orthologs或同功酶。
在以上方法的另一个实施方案中，将其构建体转化到植物细胞中导致至少一种靶细胞壁多糖修饰酶的产量改变的核酸序列和宿主植物内源性基因是完全不同的，因此共抑制不会发生。
在以上方法的又一个实施方案中，辅助酶，包括如甲基酯化酶、乙酰酯化酶或糖苷酶除去多聚物中的单个单糖(例如将阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳糖苷酶、木糖苷酶或岩藻糖苷酶)与靶细胞壁多糖修饰酶共表达，其中共表达使多糖修饰酶更容易接近其作用底物。
本发明的另一个方面涉及修饰植物细胞中的至少一种复合细胞壁多糖的生物合成，以获得转基因植物材料的方法，该转基因植物材料与野生型形态相比其中复合细胞壁多糖的结构被修饰，该修饰至少包括糖苷键形式和单糖分布中的一个。该方法包括以下步骤：(i)提供含有核苷酸序列的核酸构建体，在植物中表达该构建体，使至少一种细胞壁多糖修饰酶定位到植物细胞的间隙中，而该间隙在正常情况下不存在该酶，或者在植物细胞中产生的一种天然多肽，从而影响细胞壁多糖的生物合成的表达发生变化，(ii)用该核酸构建体转化植物细胞，和(iii)于所说的转化植物细胞取得植物细胞培养物、植物组织或转基因植物，相应于野生型植物，其在不同的间隙产生至少一种细胞壁多糖修饰酶。
上述方法包括实施方案，其中与野生型的植株相比，在获得的转基因植物细胞、植物组织或植株中，靶底物细胞壁基质多糖被修饰，具有的单糖分布中至少一种单糖的比例改变至少10％，或至少一种糖苷键的比例改变至少10％。
在以上方法更具体的实施方案中，至少一种细胞壁多糖修饰酶定位到高尔基体，包括与高尔基Stacs融合或从上萌芽的膜囊，其中，在植物细胞中表达导致至少一种细胞壁多糖修饰酶定位到高尔基体的核酸序列是编码嵌合基因产物(该基因产物包括至少一种细胞壁多糖修饰酶)的序列，和能使嵌合基因产物定位到高尔基体的序列。这种定位序列为II型膜锚定高尔基蛋白(例如唾液酸转移酶、N-乙酰葡萄糖氨基转移酶、岩藻糖基转移酶、木糖基转移酶或半乳糖基转移酶及其片段)，或者可溶性高尔基体靶蛋白(如Pisum sativum逆向糖基化多肽(RGP1)或其片段)。
以上修饰细胞壁多糖生物合成方法的另一个具体实施方案中，核酸序列(其在植物细胞中表达，导致至少一种细胞壁多糖修饰酶定位到植物细胞间隙，而在正常情况下该酶不存在)可操作地与一个其将导入的植物细胞基因组中的启动子连接。
本发明的另一方面涉及提供转基因植物的方法，该转基因植物中含有至少有一种复合细胞壁多糖，如果胶或半纤维素多糖的部分，采集后，该部分能用植物材料自身存在的酶处理，即“自处理”植物，该方法包括：(i)提供含有核苷酸序列的核酸构建体，将该构建体转化到植物细胞后，在植物细胞的原生质体(non-apoplastic)或非高尔基体间隙中表达细胞壁多糖修饰酶或表达在体内条件下无活性，但在来源于植物细胞的植物材料采集后能被激活的细胞壁多糖修饰酶，(ii)用该核酸构建体转化植物细胞，和(iii)于所述转化植物细胞中取得转基因植物材料，在合适的采后条件下，其中至少一种复合细胞壁多糖在采后可被酶处理，方法是将至少一种复合细胞壁多糖和细胞壁多糖修饰酶接触(该酶在原生质体和非高尔基体间隙中表达)，或将采集的植物材料放在一定的条件下，在该条件下在体内以失活形式表达的酶被激活。
关于这方面的一个具体的实施方案中，在将核酸构建体转化到植物细胞后，使细胞壁多糖修饰酶在原生质体或非高尔基体结构中表达的核酸序列是使细胞壁多糖修饰酶在植物生长过程中定位到细胞间隙(选自：液泡、内质网、细胞质和质体)的序列，包括，在原生质体或非高尔基体空隙中表达的多糖修饰酶的编码序列是包含于转化到植物细胞中的核酸构建体中的序列，或者是核酸构建体转化的细胞的基因组中存在的内源序列。
在以上制备采后自处理植物的方法的有用的实施方案中，细胞壁多糖修饰酶选自：内源性多聚半乳糖醛酸酶、内源果胶裂解酶、果胶酸盐裂解酶、鼠李糖聚半乳糖醛酸水解酶、鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶、内源葡聚糖酶、内源木聚糖酶和其同功酶或ortholog。在有利的实施方案中，该酶的表达受植物启动子的指导。
在以上方法的具体实施方案中，当采集后被处理的细胞壁多糖是果胶时，果胶被处理的区域是鼠李糖半乳糖醛酸区和同型聚半乳糖醛酸区之间的区域。
在提供采后“自处理”植物的方法中，一个有用的实施方案是其中的植物细胞进一步被核酸序列转化，该核酸序列使一种能在体内修饰至少一种复合细胞壁多糖(包括能在采集后能被植物材料自身存在的酶处理的细胞壁多糖)结构的酶表达。这样的核酸序列可以是编码细胞壁多糖修饰酶的序列，或者是编码一种产物的序列，该产物影响编码细胞壁多糖修饰酶内源性序列表达。在有用的实施方案中，细胞壁多糖修饰酶定位到非原生质体。
在体内能修饰至少一种复合细胞壁多糖结构的有用酶包括：内源性鼠李糖聚半乳糖醛酸酶水解酶、内源性鼠李糖聚半乳糖醛酸酶裂解酶、内源性半乳聚糖酶、内源阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳糖苷酶，如β-半乳糖苷酶，木糖苷酶和外源性半乳糖醛酸酶及其同功酶或orthologs。
本发明的另一个方面涉及提供植物细胞壁多糖材料的方法，与野生型形态比，该细胞壁多糖的结构和组分被修饰。该方法包括以下步骤：(i)利用上文提供采集后“自处理”植物的方法提供转基因植物，如马铃薯植株，(ii)培养和采集该植株，从中分离至少有一种复合细胞壁多糖，如果胶的部分，其可在采集后被植物材料自身存在的一种酶处理，(iii)将所说的部分放置在一定的条件下，在该条件下在原生质体和非高尔基体结构中表达的细胞壁多糖修饰酶，与其细胞壁多糖底物接触，或者在体内条件下表达的无活性细胞壁多糖修饰酶被活化，从而获得修饰的细胞壁多糖，和(iv)分离修饰的细胞壁多糖材料。
在该方法的有用实施方式中，获得的材料中的修饰过的细胞壁多糖含有至少一种单糖的改变比例至少为10％或至少一种糖苷键的改变比例至少为10％的单糖分布。
本发明的另一个方面是提供植物细胞壁多糖材料，相对应于野生型的形态来说，通过以上方法获得的该多糖材料，具有修饰过的结构和组分。
本发明也提供用本发明第一方面的提供转基因植物材料的方法提供转基因植物或其后代或其部分，该转基因植物材料相对于野生型形态来说，其复合细胞壁多糖结构被修饰，相对于含有相应的野生型细胞壁多糖的材料来说，这种转基因植物或其后代或其含有转基因植物材料的部分的植物细胞壁多糖含有材料至少有一种发生改变的功能性特征，比如改变的药物活性、水结合能力、可加工性、胶凝性、粘稠性和可消化性。
本发明的又一方面涉及以上转基因植物或其后代或其部分或含有细胞壁多糖的植物材料在制造食品、食品添加物、饲料、药学或医学产品和化妆品和含有以上含有细胞壁多糖的植物材料的药学或医学产品，如药物组合物、移植材料、医学装置和外科粘合剂中的用途。
本发明的再一方面是提供生产含有复合植物细胞壁多糖的材料的方法，其中的多糖相对于相应的野生型形态的细胞壁多糖来说具有修饰的结构和/或修饰的组分，该方法包括如下步骤：(i)用本发明第一方面的方法或用上文修饰植物细胞中至少一种复合细胞壁多糖的生物合成的方法提供可培养的转基因植物，如马铃薯植株，或者其可培养后代，(ii)在合适的植物培养条件下培养所述转基因植物或其后代，以得到含有至少一种具有修饰结构和/或修饰组分的复合细胞壁多糖的植物材料，和(iii)从培养的植物中分离含有修饰过的细胞壁多糖的材料。在该方法的有用的实施方案中，从培养的植物中分离的材料含有细胞壁多糖，该多糖相对于野生型植物来说被修饰，具有其中至少一种单糖被改变的比例至少为10％或至少一种糖苷键被改变的比例至少为10％的单糖分布。
发明详述
在下文的描述和权利要求中，几个上位的和下位的术语和表达被用来限定本发明，下文将对这些术语和表达进行限定和解释：
术语“新的多糖结构”和“新的果胶结构”指的是具有新的糖苷键排列和/或聚合物中单糖结构单元的比例改变了的聚合物，即改变了的单糖侧分布。在测定连键形式时，由于分子量降低(例如成熟过程中)，那些在数量上无关紧要的新的末端基团被忽略，且只大小发生改变的聚合物在本发明中不被认为是一种新的结构。在测定单糖分布和连接形式中，非糖取代基的修饰也被忽略，因此只是由于如增加了甲基酯化而不同的多糖也不认为是一种新的结构。多糖或多糖混合物中的单糖分布可以通过如多糖水解产物乙酰衍生物气相色谱法，或者通过有或无糖醛酸分离的HPAEC法测定。连键分析可以通过下面的方法进行去除多聚或寡聚糖上的非糖修饰物，然后，在进行水解和气相色谱之前甲基化所有的自由羟基。在测定单糖分布和连键形式中，一些残留的淀粉会影响测定结果，因此试验者需要对非随机可变因素进行估计。单糖分布既是定量属性，也是定性属性，而连键形式在很大程度上是定性上的特征。特别地，定性特征具有生物学可变性。本发明在复合细胞壁多糖中导入本发明限定的新结构，通过与野生型对照(参照下文)对比予以确认。与野生型植物相比，如果单糖分布的一种单糖相差至少10mol％，包括至少15mol％、20mol％或25mol％，或在至少一个残基连键方式分析中，相差至少10mol％，包括至少15mol％、20mol％或25mol％，那么就认为是不同于野生型形态的转化子。单糖分布和连键方式不需要同时改变，但可能发生同时改变。一些可能的修饰只考虑到重排，并只在新的连键形式中出现，而其它只是单糖分布发生改变的修饰是纯组成性修饰。
术语“转基因的”或“转化的”植物指的是通过基因转化过程使其含有下列核酸序列的植物：DNA-甲基化形式，其在正常情况下不存于植物中，或正常情况下植物中存在的序列之外的核酸序列，或正常情况下植物中存在但与天然的序列相比发生了改变的DNA序列。在本文中，改变也包括DAN甲基化形式的改变或在基因组中的排列的改变。
术语“野生型”指的是既没有被稳定转化也没有被处理使之瞬间表达外源遗传材料的植株。野生型植株用来测量生物变异，通过对比可以确定表现出一种真正地新表型的已被处理的植株。在研究中，野生型对照植株应与修饰的植物进行同样培养，在基本一致的条件下生长，使其成为本发明中合适的对照物。在相同的生长阶段，从试验植株和对照植株中取出器官和组织样品用于对照分析。
术语“核酸”指的是任意核酸物质包括，包括：DNA、RNA、LNA(lockednucleic acids)、PNA、RNA、dsRNA、能够改变遗传材料遗传性或稳定性的RNA-DNA杂合体和/或植物中的甲基化DNA。还包括由非天然产生的核苷构成的核酸。
术语“核酸构建体”指的是用于转化植物细胞以产生子代转基因植物的遗传序列。核酸构建体包括至少一个编码目标基因产物的编码区，为了在植物中表达而连接在5’和3’端的调节序列。这样的构建体可以是嵌合体，即由不同来源的序列混合构成，或者是非嵌合体。根据基因产物的预定功能，编码区的方向可以是有义或反义方向。
近来已经证实在高等植物中通过同源重组进行转化是可能的(Kempin等，1997)。可以预料这将可变和开辟制备上述转基因植物的方法。因此，“核酸构建体”的定义可以被理解为包含了这些新技术。利用同源重组实现本发明的特殊技术方法包括，但不限于：通过替换启动子或敲除(knock-out)抑制因子来补充内源性细胞壁多糖修饰酶。这对于植物来说通常是可接受的，或者至少在所述基因存在几种同功酶时是可接受的。根据同样的原理，通过取代其信号序列，可以改变内源基因产物的亚细胞定位。最后，通过内源基因的取代可以将异源基因的全部或他们的编码区引入到植物基因组中。
而且，利用植物病毒将外源遗传材料携带到植物中，从而修饰感染细胞基因的表达是可行的，并且是一个植物基因修饰的有效方法，不产生稳定转化的植物。可在采集后立即对成熟植物进行感染，所需要的表型一形成就回收修饰组织。如果直接应用此处所述的转化细胞，则暗指这些被瞬间修饰的细胞。
术语“反义”指的是与有义链互补的DNA链序列，并且其不能被翻译成结构基因编码的多肽。为了达到本发明的目的，反义指的是在反方向上与启动子的全部或部分序列可操作性连接的核酸构件，因此转录形成RNA分子后，有义和反义系列能发生杂交，于是减少所述多肽的水平。术语“有义”此处是指结构基因DNA的序列，其被转录成mRNA分子，然后翻译成该结构基因编码的多肽。
