公开/公告号CN1420984A
专利类型发明专利
公开/公告日2003-05-28
原文格式PDF
申请/专利权人 有限会社环境技术研究所;株式会社产学连携机构九州;
申请/专利号CN01806587.2
发明设计人 高木厚司;
申请日2001-03-16
分类号G01N33/15;C12Q1/68;C12M1/00;C12Q1/02;
代理机构11247 北京市中咨律师事务所;
代理人段承恩;黄革生
地址 日本福冈
入库时间 2023-12-17 14:44:30
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2015-05-06
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12Q1/68 授权公告日:20050921 终止日期:20140316 申请日:20010316
专利权的终止
2006-05-17
专利申请权、专利权的转移专利权的转移 变更前: 变更后: 变更前: 变更后: 登记生效日:20060414 申请日:20010316
专利申请权、专利权的转移专利权的转移
2005-09-21
授权
授权
2003-08-13
实质审查的生效
实质审查的生效
2003-05-28
公开
公开
发明领域
本发明涉及利用DNA损伤指标的天然与人工化学物质的简易生物学的评价法，具体地说，涉及关于DNA的构成成分2′-脱氧鸟苷(dG)变为氧化型的8-羟基-2′-脱氧鸟苷(8OHdG)的反应，或关于在来自生物体细胞的产物中含有的8OHdG/dG，通过对被测物质投药组和对照组进行比较，简单地评价药品或农药等的天然与人工化学物质的有害性或有效性、或者各种功能性食品等的有害性或有效性的方法。本发明还涉及生物体样品中的DNA氧化损伤指标的高灵敏度测定装置。
背景技术
现在，在环境中，以往自然界中不存在的各种人工化学物质，例如，以药品、农药、洗涤剂、食品添加剂、防腐剂等为起源，存在着各种各样的致癌物质、紊乱内分泌物质等。另外在天然的物质中，从
1)即使是在天然原材料中也可能存在有害成分、
2)特别是在提取物的形态时，它的生物毒性有可能增加、
3)各种成分由于协同作用而存在转变为有毒物质的可能性等的理由来看，存在对于其毒性必须严加注意的物质。
但是，根据腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)的碱基对对遗传信息进行密码化。这种DNA信息，由于紫外线照射或DNA的复制错误、或是各种致癌物质或暴露在活性氧类下等受到一定程度的损伤，最终产生它的基因信息的缺失、改组或变异等，成为它的细胞或固体的灭绝、或相反地产生新生物种的引发物。上述的天然与合成化学物质，对包括人在内的动物带来毒性的机理的一部分，可以根据这种DNA的损伤来说明。
从这个观点看，着眼于DNA的氧化，含有嘌呤核的DNA(单核苷)的2′-脱氧鸟苷(dG)与2′-脱氧腺苷(dA)是与活化氧类的羟基(·OH)结合，各自氧化为8-羟基-2′-脱氧鸟苷(8OHdG)和2-羟基-2′-脱氧腺苷(2OHdA)，使原来G：C必要的DNA的碱基对变化为T：A、A：T变化为G：C。这种DNA水平的基因信息的改写发生的频率，在近年的医学界中，作为与各种疾病的病态相关的有力的信息被瞩目。
以前，化学物质的生物学上所容许的安全浓度是参考
1)对实验动物投药时的致死量、
2)对实验动物投药时，产生致癌或神经障碍等明显的脏器损害量、
3)影响生殖能力的量等，它们的最低有效量乘以100～1000倍的安全率的浓度。
但是，成为评价对象的化学物质的种类约有10万种以上很多的物质，对小鼠或者大鼠使用定量化生物毒性时，即使完成一代也要大约两个月，虽然评价超过一代的影响情况很少，但还是需要其两倍以上的时间，而且由于为维持评价系统需要很多的费用等理由，用现有的方法评价所有物质的生物学的毒性，由于受时间的与费用的限制，迄今为止，在事实上是不可能的。
另外，现在市售的多数的健康食品或功能性食品等的食品类是提取天然原材料的物质，或者在安全许可量的范围内添加了特定的物质等是主要倾向。但是，对于该食品等，关于有效性(实效性)还没有确立客观的评价系统。
一方面，现在，白血球、实质器官或浮游细胞溶液等的生物体样品中，作为测定上述的氧化DNA物质的一种8-羟基-2′-脱氧鸟苷(8OHdG)的方法，从这些的细胞成分中提取核DNA进行各种酶处理后，通过HPLC(高效液相色谱)的游离液流入电化学检测器，一般按单核苷的形式进行测定。这种方法，虽然可以评价测定灵敏度10pg/ml左右的核DNA的氧化性损伤，但是由于经过酸或碱处理、酶反应等步骤，操作烦杂，很难避免由这些操作引起的二次DNA的氧化，因此在实际上只能用很有限的设备来实施。
测定大量地含有同样8OHdG的尿时，经过除蛋白处理后，虽然也使用通过HPLC和电化学检测器的方法，但是由于尿本身是极易氧化的生物体样品，因此如何在预防氧化的条件下除去蛋白是最大的难关。
近来，作为正在使用的8OHdG的定量法，有使用单克隆抗体的酶抗体法(EIA法)。这种方法和根据HPLC与电化学检测器的方法不同，虽然具有不在单核苷酸的状态下也可以检测的特征，但是存在除8OHdG以外也有交叉反应，和检测灵敏度低到1ng/ml左右的缺点，一般化地未解决的问题很多。
一方面，生物体样品中的单核苷酸本身，由于其核DNA内的绝对量是8OHdG等氧化物的约10,000～100,000倍，比较多量地存在，因此检测比较容易，从它的化学结构的特征考虑，作为一般的检测方法，可以有效地使用紫外线吸收测定装置。但是，由于测定分析物的前处理是与使用电化学检查器测定8OHdG的情况相同，因此基本上也存在同样的问题点。
上述的人工化学物质或食品类，人类可能日常地摄取或者投药或接触，虽然确认它们的生物学毒性或有效性、特别是以确认毒性为首要任务，但是现状如上所述，有耗时长、费用高等问题。所以，期望开发出简便且低消耗地评价人工化学物质的生物学毒性或食品类的有害性·有效性的方法。
本发明的目的在于，为适应这个期望，提供一种合理且简便的评价庞大种类的天然物质或人工化学物质与食品类的生物学的有害性或有益性的方法。
另外，本发明的另一个目的在于，提供一种测定装置，这种装置应对生物学的评价法中作为指标的物质，一般是指氧化DNA物质，特别是8-羟基-2′-脱氧鸟苷(8OHdG)、2-羟基-2′-脱氧腺嘌呤核苷(2OHdA)等的量和生物体样品中的核DNA的量能用简便的方法进行正确地定量，其重现性良好。
特别地，本发明的另一个目的在于，在该测定装置中，提供一种能够防止生物体样品中的DNA受氧化损伤的抗氧化保存液。
发明内容
本发明者们为实现上述目的进行了深入研究，结果发现，在含有被测物质的天然或者人工化学物质或食品类的溶液中加入2′-脱氧鸟苷，经过一段时间后，通过测定该溶液的2′-脱氧鸟苷的氧化型8-羟基-2′-脱氧鸟苷(8OHdG)的浓度，可以知道被测物质的氧化能或者抗氧化能的有无及其程度，将它作为指标，可以评价被测物质的生物学的有害性与无毒性或有益性，在通过进一步研究后，便完成了本发明。
即，本发明涉及一种天然或人工化学物质的生物学的评价法，该评价法包括，在含有特定的天然或人工化学物质的溶液中加入已知量的2′-脱氧鸟苷后，定量分析该溶液中的8-羟基-2′-脱氧鸟苷，按照该8-羟基-2′-脱氧鸟苷的量来评价该天然或人工化学物质的有害性或有益性。
另外，在上述被测溶液的生物学的评价法中，通过加入dG，对上述溶液进行紫外线照射和/或添加活性氧类发生剂后，通过定量分析上述溶液中的8OHdG，也能够评价对于来自上述被测溶液的活性氧的基因核酸的氧化损伤有无相加、协同或相抵的效果。
因此，本发明涉及一种天然或人工化学物质的生物学的评价法，该评价法包括，在含有特定的天然或人工化学物质的溶液中加入已知量的2′-脱氧鸟苷，对该溶液进行紫外线照射和/或加入活化氧类发生剂后，定量分析该溶液中的8-羟基-2′-脱氧鸟苷，按照该8-羟基-2′-脱氧鸟苷的量，将来自天然或人工化学物质的活性氧的基因核酸的氧化损伤有无相加、协同或相抵效果作为指标，评价天然或人工化学物质的有害性或有益性。
进而，本发明涉及一种由天然或人工化学物质组成的食品的生物学评价法，该评价法包括，在含有天然或人工化学物质组成的食品的溶液中加入已知量的2′-脱氧鸟苷后，定量分析该溶液中的8-羟基-2′-脱氧鸟苷，按照该8-羟基-2′-脱氧鸟苷的量来评价该食品的有害性或有益性；另外，本发明还涉及一种由天然或人工化学物质组成的食品的生物学评价法，该评价法包括，在含有天然或人工化学物质组成的食品的溶液中加入已知量的2′-脱氧鸟苷，对该溶液进行紫外线照射和/或加入活化氧类发生剂后，定量分析该溶液中的8-羟基-2′-脱氧鸟苷，按照该8-羟基-2′-脱氧鸟苷的量，将来自该食品的活性氧的基因核酸的氧化损伤有无相加、协同或相抵效果作为指标，评价天然或人工化学物质的有害性或有益性。
