金龟子绿僵菌无纺布菌条生产工艺方法

摘要

本发明涉及一种真菌杀虫剂新剂型的生产方法，确切地说是金龟子绿僵菌无纺布菌条生产工艺方法。该方法包括五道生产工序，即菌种的取得、一级斜面菌种培养、液体种子培养、液体发酵罐生产和菌条的接种培养。本发明生产的杀虫剂，对害虫的防治效果持久，对天牛类蛀干害虫杀虫效果明显且稳定，受天气影响相对较小，工艺稳定，投资少，占地小，生产无三废问题。

说明书

技术领域

本发明涉及一种杀虫真菌的新剂型生产方法，具体地说是用一种分离自天牛的金龟子绿僵菌[Metarhizium anisopliae(Metsch.)]RCEF0770菌株的无纺布菌条生产方法。

背景技术

20世纪50年代以来，化学农药虽在控制害虫方面起了巨大的作用，但是随之而来的是严重的生态后果：如导致某些害虫种群对常用杀虫剂抗性的增强，防治效果下降，用药量增加；大量杀伤害虫天敌，引起目标害虫再度猖獗和次要害虫上升为主要害虫；某些杀虫剂的残留对环境和食物的污染，影响了人类的生存环境。由于大量及不合理的使用化学农药，造成农药的残留累积，使环境受到污染，生态平衡遭到破坏。主要表现在：有益生物被杀伤，害虫的抗药性日起严重，农副产品中农药残留量增加等。

为了克服以上弊端，生物防治产业迅速发展。特别是虫生真菌由于有独特的扩散能力和在自然界的强大宿存力而得到人们的青睐。目前世界上已有20多种真菌杀虫剂产品登记注册，主要的产品多为球孢白僵菌和金龟子绿僵菌粉剂，防治的对象主要为森林昆虫、温室及蔬菜害虫。我国主要由一些半工业化的白僵菌生产厂，生产白僵菌菌粉和高孢粉，用于马尾松毛虫和玉米螟的防治。由于虫生真菌主要依靠昆虫表皮入侵，所以对于刺吸式口器害虫和钻蛀性害虫却无良好的剂型和使用方法。

发明内容

为了解决上述问题，实施农业可持续发展战略，生物防治的实行则是必须的，真菌杀虫剂的生产也是一个很有发展前景的产业。本发明提供一种对于刺吸式口器害虫和钻蛀性害虫有良好杀灭效果的金龟子绿僵菌无纺布菌条生产工艺方法。

实现上述目的具体技术解决方案如下：金龟子绿僵菌无纺布菌条生产工艺方法，其特征在于：

A、菌种：

RCEF0770菌株，分离自陕西杨陵的青杨天牛的金龟子绿僵菌；

B、一级斜面菌种培养：

将分离纯化的菌种接种于PPDA培养基斜面，放入25℃培养箱，培养9～14天，待菌丝长满斜面并产孢时，转入摇瓶培养；

C、液体种子培养：

在500ml三角瓶中，装入200ml的液体种子培养基，1.5pa/kg高压灭菌30min，待冷却至40℃左右，接入斜面菌种，接种量为500ml三角瓶接2支培养好的一级斜面菌种(试管规格150mm×15mm)。接种后置于恒温振荡培养箱(24-26℃，180转/分)培养3天～5天即可；

D、液体发酵生产：采用三级发酵

(1)、一级种子罐生产

取70L气升式发酵罐，装入50L液体培养基，温度大于95℃，并加入消泡剂聚氧丙烯氧化乙烯甘油醚15ml，在14.7×10⁴Pa压力下，保压25～40分钟，消毒冷却后将4瓶上述培养好的500ml摇瓶种子接入培养(24-26℃)，通气量1∶0.5，保压4.903～7.0845×10⁴Pa，经60～72小时通气培养，达到对数生长期后，接入二级种子罐；

(2)、二级种子罐生产

取700L气升式发酵罐，装入450L液体培养基，温度大于95℃，并加入消泡剂聚氧丙烯氧化乙烯甘油醚150ml，在14.7×10⁴Pa压力下，保压25～40min，消毒冷却后将一级种子罐种子50L全部接入二级种子罐培养，温度24～26℃，通气量1∶0.5，保压4.903～7.0845×10⁴Pa，经60～72小时通气培养，达到对数生长期后，接入三级种子罐；

(3)、三级种子罐生产

取7T气升式发酵罐，装入4.5T液体培养基液体，pH6.0～7.0，加入的热水温度大于95℃，并加入消泡剂聚氧丙烯氧化乙烯甘油醚1500ml，通入蒸汽加热到121℃，保压30分钟，冷却至24～26℃，将二级种子罐培养好的液体种子500L全部接入，通气培养，通气量1∶0.4～0.5V/V·min，搅拌转速190r/m，罐压4.903～7.0845×10⁴Pa，培养时间72～96小时；

当发酵液中出现大量菌丝及液生孢子时，残糖在1％以下，发酵液较粘稠，另外镜检菌丝变细、菌丝体中无明显的液泡，发酵液中无明显断裂的菌丝，可放罐；

E、将无纺布条在1.5Pa/Kg高压灭菌30min后，冷却后按700条无纺布条接入100L发酵液的比例接(浸)入已培养好的发酵液，在20～28℃，RH95％的培养室架上平铺培养5天，待菌条上长满菌丝后，移入温度在20～28℃，RH90％的培养室继续培养3～5天，菌条上长满大量孢子，风干即可。

所述的斜面培养基液包括：马铃薯200g，蛋白胨10g，葡萄糖60g，琼脂20g，水1000ml。

所述的液体种子培养基包括：在1000ml培养基中含20g葡萄糖、40g黄豆粉、0.5gKH₂PO₄，各组分混合后加水补至1000ml，并用饱和NaOH调pH至6.3。