术语“可操作性连接”指的是编码序列表达必须的调节序列位于核酸分子中相对于编码序列的合适位置，从而影响编码序列的表达。选择地，在被编码序列转化的细胞的基因组中，编码序列可以与调节序列可操作性地连接。此处所用术语“启动子”指的是引起或者将DNA转录成RNA分子所必需的DNA序列。该启动子可以是组织特异性或器官特异性启动子、在特定生长阶段具有活性的启动子或可诱导的启动子，如下文所述的一种可诱导的启动子或现有技术中已知的另一种可诱导的启动子，或一种组成性启动子，如花椰菜花叶病毒35S启动子或现有技术已知的另一种组成性启动子。
术语“载体”指的是在细胞中能够复制的核酸分子(或者在体外能够扩增，如通过PCR方法)，该核酸分子在细胞中能和其他的核酸分子可操作性连接，使连接的核酸序列发生复制。常用载体如下所述，并包括细菌质粒和噬菌体。
利用常规的核酸重组技术可将上文所述的核酸构建体掺入到植物细胞中。一般来说，该技术包括将核酸插入到表达载体中，该载体具有转录和表达插入的蛋白编码序列所需的元件和用于筛选转化细胞或植株的一个或多个标记序列。一旦核酸构建体被克隆到表达载体中后，利用本领域技术人员公知的常规转化方法将其导入到植物细胞中。这个过程包括，但不限于，使用土壤杆菌属(Agrobacterium)载体，如根瘤土壤杆菌(A.Rhizogenes)和毛根土壤杆菌(A.rhizogenes)，用PEG处理原生质体，DNA传送，用包被有核酸构建体的金颗粒轰击，原生质体电穿孔或如《植物组织培养杂志》中通常所述(Lindsey，1992，Kluwer Academic Pubs.，Dordrecht)的核酸直接吸收。根据不同的预转化植株使用合适的转化方法对于本领域的普通技术人员来说是显然易见的。此处所用的术语“转化”指的是将核酸转化到植物细胞中的这个事实，而不考虑核酸接下来是否掺入到转化细胞的基因组中。
术语“植物细胞”包括任何来源于植物的细胞，包括未分化的组织，如愈伤组织和悬浮培养物，以及植物种子、花粉或植物胚。适合于转化的植物组织包括叶组织、根组织、分生组织、原生质体、胚轴、子叶、盾片、苗端、根、未成熟胚、愈伤组织、体细胞胚、胚胎发生结构、花粉及花药。
术语“定向(targeted)”，当涉及在体内进行细胞壁多糖的改造或修饰的方法时，是指本发明与天然存在的随机突变方法相区别，也与改变多糖聚集前体库的转基因方法相区别。后一种方法通常通过影响结构单元来改变所有聚合物的单糖分布，而利用本发明可以定向的修饰特定的细胞壁聚合物。另外，术语“定向”还表明了对定向的多糖组分的副作用，如降低细胞壁原纤维或木质素的含量，其被认为随机修饰。在任何主要组分减少后，细胞壁的剩余成分就会由其他的细胞壁结构单元补充。
术语“复合细胞壁多糖”指的是一类来自本发明涉及的维管植物的聚合物。不包括细胞内的复合多糖、淀粉和果聚糖。不考虑种子贮藏多糖，如甘露聚糖、半乳甘露聚糖和在种子次生壁中的贮藏木葡聚糖。简单的、纤维素的晶体丝不能满足本文中的“复合”要求。该定义涵盖下文例子中的半纤维素和果胶。
术语“半纤维素”或“半纤维素多糖”指的是结构性木葡聚糖(相对于贮藏性木葡聚糖)、木聚糖、阿拉伯糖木聚糖和多种非纤维质β-葡聚糖。
术语“果胶”或“果胶多糖”指的是上文描述的多糖一般称为果胶，即在植物细胞壁中以同型聚半乳糖醛酸、木糖聚半乳糖醛酸、鼠李糖聚半乳糖醛酸和阿拉伯半乳聚糖聚合物的混合物形式存在的多糖材料。
术语“光滑区”指的是主要由同型聚半乳糖醛酸组成的果胶基本直链的、非支链区域，其中含有的半乳糖醛酸单元可以被不同程度地酯化，一般是O-乙酰基和O-甲基。该光滑区还可以进一步含有一段木糖聚半乳糖醛酸和鼠李糖聚半乳糖醛酸II。
术语“毛发状区”指的是含有鼠李糖聚半乳糖醛酸I的果胶支链区。其主链由GalA和Rha构成，多种侧链主要由阿拉伯糖和半乳糖构成。
术语“多糖修饰酶”指的是修饰复合细胞壁或其部分的结构的任何酶。如果一种多糖表现出如上文所述的新的结构，那么该多糖的结构就认为是新的。在新的多糖中非糖修饰被忽略，负责转移这些组分的酶不认为是多糖修饰酶(还可参见下文“辅助酶”的定义)。在本文中，多糖主链的生物合成中所涉及到的糖基转移酶也不认为是多糖修饰酶。操纵合成酶的表达可以使多糖的结构发生重大的改变，但是与本发明相比，这种方法与获得新的多糖的方法有根本性的不同，该技术并不依赖于修饰。但本发明也与鉴别具有多糖单糖残基修饰功能的基因有关(参见下文“修饰酶”的定义)。一般来说，多糖修饰酶属于参与多糖降解或代谢的酶类。这种酶的非限制性例子包括：内源性鼠李糖聚半乳糖醛酸水解酶、内源性鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶、内源性多聚半乳糖醛酸酶、内源性果胶酸盐裂解酶、内源性果胶裂解酶、内源性半乳聚糖酶、内源性阿拉伯聚糖酶、内源性木糖葡聚糖酶、内源性葡聚糖酶、木聚糖酶、阿拉伯木聚糖酶、木糖聚半乳糖醛酸酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳糖苷酶、岩藻糖苷酶、外源性半乳糖醛酸酶和木糖苷酶。特别的多糖修饰酶的特定登记号包括：棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)内源性半乳聚糖酶(登记号为L34599)或其同功酶或ortholog，例如来自塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)的ortholog AJ012316，鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶(登记号为L35500)或其同功酶或ortholog，和棘孢曲霉内源性1，5-α-阿拉伯糖苷酶(WO 94/20611中的SEQ ID No 1)或其同功酶或ortholog，例如来自黑曲霉(Aspergillus niger)的ortholog L23430。
术语“修饰酶”指的是一种酶，如转移酶，该酶将单糖侧链或非糖取代基，一般如feroyl、乙酰基或甲基酯加到果胶主链或支链上。修饰酶从也是转移酶的进行果胶的主链多聚化的(同型聚半乳糖醛酸和改变鼠李糖聚半乳糖醛酸主链)和长侧链(大量的半乳聚糖和阿拉伯聚糖)合成酶中分离出来。
术语“辅助酶”指的是能除去由于上文定义的修饰酶而产生的果胶修饰酶。修饰使果胶不受多糖修饰酶的作用，于是，将多糖修饰酶与匹配的辅助酶共表达能促使大部分酶与果胶底物发生反应。辅助酶包括：酯酶，如对同型聚半乳糖醛酸酶和鼠李聚半乳糖醛酸酶都具有特异性的甲基酯酶和乙酰酯酶，和能从聚合物中除去单个单糖的糖苷酶，如阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳糖苷酶、木糖苷酶和岩藻糖苷酶。
“分子养殖”是指利用植物作为载体进行与蔬菜、水果或其部分(如果汁或面粉)不同的特异分子的生产实践。典型的用于回收精确限定的分子的植物产物是植物油、糖和淀粉。转基因技术大大地增加了可以在植物中养殖的分子的范围，此处所用的该术语特指这些较宽的含义。
术语“ortholog″用来表示下列两种来自不同有机体的基因(编码酶)的关系：如果序列相似性表明了进化相关性(但是边缘的)，那么这些基因就认为是ortholog，他们的基因产物催化同样的反应，他们在两种有机体中具有基本相似或重叠的生理功能。
术语“同工酶”用来表示下列两种来自同一有机体的基因的关系：如果序列相似性表明了进化相关性，且编码的酶催化相似的反应，那么该基因就编码同一基因产物的同工酶。同工酶可以，或不可以在有机体中行使不同的生理功能。
术语“组织特异性”和“器官特异性”在用来指启动子时，也包括可被同化诱导的启动子。可同化诱导型启动子只是由于其同化物，如蔗糖的诱导其接收器官中直接表达。为了实践的目的，本文中的启动子是贮藏器官特异性的。
复合细胞壁多糖贮藏在细胞壁中，即原生质体的外面，然而其主要生物合成步骤发生在高尔基体。因此，多糖修饰酶从高尔基体转移到原生质体，与其底物接触，并在这些位置发生作用。
本发明的一方面涉及到植物基因的异位表达，或者微生物基因的异源表达，一般来说，不考虑任何以确保其亚细胞器的准确定位的修饰。由植物基因编码的非原生质体酶的信号序列一般能跨植物种起作用，当将其用于嵌合体结构中时也能指导表达产物进入正常情况下不积累该基因产物的器官中。甚至分泌型真菌酶在植物细胞中表达时也能定位到非原生质体。本领域的技术人员都知道构建一个基因的可用方法，该基因可分泌到内源基因不产生功能的非原生质体中，即一般用一个已知功能的植物或真菌序列代替非功能信号序列，或者提供无替换的所说序列基因。
利用植物信号序列确促转基因产物在高尔基体中的准确定位，显然，本领域的技术人员能用合适的序列构建转移基因用来在合成位点修饰细胞壁多糖，包括果胶。下文的实施例8描述了本发明的一个具体实施方式，其优点在于将能跨种系远距离地准确操纵鼠基因的信号序列用于确保高尔基体的定位。
本发明的另一步方面涉及编码酶基因的共表达，该酶除去了一种特别的果胶修饰以促进其和底物接触，从而催化所需多糖改造。本发明的这个实施方案涉及到用一种辅助酶，下文的实施例9将详细介绍其构建和转化。
一般成对的酶(除非需要辅助酶以发挥合适活性的酶)的共表达的另一个方面涉及到自处理植物材料(如马铃薯中的自处理块茎)。该实施方案包括用酶剪切预选择部分或靶细胞壁多糖片段，如果胶，其部分或片段可以进行也可以不进行发行(在后者中，该技术不包括共表达)。用一种贮藏在植物细胞中与底物的分离的酶在采集后剪切预选择部分或片段，即该酶在生长植物中不催化细胞壁多糖的任何改变。能产生这种剪切作用的酶的可能位置包括，但不限于液泡、内质网、细胞质和质体。根据在植物中的稳定性和该基因产物对植物的毒性来选择位置。但是，如果能利用一种在室温下能基本失活的或在植物非原生质体pH范围(pH3-7.5)内能基本失活的酶避免与底物的互相作用(避免结合)，以便于在需要时合适地改变条件能使该酶激活，该酶也可以是直接贮藏在非原生质体中。激活处理包括(但不限于)加热、加入盐、加入有机化合物、物理处理(pH改变)、加入蛋白酶(例如切除修饰酶抑制部分的蛋白酶)、加入蛋白质(如修饰酶的另一种必需亚基)。
概括的说，在需要的情况下靶多糖在体内被修饰。植物在采集后被处理，如通过在酶具有剪切活性的条件下温育浸泡的植物材料，使贮藏的酶与其底物发生作用。然后在适于纯化的阶段回收释放的片段。该技术在两个方面优于使用工业酶：工业酶很少具有足够高的纯度使之只对多糖需要剪切的片段和部分作用而不会因为存在侧链活性而降解产物。许多植物器官、贮藏器官如马铃薯块茎，内源多糖修饰酶的含量非常低。而且，具有剪切活性的这种酶相对于工业酶来说能更好的与其底物接触，工业酶是另外加入的，其效果依赖于植物组织的均一化，不包括当酶和其底物在一起时或在其底物紧密相当的间隙中的情况。
下文的实施例3和10表明细胞壁多糖修饰酶在细胞内质网中的滞留及将该酶定位于液泡中。实施例12提供了设计自处理植物材料，包括释放修饰毛发区半乳聚糖酶的马铃薯块茎的具体策略的例子，该实施例也证实了基因产物在细胞质中积累。
迄今为止已有的技术应用，包括分子养殖剪切的寡和多糖。使用任何领域的技术可能使其它工业副产品的价值提高。来源于产糖甜菜产品的和来源于淀粉产品的果肉，是富含细胞壁多糖(包括果胶)的副产品的非限制性例子，其在天然状态下价值低，但可通过本发明的方法提高其价值。
医药应用包括提供药物化合物和药物材料，如伤口敷料、移植或植入材料、生物相容性的外科粘合剂、免疫调节化合物和血液凝结调节剂等。本发明的技术的用途不限于只是终产品的分子养殖，但是在发明的过程中是重要的。产生剪切多糖如果胶的植物，能用于包括一些医药用途的结构活性空间的聚合物库和寡聚物的库的系统发生，即在应用时功能不变的情况下描述允许的结构可变性。对于这些库的评价数据，怎样使用化学统计学多变量分析、QSAR(数量结构活性关系，quantitative structure activity relationships)和QSPR(数量结构特性关系，quantitative structure property relationships)是已知的。