本发明还涉及一种由天然或人工化学物质组成的食品的生物学评价法，该评价法包括，在含有由天然或人工化学物质组成的食品和具有基因核酸的氧化损伤作用物质的溶液中，加入已知量的2′-脱氧鸟苷后，定量分析该溶液中的8-羟基-2′-脱氧鸟苷，按照该8-羟基-2′-脱氧鸟苷的量来评价该食品成分的基因核酸的氧化损伤预防作用的有效性。
本发明还涉及一种被测溶液的生物学评价法，该评价法包括，在含有不特定化学物质的被测溶液中加入已知量的2′-脱氧鸟苷后，定量分析该溶液中的8-羟基-2′-脱氧鸟苷，按照该8-羟基-2′-脱氧鸟苷的量来评价该被测溶液的抗氧化能力或者氧化能力。
本发明还涉及一种化学物质或食品的生物学评价法，该评价法包括，在一定期间内把特定的化学物质或食品投喂给包括人在内的动物、植物、细菌或真菌，按照取自它们的来自生物体细胞产物中的8-羟基-2′-脱氧鸟苷和2′-脱氧鸟苷的含量比，评价该化学物质或者食品的有害性或有益性。
本发明者们发现，将混入抗氧化保存液中的生物体样品，灌注到具有分子量20～50kD截断功能的透析膜中，通过所谓的微量透析处理，能够在抗氧化环境中进行该生物体样品的除蛋白操作，及对于灌注后通过高效液相色谱得到的洗脱成分，同时进行用紫外线吸收分析的DNA的定量和用电化学测定的DNA氧化损伤物的定量，能够在同一条件下正确地测定两者的值，正确地检测出DNA的氧化损伤状态。
所以，本发明涉及一种DNA氧化损伤指标的测定装置，其特征在于，该装置具有：
a)用于与液态生物体样品混合并进行冷冻保存，其准备量为该样品的1～5倍的抗氧化保存液，
b)微量透析装置，该装置通过向上述液态生物体样品和上述抗氧化保存液的混合溶液中浸渍的透析膜管内，灌注由甘油水溶液组成的灌注液，阻止分子量20～50kD以上的物质通过，同时对回收液进行微量透析处理，使回收液中的甘油浓度目标值在10～20重量％的范围内，
c)具有用于从上述微量透析处理的回收液中分离出低分子DNA关联物质的色谱柱的高效液相色谱，
d)用于对上述色谱柱的洗脱液进行紫外线吸收分析和用于测定DNA核酸的量的紫外线吸收分析装置，
e)用于对上述色谱柱的洗脱液进行电化学分析和用于测定DNA氧化损伤物的量的电化学测定器，
f)根据测得的DNA核酸的量和DNA氧化损伤物的量的比率求出上述液态生物体样品中的DNA氧化损伤指标。
本发明还涉及一种DNA氧化损伤指标的测定装置，其特征在于，该装置具有：
a)用于把由含有细胞成分的生物体样品和相当于其1～5倍量的上述抗氧化保存液的混合溶液密封而且冷冻保存的组织细胞粉碎用的管，
b)细胞粉碎与固体物质分离装置，该装置通过把在密封·冷却后的管内生物体样品中含有的组织粉碎来使细胞内外的游离核酸溶出到保存液中，同时使固体物质从粉碎样品中分离出来并沉淀。
c)微量透析装置，该装置通过向上述液态生物体样品和上述抗氧化保存液的混合溶液中浸渍的透析膜管内，灌注由甘油水溶液组成的灌注液，阻止分子量20～50kD以上的物质通过，同时对回收液进行微量透析处理，使回收液中的甘油浓度目标值在10～20重量％的范围内，
d)具有用于从上述微量透析处理的回收液中分离出低分子DNA关联物质的色谱柱的高效液相色谱，
e)用于对上述色谱柱的洗脱液进行紫外线吸收分析和用于测定DNA核酸的量的紫外线吸收分析装置，
f)用于对上述色谱柱的洗脱液进行电化学分析和用于测定DNA氧化损伤物的量的电化学测定器，
g)根据测得的DNA核酸的量和DNA氧化损伤物的量的比率求出上述液态生物体样品中的DNA氧化损伤指标。
进而，本发明者们发现，作为在上述测定装置中的生物体样品用的抗氧化保存液，含有0.5～2mM/l的EDTA、2～5重量％的甲醇、与10～40重量％的甘油的水溶液是特别有用的。
所以，本发明涉及上述DNA氧化损伤指标的测定装置，其中，上述抗氧化保存液是一种含有0.5～2mM/l的EDTA、2～5重量％的甲醇与10～40重量％的甘油的水溶液；另外，本发明还涉及由含有0.5～2mM/l的EDTA、2～5重量％的甲醇与10～40重量％的甘油的水溶液组成的生物体样品的抗氧化保存液本身。
对附图的简单说明
图1是表示本发明的生物体样品测定装置的顺序的流程图。
图2是表示使用本发明的生物体样品测定装置测得的人尿中的NO3-/dG的浓度比与8OHdG/dG的浓度比的关系的曲线图。
图3是表示根据HPLC+电化学检测器(ECD)法和EIA法得到的8OHdG浓度的关系的曲线图。
图4是表示尿中的8OhdG浓度和硝酸根离子(NO3-)浓度的关系的曲线图。
图5是表示在母乳主体、奶粉主体及混合营养的各组中，8OHdG浓度、dG浓度与8OHdG浓度对dG浓度之比的柱形图。
用于实施发明的最佳方案
本发明所说的「评价有害性或有益性(的有无)」，意味着它可作为判断被测物质是否具有生物学的有害性(对氧化应力的授予、致癌性、促畸形性、对生殖能力的不好的影响等)的判断标准，或者有无有害性或有益性(有效性)的判断标准，以及提示上述有害性或有益性的程度。另外，「评价抗氧化能或者氧化能」是指，它可作为判断被测溶液有无抗氧化能、换言之，有无还原能力的判断标准，或者被测物质有无氧化能力(氧化力)的判断标准，以及提示它们的程度。
本发明中使用的2′-脱氧鸟苷是DNA的构成成分脱氧嘌呤核苷的一种。虽然几乎全部的基因信息能用腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)的碱基对进行密码化，但其基因信息，由于自然突变(紫外线照射或DNA的复制错误等引起)或由人工产物引起的突变(各种致癌物质、活性氧等引起)受到一定程度的损伤，最终引起基因信息的缺失、重复、反转、插入、移位、点突变等，导致细胞或个体的灭亡，反之成为新的生物种诞生的引发物。
我们知道，活性氧除了可以由进入体内的氧生成以外，还可由生物体摄取的天然或人工化学物质作为活性氧的起源或诱导因子来生成，给作为生物体成分的蛋白质、脂质、基因核酸等带来氧化损伤。在上述dG的情况下，当它一旦和活性氧类的羟基(·OH)等结合，就会生成氧化型的8-羟基-2′-脱氧鸟苷(8OHdG)。该(8OHdG)最终由本来的G：C的碱基对变换为T：A的碱基对。总之，从G：C到T：A的变换，意味着各个细胞的基因有一定程度的损伤，其程度的多少，必然被认为是作为评价其个体的自己保存能力或物种保存能力的有力的指标。实际上，8OHdG作为DNA的代表的氧化损伤指标，例如与致癌率或脑的变性疾病的发病具有有意义的相关性(「实验医学」第13卷，第15号，第31～37页，1995)或和细胞死(apoptosis)有密切的关系(「最新医学」第51卷，第3号，第42～47页，1996)等。
本发明是，进而使用8OhdG作为DNA氧化损伤指标，测定被测物质是否具有把dG氧化为8OHdG的能力及其程度，据此评价该被测物质的有害性或安全性。换言之，本发明是用被测物质将dG变换为8OHdG的能力作为该物质有无有害性等的判断标准，这与现有技术将生物体样品等中已经存在的8OHdG作为癌或者神经变性疾病的发病的危险性或老化程度的尺度的技术思想是基本不同的。本发明的生物学评价法中dG到8OHdG的变化，反映了生命现象的设计图的DNA的损伤程度，可以说它是用于评价对包括人类在内的生物的各个体的自我保存能力或物种保存能力的影响的非常合理的客观指标。
作为按本发明进行的生物学评价的被测物质，可列举的有天然与人工化学物质，例如药品、农药、洗涤剂、食品添加剂、防腐剂、各种致癌物质、内分泌紊乱物质等，除此之外，还有大气污染物质，水质污染物质等，及含有天然与人工化学物质的健康食品或功能性食品的食品类等。该食品类中，除一般食品类和健康食品类本身之外，还包含它的成分。另外，本发明的上述被测物质中，含有不特定的物质的水溶液(组成不明确的溶液。本说明书中也记作被测溶液。)例如包含生活下水、工业下水、污水、自来水、净化水、天然水、河流水、海水、湖水等。
本发明的方法，虽然通常将被测物质的人工化学物质或食品类或者自来水等的被测溶液和dG一起放置一段时间后，根据测定生成的8OHdG进行评价，但是此外，通过添加活性氧类发生剂，照射紫外线等，可以使有可能暴露在自然界或生物体内的某些氧化诱导因子再负荷，这样也可用来评价它们和被测物质的相互作用。
这样，本发明的方法能够简便而且合理地、并且低消耗地评价药物、农药等的人工化学物质与天然物质或者食品类的有害性或有益性。另外，用该方法在带有粗略的容许量或有效量的标准的物质中，而且对于其重要性高的物质，特别的用下述的细胞培养评价法、生物体内评价法也可以进行更严密的评价，本发明也提供这些方法。
细胞培养评价法：
在添加了被测物质的培养液中的动物细胞(例如，小鼠的淋巴球细胞系的B9细胞系)、植物细胞(例如，烟草BY-2细胞)、真菌(例如，酵母菌)中，根据需要添加氧化剂和/或进行紫外线照射，经过一定时间后，测定来自培养细胞的dG与8OHdG浓度，比较处理前后的值。低等的动植物细胞，虽然本身作为一个生命单位有适应多种环境的能力(人工化学物质的解毒或活性氧消去功能等)，但使用生物细胞的有用性，就能评价这种生物具有的恒常性维持机能中被测物质能达到多大程度的影响。这就意味着，细胞评价法可以称作是可最简单地使用的生物指标(biomarker)。培养细胞的世代交替非常快，能够高灵敏度地反映细胞分裂时容易产生的DNA损伤的频率，另外，若对dG与8OHdG的定量分析结果也有107～109个的细胞数，由于可能充分地测定，和通常的恒温槽相比，能够建立一种可以使用较多分析物的系统。