所述的种子罐生产液体培养基包括：6％麸皮煮汁、2％白砂糖、2％黄豆粉和005％K₂HPO₄，pH6.3。即在1000ml培养基中含20g白砂糖糖、20g黄豆粉、0.5gKH₂PO₄，加麸皮煮汁(在800ml水中加麸皮60g煮30分钟，一层纱布过滤，去除残渣)，各组分混合后加水补至1000ml，并用饱和NaOH调pH至6.3。

所述的消泡剂为聚氧丙烯氧化乙烯甘油醚，用量为发酵液总量的0.03％(即50L中加量为15ml，500L培养料中加150ml，5T培养料中加1500ml)。

按照权利要求1、2、3、4和5所述的其中任何一款金龟子绿僵菌无纺布菌条生产工艺方法，其特征是：所述的无纺布条为长60cm，宽5cm，厚04cm。

由于虫生真菌具有可观的扩散效果，较长的土壤宿存能力，独特的体壁侵染方式，以及害虫抗性发展缓慢和容易生产等显著优点，因此以绿僵菌为代表的真菌杀虫剂被世界粮农组织在西非撒哈拉沙漠以南国家大面积推广治蝗；另外，它们对于刺吸式口器害虫如：蚜虫、飞虱、叶蝉、粉虱、介壳虫等和钻蛀性害虫如玉米螟、各种天牛、吉丁虫等有着强大的毒力，只要选择良好的施用方式和正确的剂型，就能取得优于其他生物或化学农药无可比拟的良好效果。

本发明工艺生产的无纺布菌条剂型具有独特的先进性：一是对害虫的防治效果持久。由于无纺布上的真菌孢子生存活性远高于孢子粉，而且，真菌还可以利用无纺布上的营养不断生长产孢，孢子存活力明显加长，有利于杀灭羽化周期长的天牛等害虫；二是无纺布真菌菌条剂型在田间寿命很长，受天气影响相对较小。无纺布上的孢子主要是靠飘移而接触虫体的，与昆虫接触的机会相对较多，环境中有利因子出现的时间较长，只要条件具备就会侵染害虫，受环境制约的幅度较小；三是本发明工艺生产的金龟子绿僵菌菌条对天牛类蛀干害虫杀虫效果明显且稳定；四是本发明生产工艺不复杂、工艺稳定、易调控、成功率高。五是投资少，占地小、无三废问题，尤其适于中小企业采用。

具体实施方式

实施例1该金龟子绿僵菌无纺布菌条生产工艺方法，包括五道生产工序：

1、菌种：

RCEF0770菌株，分离自天牛的金龟子绿僵菌[Metarhizium anisopliae(Metsch.)]；

2、一级斜面菌种培养：

将分离纯化的菌种接种于PPDA培养基斜面，每1000ml培养基含马铃薯200g，蛋白胨10g，葡萄糖60g，琼脂20g，水1000ml；放入25℃培养箱，培养10天，待菌丝长满斜面并产孢时，即可转入摇瓶培养；

3、液体种子培养：

在500ml三角瓶中，装入200ml的液体种子培养基，1.5pa/kg高压灭菌30min，待冷却至40℃左右，接入斜面菌种，接种量为500ml三角瓶接2支培养好的一级斜面菌种，试管规格150mm×15mm，接种后置于恒温振荡培养箱，24-26℃，180转/分，培养3天～5天即可；

4、液体发酵生产：该工序分为三个步骤即采用三级发酵

(1)、一级种子罐生产

取70L气升式发酵罐，按配方加入原料和水，即50L液体培养基，温度大于95℃，并加入消泡剂聚氧丙烯氧化乙烯甘油醚15ml，在14.7×10⁴Pa压力下，保压25～40分钟，消毒冷却后将4瓶上述培养好的500ml摇瓶种子接入培养，24-26℃，通气量1∶0.5，保压4.903～7.0845×10⁴Pa，经60～72小时通气培养，达到对数生长期后，接入二级种子罐；

(2)、二级种子罐生产

取700L气升式发酵罐，以培养500L液体菌种计算，注意扣除消毒过程中的冷凝水200L；按配方加入原料和水，即装入450L液体培养基，液体培养基配方及其它控制条件同一级种子罐生产；达到对数生长期后，接入三级种子罐。

(3)、三级种子罐生产取7T气升式发酵罐，装入4.5T液体培养基液体，发酵用培养基配方同一级种子罐生产，pH6.0～7.0。将培养料按比例投入发酵罐中，加入热水，热水温度等于95℃，通入蒸汽加热到121℃，保压30分钟，冷却至24～26℃，将二级种子罐培养好的液体种子500L全部接入，注意培养时体积应控制在发酵罐体积80％，即5000L，通气培养，通气量1∶0.4V/V·min，搅拌转速190r/m，罐压4.903～7.0845×10⁴Pa，培养时间80小时；经检验合格，即可放罐。

当发酵液中出现大量菌丝及液生孢子时，残糖在1％以下，发酵液较粘稠，另外镜检菌丝变细、菌丝体中无明显的液泡，发酵液中无明显断裂的菌丝，可放罐；

5、菌条灭菌及接种培养

将无纺布条剪成长60cm，宽5cm，厚0.5cm的条状，在1.5Pa/Kg高压灭菌30min后，冷却后按700条无纺布条接入100L发酵液的比例接(浸)入已培养好的发酵液，在20～28℃，RH95％的培养室架上平铺培养5天，待菌条上长满菌丝后，移入温度在20～28℃，RH90％的培养室继续培养3～5天，菌条上长满大量孢子，风干即可。