为了实现本发明的目的，欲进行修饰，即属于微管植物的任何植物的复合细胞壁多糖的酶修饰，包括被子植物中的单子叶植物和双子叶植物。考虑到剪切果胶，双子叶植物和非鸭跖草苷(non-commelinoid)单子叶植物是特别重要的。相反地，在后者种类的一些种中修饰半纤维素聚合物是非常重要的，不仅饲料草和谷类。其他的用本发明可以修饰的商业上的重要植物包括，但不限于大豆、烟草、欧芹、胡萝卜、花椰菜、甘蓝、椰菜、马铃薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、甜菜、萝卜、红萝卜、菠菜、洋葱、大蒜、胡椒粉、芹菜、柳树、白杨树、倭瓜、南瓜、夏季南瓜、黄瓜、苹果、梨、甜瓜、李子、樱桃、桃子、油桃、杏、草莓、葡萄、树莓、黑莓、菠萝、鳄梨、番木瓜、芒果、香蕉、柑橘类、阿布属类、鸭草(duck weed)和番茄。在非维管植物中，藻类和海草是重要的。
在本发明的具体实施方案中，直接用酶来修饰果胶的毛发状区，如通过去除光滑区的毛发状区，和/或去除或缩短毛发状区的单个侧链。因此，为了产生其中的果胶的毛发状区在体内被修饰的转基因植物，表达这种酶的核酸序列是重要的。在本发明的涉及到“自处理植物材料”具体实施方案中使聚合物部分更好溶或使其从细胞壁其质中释放出来的酶是重要的。因此，本发明的关键是能切断所述多糖聚合主链的酶。
本发明的技术人员能意识到，本发明中的细胞壁多糖是植物细胞壁在数量上和功能上都重要的组分。必须承认对于修饰的程度可能具有某种天然存在的限制。因此很明显在本发明中进行的修饰就不会那么剧烈以至产生无生育能力的植株。在生长过程中，细胞壁的变化被削弱，从中产生的一些发展的变化可以获得部分细胞切除，从而开发为制备雄性不育和提到的其他目的特性的路线。另一方面，如上文所述，本发明者惊讶的发现对单糖分布和整个细胞壁多糖的连键形式进行明显的修饰是可能的，而且植株还保持生育能力。基于这些惊人的发现，用本文的这些技术在体内对细胞壁多糖进行各种修饰而不牺牲植物的发育能力。
修饰复合细胞壁多糖的方法
根据本发明，可以用几种不同的方法在植物中或在采集所述的植物材料后修饰复合细胞壁多糖，下文将作简要的介绍：
(i)通过调节与复合细胞壁多糖的生物合成直接相关的植物基因，如转化和聚合步骤(通过操纵富集池的大小和底物分子的运输)或通过表达多糖修饰酶来干扰聚合物的生物合成来操纵生物合成，其中多糖修饰酶在被翻译和进入分泌路径后被保留在高尔基体中，因此在果胶或半纤维碳水化合物合成的位置更新果胶或半纤维碳水化合物。
(ii)通过表达合适的具有信号的多糖修饰酶进行保存后修饰，其中该信号能确保酶在翻译后直接转移到非原生质体空间及细胞壁，于是在到达或被吸附到细胞壁中后与酶底物直接相互作用。
(iii)采集后释放一种或多种在植物中产生的多糖修饰酶，接着在合适的细胞器官中进行翻译后积累或通过选择那些仅仅在采集后条件下具有活性而在活体植物中无活性的酶来间接隔室化。
细胞壁多糖修饰酶的器官/组织特异性表达
本发明欲定点表达多糖修饰酶，仅仅使所给植株的某些部分的细胞壁多糖被修饰，使更大范围的细胞壁多糖的体内修饰成为可能。例如，想在马铃薯中，仅仅在块茎中表达多糖修饰酶，而植株其他部分保持他们原有的多糖结构。
根据本发明的这种定点表达多糖修饰酶可以通过使用组织特异性调控序列来实现。在现有技术中许多组织特异性序列是已知的。
例如，US 5,723,757公开了使用植物基因的5’转录调控区确保目标DNA序列的“接收组织”特异性表达。该转录调控序列使目标DNA序列的表达特异地发生在“接收器官”，即植物地光合成失活部位，如根、谷粒、果实或块茎。于是，目的基因产物在某种组织中或被表达或被抑制。该调控区特别的来源于编码patatin蛋白的基因，该基因属于I类patatin基因。
US 5,436,393公开了一种含有来自马铃薯的patatin基因的马铃薯块茎特异性调控区表达盒DNA序列，特别的是patatin基因的B33启动子序列。用该表达盒转化马铃薯细胞可能产生转基因马铃薯植株，在该植株中，异源的DNA序列与B33启动子序列融合，能在块茎中特异性表达。
其他已知的指导在块茎中表达的启动子包括来自马铃薯的推定的金属羧肽酶(metallocarboxypeptidase)抑制剂(登记号为U30388)，马铃薯脂肪氧化酶(登记号为X95513)和组织蛋白酶D抑制剂(登记号为X74985)。本领域的技术人员能够剪切其他具有目的特异性的启动子区，与目标多糖修饰酶构建出嵌合基因结构。因为至少一些块茎特异性启动子的器官特异性是由于他们的蔗糖可诱导性，因此这些启动子经常用于其他的蔗糖积累的种中，例如，甜菜根(烟草叶中的GBSS启动子的活性将在实施例10中说明)是不奇怪的。相反，对于本领域的技术人员来说，蔗糖可诱导的启动子可以从其他种物种中分离，且发现不仅仅在其来源植物中具有器官特异性，在马铃薯中还具有块茎特异性是不奇怪的，确保高表达(如在马铃薯块茎中)的启动子包括GBSS和B33启动子。
修饰植物细胞壁多糖的生物合成
利用在不同合成水平起作用的酶修饰果胶或半纤维多糖的机会：(i)保持核苷糖的聚集，(ii)特定主链的多聚化，和(iii)用多种取代基(糖基、甲基和乙酰基)修饰这些主链。
根据本发明，可以通过使多糖修饰酶定位于高尔基体干扰生物合成实现干扰生物合成。构建这种酶，使其能锚定在膜上，于是保持在高尔基体上，或者将其作为可溶性酶定位在高尔基体上，最终和细胞壁多糖一起分泌到非原生质体中。惊奇的发现，锚定在高尔基体膜上的酶成功地与结合在膜上地生物合成复合体发生反应。因此，膜锚定和可溶性变体，都具有所期望的高特异性。该实施方案还提供了一种解决由于一些分泌多糖水解酶对植物的毒性而产生的问题的方法。
几个证据支持通过用诱导的酶降解植物细胞壁释放的寡聚半乳糖醛酸能引起植物细胞中的特异性反应的观点(Moloshok等，1992)。因此，根据本发明可能一种或几种用于植物细胞的体内修饰的潜在候选酶将会释放碳水化合物类寡聚物，这些聚合物能引起与寡聚半乳糖醛酸所引起的相似的反应。
已经发现来自烟草N-乙酰葡糖酰氨转移酶I的N末端的77个氨基酸足够滞留Nicotiana benthamiana细胞高尔基体的报告蛋白。Essl等(1999)和Dhugga等(1997)克隆了在多糖合成有暗示作用多肽，这些多肽和高尔基体相关联，不是整合的蛋白(Pisum sativum可逆型糖基化多肽(RGP1)U31565)。来源Arabidopsis的一种乙酰葡糖酰氨转移酶AJ243198和一种木糖转移酶AJ272121已经被鉴定。完成Arabidopsis基因组的序列测定之后，本领域的技术人员都知道怎样寻找能量外产生高尔基体定位基因产物的基因组。当鉴定出其它可溶的和整合的植物高尔基体蛋白后，其序列可用于构建高尔基体定位的多糖修饰酶。目前，有利的事实是至少有一些高尔基体靶序列在不相关物种中都具有功能。在本发明的一个具体实施方案中，可用来源于鼠基因的一个序列，该序列在实施例8中将被证实。
细胞壁多糖的沉积后修饰
下文的实施例5描述了利用真菌半乳聚糖酶使细胞壁多糖的预选片段或部分，例如果胶的毛发状区的单糖分布发生定点改变，半乳聚糖侧链被缩短到一定程度，使该侧链不再与酶发生反应。植物通过增加糖醛酸的相对和绝对含量和增加乙酰化程度来补偿。
在本发明中，半乳聚糖几乎不含有或不含有短的单糖侧链修饰(一般是阿拉伯糖基修饰)，因此共表达辅助酶是不必要的。对于必要的情况，本发明的一个具体实施方案使用含有目的发造酶外加辅助酶的双构建体，在处理过程中辅助酶起辅助作用，见实施例4和9。
此外实施例2和7描述了鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶的表达，即一种能切断果胶毛发状区主链，能够剪切果胶聚合物而对乙酰基和甲基酯修改不反应的酶。其中，辅助酶，一般为鼠李糖聚半乳糖醛酸或同型聚半乳糖醛酸乙酰酯酶或甲基酯酶，和主要的改造酶共表达从而使主链切断不属于上述情况。
采集后修饰和自处理植物材料
同上文解释的那样通过在植物组织中贮存一种和多种酶设计自处理植物材料，如块茎，使其中的酶在体内不能和它的/他们的底物发生反应，而在采集后剪切目标片段。这种表达可以和在生长过程中催化靶细胞壁多糖改造的附加酶协同表达。如上文所述，在植物生长过程中处理酶的汇集可以是液泡、内质网、细胞质和/或质体，也可以是化学汇集。内部贮藏的酶可以利用KDEL滞留信号定位在内质网或者利用来源于patatin或sporamin的信号序列定位在液泡。
接着进行采集后处理，一般为匀浆或软化形式的物理处理，使内部贮藏的酶与细胞壁多糖接触从而催化细胞壁材料的采集后修饰。采集后修饰的一个重要且有意义的实施方案是从浆汁材料中释放体内修饰的聚合物。以剪切过的果胶毛发状区作为例子，通过酶的作用切断果胶的光滑区释放出聚合物。下文的实施例12描述了将植物或真菌内源性多聚半乳糖醛酸定位到细胞质、液泡和滞留在内质网(ER)。在这些点内部，根据稳定性和酶在每一位点获得的积累以及当贮存在不同位点时酶对植物可能的毒性来挑选细胞内位点。根据内部贮存的酶的特性、在植物组织中对内源性酶的阻碍、恢复的聚合物或寡聚物稳定性可能来选择自处理植物材料的软化和温育条件。根据上文描述，我们能够明白酶或许需要一种辅助酶，因此，可以制备三元的或更高级别的载体结构来扩展本发明的该实施方案。
具有能从细胞壁多糖网孔中释放果胶多糖属性的酶特别包括那些能切断多糖主链的酶(任选地在辅助酶地协助下)。果胶和果胶酯水解酶和裂解酶、鼠李糖聚半乳糖醛酸水解酶和裂解酶是公知地具有这种特性的酶。对木糖聚半乳糖醛酸具有活性的酶同样是有用的，他们被作为对多糖主链的特别结构特征具有活性的例子。在本发明中，能除去果胶侧链的酶被认为是主要的改造酶。但是很明显侧链的去除将促进特定寡糖的溶解。
很明显，将酶进行内部贮藏的技术可以用于分子养殖。同样地，很明显该技术可以用于制造功能性饲料。“功能性饲料”是指家禽和牲畜的饲料，在该饲料中一种或更多地细胞间积累的多糖修饰酶提高了植物材料自身和与其混合的其他饲料成分的可消化性。实施例10证实了在马铃薯叶的内质网中积累了阿拉伯聚糖酶。
修饰的果胶或其片段在食品工业上的应用
果胶是一种重要的食物添加剂和配料，是决定植物材料结构的重要因素。果胶的结构修饰，特别是在分子严重分支的区域(毛发状区)将改变聚合物的物理特性和细胞壁材料的性质。该技术调控中性糖侧链和同型聚半乳糖醛酸的比例。食品工业主要感兴趣的，与这个比例相关的果胶的功能性质包括凝胶性、凝胶的稳定性和水结合效率。当毛发状区的比例较高时聚合物的水结合效率较高，当同型聚半乳糖醛酸的含量高时凝胶性和凝胶的稳定性较好。
由于马铃薯果胶具有高的中性糖含量和存在乙酰基阻碍凝结，所以没有发现其在食品应用中有任何用途。从历史的观点来看，高质量的柠檬和酸柚果胶一般被直接用于一方面为凝胶剂、果酱等(高甲基酯果胶)和另一方面为低糖产品(低甲基酯果胶，如果胶酸钙)。但是，在最近二十年中，应用领域已经扩大，现在包括用作乳化剂和稳定剂和烘干前作为产品的衣壳。果胶来源的分子的新的应用包括用作可饮用性节食纤维。其中有一个问题是果胶有很高的粘性。但是，已经证实，当降解果胶中的同型聚半乳糖醛酸部分时，鼠李糖聚半乳糖醛酸部分(修饰过的毛发状区，MHR)保持同样的纤维效果，而其粘性大大降低(EP 0868854-A2)。通过本发明从剪切过的马铃薯果胶产品中能得到相似的MHR。优点是马铃薯浆汁原材料的两个特性：低消耗和原材料丰富。理想地，在淀粉处理过程中，马铃薯中的PG活性被激活，直接在马铃薯的汁液中，如自处理块茎中修饰毛发状区。这样处理淀粉比较容易且修饰毛发状区的耗费低。淀粉的易化处理可以是由于提高了可萃取性或者是由于“较少包装”的块茎细胞，即作为细胞壁的一种有意剪切或作为一种果胶修饰的副作用的细胞的细胞壁变薄。除了只与贮藏器官相关的淀粉抽提外，与一些(丰富的)原料的果胶量低相关的问题，及本技术提供的方法，都不是是马铃薯特异性的。该技术也适合用于其他农作物，如产糖甜菜。
更进具体地食品应用还需要控制水结合能力和粘性和聚合物溶液的“口感”。鼠李糖聚半乳糖醛酸，无论是原有的还是剪切的，可以用于低粘度产品如牛奶shakes、饮用型酸乳等。
果胶加工技术可以更进一步地用于果汁、苹果酒和葡萄酒工业，因此，与葡萄、苹果和其他水果有关。果汁和鲜葡萄汁经常要过滤以除去水状胶质和悬浮的寡聚和多糖，从而使果汁澄清，防止在后续处理步骤中产生浑浊或沉淀。过滤剪切的果胶以增加稳定性，或相反的增强可沉淀性。本发明提供控制这些果汁和鲜葡萄汁性质的新方法，这些果汁的性质依赖于可溶解和悬浮的果胶聚合物。
最后，因为果胶调节细胞壁的孔隙(Baron-Epel等，1988)，所以剪切的果胶可能会影响钙的固化和罐头制造的相似处理过程。于是本发明利用含有上文描述的修饰果胶的植物材料，提供了一种提高植物材料食品工业可处理性的方法，一般地如在罐头制造、钙固化、过滤等。
修饰过的植物细胞壁多糖的医药用途