生物体内评价法：
向实验动物(例如小鼠)中定期投予被测物质，测定尿中与生殖器官(卵巢或精巢)中的dG与8OHdG的浓度。现在，虽然开始对人工化学物质等的生物毒性从多个侧面(例如，寿命、体重变化、血液生物化学数据、疾病的发病频率等)进行评价，但是全部网罗各个指标进行综合的判断几乎是不可能的。但是，DNA损伤指标表示生命活动的设计图的质量，认为它的生成量应该是全部的病态所共有的。从此意义来看，本发明中对8OHdG的生成量的测定，可以说是能够推定生命体的健康程度的最简单、而且合理的综合指标。因为生命活动的本质是汇总自身保存和物种的保存，评价生殖毒性的意义重大，根据本发明的方法，将目标缩小到只限于作为雄性和雌性生殖器官的精巢和卵巢，根据下一代的生命的设计图(DNA)有何种程度的损伤，也能够评价被测物质的基本的危险性。另外，生物体内评价法是一系列评价法中，最需要劳力和时间的方法，对于暴露浓度高的物质或者即使低浓度但有害性也高的物质，最终在与人近似的动物(哺乳类动物)上进行验证是必要的。但是，本发明把DNA损伤能这一点当作焦点的评价法，和现有的方法相比能格外地减少时间或者经费。
本发明的方法中，例如可以用高效液相色谱(HPLC)分离样品溶液中含有的dG和8OHdG，以及利用和该色谱仪相连的紫外线吸收分析装置和电化学检测器，能够进行8OHdG浓度的测定。而且，用此方法可能同时检测出dG和8OHdG的浓度。另外，8OHdG浓度，使用和8OHdG有特异反应的抗体、优选单克隆抗体等也能够测定。
另外，在使用生物体样品时，优选使用微量透析法(透析膜灌注法)较高效率地回收低分子DNA组成成分(dG、8OHdG等)后，进行8OHdG等的测定。具体地说使用能截止20kD～50kD的高分子成分的透析膜进行灌注。但生物体样品是液态样品(血浆、尿、骨髓等)时，使用上述的膜进行透析，在8OHdG等的测定中提供透析后的混合液。含有细胞成分的样品(全血、细胞浮游液、组织液等)时，用细胞粉碎装置粉碎组织或细胞，以便使存在于细胞质或核内的核酸成分溶出。然后，通过离心分离法将固体成分分离，然后用上述的透析膜透析其上清液，测定回收的透析液中的dG与8OHdG。
然后，在使用生物体样品作为被测物质时，像从dG到8OhdG那样利用活性氧的氧化是从样品取样之后立即开始，这样，在评价结果中有时不能正确地反映刚取样后的状态。像这种场合，优选通过在阳离子螯合剂、抗氧化剂与甘油作为主成分的抗氧化保存液中浸渍生物体样品来防止样品取样后的氧化。阳离子螯合剂具有高效率地停止各种生物体反应或者酶反应的作用，例如使用乙二胺四乙酸钠等。由于抗氧化剂是预防羟基产生·游离的物质，因此可以使用例如甲醇等。另外，甘油除了具有由羟基引起的防止氧化的效果以外，还具有可使生物体样品在-20℃～4℃的条件(通常到生物体样品使用时为止的保存条件)下稳定的保存作用，例如使用20～50％的水溶液。进而，在添加完dG并放置一定时间之后，再将该抗氧化保存液不但加入到生体样品中，同时也加入到被检出物质中，这样就能在测定80HdG之前的时间内抑制氧化，并能够测定经过一定时间后的正确的(抗)氧化能力。
作为上述抗氧化保存液，优选是由一种含有0.5～2mM/l的EDTA、2～5重量％的甲醇、与10～40重量％的甘油的水溶液组成的抗氧化保存液。该抗氧化保存液，可以特异地防止dG(脱氧鸟苷)被诱导为8OHdG。第一，作为阳离子螯合剂的EDTA，能使钙变成螯合物，从而能高效率地防止生物体反应或者酶反应，第二，作为抗氧化剂甲醇，能预防羟基的产生·游离，另外，作为第三的主要原因，甘油溶液不仅具有由羟基(OH基)引起的防止氧化的效果，同时还具有作为不冻液在-20℃～4℃下稳定地保存分析物的作用。甘油另外还有防止蛋白分解，除此之外，还具有抑制酶反应效果。
为了确认上述抗氧化保存液的有效性，本发明者们，
(1)在准备的各170μg/l的各种保存液成分(候补)中，添加·混合进氧化剂(KBrO3，50mg/ml溶液)各20ml，
(2)在这种混合液中，各加入市售的dG标准溶液(2’-脱氧鸟苷，400μg/l)各加10μl，配制被测溶液，
(3)经过30分钟后混合各分析物50μl和等量(50μl)的20％甘油水溶液，
(4)通过利用这种混合液作为抗氧化保存液对8OHdG和dG进行定量分析来调节各分析物的氧化状态(8OHdG的增加)。
结果如下表所示。另外，作为氧化剂使用KBrO3是因为一般将这种物质作为面包的漂白剂或防腐剂之类的食品添加剂来使用。
表中的第一行中列举使用纯水代替在上述(1)中得到的混合液作为「纯水分析物」时的数据，在第二行中列举使用纯水代替保存液成分，和使用含有规定量氧化剂(KBrO3)的混合液作为「纯水/氧化剂分析物」时的数据。从表中可以看出，纯水分析物的dG浓度是1.0300VS(以紫外线吸光分析装置的输出表示的值。此时溶解的标准dG浓度是10μg/ml。)，其配制·测定阶段中已经存在的8OHdG浓度是0.2710mVs(以电化学检测器的输出表示的值。浓度为5ng/ml的标准8OHdG的输出相当于7.0mVs。)，所以8OHdG/dG之比是0.263×10-3。然后在纯水/氧化剂分析物中经过30分后，8OHdG的浓度变为3.779mVs，8OHdG/dG之比是3.542×10-3，这相当于纯水分析物时的13.47倍。以下，为了讨论各种保存液成分的效果，使用8OHdG/dG之比，其理由是，在各测定时，预料8OHdG和dG测定值两者会出现同一个倾向的误差，例如关于被测溶液的浓度与容量的误差，使用80HdG/dG之比就是为了减轻数据所受到的影响。
使用属于阳离子螯合剂的EDTA/4Na(测定时浓度1mM/l)作为保存液成分时，在相同氧化条件下，其8OHdG/dG是1.101×10-3，这相当于被抑制为超纯水分析物时的4.19倍，使用甘油(测定时浓度：10重量％)时，在相同的氧化条件下，其80HdG/dG值是1.506×10-3，这相当于被控制为纯水分析物时的5.73倍。另外，在使用抗氧化剂甲醇(测定时浓度：1重量％与5重量％)时，在各自相同的氧化条件下同值变为2.771×10-3与2.238×10-3，这相当于被控制为各个超纯水分析物时的10.54倍与8.51倍。
除了上述保存液成分(EDTA/4Na，甘油与甲醇)以外，上述的表中也表示出了使用棉子糖与葡萄糖各两个的场合。棉子糖是由甜菜得到的三糖类中的一种，由于其物理·化学的稳定性，可以作为在精子保存液或脏器保存液中添加的组织稳定化剂使用。一方面，我们知道葡萄糖是最一般的单糖，同时也是生物体内最大量地存在的强有力的抗氧化物质(二木他编、「抗氧化物质」、学会出版中心、1994年)。但是上述表中也表明，8OHdG/dG之比与超纯水时比较约有10～12倍，该数值比较大，不适合作抗氧化保存成分。
此外，对于生物体样品作为用于发挥抗氧化性的代表物质，有VC(抗坏血酸)或NaN3(迭氮化钠)。但是，虽然VC本身有极强有力的抗氧化性(还原性)，但是在阳金属离子存在下相反地成为强有力的氧化剂，实际上，添加在dG溶液中和空气接触下长期保存，可以确认它能大量地诱变成8OHdG。另外迭氮化钠虽然是作为核酸的成分或各种酶的保存液(稳定化剂)被大量使用的物质，但它的化学反应性也很强，可以确认，由于它与空气中和样品中的氧反应而诱变成大量的氮氧化物。
与此相反，甘油、甲醇与EDTA是非常稳定的化学物质，它们也不诱导微生物的繁殖，如与上述的表有关的说明，显示超过葡萄糖、棉子糖等的抗氧化能数据。
所以，期望得到优选结果的上述三要素的协同效果，配制抗氧化保存液(No.10分析物、测定时浓度：甘油10重量％、甲醇2.5重量％、与EDTA/4Na 1mM/l组成的混合物)。使用该抗氧化保存液的物质，显示0.924的8OHdG/dG之比、与3.51的对初期值的倍率，可以看出dG的氧化受到大幅度地抑制。所以只有No.10分析物的成分(上述三要素)是作为抗氧化保存液相适应的物质，上述的配合比是为了供给到由液相色谱开始的测定系统中，它们均处于各优选成分浓度范围内。
结果，该氧化保存液的成分配合比是，由于使用微量透析除蛋白处理的灌注液，典型地为20重量％甘油的水溶液，导致各成分在测定时的浓度发生变化，为了使其数值接近于上述No.10分析物的值(但是，测定时的甘油浓度，虽然可能高达该分析物的10重量％～40重量％左右，但是它与将要测定之前的除蛋白处理的精度有关，因此将其上限它为20重量％左右。)，确定EDTA是0.5～2mM/l、甲醇是2～5重量％、而甘油是10～40重量％。
另外，在上述表中的No.11～17分析物示出了在用纯水代替添加了dG标准溶液的混合液中的保存液成分以便使氧化剂(KBrO3)的浓度按三阶段变化时，随着时间经过的dG的氧化状态。No.11与No.12是在测定时具有与纯水/氧化剂分析物相同的氧化剂浓度(KBrO3 10mg/ml)的物质，经过15分钟后的8OHdG浓度3.991与经过60分钟后的8OHdG浓度3.667是一个接近于纯水/氧化剂分析物(30分)的8OHdG浓度3.779的值。这些值，与KBrO3浓度是1mg/ml与0.1mg/ml的No.13～17分析物的场合下的0.7～0.8左右与0.2左右相比，是很高的数值，在不含抗氧化保存液的dG中添加氧化剂(KBrO3)时，明确显示了氧化的进行与该添加量有关。
从此结果可以看出，从dG诱导变成80HdG取决于KBrO3的浓度，并且在15分钟后至60分钟后之间看不出8OHdG的诱导量有实质性的差异，因此可以推测，由KBrO3引起的氧化反应在快速产生后稳定化。因此，利用本发明的测定装置，可以明确地把握以KBrO3为代表的日常口服摄取的各种食品添加物的DNA氧化功能，对其容许浓度的再研究是有益的。
本发明的生物学的评价法例如像下面这样进行。首先，在多阶段稀释被测物质的溶液或被测溶液中，加入已知浓度的2′-脱氧鸟苷(dG)，在水温为50℃、优选为室温下放置一定时间后，测定8-羟基-2′-脱氧鸟苷(8OHdG)的生成量(此值作为A)。除此以外，对dG的超纯水溶液在上述同样条件下测定其在放置一定时间后的8OHdG的量(此值作为B)。如果A大于B，则可评价为被测物质具有氧化诱导能力，反之，如果A小于B，则可评价为被测物质具有抗氧化能力。另外，任何场合下，它的差值越大，可以判定其氧化诱导能力或抗氧化能力的程度越大。
活性氧的产生是在进行生命活动的基础上不可避免的现象。但是，在消去其生理活性的系统功能不充分时，可以认为，这将会导致DNA的氧化损伤的增加，致癌或细胞活性降低(老化)，并进一步诱导细胞死亡(apoptosis)。根据本发明，可以简单地评价被测物质以DNA水平、单一细胞水平、单个体水平下、能否消除哪一个(有无有效性)，或能否增加哪一个活性氧的毒性(有无毒)。
另外，各种健康食品或功能性食品等食品类的有效性，换言之，这取决于可以在多大程度上能有效地消去生物体内产生的活性氧的毒性。但是，根据本发明，各种食品类的抗氧化能，可以客观化地作为DNA氧化损伤的指标。
紫外线由于直接作用于核DNA，是引起DNA氧化损伤的有力的因子，在地球上栖息的生物不能避开它的影响。另外，自然环境中排出的合成物质或自然中存在的天然物质也可能受紫外线照射而活化(自由基化)，因此不能忽视由于摄取这些活化的合成物质、或和该合成物质接触而产生的生物学的毒性。根据本发明，也可以简便地评价这种合成物质等的被测物质与紫外线的相加、协同或相抵效果。另外，本发明还提供了对活性氧物质产生剂和被测物质的相加、协同或相抵效果的简便的评价方法。进而，根据本发明，通过在含有可以确认具有基因氧化损伤作用的物质和被测物质的溶液中，加入已知量的dG来定量分析上述溶液中的8OHdG，根据其含量也可评价对上述被测物质的基因氧化损伤作用是否存在有效性。这里，作为可以确认具有基因氧化损伤作用的物质，根据选择在日常生活中暴露可能性高的物质，可以按照更接近于现实的状态来评价被测物质的作用。特别是，由于被测物质是食品类，本发明可以评价由于该食品类和基因氧化损伤性物质的混杂带来的影响。
在本发明的生物学的评价法中，从投喂化学物质或食品，或摄取或接触这些化学物质或食品的包括人在内的动物、植物、细菌或真菌等中采取的来自生物体细胞的产物，例如血液、尿、其它的体液、组织粉碎液或细胞粉碎液等作为被测对象，算出该被测对象中的8OHdG与dG的含量比(8OHdG/dG)，根据该含量比的大小，可以评价上述化学物质或食品的有害性或有益性(对于上述化学物质或食品，上述含量比越高，有害性越高，含量比越低，有益性越高)。
另外，在本发明的生物学的评价法中，有优异的抗氧化能力，即，可以有效率地消除由于某些原因产生的活性氧的物质，例如含有各种各样的天然或人工化学物质的功能性食品，或其组成不明确的物质，特别是水，通过持续地摄取，可以治疗、改善与减轻包括人在内的动物的各种各样的疾病与障碍。在使用超纯水时，这种物质所应具有的抗氧化能力大体上与被测对象中的8OHdG与dG的含量比相等，这一点可以作为一个基准。
对于溶解生物体的液体样品，即全血、血浆、血清、尿、脑脊髓液、组织液等的被测物质的水溶液，在使用本发明的测定装置时，可以按以下步骤进行。首先，作为样品的前处理，将液态样品和等容量的抗氧化保存液混合，然后，保存至测定为止，直到将要从微量透析处理开始的测定操作之前再将保存分析物的温度恢复至室温。通过微量透析处理将灌注·回收的被测溶液供应给高效液相色谱，将含有dG峰与8OHdG峰的洗脱液供给到8OhdG/dG同时测定系统中并进行测定。根据该测定值，算出最终的生物体样品中的DNA氧化损伤指标。
对于含有细胞成分的生物体样品，即，全血、细胞浮游液、组织等必须粉碎的物质，在使用本发明的测定装置时，可以按以下所述进行。首先，在组织粉碎用管中先注入0.5～0.1ml抗氧化保存液。作为该组织粉碎用管，可以使用适用于物理的细胞粉碎和在生物化学上的DNA酶非敏感性，或RNA酶非敏感性的灭菌管，例如美国的生物101公司制造出售的“FastDNA管”。然后，在该管中放入100～200mg生物体细胞样品，然后直接用冰冷冻。细胞粉碎与相关操作的准备完成后，使用专用的粉碎装置，例如美国的生物101公司制造出售的“FastPrep FP120”型装置将组织粉碎，以便使细胞内外的游离核酸溶出到保存液中。将固体物从含有游离核酸的保存液中离心分离除去，将所获上清液作为保存分析物。将测定分析物在将要测定之前恢复至室温，供微量透析处理。通过微量透析处理将灌注·回收的被测溶液供应给高效液相色谱，将含有dG峰与8OHdG峰的洗脱液供给到8OHdG/dG同时测定系统中并进行测定。根据该测定值，算出最终的生物体样品中的DNA氧化损伤指标。
上述抗氧化保存液基本上是由阳离子螯合剂和抗氧化剂溶解在10～40％甘油水溶液中得到的溶液，在混入生物体样品之前保存在冰冷条件以下的温度与避光条件。优选的组成配合比如下所示。
甘油： 10～40重量％
甲醇： 2～5重量％
EDTA/4Na： 0.5～2mM/l
上述的组成配合比中，甲醇与EDTA/4Na也可以进行适宜的追加。配制的保存液本身，或生物体样品混入后的保存都可以在避光·密封状态下，按如下所示方式进行。
2～3天的短期保存： 于冷藏库(4℃)
半年左右的中期保存： 于冷冻库(-10℃～-20℃)
半年以上的长期保存： 将样品管内的空气用氮气置换后，于冷冻库
(-80℃以下)
上述的微量透析(微细透析)中，将具有阻止20～50KD的高分子量成分的截断功能的透析膜管在分析物中浸渍，利用含有管内通灌注液的灌注系统的装置，高效地从分析物回收低分子量的DNA成分。回收成分是dG、C10H13N5O4、MW267、8OHdG、C10H13N5O5、MW283等。灌注条件以下面的值为基础。
灌注液： 20％甘油溶液
灌注温度： 室温
灌注速度： 0.5～2μl/分
但是，为了提高回收率、改善目的成分的S/N比，可以适当地改变这些条件。
把用微量透析回收的低分子DNA成分送进高效液相色谱的色谱柱中，将8OHdG、dG等全部成分的峰值部分从色谱柱中洗脱。将色谱柱洗脱液首先进入紫外线吸收分析装置的样品池中，测定dG的量后，送进电化学检测器并测定8OHdG的量。
以上所述的本发明的测定装置的顺序，根据图1的流程图整理，如下所示。
步骤1：生物体样品的选取。
步骤2：将生物体样品和保存液混合冷冻保存。
步骤3：将管内保存液中混有的细胞分析用样品的粉碎与固体物的分离。
步骤4：把保存的液态样品，或者粉碎与分离后的细胞分析用的样品进行微量透析处理。
步骤5：把通过透析得到的灌注·提取的样品成分提供给高效液相色谱(HPLC)。
步骤6：将液相色谱柱的洗脱液加入到紫外线(UV)吸收分析装置的样品池中，测定dG的量。
步骤7：把通过上述样品池的色谱柱洗脱液，利用电化学检测器测定其中的8OHdG的量。
步骤8：使用步骤6与7的测定值处理8OHdG/dG之比与其它的数据。
然后，根据以下的实施例对本发明进行更详细的说明，但是本发明并不限于以下的实施例。实施例1
做成五氯苯酚(PCP、除草剂)、双酚A(BPA、树脂原料)与白藜芦醇(RVT、多酚的一种)的各种浓度溶液(0.0005ppm、0.005ppm、0.05ppm、0.5ppm与5ppm)，在两块99穴塑料分析板的各穴平均注入180μl。然后向各穴添加200μg/ml的dG(溶解于超纯水中)20μl，将一块分析板直接在室温下放置90分钟，将另一块分析板在紫外线照射箱中用紫外线(254nm、860μW/cm2)照射90分钟。放置或照射结束后，将各穴的溶液与等量的20％甘油溶液混合，用HPLC[使用的柱：CA-5ODS(AICOM公司制)、流动相溶液：0.1M磷酸缓冲液、3～10％甲醇、SOS90～100mg]将dG与8OhdG分离，然后，利用与该HPLC连接的紫外线吸收分析装置与电化学检测器定量分析两者的核苷。另外，为了进行比较，对于只用超纯水施加了同样处理的物质测定其dG与8OHdG。结果如表1所示。此测定是相对两者的核苷进行的，下表仅示出8OHdG的浓度(ng/ml)(以下的实施例与之相同)。[表1]