除了上文讨论的修饰果胶多糖用于不同工业应用的多种可能性外，修饰细胞壁多糖包括修饰果胶基质，还可以用于药品和医疗领域的多种应用。例如本发明使在体内修饰细胞壁多糖的结构以产生具有特别属性，如免疫调节性的修饰多糖或成为可能。更进一步地，根据本发明制备和产生的修饰过的细胞壁多糖还适合于用作许多种炎症反应的消炎化合物的广泛应用，无论是因为什么原因，包括物理损伤、化学试剂和生物试剂，如细菌、真菌、病毒和其他微生物引起的炎症。
剪切的复合细胞壁多糖的应用涉及到两个基本领域：药学的和医学的材料。目前用来制备用于慢性的、未愈合伤口、牛皮癣(对于疾病具有一种自我免疫的成分)导致的伤口、坏疽的伤口和造口术成品伤口敷料的材料几乎完全依赖于藻酸盐和根据物理性质挑选的修饰的纤维素(他们一般含有许多果胶和半纤维素聚合物)。对于治疗各种形式慢性伤口的伤口敷料，物化属性是重要的。这些属性包括胶凝能力和胶凝强度、水结合能力、电荷浓度和亲水性。对这些属性与植物多糖的食品工业应用的关系进行研究。修饰过的细胞壁多糖能够产生水缓冲系统的作用，在其中敷料既可以除去伤口中的水，也可以将水提供给干性坏疽以使细胞免疫系统能够进入表面。但是，果胶的生物学活性是果胶所独有的。需要的生物活性包括果胶作为细胞生长因子池，从而促进慢性伤口中的细胞生长的潜能。
另一个有意义的方面是利用果胶膜作为预移植的皮肤细胞再生长的支架。
用作抑制自身免疫过程或预防或治疗免疫过程影响的药物的用途是可以预料的可以用于较宽范围的疾病。某些形式的溃疡被认为与自身免疫有关，并发现在这种情况下果胶的结构(可能是鼠李糖聚半乳糖醛酸)有活性(Sakurai等，1998)。更进一步，这种与自身免疫有关的疾病的非限制性例子包括：自体免疫型肝炎、初级胆硬化、初级硬化型胆管炎，自体免疫型溶血型贫血症、Grave’s病、肌无力、I型糖尿病、炎性骨骼肌变、多发性硬化、淋巴瘤性甲状腺肿、自体免疫型肾上腺炎、Crohn’s病、溃疡性结肠炎、血管球性肾炎、渐进式系统硬化症(硬皮病)、Sjogren’s病、红斑狼疮、初级血管炎、风湿性关节炎、原生性关节炎、结缔组织综合症、牛皮癣、天疱疮(Pemfigus)、类天疱疮(Pemfigoid)、疱疹样皮炎等。
修饰的果胶和其他的多糖的另一种可以预料的用途是能用来治疗一些形式的癌症。有证据表明，修饰过的柑橘类果胶(MCP)能治疗多种形式的癌症，包括恶性黑素瘤(皮肤癌)和前列腺癌。这种效果被认为是与MCP在转移的早期阶段具有抑制细胞生长或抗粘连活性有关(Ralph W.Moss，http：/ralphmoss.comlmcp.html)。通过使用本发明的方法来鉴定和制备修饰的果胶多糖，我们相信适合于用来作为抗癌试剂的包括修饰过的果胶糖在内的细胞壁多糖能够开发，且能够商业制备，例如通过分子养殖技术。
在医学领域的应用并不严格限制在药学的和医学的材料，还与在先发现阶段有关，即作为制备细胞壁多糖寡聚和多糖文库和鉴定该寡聚和多糖所需药物活性的所必需的结构的工具。例如，合成的果胶聚合物包括重复结构，这些重复结构又由其他的更小的重复结构组成。然而本文的改造技术不改变果胶聚合物的性质发生改变的事实，可能会产生分子群，其中这些分子的差别是相当清楚的。例如，实施例5描述的来源于能表达内源性半乳聚糖酶的块茎的鼠李糖聚半乳糖醛酸和相应的野生型多糖相比，其半乳聚糖毛发的长度、乙酰化程度和糖醛酸含量是不同的。因此可以鉴定这些特征是否是所观察生物活性所必需的。
以果胶作为例子，入口不同的已知(即使还不知道其精确结构)文库能用以下步骤制备：
1)从一些转基因植物收集剪切的果胶，其中每种转基因植物以精确限定的方式产生修饰的多糖。
2)将步骤1中的样品再分离，在体外用酶进行采集后处理。
3)将步骤2中的样品再分离，在体外通过化学处理，如皂化和部分水解及衍生的方法进行修饰；后者包括但不限于预甲基化、乙酰化、环氧化和酰氨化。衍生的方法的类型和方法本身是食品工业、纺织工业和有机物合成和碳水化合物光谱学领域公知的。
如果需要，步骤2和3可以以相反的顺序进行，于是化学修饰的目的是保护或使分子的一些部分暴露于酶反应。
然后，用现有技术已知的监测方法监测文库的医药活性。当特定化合物的结构和功能的关系变得明显时，这提供了有用的信息来决定是否要转移一些用于采集后的酶处理剂(步骤2)到植物上(植物的补偿允许，从而制备出转化植物以用于起始材料的分子养殖，其中起始材料通过体内处理果胶的方式被尽可能剪切。
将通过下文的非限制性实施例和附图对本发明作进一步的描述。
图1显示了使用探测性主成分分析(PCA)来区分野生型和两种表达来自野生型棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)内源性半乳聚糖酶的转基因马铃薯植株T11.1和T13.1，用第三和第五主成分(PC)数值将T13.1和野生型作了对照；
图2显示了鼠李糖聚半乳糖醛酸(RGI)大小排阻色谱分析(通过折射率检测)(任意单元)，RGI特异地分别从经过真菌EPG和PME的联合处理的野生型马铃薯块茎(WT)和转基因马铃薯植株T11.1和T13.1的细胞壁中分离出来。相对于野生型，这种EPG/PME处理从转化块茎的细胞壁中释放出两倍的糖醛酸(UA)。如同UA含量和折射率检测所显示的那样，用EPG/PME从细胞壁中抽提出的RGI含有两种主要的成分：成分A(分子量大于500Kda)和成分C(分子量为0.2-8KDa)。T11.1和T13.1中EPG/PME抽提物与野生型的不同，含有较少的成分A，更多的成分C，另外还有野生型中不存在的小于120KDa的片段(成分B)。其中的星号表示不含果胶材料的样品缓冲盐的存在而导致的大波峰；和
图3表示野生型(A，C)和表达内源性半乳聚糖酶(T13.1)(B，D)的马铃薯块茎的切面，其用单克隆抗体LM5金标记，银增强，通过反射聚焦扫描显微镜(A，B)和透射电子显微镜(C，D)观察。野生型的实质细胞的细胞壁被强烈标记(A中的白色，C中的黑色颗粒)，但是在T13.1的块茎中，标记的密度大大降低，且标记的位置仅仅在靠近质膜(D中的箭头)的一些细胞的角落(B中的箭头)。星号代表淀粉粒曾经占过的空间。ML表示这些填满的角落中膨胀的中央薄片。比例：A和B是100mm，C和D是2mm。
实施例
材料和方法
试剂和酶
除非另有说明，常规分子生物学方法所用的所有酶都是从丹麦的Boehringer购得。用于细胞壁性质的化学药品和试剂都是从Sigma公司购得。猪胰腺α-淀粉酶是从Merck(Darmstadt，德国)购得，来自Bacillus acidopullulyticus的支链淀粉酶和来自黑色曲霉的内源性多聚半乳糖醛酸酶从Megazyme International(Bray，爱尔兰)购得，纯化的来源于棘孢曲霉的重组果胶甲基酯酶(PME)是由KirkSchnorr博士(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，丹麦)赠与的。
植物的转化
烟草(Nicotiana tabacum(L.))cv.Xanthi.叶盘的转化基本上与Horsch等1985所描述的相同。来源于转化植物和野生型植物的体外节间被转移到温室中使之发育成成熟植株。采集叶子用于分析。马铃薯、cv Posmo和Karnico用于根瘤土壤杆菌介导的转化(Visser，1991)。将在体外转基因的枝条和对照克隆转到温室中使之发育成成熟植株。
DNA分析
根据Rogers和Bendlich(1988)所描述的CTAB方案从在液体N2中研磨的叶子中抽提取DNA。为了鉴定转基因克隆中转基因的存在，分离基因组DNA，用在cDNA中剪切两次的EcoRl和在cDNA中剪切一次的Kpnl消化。电泳分离消化的DNA，根据Sambrook等描述(1989)的方法在碱性条件下将其印迹到Hybond N膜(Amersham)上。如同alehuzzaman等(1992)所描述的方法，用32P-ATP标记的鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶/pYES2的1kb的Kpnl-Xbal cDNA片段来杂交膜。
RNA分析
用Kuipers等(1994)所描述的方法从每个转基因系的一个块茎中抽提RNA，将组织(5g)在液体N2中研磨，和5ml的抽提缓冲液(50mMTris，pH9.0，10mM EDTA，2％SDS)和5ml的苯酚混合。离心(2，000g10分钟)该混合物，用5ml的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提上清，再次离心混合物。用5ml的异丙醇沉淀核酸，离心(10分钟，2000g)，将沉淀溶解到1125ul的H2O中。加入375ul的8M LiCl在0℃条件下过夜沉淀RNA并离心(10分钟，13,000g)，将RNA沉淀溶解到0.4ml的水中，用40ul的3M NaAc和1ml的乙醇沉淀。离心后用70％的乙醇冲洗沉淀，干燥，重悬于水中。按Sambrook等(1989)所述方法，每个样品用40ug的块茎RNA来进行RNA凝结印迹和杂交。用32P-ATP标记的cDNA探针：鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶/pYES2的1kb的Kpnl-Xbal片段和马铃薯28S核糖体RNA基因的2.3kb的EcoRl片段(L和smann和Uhrig，1985)来杂交膜。
叶和块茎抽提物的制备
将新采集的叶片冷冻于液体N2中，每克组织(鲜重)加入3ml的抽提缓冲液A(25mM NaOAc pH5.0，含有完整的TM，BoehringerMannheim)，用研棒和研钵研粹。在冰上将样品保温10分钟，离心(18,000xg)10分钟沉淀不可溶物，回收上清，在20℃下保藏。将新采集的块茎切成小块，在液体N2中冷冻，用电子研磨机研成粉末。根据上述方法用抽提缓冲液A抽提粉末。
半乳聚糖酶活性分析
利用含0.5％上层和1％下层琼脂(在pH4.5的50mM柠檬酸钠中)的平板法测定酶活。上层含有悬浮的底物：天青蛋白偶联的马铃薯半乳聚糖(Megazyme International，Bray，爱尔兰)，浓度为1mg/ml。部分(20ul)组织上清加到上层所打的孔中，将平板在室温下保温24小时。
可溶解的半乳聚糖酶的定量分析.对野生型和转化体(T11.1和T13.1)中的块茎抽提物中的内源-半乳聚糖酶活性进行分析，方法是：以0.1mNaOAc(pH4.0)中的浓度为0.1％的马铃薯半乳聚糖(从Megazyme购得的P-GALPOT)作为底物，在40℃下利用p-羟基苯甲酸杂交分析法分析。
阿拉伯聚糖酶活性分析
利用含0.5％上层和1％下层琼脂(在pH5.5的50mM柠檬酸钠中)的平板法测定酶的活性。上层含有悬浮的底物：天青蛋折偶联的马铃薯半乳聚糖(Megazyme International，Bray，爱尔兰)，浓度为1mg/ml。部分(20ul)组织上清加到上层所打的孔中，将平板在室温下保温24小时。
曲霉菌RG-裂解酶测定
将冰冻的马铃薯组织在加有液态氮的研钵中研碎。用Ultra-Turrax TP 18-10(14,000rpm，ka Werk，Staufen，德国)在2ml含有0.4M NaCl的0.25M磷酸钠缓冲液(pH6.5；4℃)中将约1g的马铃薯组织研粹，在4℃抽提(周期性摇晃)1小时后，离心(10分钟，2,000g)悬浮液。上清用作酶抽提物。
然后，将5ul的上清加到245ul 0.25％w/v的皂化的苹果MHR(溶于0.1m，pH5.0的磷酸缓冲液)溶液中。在漩涡混合器中40℃保温15分钟，在100℃加热5分钟使酶失活。用HPSEC(BioGel TSK 40XL，30XL，和20XL柱系列)来测定皂化苹果MHR的降解。
SDS-PAGE和Western印迹
根据标准方法，进行块茎抽提物的SDS-PAGE和Western印迹分析。印迹用兔抗体来检测，该抗体对纯化的曲霉菌半乳聚糖酶(由哥本哈根大学的Jens-Christian Navarro Pulsen，Centre forCrystallographic Studies赠送)具有抗性。
傅立叶(Fourier)转化红外线微光谱分析