被测物质 浓度(ppm) 放置90分钟 UV照射90分钟
超纯水 0.267 0.529
PCP 5 0.340 5.730
0.5 0.282 0.396
0.05 0.285 0.431
0.005 0.236 0.451
0.0005 0.260 0.585
BPA 5 0.192 7.142
0.5 0.231 1.736
0.05 nd 0.614
0.005 0.315 0.794
0.0005 nd 0.689
RVT 5 nd 5.582
0.5 nd 1.378
0.05 nd 0.571
0.005 nd 0.690
0.0005 nd 1.026(表中，各测定值是两次测定值的平均值，「nd」表示没有测定。)
PCP是农药或皮的软化剂，有报告指出，其安全浓度为5mg/kg。但是，从上述结果可以看出，5mg/kg相当于5ppm，在此浓度下由于紫外线引起的氧化损伤作用极端地上升，并且有害性提高。
BPA是有代表性的内分泌紊乱物质(环境激素)，在0.5ppm以上由于紫外线引起的氧化损伤作用明显地上升，并使有害性提高。作为参考，实际有暴露可能性的BPA浓度如下所示。
河流或湖泊中： 多数情况下是0.001ppm左右
一般产业废弃物处理厂的浸出水： 最大20ppm左右
PC制餐具(95℃下30分)： 0.005～0.1ppm
从饮水罐的涂层剂溶出： 0.1ppm左右
齿科用胶合剂溶出： 治疗龋齿后的唾液中1ppm左右
鱼： 0.02～0.3ppm左右
另外，对于BPA，在日本的标准是，作为溶出部分是2.5ppm以下，作为材质部分是500ppm以下，容许摄取量在各国共通的是0.05mg/kg/天。本发明有助于重新估量这些标准。
RVT是代表性的多酚，近年的报告表明，在红葡萄酒中溶解有2～10ppm左右，有抗动脉硬化作用等。但是根据上述的结果，当其存在0.5ppm以上时，由于紫外线引起的氧化损伤作用明显地升高，有害性提高。由此，本发明也可以简单合理地验证以往被认为有效的物质的有效性(或有害性)。
上述的实验中一次测定中必要的样品量只需10～100μl这样少，在样品注入后5～10分钟以内就能检测出测定的峰，在15分/样品的速度下可以连续测定。所以，采用本发明，只需1台的HPLC在每周120小时的速度下运转时，就可以测定480分析物/周，也就是约2000分析物/月。此事意味着，按照本发明，能够评价迄今为止尚未报导过的在高速度下的被测物质的毒性等。
另外，在实施例1中虽然可以用紫外线吸收分析装置与电化学检测器同时测定dG与8OhdG二者，但最好单独测定8OHdG。这种场合，通过使用一种利用单克隆抗体的测定装备[例如商品名8-OHdG Check(日本控制老化研究所制)]，可以在短时间内高灵敏度地进行大量的样品测定。实施例2
制成维生素C(VC)、维生素E(VE)、儿茶素(Cate)与鞣酸(Tan)的规定浓度的溶液，在两块99穴塑料分析板的各穴平均注入180μl。然后向各穴添加200μg/ml的dG(溶解于超纯水中)20μl，将一块分析板直接在室温下放置90分钟，将另一块分析板在紫外线照射箱中用紫外线(254nm、860μW/cm2)照射90分钟。放置或照射结束后，将各穴的溶液与等量的20％甘油溶液混合，与实施例1同样地定量分析dG与8OHdG。另外，为了进行比较，对于只用蒸馏水施加了同样处理的物质测定其dG与8OHdG。结果如表2所示。[表2]
被测物质 浓度 放置90分钟 UV照射90
分钟
蒸馏水 0.15 1.23
维生素C 0.001％ 6.04 38.36
0.0001％ 0.63 1.51
0.00001％ 0.44 0.46
维生素E 0.05％ 0.44 0.42
0.005％ 0.45 0.18
0.0005％ 0.49 0.30
儿茶素 100μg/ml Nd nd
10μg/ml 133.71 nd
1μg/ml 9.07 nd
鞣酸 100μg/ml 54.00 97.07
10μg/ml 5.64 19.29
1μg/ml 0.84 1.04(表中，各测定值是两次测定值的平均值，「nd」表示没有测定。)
从上述的结果可以导出以下的结论。
·VC虽然是强有力的抗氧化物质，但对于水溶性的dG来说却是作为非常强的氧化诱导物质起作用。
·VE是非常稳定的抗氧化物质。
·儿茶素与有无紫外线的照射无关，非常强有力地诱导8OHdG。可以认为它的氧化能力与儿茶素的杀菌作用或者抗病毒作用有关。如儿茶素的场合，物质所显示的8OHdG诱导能力，能够作为杀菌·灭菌效果或者抗病毒效果等指标(有效浓度指标)的可能性高。
·鞣酸显示高的基因损伤诱导作用。实施例3
制成甘油(Gly)与甲醇(Meth)的规定浓度的溶液，在5块99穴的塑料分析板的各穴平均注入180μl。然后向各穴添加200μg/ml的dG(溶解于超纯水中)20μl，将一块分析板直接在室温下放置90分钟，另一块分析板同样地在室温下放置24小时，然后将剩下的三块分析板在紫外线照射箱中用紫外线(254nm、860μW/cm2)分别照射60分钟、90分钟或120分钟。放置或照射结束后，将各穴的溶液与等量的20％甘油溶液混合，与实施例1同样地定量dG与8OHdG。另外，为了进行比较，对于只用超纯水施加了同样处理的物质测定其dG与8OHdG。结果如表3所示。
[表3]
UV照
被测 放 置
浓度 射 120分
物质 90分钟 24小时 60分钟
90分钟
超纯水 0.323 0.382 0.231 0.382 0.645
甘油 5％ 0.228 0.306 0.344 0.399 0.544
20％ 0.213 0.342 1.317 1.417 1.374
甲醇 5％ 0.146 0.336 0.181 0.209 0.332
20％ 0.186 0.274 0.324 0.395 0.518(表中，各测定值是两次测定值的平均值)
虽然在报告中指出，甘油与甲醇都对由羟基引起的DNA损伤具有预防效果，但从本实施例的结果也可以确认它们具有抗氧化能力。特别是，能确认甘油仅在室温放置时具有抗氧化能力，而Meth能在室温放置时与紫外线照射时的这两种情况下皆具有强有力的抗氧化能力。实施例4
制成葡萄糖(Glu)、棉子糖(Raffi)与蔗糖(Suc)的规定浓度的溶液，在4块99穴塑料分析板的各穴平均注入180μl。然后向各穴添加200μg/ml的dG(溶解于超纯水中)20μl，将一块分析板直接在室温下放置90分钟，然后将剩下的三块分析板在紫外线照射箱中用紫外线(254nm、860μW/cm2)分别照射60分钟、90分钟或120分钟。放置或照射结束后，将各穴的溶液与等量的20％甘油溶液混合，与实施例1同样地定量分析dG与8OHdG。另外，为了进行比较，对于只用超纯水施加了同样处理的物质测定其dG与8OHdG。结果如表4所示。[表4]
放置90 UV照射
被测物质 浓度
分钟 60分钟 90分钟 120分钟
超纯水 0.195 0.392 0.901 1.183
葡萄糖 1mg/ml 0.220 0.094 0.099 0.237
00μg/ml 0.200 0.132 0.274 0.414
10μg/ml 0.240 0.291 0.458 0.277
1μg/ml 0.260 0.384 0.595 0.385
.1μg/ml 0.295 0.399 0.702 0.410
棉子糖 1mg/ml 0.340 0.115 0.176 0.240
00μg/ml 0.455 0.158 0.370 0.503
10μg/ml 0.405 0.281 0.626 1.314
1μg/ml 0.185 0.304 0.854 1.049
.1μg/ml 0.205 0.375 0.689 1.127
蔗糖 1mg/ml 0.300 0.127 0.309 0.364
00μg/ml 0.280 nd 0.379 0.648
10μg/ml 0.235 0.333 0.690 1.279
1μg/ml 0.185 0.358 0.708 1.143
.1μg/ml 0.235 0.299 0.756 1.073(表中，各测定值是两次测定值的平均值，「nd」表示没有测定。)
从上述的结果可以导出以下的结论。
·抗氧化能力的强度在室温下放置与紫外线照射的任一场合下，皆可以评价为葡萄糖＞棉子糖≈蔗糖。
·但正常的血糖值在约50～100mg/dl(0.5～1mg/ml)时，可以说血液中存在的葡萄糖相对于紫外线照射是非常有效的抗氧化物质。
·棉子糖作为天然低聚糖的一种，添加在清凉饮料、健康饮料、健康食品等多数的食品中，虽然其抗氧化能力不如葡萄糖，但是在10μg/ml以上的浓度还是有效的。
·蔗糖显示与棉子糖相同程度的抗氧化能力。实施例5
制成全部都与精蛋白有关的物质1精氨酸(Arg)、1-瓜氨酸(Cit)与精胺(Spe)的规定浓度的溶液，在2块99穴塑料分析板的各穴平均注入180μl。然后向各穴添加200μg/ml的dG(溶解于超纯水中)20μl，将一块分析板直接在室温下放置90分钟，将另一块分析板在紫外线照射箱中用紫外线(254nm、860μW/cm2)照射90分钟。放置或照射结束后，将各穴的溶液与等量的20％甘油溶液混合，与实施例1同样地定量分析dG与80HdG。另外，为了进行比较，对于只用超纯水施加了同样处理的物质测定其dG与80HdG。结果如表5所示。[表5]
被测物质 浓度 放置90分钟 UV照射90分钟
超纯水 0.219 0.422
1-精氨酸 1mg/ml 0.173 0.299
100μg/ml 0.150 0.305
10μg/ml 0.153 0.253
1μg/ml 0.186 0.323
1-瓜氨酸 1mg/ml 0.156 0.125
100μg/ml 0.120 0.225
10μg/ml 0.179 0.305
1μg/ml 0.184 0.332
精胺 1mg/ml 0.179 0.112
100μg/ml 0.154 0.351
10μg/ml 0.150 0.328
1μg/ml 0.140 0.297(表中，各测定值是两次测定值的平均值)
精蛋白是支持基因的立体结构的蛋白质，代表的碱性氨基酸精氨酸的含量特别高(20～70％)。
1-精氨酸、1-瓜氨酸与精胺的任意一个皆可确认具有抗氧化能力，Cit与Spe在高浓度时(1mg/ml)，其抗氧化能特别高。
虽然在数据中没有显示，但一般地，根据本发明可以确认，酸性氨基酸具有能够预防氧化诱导和碱性氨基酸氧化的倾向。实施例6
制成尿酸的各种浓度的溶液(溶液：蒸馏水+0.025％FBS)，在2枚99穴塑料分析板的各穴平均注入180μl。然后向各穴添加200μg/ml的dG(溶解于超纯水中)20μl，将一块分析板直接在室温下放置90分钟，另一块分析板在紫外线照射箱中用紫外线(254nm、860μW/cm2)照射90分钟。放置或照射结束后，将各穴的溶液与等量的20％甘油溶液混合，与实施例1同样地定量分析dG与8OHdG。另外，为了进行比较，对于只用上述溶解液施加了同样处理的物质，测定其dG与8OHdG。结果如表6所示。[表6]
被测物质 浓度 放置90分钟 UV照射90分钟
溶液 0.218 1.007
尿酸 10μg/ml 0.147 15.619
1μg/ml 0.175 2.369
0.1μg/ml 0.193 0.966
0.01μg/ml 0.176 1.064(表中，各测定值是两次测定值的平均值)
尿酸被称作生物体内代表的抗氧化物质。但是，从上述的结果可以明确，在生物体内的实际血浆浓度(40～80μg/ml)下，虽然如果不是在强的氧化环境中可以抑制8OHdG的诱导，但是在紫外线共存的场合DNA氧化损伤的程度高，其毒性增强。实施例7
制成溴酸钾(KBrO3)的各种浓度的溶液，在2块99穴塑料分析板的各穴平均注入180μl。然后向各穴添加200μg/ml的dG(溶解于超纯水中)20μl，将一块分析板直接在室温下放置15分钟，另一块分析板放置60分钟。放置结束后，将各穴的溶液与等量的20％甘油溶液混合，与实施例1同样地定量分析dG与8OHdG。另外，为了进行比较，对于只用超纯水施加了同样处理的物质测定其dG与8OHdG。结果如表7所示。[表7]
被测物质 浓度 放置15分钟 放置60分钟
超纯水 0.155 0.289
KBrO3 10mg/ml 2.851 2.626
1mg/ml 0.511 0.563
0.1mg/ml 0.159 0.131(表中，各测定值是两次测定值的平均值)
虽然溴酸钾是作为面包的漂白剂或防腐剂而广泛使用的食品添加剂，但是从上述结果，可以看出与浓度有关的对8OHdG的诱导。由于放置15分钟与放置60分钟没有大的差别，因此可以认为由溴酸钾引起的氧化反应在快速地发生后是稳定的物质。按现在的评价试验认为安全的溴酸钾，用本发明的方法也显示有毒性。这样，根据本发明可以重新研究日常经口摄取的各种食品添加剂的容许浓度。实施例8
将1mM乙二胺四乙酸钠(EDTA)溶液、10％甘油(Gly)溶液、1％或2.5％甲醇(Meth)溶液、10％甘油与2.5％甲醇的混合溶液在99穴塑料分析板的各穴平均注入170μl。然后向各穴添加400μg/ml的dG(溶解于超纯水中)10μl与50mg/ml的溴酸钾(KBrO3)溶液20μl，将其直接在室温下放置30分钟。然后，将各穴的溶液与等量的20％甘油溶液混合，与实施例1同样地定量分析dG与8OHdG。另外，为了进行比较，对于只用超纯水施加了同样处理的物质测定其dG与8OHdG。结果如表8所示。[表8]
被测物质 放置30分钟
超纯水 2.699
1mM EDTA 0.784
10％甘油 1.123
1％甲醇 2.059
2.5％甲醇 1.685
10％甘油+2.5％甲醇 0.954
10％甘油+2.5％甲醇+1mM 0.699
EDTA(表中，各测定值是两次测定值的平均值)
在作为活性氧产生剂作用的溴酸钾的存在下，10％甘油与2.5％甲醇与1mM EDTA的混合溶液显示了最高的抗氧化能力。从此来看，可以知道由这三种成分组成的溶液作为各种被测溶液或被测样品的抗氧化保存液是有效的。实施例9
作为被测物质，将超纯水与规定浓度的维生素C(VC)、维生素E(VE)与葡萄糖(Glu)170μl添加至2块99穴塑料分析板的各穴，作为添加液在各穴注入超纯水或规定浓度的双酚(BPA)20μl。然后向各穴添加400μg/ml的dG(溶解于超纯水中)10μl，将一块分析板直接在室温下放置90分钟，将另一块分析板在紫外线照射箱中用紫外线(254nm、860μW/cm2)照射90分钟。放置或照射结束后，将各穴的溶液与等量的20％甘油溶液混合，与实施例1同样地定量分析dG与8OHdG。结果如表9所示。[表9]
被测物质 添加液(浓度) 放置90分钟 UV照射90分钟
超纯水 超纯水 0.21 0.64
BPA
0.22 11.58
(50ppm)
BPA(5ppm) 0.31 6.19
BPA
0.19 2.09
(0.5ppm)
VC(0.001％) 超纯水 16.3 5.75
BPA
VC(0.001％) 1.51 12.53
(50ppm)
VC BPA
nd 15.95
(0.0001％) (50ppm)
VC BPA
nd 14.96
(0.00001％) (50ppm)
VE(0.001％) 超纯水 0.18 0.28
BPA
VE(0.001％) 0.29 3.79
(50ppm)
VE BPA
nd 8.27
(0.0001％) (50ppm)
VE BPA
nd 15.43
(0.00001％) (50ppm)
葡萄糖
超纯水 0.16 0.40
(1mg/ml)
葡萄糖 BPA
0.24 4.46
(1mg/ml) (50ppm)
葡萄糖 BPA
nd 7.52
(0.1mg/ml) (50ppm)
葡萄糖 BPA
nd 14.93
(0.01mg/ml) (50ppm)(表中，各测定值是两次测定值的平均值，「nd」表示没有测定。)
从上述的结果可以导出以下的结论。
·由于添加BPA，紫外线照射时的8OhdG随浓度而增加。
·VE与葡萄糖，能够有意义地抑制由于添加BPA和紫外线照射所引起的8OHdG的增加。
·0.001％的VC虽然单独可以强力诱导8OHdG，但与BPA共存则能消除此作用。但是在紫外线照射时，VC不能消除由于BPA引起的8OHdG的诱导。
如上所述，BPA的基因氧化能力由于共存的物质而受到各种各样影响。
因此，通过利用本测定法，不仅可以测定诱导基因的氧化损伤的物质，还能测定对能消除其氧化毒性的在该物质中的特异的抗氧化物质，特别地能定量地评价它们的抗氧化能力。实施例10
将各种饮用水作为被测物质(被测溶液)。测定其抗氧化能力或者氧化能力。
为使浓度变为10μg/ml，把在各种饮用水中溶解dG而获得的溶液200μl注入到两个试验容器(溶液的表面积为36mm2)中。将一个容器在室温下放置90分钟，另一个容器在紫外线照射箱中用紫外线(254nm、860μW/cm2)照射90分钟。放置或照射结束后，将各容器的溶液与等量的20％甘油溶液混合，与实施例1同样地定量分析dG与8OHdG。
实验的饮用水是以下的物质。
超纯水：比电阻18兆欧的水(微孔系统制)，氧化还原电位是360mV。
自来水：福冈县春日市的一般自来水(1999年7月采集)，氧化还原电位是727mV。
处理水：将上述的自来水利用市售的净水器(水由于通过活性炭、强磁石与陶瓷制品等得到净化)净化而得到的水，氧化还原电位是518mV。
天然水：从大分县日田市采集的地下水(与酸雨或肥料等的地表污染隔绝的水，溶解的氮氧化物浓度在0.01ppm以下)，氧化还原电位在280mV。结果如表10所示。[表10]
生成
被测溶液 紫外线1) 相对于超纯水的比率3)
8OHdG2)
超纯水 (-) 0.131 1.00
(+) 1.049 1.00
自来水 (-) 0.342 2.61
(+) 12.561 11.97
处理水 (-) 0.157 1.20