将来源于体外植物20片叶的剥落的表皮和来源于20个新鲜采集的野生型和转基因型(11.1，11.2和13.1)块茎的Vibratome切面(60um)封固在氟化钡窗口上，风干。该氟化钡窗口安装在Bio-RadFTS175c FTIR分光计的UMA500显微镜附件处，该分光计安装有液态氮冷却型碲镉汞检测器。挑选层皮和环髓区域的100um2的面积并取得光谱。收集在8cm-1的溶液和共增加的以提高每个样品信噪比的传输模式中的六十四干涉图。将光谱进行基线校正和区域标准化。使用WINDISCRIM软件(E.K.Kemsley，Institute of Food Reseach(食品研究学院)，Norwich，英国)在1800到800cm-1的区域进行区域标准化的光谱探测性主成分分析(PCA)。
分析转基因马铃薯块茎中的果胶
为了测定马铃薯植株中果胶的精细结构，首先必须从马铃薯块茎中分离细胞壁材料(CWM)。马铃薯块茎去皮，切成方块，在液态氮中冷冻。然后，将100g组织用Braun Multimix MR 860厨用切粹机(2×30秒，350watt)切成粉末。在300ml含有Triton X 100(2mg/ml)的阳离子混合缓冲液(10mM NaOAC，3mM KCl，2mM MgCl2和1mMCaCl2)中，4℃下用Ultra-Turrax T25(24,000RPM)7×60s将该粉末匀浆。加入几滴辛醇以减少混合过程中产生的泡沫。用冷却的阳离子混合缓冲液冲洗通过250和36um的网筛以除去其中的去污剂。这个过程在4℃下进行。除去网筛中的残余物质，在50％的冷丙酮中搅拌。过滤样品，倒入一个大炔杯中称重。加入5倍样品重量的饱和酚溶液。搅拌30分钟后，吸去饱和酚，在3级烧结玻璃漏斗上用阳离子混合缓冲液冲洗剩余物。
剩余物在液氮中冷冻成称小颗粒，在咖啡研磨器中低温研磨2×15秒，样品融化后立即与阳离子混合缓冲液混合成糊。迅速该糊搅拌将加到大体积的煮沸的阳离子混合缓冲液中，并煮沸30秒煮沸后后立即将混合物倒入到冷却的阳离子混合缓冲液(10倍体积)中迅速冷却。
在含有0.01％w/v NaN3的阳离子混合缓冲液中用1,500单位的α淀粉酶(Boehringer)和400单位的支链淀粉酶(Megazyme)除去淀粉。在轨道摇床上37℃搅拌样品过夜。如果还存在淀粉，用酶重复处理。用1％比Kl/0.5％I2在光照显微镜下检测淀粉的存在。当用Kl染色检测发现淀粉去除完全后，在36um的网筛上冲洗细胞壁以除去其中的葡萄糖和盐。剩下的物质冷冻干燥作为细胞壁材料。
根据Huisman等(1999)描述，用不同的溶剂抽提以分离获得的CWM。每1g的CWM用70ml 0.05M乙酸钠缓冲液，pH5.2在室温下抽提两次60分钟，用40ml 0.05M乙酸钠缓冲液，pH5.2在70℃下抽提三次45分钟，用35ml含有0.05M EDTA和0.05M草氨酸的0.05M乙酸钠缓冲液，pH5.2在70℃下抽提三次45分钟，最后用40ml 0.05M乙酸钠缓冲液，pH5.2在2℃下抽提三次45分钟。在每次抽提步骤后，将悬浮液在3级烧结玻璃漏斗上过滤。
于是产生5个不同组分：冷缓冲可溶性固体(CBSS)，、热缓冲可溶性固体(HBSS)、螯合剂可溶性固体(ChSS)、碱性可溶性固体(ASS)和富含半纤维素的残余物(Res)，每一种组分含有不同的细胞壁聚合物。在进行进一步的分析之前，将所有的组分都冷冻干燥。
用不同的技术鉴定CWM和组分：通过使样品被1M H2SO4水解(100℃下3小时)来鉴定中性糖的组分。然后，释放的中性糖转变为他们的糖醇乙酸酯，在Carlo Erba Fractovap 2300气相色谱仪(意大利的米兰(Milan，Italy))中用2mm的被3％0V275(Chrompack，Middelburg，荷兰)包被，装有Chrom WAW 80-100目的玻璃柱在200℃下分离，安装一个火焰电离检测器，设置为270℃，用环己六醇作为内部标准。
利用Voragen等(1986)的方法通过HPLC测定乙酰基和甲基酯化的程度。
果胶酶，例如多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲基酯酶、内源性阿拉伯糖酶、内源性半乳聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、半乳糖苷酶、果胶裂解酶、鼠李糖聚半乳糖醛酸乙酰酯酶，与高效大小排阻层析法(BioGelTSK 40XL，30XL，和20XL系列柱)和高效阴离子交换层析结合进一步测定果胶组分的结构，其中高效阴离子交换层析使用安装有DionexCarboPac PA-100柱(250×4mm，20C)的Dionex(Sunnyvale，CA，USA)Bio-LC GPM-II四梯度模式。但是溶解性问题会阻碍本实验的进行。
对野生型马铃薯的结构分析获得的结果将用来与转基因马铃薯果胶进行比较，使组分保持溶解状态而不将他们冷冻干燥被认为能解决酶定性过程中发生的溶解性问题。进一步地，利用MALDI-TOF MS通过研究纯的和很好定性的酶所释放的片段能获得额外的信息。
果胶多糖的分离
根据O’Neill等(1990)的方法，将脱淀粉细胞壁材料(10mg)悬浮在2ml含有0.05％叠氮化钠的pH4.5的50mM甲酸铵中。加入EPG(1u，每分钟1单位释放1umol的降解半乳糖醛酸酯)和PME(1u，每分钟1单位释放1umol的甲醇)，在40℃下温育悬浮液16小时。然后将悬浮液过滤通过一个双层尼龙(孔径30um)，从而使EPG/PME抽提物和残余的细胞壁材料分离，残余的细胞壁材料悬浮在1ml含有10mM硼氢化钠的50mM的冰冻碳酸钠中。悬浮液在4℃保温1小时，接着在室温下培养4小时，通过一个双层尼龙过滤除去不溶材料。将滤出液的pH值调到5，加入EPG(1u)，在40℃保温混合物4小时，使溶解的果胶材料部分解聚。这种被消化的溶解细胞壁材料命名为碳酸盐抽提物。
用Superose 12柱(1×30cm，Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典)进行EPG/PME和碳酸盐抽提物大小排阻层析。在抽提物上柱之前用50mM的pH5.0的甲酸铵平衡柱，用同样的缓冲液在0.4ml/min的低速下isocratically洗脱。用折射指数检测仪(Model131，Gilson，Middleton，WI)监测洗脱液，用m-羟基联苯分析法(Blumenkrantz & Asboe-Hansen 1973)测定收集的组分(0.8ml)的糖醛酸含量。富集某些组分，冷冻干燥，测定其单糖组成。将其滞留时间与标准葡聚糖(Fluka，Buchs，瑞士)和半乳糖醛酸的滞留时间相比较，估算流出液组分的分子量，
单糖组成分析
用Seaman水解法(Selvendran等，1979)水解的天然或不溶的细胞壁残渣进行单糖组成分析，而用2M TFA水溶液在121℃下作用可溶细胞壁组分1小时使之水解成单糖。Seaman水解法如下所述进行：将细胞壁残渣(2-4mg)加入到装有100ul超纯水的螺口硼硅酸盐测试管中，加入300μl浓H2SO4，悬浮液在室温下偶尔旋转放置3小时。然后用6.6ml超纯水稀释，100℃加热2小时。冷却后，用饱和氢氧化钡中和溶液。离心(1000 x gmax)5分钟除去BaSO4沉淀，剩下的上清液通过转子汽化浓缩，测定其单糖组成。
单糖混合物(5-15ug)加到Carbo-Pac PA10柱(Dionex，Sunnyvale，CA，USA)中，用1.5ml/分钟流速的水洗脱。向柱上加入氢氧化钠(300mM)，继续以0.5ml/分钟的流速连续洗脱，用脉冲电流检测计(Dionex)监测洗脱液。通过与标准糖(海藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖)的滞留时间相比较鉴定洗脱的单糖，通过比较各个单糖产生的标准曲线和整合其各自的波峰面积来定量洗脱的单糖。通过m-氢氧联苯法(Blumenkrantz和Asboe-Hansen 1973)测量每种单糖混合物中的糖醛酸含量。
测定酯化程度
根据Voragen等(1986)描述的方法通过HPLC估算乙酰基和甲基酯化的程度。
马铃薯块茎的免疫金标记
基本如同Bush和McCann(1999)的描述对转化子和野生型的块茎细胞壁进行性质分析。简要的说，用戊二醛固定的来源于野生型和转化子13.1的块茎的低温树脂包埋部分，用mAb LM5(识别1，4-β-半乳聚糖(Jones等1997))对该块茎进行免疫金标记，银增强，用上述McCann等(1992)的方法，用反射激光扫描聚焦显微镜和电子显微镜进行分析。
实施例1
用于植物转化的一般DNA构建体
DNA构建体pPGB121s-new
用聚合酶链反应(PCR)扩增载体pPGB121s(R.Visser赠送)中颗粒束缚的淀粉合成启动子区，引物序列是5’GATTACGCCAAGCTTTAACG3’(SEQ ID NO：1)和5’GGTTTGTCGACGAAATCAGAAATAATTGGAGG3’(SEQ ID NO：2)，从而在PCR产物的3’末端导入了一个HindIII 5’位点和一个SalI位点，另外，PCR方法删除了GBSS5’非编码区的一个假转录起始密码子。该产物通过琼脂糖凝胶电泳纯化，连接到pGUSNos(L.Sander赠送)的HindIII/SalI酶切产物pGBSS-GUSNos上。用HindIII和XbaI从pGBSS-GUSNos中切除GBSS启动子片段，纯化后，克隆到HindIII/XbaI消化的pBI121(Datla等1992)上，得到载体pPGB121-new。将该载体用Smal和Sacl消化，以除去GUS编码区。接着，用Klenow片段使Sacl粘性末端变平，通过连接封闭载体形成pPGB121s-new。
DNA构建体pPGB121s-B
用SalI和BamHI完全消化载体pPGB121s-new，通过琼脂糖凝胶电泳纯化。通过两个合成的寡核苷酸序列5’TCGACCGGTACCTAGGCCCGG’3(SEQ ID NO 3)和5’GATCCCGGGCCTAGGTACCGG 3’(SEQ ID NO：4)退火产生多(位点)接头，在Sall/BamHI酶切的载体上克隆该多接头。该步骤得到含有MCS的载体pPGB121s-B，MCS具有唯一的AgeI，KpnI，AvriI，SmaI和XmaI位点。
DNA构建体pGEd
用HindIII消化pPGB121s-new，接着在核苷酸存在的情况下用Taq酶在72℃反应7分钟填平粘性末端，从而除去HindIII位点。将得到的产物用琼脂糖凝胶电泳纯化并封闭连接，产生pPGB121s-new-DHindIII。通过用两种合成的寡核苷酸序列5’TCGACAAGCTTTCTAGAGCCTCGAGG3’(SEQ ID NO：5)和5’GATCCCTCGAGGCTCTAGAAAGCTTG3’(SEQ ID NO：6)退火产生新的多接头，将该多接头克隆到原始多克隆位点(MCS)的保留部分，产生质粒pGED。新的MCS导入了HindIII，XbaI和XhoI的限制位点。
DNA构建体pADAP
用SalI和BamHI消化pGED，通过琼脂糖凝胶电泳纯化。通过用两种合成的寡核苷酸序列5’TCG ACC GGT ACC AAG CTT GCG GGC TCT AGACTC GAG CCT AGG CCC GG’(SEQ ID NO：7)和5’GAT CCC GGG CCTAGG CTC GAG TCT AGA GCC CGC AAG CTT GGT ACC GG’(SEQ ID NO：8)退火产生一种新的多接头，将该多接头克隆到pGED的原始MCS的保留部分中，产生质粒pADAP。新的MCS导入了AgaI，KpnI，HindIII，XbaI，XhoI，AvriI和SmaI的限制位点。
DNA构建体pPGB121s-B-B33
用EcoRI消化载体pBINB33(L.Willmitzer赠送)，通过琼脂糖凝胶电泳纯化。通过寡核苷酸5’AATTCAAGCTTG 3’(SEQ ID NO：9)和5’AATTCAAGCTTG 3’(SEQ ID NO：10)退火产生一个编码HindIII位点的接头，将该接头克隆到EcoRI酶切的pBINB33载体中。该步骤产生载体pBINB33-EHE。为了分离含有patatinB33启动子的片段，用HindIII和SalI消化载体pBINB33-EHE。将得到的片段克隆到HindlIII/SalI消化的pPGB121s-B中，得到质粒pPGB121s-B-B33.