(+) 0.584 0.56
天然水 (-) 0.091 0.69
(+) 0.516 0.49
1)(+)表示进行外线照射，(-)表示不进行紫外线照射，在室温下放置90分钟。
2)各测定值是两次测定值的平均值。
3)表示将在超纯水中生成的8OHdG的值作为1时的各数值的比率。
从上述的结果可以导出以下的结论。
·从杀菌、抗菌的观点来看可以非常合理地判断自来水所具有的氧化能力。
·用净水器处理的水(处理水)显著地抑制8OHdG，紫外线照射时的8OHdG的诱导比在室温放置时的值低。
·天然水，在室温放置与紫外线照射下都可以有意义地抑制8OHdG的诱导。
如上所述，根据本发明，可能将水的还原性(抗氧化能力)或者氧化能力定量化。利用此点，能够探讨饮用水与各种疾病的相关性(重伤程度、疾病的过程、治疗效果、预防效果等)，特别是也能够综合评价含有未知物质水溶液的基因损伤诱导作用。实施例11
将从健康人采集的随时的尿与实施例8中显示的10％甘油与2.5％甲醇与1mM EDTA的混合溶液组成的抗氧化保存液在容量比1∶1下混合，迅速地冷冻(约-20℃)保存。在将要试验前将该混合液解冻，通过使用有截止分子量50KD功能的透析膜的微量透析处理进行灌注(1μl/分)。关于如此提取的低分子的DNA有关成分(回收率约30～40％)，与实施例1同样地定量分析dG与8OHdG。另外，与该定量分析合并，用高灵敏度的氧化物检测器(ENO-10，Eicom公司制)定量分析在同一被测样品中含有的硝酸根离子(NO3-)。
结果如图2的图表所示。该图中X轴是检测出的NO3-浓度(μmol/l)与dG浓度(ng/ml)之比(NO3-/dG)，Y轴是检测出的8OHdG浓度(pg/ml)与dG浓度(ng/ml)之比(8OHdG/dG)的对数值。另外，尿中的dG浓度与尿的浓缩率有关，通过将NO3-与8OHdG的各浓度值除以dG浓度的值，可以排除由尿的浓缩率的差异所引起的数据的误差。特别是，根据基因的氧化损伤的危险率(Y轴)用氧化型(8OHdG)/还原型(dG)表示，可以得到更合理的指标。作为参考，表11中显示了使用与上述同样的测定装置测出的生物体样品中的大概的8OHdG浓度与dG浓度。[表11]
生物体样品 8OHdG浓度 dG浓度
人尿 10-5000pg/ml 50-2000ng/ml
人血浆 1-50pg/ml 5-25ng/ml
人脑脊髓液 2-15pg/ml 50-200ng/ml
小鼠脑组织 20-50pg/g 200-1000ng/g
小鼠精巢组织 50-100pg/g 2000-5000ng/g
从图2显示的结果来看，可以明确显示出8OHdG/dG的对数值与NO3-/dG之比是正比关系(p＜0.05)。这里意味着8OHdG/dG的对数值是与在生物体产生的代表的氧化物硝酸根离子浓度成正关系，显示8OHdG/dG的对数值成为生物体的氧化应力指标。
另外，虽然数据没有显示，但从以上的研究可以判明以下的事情。
·恶化癌病患者或先天性的基因异常的患者中，8OHdG/dG的值转位为按健康平常人绘制的近似线的上方(相对于NO3-/dG之比表示的个体全体的氧化指标，更强地反映基因的氧化损伤和推测的8OHdG/dG之比显示比较高的值。)
·在吸烟者中，8OHdG/dG比、NO3-/dG比都有显示较高数值的倾向。
·即使是同一人，在非正常的状态(例如宿醉、感冒、过量运动后等)时，8OHdG/dG比、NO3-/dG比的值向右上方偏。
从以上的结果可以导出以下的结论。
·8OHdG/dG值成为有力的生物体氧化的指标。
·根据被测者的日常生活(吃饭、运动、休养等)等，8OHdG/dG的值变化，成为包含心理社会的因子的广泛意义下的压力指标。
·生物体定期地摄取的天然与人工化学物质或食品类，根据定量它们的指标带来的影响，可以合理地评价由该天然与人工化学物质或食品类的有害性(致癌性、促畸形性、生殖毒性等)或有益性(生物体氧化或基因核酸氧化损伤为原因导致的各种疾病的治疗或预防作用、恢复疲劳作用、防止老化作用等)。
·8OHdG的测定界限是0.5pg/ml(样品量50μl)，大大地超过用现在的EIA法的测定界限1ng/ml。另外dG的测定界限是0.2ng/ml(样品量50μl)。实施例12
对于自来水、碱性离子水与深海盐矿物水，进行以下的三个实验，对它们的有益性进行评价。实验1氮氧化物的定量
为了测定硝酸性氮与亚硝酸性氮的含量的目的，定量分析上述三种样品中的氮氧化物。氮氧化物的高含量，由于流出的肥料成分、屎尿、污水等引起的污染在过去显示很大的问题，在水质标准中，定为必须在10ppm以下。另外还已知，如果婴儿(未满6个月)摄取了含有高浓度氮氧化物的水，则会引起正铁血红蛋白血症，呼吸作用被阻碍。
测定时，使用能在微量的样品量下同时测出NO3与NO2的高灵敏度氮氧化物分析器(Eicom公司制、ENO-1O)，用还原柱分离NO3与NO2后，根据重氮化反应测出在吸光度540nm下所呈现的颜色。
结果如下所示。
实验结果，任何的样品都在作为自来水的水质标准范围内。实验2氧化还原电位的测定
对上述的三种样品进行氧化还原电位的测定。另外，作为对照，也对超纯水进行了实验。
结果如下所示。
抗氧化能力的顺序是，碱性离子水＞深海盐矿物水＞自来水。
实验3基因氧化损伤诱导试验
对于上述的三种样品，测定诱导基因氧化损伤的能力。在该测定中，在加入已知浓度dG溶液的玻璃管中分别加入各样品，用紫外线照射一定时间(0(＝立即)、0.5、1与2小时)，氧化dG。然后，用反应停止液停止反应，用高效液相色谱将dG与其氧化物8OhdG分离，与实施例1同样地定量分析dG与8OHdG。另外，作为对照，也进行关于超纯水的实验。
结果如下所示。超纯水
根据结果能导出以下的结论。而且，8OHdG/dG之比的值越大，基因的氧化损伤作用越强。
·自来水的基因氧化损伤作用在0.5小时内最强，然后有减少的倾向。
·和超纯水相比较，碱性离子水与深海盐矿物水的基因氧化损伤作用都低。
·比较抑制氧化损伤的能力(抗氧化力)，顺序是深海盐矿物水＞碱性离子水。
如上所述，在本发明的生物学评价法中，对于不能明确地确定组成的自来水、碱性离子水、深海盐矿物水等，能够评价其有益性。实施例13
对于以下的样品，进行与实施例12相同的三种实验，据此评价它们的毒性。
样品A：白酒废液的原液
样品B：样品A的电气分解处理水实验1氮氧化物的定量
同实施例12一样，定量分析样品A与B中的氮氧化物。
结果如下所示。
样品A NO2-0.008ppm+NO3-9.8ppm＝NOx9.808ppm
样品B NO2-0.319ppm+NO3-216.0ppm＝NOx216.319ppm
根据结果可知。
·作为自来水法的基准，氮氧化物浓度的上限定义为10ppm，样品A含有接近上限的氮氧化物(9.8ppm)。
·样品B含有自来水法上限的20倍以上的氮氧化物(216.3ppm)。实验2氧化还原电位的测定
对于样品A使用原液，而对于样品B使用NO3-浓度稀释为10ppm的物质，测定氧化还原电位(银·氯化银电极)。
测定的结果，样品A的氧化还原电位是184.8mv，另一方面，样品B的氧化还原电位是715.4mv。实验3基因氧化损伤试验
在dG溶液(200μg/ml)10μl中加入各样品90μl，搅拌5分钟。然后，加入反应停止液100μl，与实施例1相同地同时测定dG与8OHdG。
结果如下所示。
从此结果可以导出以下的结论。
·证明了样品A的基因氧化损伤诱导性不高，在样品A中能繁殖微生物。
·样品B具有能够将dG本身分解的强毒性，即使是稀释1000倍时，也不能中和其毒性。
如上所述，按照本发明的生物学评价法，能够评价白酒废液与电解处理完的白酒废液的毒性。实施例14
对于实施例13的样品B，加入以下所示的催化剂，进行处理，调查氮氧化物的含量与基因氧化损伤诱导性的变化。
处理条件：
①样品B+磁铁矿(2g)+TiO2(0.5mg)
②样品B+磁铁矿(2g)+C(0.5mg)
③样品B+磁铁矿(2g)+TiO2(0.5mg)+C(0.5mg)
④样品B+磁铁矿(2g)+TiO2(0.5mg)+磁铁
⑤样品B+磁铁矿(2g)+C(0.5mg)+磁铁
⑥样品B+磁铁矿(2g)+TiO2(0.5mg)+C(0.5mg)+磁铁
⑦样品B+磁铁矿(2g)+TiO2(0.5mg)+磁铁+US
(42KHz，300W)
⑧样品B+磁铁矿(2g)+C(0.5mg)+磁铁+US
(42KHz，300W)
⑨样品B+磁铁矿(2g)+TiO2(0.5mg)+C(0.5mg)+磁铁+US
(42KHz，300W)
*TiO2：二氧化钛、C：活性炭、US：超声波
在放入了上述各催化剂的褐色瓶中，加入样品B30ml，常温下放置15分钟。然后，在应用超声波的情况下暴露在超声波中30分钟。实验1氮氧化物的定量分析
将如上述处理的液体稀释20倍，与实施例12同样地进行氮氧化物的定量分析。
结果如下所示。
从结果可以导出以下的结论。
·NO3的浓度在处理条件①～⑨的任意一项中都比样品B的电解处理液减少。
·通过不单独使用TiO2与活性炭而是将它们混合起来使用，可以改进NO3的减少效率。