实施例2
进行植物转化的含有定位到非原生质体的多糖修饰酶的特异DNA构建体
DNA构建体pGED-GAL
用HindIII和XbaI消化切除载体pC1G1(S.Kauppinen赠送)，中编码棘孢曲霉半乳聚糖酶的1.3kb的cDNA，纯化并克隆到pGED MCS的相应位点，构建表达盒：GBSS启动子、内源性半乳聚糖酶、胭脂碱合成终止子。该DNA构建体被称为pGED-GAL。
pGED-ARA的构建
用HindIII和XbaI消化切除载体pC1A4(S.Kauppinen赠送)，中编码棘孢曲霉阿拉伯聚糖酶的1.2kb的cDNA，纯化并克隆到pGED
MCS的相应位点，产生质粒pGED-ARA。
DNA构建体pADAP-ARA
用HindIII/SalI消化，从pGED-ARA中分离出编码棘孢曲霉阿拉伯聚糖酶的1.2kb的片段，将其克隆进预剪切的pADAP，这一步产生载体pADAP-ARA。
DNA构建体pADAP-GAL
用HindIII/SalI消化，从pGED-ARA中分离出编码棘孢曲霉半乳聚糖酶的1.3kb的片段，将其克隆进预剪切的pADAP，这一步产生DNA构建体pADAP-GAL。
DNA构建体pPGB121s-B-B33-ARA
用KpnI和SmaI消化，从pGED-ARA中分离出编码棘孢曲霉阿拉伯聚糖酶的1.2kb的片段，然后将其克隆进预剪切的pPGB121s-B-B33中，这一步产生DNA构建体pPGB121s-B-B33-ARA.。
DNA构建体pPGB121s-B-B33-GAL
用KpnI和SmaI消化，从pGED-ARA中分离出编码棘孢曲霉半乳聚糖酶的1.2kb的片段，然后将其克隆进预剪切的pPGB121s-B-B33中，形成表达盒：Patatin B33启动子、内源性半乳聚糖酶、胭脂碱合成终止子。这一步产生DNA构建体pPGB121s-B-B33-GAL。
DNA构建体pPGB121s-new-RHGB
用限制性酶SalI消化植物转化载体pPGB121s-new，用Klenow酶消平末端，加热使这两种酶失活后，进一步用限制酶XbaI消化。用限制酶BamHI消化含有编码棘孢曲霉鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶cDNA的载体pYES2/RHGB，用Klenow酶消平末端，加热使这两种酶失活后，进一步用限制XbaI酶消化。琼脂糖凝胶电泳纯化被处理的载体和插入的cDNA，并进行连接，形成DNA构建体pPGB121s-new-RHGB。
实施例3
设计将基因产物定位到细胞间隙的构建体
DNA构建体pADAP1ARA-KDEL
以载体pGED/ARA为模板，用引物ACAGCTCAACAAGTGGTAAC(GBSSpro引物，SEQ ID NO：11)和GACTTCTCGAGTGGCTGG-CCTGTTGTGAAGGATGAACTTTAGTCTAGAAATGCTC(ARA-KDEL引物2，斜体表示编码KDEL ER停滞信号的核苷酸，粗体表示构建的终止密码子，SEQ ID NO：12)扩增编码阿拉伯聚糖酶的cDNA，根据制造商(Invitrogen)的方法将得到的产物克隆到载体pCR2.1-TOPO中。这一步产生不同的方向含有ARA-KDEL产物的载体pCR2.1-TOPO/ARA-KDEL1和2的混合物。
为了减少在PCR过程中由于错误导入而产生的表达问题的可能性，将大部分的ARA-KDEL编码区和来源于酵母表达载体pC1A4中的原始ARA cDNA的编码区进行交换。用SalI和XbaI剪切载体pCR2.1-TOPO/ARA-KDEL1和2，将产生的KDEL编码片段克隆进SalI/XbaI-酶切的pC1A4。于是产生载体pYES2.0/ARA-KDEL。用HindIII和XbaI酶切载体pYES2.0/ARA-KDEL，将得到的ARA-KDEL片段克隆到HindlIll/Xbal消化的pADAP中，产生载体pADAP/ARA-KDEL。
DNA构建体pPGB121s-B-B33-ARA-KDEL
用KpnI和SmaI从pADAP/ARA-KDEL中切除ARA-KDEL融合体，通过琼脂糖凝胶电泳纯化片段。将得到的片段克隆到KpnII/SmaI消化的pPGB121s-B-B33中，得到载体pPGB121s-B-B33/ARA-KDEL.
DNA构建体pPGB121s-B-B33-ARA-KDEL
用KpnI和SmaI从pADAP/ARA-KDEL中切除ARA-KDEL融合体，通过琼脂糖凝胶电泳纯化片段。将得到的片段克隆到KpnIl/Smal消化的pPGB121s-B-B33中，得到载体pPGB121s-B-B33/ARA-KDEL.
DNA构建体pADAP/ST-ARA
糖基转移酶α-2，6-唾液酸转换酶(ST)是II型膜蛋白，定位在高尔基体上。已经证明，该蛋白的头44个氨基酸指导融合标记蛋白，溶菌酶(Munro 1991)在高尔基体的滞留。另外，通过融合ST的52个N-末端氨基酸可以实现GFP的高尔基体定位作用(Boevink等.1998)。
最后，通过如下方法产生带有52个ST的N-末端氨基酸和内源性阿拉伯聚糖酶的成熟形式融合的构建体。用PCR扩增相关的ST区域，引物为(ST SOE FWD，下划线表示ST特异序列)5’GACGAAGCTTATGATTCATACCAACTTG 3’(SEQ IDNO：13)和(ST SOE REV，下划线表示ST特异序列)5’GGAGCCGGGGTTGGCGTA-GGCCACTTTCTCCTGGCTC 3’(SEQ ID NO：14)。Soren Mgelsvang赠送的质粒pST-MYC作为模板。然后扩增阿拉伯聚糖酶的成熟部分，引物为(ARA SOE FWD，粗体表示阿拉伯聚糖酶特异序列)5’GAGCCAGGAGAAAGTGGCCTACGCCAACCCCGGCTCC 3’(SEQ ID NO：15)和(ARA SOE REV，粗体表示阿拉伯聚糖酶特异序列)5’CAGTCTAGACTACACAACAGGCCAGCC3’(SEQ ID NO：16)。通过琼脂糖凝胶电泳纯化这两种产物，接着通过序列重叠延伸PCR融合(Higuchi1988)，使ST的52个N-末端氨基酸和阿拉伯聚糖酶的成熟部分(302个氨基酸)融合。用琼脂糖凝胶电泳纯化融合产物，HindIII和XbaI消化后克隆到HindIII/XbaI消化的pADAP中。产生的质粒命名为pADAP/ST-ARA。
实施例4
设计含有两种基因的构建体
DNA构建体pGED/double/1和pGED/double/2
用HindIII和EcoRl切割载体pPGB121s-B。将产生的含有GBSS-Tnos表达盒的片段用Taq酶将其末端填平，按制造商(Invitrogen)所述的步骤将得到的产物克隆到载体pCR2.1-TOPO中。这一步产生载体CR2.1-TOPO/GBSS-nosterm 1和pCR2.1 TOPO/GBSS-nosterm 2。用EcoRI消化每个载体，产生的片段用琼脂糖凝胶电泳纯化。将该片段克隆到已经用EcoRI消化的/并按制造商(BoehringerMannheim)的描述用碱性磷酸酶脱磷酸载体pGED中。这一步产生载体pGED/double/1和pGED/double/2，这两个载体含有两个GBSS启动子，其后接有含有SalI，HindIII，XbaI，XhoI，BamHI(MCS1)和SalI，AgeI，KpnI，AvriI，SmaI，XmaI和BamHI(MCS2)的多克隆位点。
含有编码修饰酶和辅助酶的DNA构建体pPGB121s-new-RHGB RHA1：
将载体pBI221(Clontech)用限制酶EcoRI消化，脱磷酸，苯酚/氯仿抽提，再用乙醇沉淀。磷酸化的寡核苷酸P-AATTAAGCTT(SEQ IDNO：17)自身退火，并连接到EcoRI消化的pB1221载体中，产生载体pB1221-2HindIII。
将载体pBI221-2HindIII用限制酶SacI消化，用T4 DNA聚合酶使末端钝化，加热使这两种酶失活后用限制酶BamHI进一步消化。凝胶电泳纯化被处理的载体(pB1221-2HindIII*B*Sb)。
含有编码棘孢曲霉鼠李糖聚半乳糖醛酸乙酰酯酶的cDNA克隆的载体pGEM-7Z/RHA1被限制酶XbaI消化，用Klenow酶使末端钝化，加热使这两种酶失活后用限制酶BamHI进一步消化。凝胶电泳纯化该处理过的插入cDNA，并连接到凝胶纯化的载体部分pB1221-2HindIII*B*Sb中，产生载体pB1221-2HindIII-RHA1。用HindIII限制酶消化载体pB1221-2HindIII-RHA1，通过凝胶电泳纯化含有鼠李糖聚半乳糖醛酸乙酰酯酶35S启动子、胭脂碱合成终止子的表达盒。
将DNA构建体pPGB121s-new-RHGB用限制酶HindIII消化，脱磷酸，凝胶电泳纯化，连接到纯化的HindIII片段中，该片段含有表达盒：35S启动子、鼠李糖聚半乳糖醛酸乙酰酯酶、胭脂碱合成中止子，产生DNA构建体pPGB121s-new-RHGB-RHA1。
DNA构建体pGED/apoGal/empty/1和pGED/apoGal/empty/2
用HindIII/XbaI消化pGED/GAL构建体，通过琼脂糖凝胶电泳分离产生的GAL编码片段。用HindIII和XbaI消化载体pGED/double/1和pGED/double/2，凝胶电泳纯化后克隆GAL编码片段，这一步分别产生两种设计的载体pGED/apoGAL/empty/1和pGED/apoGAL/empty/2。于是，这两种载体在第一个GBSS/Nos终止子表达盒中的GBSS启动子和Nos终止子间就含有了非原生质体定向半乳聚糖酶。
设计‘自处理’型双DNA构建体
从上述任何一个构建的载体中分离编码棘孢曲霉内源性半乳聚糖酶的1.3kb的cDNA片段，将其克隆到pGED/double/1或2的GBSS/Nos终止子表达盒中的GBSS启动子和Nos终止子之间，产生非原生质体表达盒GBSS启动子-内源性半乳聚糖酶-Nos终止子。该载体被命名为pGED/apoGAL/1和2，是用于设计所有的双链DNA构建体的起始载体。第二个GBSS启动子-Nos终止子表达盒用来构建将细胞壁修饰酶传递到细胞质、内质网(ER)或植物液泡中的表达盒。该酶优选的是采集后发生作用，并从细胞壁浆汁中释放有益产物的酶。在下文的实施例12中举例说明将非限制性地以内源性半乳聚糖酶作为改造酶，以内源性PG作为剪切酶。如下简述制备载体构建体，该构建体能引导内源性PG，并将其定位到不同亚细胞位点。
细胞质定位.为了细胞质定位，优选来源于植物、细菌或真菌的在中性pH环境下具有高稳定性的内源性PGs。通过除去内源性PG cDNA编码内源性PG信号肽的序列，使内源性PG不能转移通过内质网，从而达到定位在细胞质的目的。如果从蛋白质序列中不知道成熟蛋白质的N-末端序列，根据经验利用计算机程序优化地来确定信号肽的剪切位点达到目的。然后将编码成熟内源性PG蛋白的cDNA克隆到构建体pGED/apoGal/empty/1和pGED/apoGal/empty/2第二个GBSS/Nos终止子表达盒的GBSS启动子盒Nos终止子之间。
ER滞留.为了达到ER滞留，优选来源于植物、细菌或真菌的在微酸性和中性pH环境下具有高稳定性的内源性PGs。将编码四肽KDEL的序列连接到编码内源性PG的cDNA的编码区末端，产生在其C-末端含有KDEL的表达蛋白，从而达到定位于ER的目的。然后将编码融合蛋白的cDNA克隆到载体pGED/apoGal/empty/1和pGED/apoGal/empty/2第二个GBSS/Nos终止子表达盒的GBSS启动子盒Nos终止子之间。
液泡定位.为了实现液泡定位，优选来源于植物、细菌或真菌的在酸性环境下具有高稳定性的内源性PG。定位液泡可以通过如下方式完成：附加一个编码信号序列的核酸序列以确保将杂合体转移到ER，在其下游再连接一个液泡信号序列，如包含氨基酸NPIRL的序列(例如N-末端多肽(NTPP))。选择地，NPIRL序列或其类似序列可以融合到所述蛋白质的C-末端，而确保转移到ER的信号序列融合到预定位液泡蛋白质的N-末端部分(Koide等.1997)。
在N末端含有NTPP的蛋白中的一个例子是甘薯sporamin，已经证实当将蛋白质与该sporaminN末端部分融合时，sporamin的N末端能引导正常情况下液泡中不存在的该蛋白到达液泡。因此，可以将编码sporamin N末端部分的核酸序列直接融合到编码水解果胶主链的酶(如信号肽被删除)的核酸序列上，从而指导果胶酶的液泡定位。然后将编码融合蛋白质的cDNA克隆到第二个GBSS/Nos终止子表达盒的GBSS启动子盒Nos终止子之间，该载体被命名为pGED/apoGALvacPG/1。下面的实施例10和11分别描述了利用单一基因构建体将内源性阿拉伯聚糖酶定位到ER和液泡中。
实施例5
改造马铃薯中鼠李糖聚半乳糖醛酸的半乳聚糖侧链
在块茎特异的GBSS启动子的控制下表达一种真菌(棘孢曲霉)内源性半乳聚糖酶(Christgau等，1995)的马铃薯植株已经产生，见实施例2。与野生型植株相比较，除了低转化效率，外获得的植株表型没有什么改变。这种低效率可能表明启动子在体外培养过程中具有活性及在发育的早期阶段具有高活性的内源性半乳聚糖酶在转化细胞中变得无活性。在野生型马铃薯植株的块茎抽提物中内源性半乳糖酶的活性几乎检测不到，而在T11.1和T13.1中其活性水平分别是104和214umol等量半乳糖/分钟/g块茎鲜重(表2)。挑选T11.1和T13.1进行分析，是因为最初就用FIIR光谱挑选了它们的细胞壁表型。
在低浓度的盐缓冲液中定量抽提转基因植物中的具有活性的内源半乳聚糖酶，表明该酶与细胞壁是不紧密结合。用Western印迹法分析转基因和野生型植株的抽提物。所有具有内源性半乳聚糖酶活性的抽提物都含有一种与分离的重组内源性半乳聚糖酶相似的分子量为38kDa的蛋白质。