·通过加入磁铁，可使NO3的减少效果进一步上升。
·由于应用了超声波，NO3反而显示了增加的倾向。这可以推测出是因为应用了超声波，发生了也包含氧化反应在内的各种化学反应。
·条件⑥是NO3的减少效率最高，与样品B相比减少了约16％的NO3(189ppm→159ppm)。
·可以认为，通过对催化剂量等条件的研究，有可能进一步地提高NO3的减少效率。实验2基因氧化损伤试验
对于样品B与对样品B进行了处理⑨的溶液，进行基因氧化损伤试验，观察基因氧化损伤诱导性的变化。
在该试验中，在90μl样品中加入dG(200μg/ml)10μl，搅拌5分钟。然后，加入反应停止液100μl，与实施例1同样地同时测定dG与8OHdG。
对于催化剂处理两天时与催化剂处理1个月时的各自的结果如下所示。[催化剂处理2天]
结果如下所示。
·样品B能够分解dG本身，为了中和其毒性至少需要稀释10000倍以上。
·按照处理⑨对样品B进行处理后得到的溶液，由于稀释10倍以上而使其毒性骤减。所以，处理⑨的处理，能够解除电解处理水的生物毒性的可能性高。
·由于按照处理⑨持续处理1个月，溶液的毒性骤减。
因此可以理解，处理⑨的处理，可以随时间共同进行。
如上所述，本发明的生物学评价法是通过对利用各种各样的方法处理的溶液毒性进行评价，这样有助于决定最适宜的处理方法。实施例15
对于进行以下的处理的各种工业废液，进行氮氧化物的定量分析与基因氧化损伤试验两方面，对废液处理结果进行调查。
样品C：使用铂电极对工业废液进行电解处理
处理完毕时的COD：350ppm
处理完毕时的次氯酸浓度：3,013ppm
样品D：使用铂·铱电极对工业废液进行电解处理
处理完毕时的COD：2,600ppm
处理完毕时的次氯酸浓度：1,560ppm实验1氮氧化物的定量
样品C与样品D各稀释100倍后，与实施例12相同，定量分析样品A与B中的氮氧化物。
结果如下所示。
对于样品C与D，进行基因氧化损伤试验，观察基因氧化损伤诱导性的变化。
在该试验中，分别向各样品90μl中加入dG(200μg/ml)10μl，搅拌5分钟。然后，加入反应停止液100μl，与实施例1相同地同时测定dG与8OHdG。
结果如下所示。
从以上的结果可以导出以下的结论。
·样品C的原液具有非常强的毒性。为中和其毒性必须稀释10000倍以上。
·样品D的毒性大部分消失了。处理条件的改变被认为是与样品C产生显著差异的原因。
如上所述，按照本发明的生物学评价法，通过对处理后的溶液进行试验，可以对使用的处理法的有用性进行评价。实施例16
关于婴幼儿的牛奶营养与尿中的8OHdG排泄量的相关性按以下的顺序进行试验。
首先，把出生后1～3个月的婴幼儿作为对象，分为母乳主体(n＝6)、奶粉主体(n＝8)、混合营养(n＝6)。冷冻保存从这些婴幼儿中随时地采集的尿，使用用单克隆抗体的8OHdG酶免疫抗体(EIA)测定装置(日本油脂公司制、测定灵敏度＞1ng/ml)测定8OHdG的浓度。进一步，解冻同一冷冻样品100μl后，加入到含有由40％甘油、10％甲醇与2mMEDTA组成的抗氧化保存液200μl的保存管中，配制被测尿与保存液的混合溶液。然后，在该混合溶液中，使用微量透析系统(50KD截断纤维素膜、膜长10mm、Eicom公司制)，按1μl/分(37℃)的速度使回流液(20％甘油溶液)回流，将回收的回流液用冰冷却。但是，同条件下的8OHdG与dG的标准液的回收率(30～40％)每次都用微量透析的探头在事前确认。使用自动进样装置(4℃)将该回流液10μl自动注入与实施例1相同的8OHdG/dG同时测定系统中并进行测定。另外，将该混合溶液用100％甲醇液稀释10倍，用离心分离沉淀蛋白成分，用高灵敏度氮氧化物测定器(ENO-10，Eicom公司制)测定其上清液中的硝酸根离子浓度。
得到的结果如图3～5所示。
由图3可得到以下结论。
·从ECD法与EIA法之间，可以看出其相关系数是R2＝0.767的正相关。
·此结果中，按ECD的测定值比EIA的测定值显示相对较高的值。这是由于从采集分析物到加入保存液为止有几个月的时间差，因此诱导分析物自然氧化的可能性高。
另外，由图4可得到以下结论。
·从8OHdG与NO3-浓度之间，可以看出其相关系数是R2＝0.627的正相关。
·一般地尿中的NO3-浓度，认为是生物体的氧化压力指标。所以，从8OHdG与NO3-浓度显示正的相关性，暗示出8OHdG浓度即使是作为一般的生物体氧化压力指标也是有用的。
进一步，由图5可得到以下结论。
·尿中的8OHdG的排泄量，在奶粉组中比母乳营养组显示有意义的高值。但是，dG的排泄量同时也显示高值，按照8OHdG/dG之比，不存在组间的差别。
·最近发现，在评价被测者的健康状态时，只关注排入到尿中的8OHdG排泄量的报导，从此次结果看，尿中排泄的总核酸量与摄取的营养组成相比有很大的差异，认为如果不同时考虑尿中的8OHdG排泄量与dG排泄量(一般约为8OHdG的10倍)，就得不到合理的基因的氧化损伤指标。
·利用本申请的测定装置，能经常同时测定同一样品种的8OHdG与dG，与其它的测定法(EIA法或LC-MAS法)相比存在着很大的优点。
工业实用性
如以上详细地说明的那样，利用本发明的DNA损伤指标对天然与人工化学物质的生物学的评价法，可以在试管内非常简便且低成本地评价天然或人工化学物质或食品类等的被测物质的生物学毒性、有益性或安全性等。而且此后，根据被测物质的重要程度，可以对培养细胞或实验动物等的生物体内进行评价。
人工化学物质即使是主要的也有10万种以上，要对其中的每一种，实施现在的正式的动物实验或临床实验在事实上是不可能的。所以，对于每个化学物质能够简便地提示具体的DNA损伤指标的本发明的方法，制定了粗略的安全标准浓度，另外，在讨论正式的动物实验或临床实验的必要性的基础上能够提供非常有用的信息。从此来看，本发明的生物学的评价法是，提供简便地筛选各种天然或人工化学物质的生物学的毒性、食品类的有害性、有益性等的手段。
另外，本发明的方法能够客观地定量化市售或者开发中的健康食品或功能性食品的有益性或有害性。即，按照本发明，不仅能可靠且简便地进行对开发中的食品类所必须的有益性、安全性等的评价，也可能重新确定现在市场中上市的食品类的有益性或安全性。
进而，对某种物质(被测物质)受紫外线照射的影响，或由于活性酶类产生剂或基因氧化损伤性物质的共存对该物质的影响，也能按照本发明简便地进行评价，可能更正确地评价自然界中的被测物质的毒性等。
另外，在本发明的方法中，通过将含有未知物质的水溶液作为被测溶液，能够综合评价该水溶液的基因损伤诱导作用。所以，对于组成不能明确的自来水、天然水等可以正确且简易地得到生物毒性指标。
根据本发明，从投喂了化学物质或食品的包括人在内的动物等中采集的尿或者血液等的生物体细胞获得的产物中的8-羟基-2′-脱氧鸟苷与2-脱氧鸟苷的含量比，能够正确且简易地评价该化学物质或者食品的有害性或有益性。
根据本发明的测定装置的高测定灵敏度，与其测定结果的可靠性是生物体样品(特别是核酸成分)的抗氧化保存液、和抗氧化环境下的除蛋白处理(微量透析法的应用)和本发明的8OHdG/dG同时测定系统的全部搭配时能最好地发挥，对大约全部的生物体样品可以提供划时代的DNA氧化损伤指标的测定装置。即，用电化学检测器可能测出的核酸氧化物，例如，与8OHdG同样地通过A：T到G：C转换生成的2OHdA或其还原型dA的同时测定，也可能在和8OHdG/dG大致相同的测定条件下测出。
在本发明的测定装置中使用的微量透析处理，能够适用于液态样品或细胞含有样品中的任一种样品。另外，在除蛋白处理中，不使用酸、碱和酶反应，因为全部的操作在低温下进行，因此分析物的劣化少，以及DNA关联物的提取效率只与从透析膜的回收率有关，因此，通过使灌注条件恒定化而可以减少误差，这是其优点。进而，若灌注液和保存液相同时，灌注后的分析物的长期保存也是可能的。
在本发明的8OHdG/dG同时测定方法中，同一样品下，能同时地定量分析非氧化型和氧化型的单核苷，而且根据两者比值的数据处理，能够排除或者减轻分析物注入量等的误差原因。而且，在一次注入样品量在10～100μl的极小量下也可能测定，由于注入到色谱柱的主要注入液是透析膜的灌注液，因此测定噪声小，与现有技术相比，能得到高的灵敏度，因此，色谱柱的使用年数延长、及测定样品在低温下稳定、由于和增加了恒温冷却装置的自动进样装置相连、系统的省力化成为可能，在各段提高了运用的经济性。
本发明的抗氧化保存液中，对于在取样之后很快就有氧化倾向的生物体样品，氧化物浓度可能进一步提高，与现有的简单的冷冻或冷藏保存不同，实际上能抑制保存中的氧化。特别是，对来自核酸的核苷与其氧化物的浓度变化调整到最小，因此最适合于在DNA氧化损伤指标的测定用分析物的保存。而且，该氧化保存液因为组成比较简单且便宜，内容成分也可能稳定地长期保存。
机译： 利用DNA损伤指数对天然和人造化学物质进行生物学评估的简单方法及其装置
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