在细胞壁的分离和抽提过程中，必须采取几点措施以避免果胶材料被导入的内源性半乳聚糖酶和内源性果胶酶降解。用含有脱氧胆酸钠的缓冲液使蛋白质变性和溶解，其中的蛋白质被几种冰冻抽提缓冲液稀释，缓冲液中的pH值不利于植物果胶酶以及特别是导入的内源性半乳聚糖酶产生最佳活性。在制备细胞壁的过程中也不能检测到细胞壁抽提物中的内源性半乳聚糖酶活性。用傅立叶转化红外显微光谱仪进行转化体的初步筛选。探测性主成分分析(PCA)法能够清楚地将两种转化体T11.1和T13.1与野生型区分开来。图1显示了用第三和第五主成分(PC)数值比较T13.1和野生型的结果。于是，筛选这些转化子作进一步的分析。转化子中的细胞壁材料的产量比野生型的低，只是一些残余的淀粉(表2)。与野生型比较(表3)，两个转化子的细胞壁制剂中的单糖组分的半乳糖含量明显降低到～30％。在对一些单糖进行检测时发现标准差很大。但是，这种可变性与转化的表型没有关系，而制备的细胞壁中的残余淀粉几乎不变。半乳糖残基存在于不同的细胞壁多糖(半纤维素、阿拉伯半乳聚糖蛋白和RGI)中，但是仅仅只有RGI已知含有β-1，4-连接的半乳聚糖，所以我们后面进行的细胞壁材料分析主要集中在这种聚合物上。
通过用真菌EPG和PME联合处理，从细胞壁中特异地抽提出RGI。用这种EPG/PME处理方法从转化的块茎的细胞壁中释放的UA几乎是野生型的两倍(表3)，该EPG/PME可溶性果胶通过大小排阻层析进行分析，以根据分大小分离的消化片段。用EPG/PME从野生型细胞壁中抽提出来的RGI含有两种主要组分，如UA含量和折射率检测所示(图2)：组分A(分子量＞500kDa)和组分C(分子量0.2-8kDa)。来自T11.1和T13.1的EPG/PME抽提物具有与野生型不同的组成(图2)，其含有较少的组分A、较多的组分C和野生型抽提物中不存在的～120kDa量外片段(组分B)。其中的星号表示不含果胶材料的样品缓冲盐的存在而导致的大波峰。
如同糖分析的检测结果(表3)，野生型块茎的组分A含有高比例的UA、鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖，而不含其他任何单糖，表现高分子量的HGA和RGI聚合物。然而，尽管野生型块茎的组分A含有64mol％半乳糖残基，转基因块茎仅含有15-20mol％，这表明了半乳聚糖的含量大大降低。转基因块茎中的阿拉伯糖基含量稍微增加，UA含量大大提高。有趣的是，在转基因成分A中检测不到岩藻糖残基，但该残基在野生型组分A中存在，虽然百分含量很低(岩藻糖残基可以被马铃薯RGI的半乳聚糖侧链取代)。转基因块茎中的单糖组分A和B是相似的(表3)。来自野生型和转化子块茎细胞壁的组分C主要含有HGA片段，但也检测到一些小分子量的RGI片段。来源于转基因块茎的该RGI片段和组分A和B中的那些片段一样，与野生型块茎(3.8mol％)相比半乳糖基的含量(1.4-1.5mol％)也很低。但是，相当大量的葡萄糖基可能代表了细胞壁材料在细胞壁制备过程中被经α淀粉酶处理而释放出来的寡聚糖污染。
用EPG/PME处理酶学细胞壁并不能完全使细胞壁脱果胶。因此，接着还要在4℃和室温下用碳酸钠进行另外抽提(表3)。用碳酸盐去酯化只能溶解很少量的果胶，与EPG/PME抽提不同，野生型和转基因细胞壁制剂的产量是相似的。碳酸盐的大小排阻层析产生两种含UA的组分(数据没有显示)：一种在排出体积中(分子量＞500kDa)，另一种的保留时间与GalA相当，这表明存在单糖或小的寡聚糖。由于样品中存在高浓度的盐，所以不能分析后一组分中的单糖组成。对含有大的聚合物的抽提液进行单糖分析显示阿拉伯糖、半乳糖、UA和鼠李糖，可表示为RGI的比例很高(表3)。大量的葡萄糖残基和木糖残基可能来源于被碳酸盐抽提液溶解的木葡聚糖。转基因细胞壁的碳酸盐抽提物也显示相对于野生型半乳糖基含量降低(18-19％对52％)。另外，碳酸盐抽提液中存在的RGI中的阿拉伯糖基含量是不变的，而只是T13.1细胞壁制剂中的UA含量升高，但T11.1没有升高。
在用酶和碳酸盐缓冲液抽提处理后，细胞壁中可以残留果胶。比较相继用EPG/PME和碳酸盐处理的前后细胞壁的单糖组成以量化果胶溶解的效率(表3)。果胶抽提后在细胞壁中不能检测到鼠李糖，尽管只用中等灵敏度检测鼠李糖，这表明存在于未抽提的细胞壁中的RGI通过相继的抽提被完全除去。但是，野生型和转化的块茎的被抽提的细胞壁仍然含有相同量的半乳糖，这些半乳糖很可能不是来源于RGI，而是来源于其他的细胞壁组分，如木葡聚糖，已经知道该糖含有β-1，2-连接的半乳糖残基且该糖不会被内源性半乳聚糖酶水解。木葡聚糖只有通过浓碱或木葡聚糖酶处理抽提，因此可以预见其存在于用本研究方法处理的细胞壁中。有趣的是，在野生型的残余细胞壁中，UA的含量比转化子的残余细胞壁中的UA含量要高3倍，这表明提高了转化子中的果胶的可抽提性。
为了测定1，4-β-D-半乳聚糖是否已经被内源性半乳聚糖酶特异地水解，用识别1，4-β-D-半乳聚糖四聚体的单克隆抗体LM5免疫金标记野生型和T13.1的成熟块茎组织(图3)。
图3显示了用单克隆抗体LM5金标记，银增强，并用反射聚焦扫描显微镜(A，B)和透射电子显微镜(C，D)观察的野生型马铃薯块茎(A，C)和表达内源性半乳聚糖酶的马铃薯块茎(B，D)的截面。野生型的实质细胞的细胞壁被强烈标记(A中的白色，C中的黑色颗粒)。但是在T13.1的块茎中，标记的密度大大降低，且标记的位置仅仅在靠近质膜(D中的箭头)的一些细胞的角落(B中的箭头)。星号代表淀粉粒曾经占过的空间，ML表示这些填满的角落中膨胀的中央薄片，比例：A和B是100mm，C和D是2mm。
为了测定由于除去鼠李糖聚半乳糖醛酸(RG)分子的半乳糖而引起的结构上的改变，用Hakomori(1964)的方法测定来自T13.1和野生型对照的分离RG的连键形式，下面表1结果表明在末端半乳糖残基得到期望的增加的同时，几种形式的内在半乳糖残基大大减少，其中内在β-1，4-半乳糖残基降低到野生型水平的九分之一，且有许多低含量的连键在转化体中降低到检测水平以下。
从这些结果中，我们可以得出结论：从转基因细胞壁中分离出的所有RGI聚合物中的半乳糖含量大大降低，这表明分泌酶在细胞壁中具有活性，水解了RGI侧链中的大部分半乳聚糖。免疫定位显示几乎完全除去了半乳糖聚酶的底物，使毛发状区的半乳聚糖足够短以至抗体LM5和半乳聚糖酶都不能和他们结合。连键分析进一步证实了这些结果，并且证明不仅仅组成发生了改变，而且形成了新的鼠李糖聚半乳糖醛酸结构。电子显微图片显示在细胞壁朝质膜方向(细胞壁的最新合成部分)的那一面有少量的长的半乳聚糖，这表明新合成的半乳聚糖的沉积与半乳聚糖的去除发生竞争，虽然其去除过程占优势。这是第一次证实对植物细胞壁多糖的单糖分布和连键形式的修饰，结果见表1：表1.在野生型和转基因型马铃薯的细胞壁中糖苷键的含量(mol％)
at表示末端残基
bAraf表示阿抗伯糖基的呋喃糖形式
c表示大多数的4-Glc被淀粉污染
结论
所有从转基因细胞壁分离的RGI聚合物中的半乳糖含量大大降低，表明分泌酶在细胞壁中具有活性，水解了RGI侧链中的大部分半乳聚糖。免疫定位显示几乎完全除去了半乳聚糖酶的底物，使多毛去的半乳糖足够短以至抗体LM5和半乳聚糖酶都不能和他们结合。电子显微图片显示在细胞壁朝质膜方向(细胞壁的最新合成部分)的那一面有少量的长的半乳聚糖，这表明新合成的半乳聚糖的沉积与半乳聚糖的去除发生竞争，虽然其去除过程占优势。这是第一次证实对植物细胞壁多糖的单糖分布和连键形式的修饰。表2.内源型半乳聚糖酶活性和细胞壁产量a
a数据(±SD)是三次独立实验的平均值
b是通过m-羟基联苯法测定
c对抽提在材料和方法中作了具体描述表3.从转基因和WT马铃薯块茎中获得的材料的糖组成
a数据(±SD)是三次独立试验的平均值
b没有检测
c组分B在WT植物的EPG/PME抽提物中不存在(见图2)
实施例6
由patatin启动子驱动的半乳聚糖酶
基本上同实施例5所述一样，用pPGB1 21 s-B-B33-GAL生产转基因马铃薯植株，以使半乳聚糖酶由patatin启动子而不是由GBSS启动子驱动。对基因表达进行分析表明表达被有效地限制在块茎中，在其他地器官中，与GBSS启动子相比需要更高浓度的蔗糖诱导。在块茎中的表达与用GBSS启动子所发生的表达没有很大的区别。可以用LM5抗体对块茎进行免疫学分析，以证实块茎中的细胞壁表型并不依赖于驱动半乳糖酶基因表达的启动子。
实施例7
转化的马铃薯表达定位到非原生质体的鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶
用根癌土壤杆菌(见pPGB121s-new-RHGB和材料和方法部分的使用步骤)转化250个外植体。产生21个独立转基因系，其中的18用于本分析。一般来说，这些转基因植物是正常的，只有一些(18％)表型发生了改变。与对照相比较，这些植株比较小且叶较小。这些叶较浓密、粗糙而且卷曲。而且，这些植株相对于其他的转基因植株和对照颜色较深。所有的具有改变表型的植株在产生块茎之前都死掉了。在另外的试验中(用其他的基因转化)也发现了相似的表型，这表明是转化程序自身(如多倍化)的影响，不是特定的基因或构建体产生的影响。外表正常的植株生产出改变了表型的块茎。
对DNA、RNA和蛋白质水平进行初级分析后，繁殖目的系以产生更多的分析材料。将所有成功转化的转基因系(基于卡那霉素抗性)进行Southern印迹分析，在18个植株的15个中，检测到鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶(rhg-lyase)，在其他的所有植株中，该基因存在一个或两个拷贝。仅仅对那些真正产生了块茎的植株进行转化基因的表达分析。因此，仅仅从11个不同系中分离的RNA被用来进行Northern印迹分析。用马铃薯核糖体DNA片段作为探针进行的RNA凝胶印迹杂交表明在每个株系中RNA的量相等。用鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶作为探针杂交块茎RNA表明大多数植株(11个中的9个)的基因发生转录。这9个中作进一步的区分，其中的4个可以构建成高表达物，而其他的5个表现出较低的表达水平。有两个在Southern印迹分析中不表现出任何杂交反应，出现一个阴性结果。我们没发现转化基因拷贝(一个或两个)的数量与RNA表达水平间的关系。将能够检测到其转化基因发生表达的所有株系用于进一步的分析。表达RG裂解酶的转基因马铃薯植株的酶学性质表明9个RG裂解酶转化子中的3个表现出高的裂解活性(将底物完全降解为寡聚物)，而其他的有中度的(9个中的1个)、低的(2)或非常低的(3)活性。另外，发现mRNA含量和酶活性正相关。
发现RGL转化子块茎中的糖组成在作为鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶时和对照植株是十分相似的。下面的表4提供了来源于高和低表达转化子和野生型马铃薯的块茎的整个细胞壁的分析数据。其中鼠李糖含量下降了1.5-1％，显示毛发状区含量的下降。
表4.来自cv Karnico野生型和两种RG-裂解酶表达转化的总细胞壁中分离的细胞壁单糖组成，w/w％(上面)和mol％(下面)
开始以上结果可能是令人惊讶的，特别是考虑到块茎改变的表型时。该结果可作如下解释：在天然果胶中毛发状区被认为是互相连接的同型聚半乳糖醛酸序列(Shols & Voragen 1996)，鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶攻击这些互相连接的序列，但不能完全降解鼠李糖聚半乳糖醛酸，因此，相对比较少的毛发状区部分被作为寡聚糖避开源性鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶作用。鼠李糖(可代表鼠李糖聚半乳糖醛酸)是细胞壁中的一种含量相对较少的糖，半乳糖醛酸在细胞壁中较丰富，但大部分是同型聚半乳糖醛酸的残基。该新的细胞壁表型确实是一种结构性表型而不是组成型表型，可以用实施例5的细胞壁特定抗原决定基的免疫定位来描述。含有半乳聚糖和阿拉伯聚糖的鼠李糖聚半乳糖醛酸侧链，依赖与其连接的鼠李糖残基。值得注意的是表示毛发状区主要结构变化的这两种糖大大减少，从而导致很少中性糖侧链取代基。通过聚焦显微方法，用阿拉伯聚糖和半乳聚糖抗体免疫定位证实组成分析。进一步地，这些测试表明，含有paranchymal淀粉的细胞很少被这两种抗原决定基标记，而转化体中的皮质细胞在细胞的对半乳聚糖和阿拉伯聚糖标记在角落处增强。
实施例8
将酶活性定位到高尔基体
根据实施例6所描述的策略表达阿拉伯聚糖酶并将其定位到非原生质体中，以产生可利用半乳聚糖酶的烟草和马铃薯植株。烟草植株不显现任何可见表型，而大部分马铃薯转化子有部分的分生组织功能障碍。利用GBSS启动子控制阿拉伯聚糖酶，几乎所有的叶腋芽产生非功能性分生组织。因此，这证实了利用本发明能产生一种非支链的植物结构，并能控制植物的生长。
酶活性的高尔基体定位应该被视为分泌到非原生质体(不是作为‘自处理植物材料’贮藏酶的一种细胞内位点)的一种选择。利用技术的力量能够直接干扰多糖在高尔基体中的生物合成过程。这些技术为构建的选择提供了一个很大的范围，不考虑植物的可变性。
已经表明来源于兔的糖基转移酶α-2，6-唾液酸转移酶(ST)能被定位到植物细胞的高尔基体结构中，可以单独(Wee等，1998)，也可以以截短的形式与溶菌酶(Munro，1991)或绿色荧光蛋白(GFP)(Boevink等，1998)融合。因此，测定这种蛋白对多种异源蛋白在高尔基体中滞留的促进能力。ST是II型膜蛋白(即含有定位胞质的氨基末端)，包括在被转移到ER的过程中被翻译后剪切的信号序列，一个短的氨基末端细胞质区域，一个指导高尔基体定位的未剪切的疏水性信号锚定子和一个大的催化lumenal区域(Weinstein等，1987)。相应地，这种内部信号锚定子足够滞留任何与ST的N末端融合于这部分的异源蛋白质。这已经Boevink等(1998)和Munro(1991)被的工作证实，他们分别将ST的N末端部分的52个和44个氨基酸融合到小鸡溶菌酶(Munro 1991)和GFP(Boevink等，1998)中。
于是，兔唾液酸转移酶满足了将蛋白质结合到高尔基体膜上(与以可溶形式存在高尔基体中的蛋白质相反)一般需要。可溶性的蛋白质通过高尔基体，周期性地定位子质膜上，从而直接与细胞壁接触。
最后，利用重组PCR(Higuchi 1988)将兔唾液酸转移酶融合到棘孢曲霉阿拉伯聚糖酶地成熟部分，将产生的融合体导入到表达载体pADAP和pPGB121s-B-B33中，由此分别产生两个含有ST-ARA融合体并在GBSS和patatin启动子控制之下的构建体。利用电穿孔技术将该构键体转化到土壤杆菌中，该细菌宿主用来转化Nicotiana tabacum(L.)cv.Xanthi和Solanum tuberosum(L.)cv.Posmo.
利用差速离心来检测微粒体中酶定位的主要部分，利用常规细胞器分离法来检测高尔基体的定位(Ray等，1969，Gibeau和Carpita1990)。
分析含有ST-ARA融合体并在GBSS启动子控制之下的植株。利用阿拉伯聚糖酶平板法测定块茎抽提物中的活性酶的表达。用Western印迹来检测酶活性与微粒体部分的相关性，接着进行细胞器分离，可以测定与高尔基体囊泡相连的主要的阿拉伯聚糖酶，然而在可溶的非原生质体和细胞质部分及质膜中没有检测到酶蛋白。在内质网中的酶蛋白可以检测到，但水平较低，这代表了转移到高尔基体的新产生的阿拉伯聚糖酶。不能排除内质网被少量高尔基体囊泡交叉污染。这个试验的重要性在于证实了阿拉伯聚糖酶从可溶形式被转化成成膜结合酶，其主要目标是高尔基体。
如同实施例5一样，分析来自这些块茎的细胞壁的EPG/PME抽提毛发状区单糖组成。结果见表5：
表5从表达定位到高尔基体的内源性阿拉伯聚糖酶的野生型和转化子中抽提得到的毛发状区中的糖Mol％
总的来说，定位到高尔基体的阿拉伯聚糖酶的表达导致毛发状区结合的阿拉伯糖下降了50％，用聚焦显微技术观察阿拉伯聚糖特异性抗体标记的图铵证实了该组分数据。这是第一个利用任何方法定位干扰复合多糖在高尔基体中的生物合成的例子。
实施例9
含有辅助酶的双构建体
根据体外的研究已知，假如将鼠李糖聚半乳糖醛酸酶与鼠李糖聚半乳糖醛酸乙酰酯酶组合使用，前者的作用要大得多。因此，构建双构建体以在马铃薯块茎中表达这两种酶，见实施例4中的pPGB121s-new-RHGB-RHA1。转化马铃薯植株，得到21个单独的转基因系，没有发现任何重要的表型改变。但是我们确实希望这两种酶的组合比只存在rhg-裂解酶的转化子能带来更大的影响。当裂解酶单独活跃时，预计表型是相似的。
实施例10
使多糖修饰酶在ER中滞留
由于在ER中滞留与此处定义的‘自处理植物材料’的相关性，下文以在ER中的滞留为例说明。在本发明的优选实施方案中，剪切多糖主链的酶，典型的如水解酶或裂解酶被滞留在ER中。在植物材料匀浆中，使酶与细胞壁接触，回收上清部分中的可溶性成分。在这儿用阿拉伯聚糖酶作为例子来说明ER滞留，其他的相关酶在下列表12中列出。
WO 94/20611的SEQ ID NO：1表示的阿拉伯聚糖酶被发现对马铃薯具有毒性，至少当其被分泌到非原生质体中时具有毒性(Libiakova等.，1999)。在本实验中用烟草来证实内质网中活性形式的多糖修饰酶的积累。如同材料和方法中所述，基因是烟草cv.Xanthi中内源性阿拉伯聚糖酶的KDEL标记的变体，被基于pADAP的含有阿拉伯聚糖酶-KDEL cDNA的构建体转化。
用平板法测定转化植株的叶抽提物中的酶积累(见材料和方法)，所有成功的转化植株均产生活性的阿拉伯聚糖酶。该方法是半定量检测，但在15分钟内(不同的转化株有一些变化)能检测(在含有样品的孔周围的蓝晕超过1mm)到的天然叶抽提物中的酶活性很明显。通过差速离心可以证实有可检测量的酶存在于微粒体部分，表明在ER发生滞留。用Husted等(1995)的方法分离烟草叶中的非原生质液体。在非原生质液体中可能不存在具有检测量的阿拉伯聚糖酶活性，这就证明了酶没有被错误地分泌到非原生质体空间。
实施例11
将酶定位到液泡
与在ER中的滞留一样，液泡定位的例子将在上下文中的“自处理植物材料”中看到。在实施例3中已经给出了一种能定位到细胞内间隙的单基因构建体。在液泡的酸性环境下能稳定存在的酶可以贮藏在该细胞器中。两种常用的方法是：将产物会在该处发生积累的基因的5’序列与目的基因相连或选择地用在进入液泡时将被切掉的N末端延长区(部分或全部)加工目的基因。马铃薯液泡patatin蛋白(146个氨基酸)(Sonnewald等.，1991)和甘薯sporamin蛋白(111个氨基酸)(Turk等.，1997)的N末端部分是实现这个目的的适合候选物。
在甘薯sporamin中，液泡定位信息位于初级结构的N末端部分。剪切掉确保蛋白转移到ER中的N末端信号序列后，前体形式就被有效地定位到液泡中，在液泡中前体肽被剪切(Koide等，1997)。和马铃薯patatin不同，sporamin中决定液泡定位信号的性质很清楚，而已知马铃薯patatin中定位决定子的准确位置是位于N-末端，但不清楚切位点。因此，sporamin被用来将异源蛋白定位到植物液泡。转移到液泡中之后，融合蛋白的主要sporamin部分被切除，于是产生高度真实的异源蛋白。用相似的方法处理patatin，产生一种永久性的N末端延伸，其能引起异源蛋白的错误折叠和失活。
最后，克隆指导液泡的马铃薯patatinCDR和甘薯的sporamin编码区的111个氨基酸，并进行测序。产生含有sporamin/patatin的N末端和合适的内源性多聚半乳糖醛酸酶形成的融合体的构建体，见下面的实施例。用Western印迹分析检验处理过的液泡入口(可使用)。同ER滞留内源性阿拉伯聚糖酶的类似，检测转化子，表明在液泡中积累了活性内源性PG。
实施例12
含有表达半乳聚糖酶+内源性多聚半乳糖醛酸酶的双构建体的自处理块茎
制备一种双构建体，该双结构体含有预定要分泌到非原生质体中去的半乳聚糖酶和被定位到内部贮藏器官的真菌或植物内源性PG，见实施例4中的“设计“自处理”DNA构建体”。半乳聚糖酶应该作为一种使任何酶催化目标果胶体内剪切的支架。在这个实施例中，植物和真菌内源性多聚半乳糖醛酸酶被作为例子来说明“自处理植物材料”。但是，必须承认植物或微生物来源的裂解酶在本文中有同样的作用。
因为他们的稳定性(如在酸性液包境条件下)，并考虑到他们对同型聚半乳糖醛酸修饰(特别使乙酰化)的敏感性和催化的最佳pH，选择真菌内源性多聚半乳糖醛酸酶。来源于棘孢曲霉的、登记号为AF074213的、WO 94/14952 和WO 94/14952的多聚半乳糖醛酸酶I、II和III包括许多目的生化属性，但也可以用其他的多聚半乳糖醛酸酶。
比较高等植物内源PG蛋白序列显示有两种截然不同的内源PG。一种在信号肽和成熟蛋白之间含有一个前体肽，而另一种不具有这种前体肽。该前体肽的功能仍然没有被证实。
含有不具有前体肽的非分泌的内源PG(修饰的内源性PG A，B，和C)的双构建体的定位可以同已举例说明的内源性阿拉伯聚糖酶在ER(实施例10)和液泡(B和C)(实施例11)中的定位一样来完成。但是，在这种情况下，要考虑到基因产物在细胞质中的积累(A)。Wegener等(1996)描述了一种Erwinia carotovora果胶酯裂解酶在转基因马铃薯的叶和块茎的细胞质中怎样进行积累的，且没有可检测的表型变化。已经在转基因植物的细胞质中成功积累了表达的耐热性细菌纤维素酶。Ziegelhoffer和其合作者从转基因紫花苜蓿、马铃薯和烟草的Thermomonospora fusca中生产出E2和E3纤维素酶，虽然量非常少(Ziegelhoffer等，1999)。没有检测到纤维素酶的表达而产生的表型影响。
然而，如同上文所述，KDEL在内质网中保留了一种转运的蛋白，该信号肽负责实际转运。因此，为了使所述酶在细胞质积累，信号肽必须在植物宿主细胞表达之前被除去。假如没有通过蛋白质测序来鉴定信号肽的剪切位点，可以测定其可能的剪切位点。例如利用神经网SignalP(Nielsen等，1997).
通过利用所述酶成熟部分的特异性引物进行PCR，在DNA水平物理除去信号肽。这个方法确保了起始密码子和酶(该酶预定在细胞质积累)成熟部分的最佳翻译序列的导入。
没有前体肽的代表性植物内源性PG包括，但不限于来源于Glycine max的AF128266：PG1和来源于蕃茄的U70480：TAPG2。
对于每个间隙来说，通过两种修饰的内源性PG将含有前体肽的非分泌的内源PG(修饰的内源性PG D-1)定位到细胞质、ER或液泡中。在前文中描述的三个修饰的(D，F和H)系列在成熟蛋白的前留有前体肽序列，另外三个修饰的系列(E，G和1)的前体肽被除去，共产生6个不同的构建体(D-1)，这些构建体包括了三种不同定位，含有或不含有前体肽。含有前体肽的植物内源性PG的例子是来自油料种子rape的X9500：RDPG1和来自kiw果实的P35336。根据实施例6的分析，可以证实由于半乳聚糖酶表达而产生的细胞壁表型是实施例5和6所期望的结果。另外，通过Northern和Western印迹分析和多聚半乳糖醛酸活性分析证实功能性内源多聚半乳糖醛酸酶的表达和积累。
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序列表
<110>Peter Ulskov
Henk Shols
Richard Visser
Berhard Borkhardt
Susanne O.Srensen
Ronald Oomen
Jean-Paul Vincken
Maureen McCann
Michael Skjt
Max Bush
Chantal Doeswijk Voragen
Gerrit Beldman
<120>改造植物细胞壁多糖结构的方法
<130>24017 PC 1
<150>EP00610020.0
<151>2000-02-10
<160>17
<170>FastSEQ for Windows Version 3.0
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从载体pPGB121s上扩增颗粒淀粉合成酶启动子区的引物
<400>1gattacgcca agctttaacg 20
<210>2
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从载体pPGB121s上扩增颗粒淀粉合成酶启动子区的引物
<400>2ggtttgtcga cgaaatcaga aataattgga gg 32
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于制备DNA构建体pPGB121s-B的寡核苷酸
<400>3tcgaccggta cctaggcccg g 21
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于制备DNA构建体pPGB121s-B的寡核苷酸
<400>4gatcccgggc ctaggtaccg g 21
<210>5
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于制备DNA构建体pGED的寡核苷酸
<400>5tcgacaagct ttctagagcc tcgagg 26
<210>6
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于制备DNA构建体pGED的寡核苷酸
<400>6gatccctcga ggctctagaa agcttg 26
<210>7
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于制备DNA构建体pADAP的寡核苷酸
<400>7tcgaccggta ccaagcttgc gggctctaga ctcgagccta ggcccgg 47
<210>8
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于制备DNA构建体pADAP的寡核苷酸
<400>8gatcccgggc ctaggctcga gtctagagcc cgcaagcttg gtaccgg 47
<210>9
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于制备DNA构建体pPGB121s-B-B33的寡核苷酸
<400>9aattcaagct tg 12
<210>10
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于制备DNA构建体pPGB121s-B-B33的寡核苷酸
<400>10aattcaagct tg 12
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增阿拉伯聚糖酶编码cDNA的GBSSpro引物
<400>11acagctcaac aagtggtaac 20
<210>12
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增阿拉伯聚糖酶编码cDNA的ARA-KDEL引物2
<400>12gacttctcga gtggctggcc tgttgtgaag gatgaacttt agtctagaaa tgctc 55
<210>13
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于制备DNA构建体pADA/ST-ARA的ST SOE FWD引物
<400>13gacgaagctt atgattcata ccaacttg 28
<210>14
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于制备DNA构建体pADA/ST-ARA的ST SOE REV引物
<400>14ggagccgggg ttggcgtagg ccactttctc ctggctc 37
<210>15
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于制备DNA构建体pADA/ST-ARA的ARA SOE FWD引物
<400>15gagccaggag aaagtggcct acgccaaccc cggctcc 37
<210>16
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于制备DNA构建体pADA/ST-ARA的ARA SOE REV引物
<400>16cagtctagac tacacaacag gccagcc 27
<210>17
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>自身退火并连接到载体pB1221的EcoRI限制性位点，产生载体pBI221-2HindIII
的寡核苷酸
<400>17aattaagctt 10
机译： 植物细胞壁多糖结构的重建方法
机译： 植物细胞壁多糖结构重塑的方法
机译： 重塑植物细胞壁多糖结构的方法
